ES2375406T3 - Sonda y cebador para la detección de bacilos tuberculosos, y procedimiento para la detección de bacilos tuberculosos humanos con el uso de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, en la que A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina y T representa timina, y T puede estar, en cualquier posición, sustituida por uracilo (U), y de aquí en adelante, se usarán las mismas abreviaturas, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis.
Description
Sonda y cebador para la detección de bacilos tuberculosos, y procedimiento para la detección de bacilos tuberculosos humanos con el uso de los mismos
La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar bacilos tuberculosos humanos, es decir, Mycobacterium tuberculosis (denominados de aquí en adelante Mycobacterium tuberculosis), en pruebas de laboratorio mediante la utilización de una amplificación del ácido nucleico y un sistema de detección de los mismos.
Mycobacterium tuberculosis es un microbio patógeno que provoca la tuberculosis en seres humanos y es un bacilo Gram positivo perteneciente al género Mycobacterium que tiene propiedades acidófilas. A pesar de la significativa disminución de la tuberculosis en los últimos años, recientemente, se ha convertido en un grave problema debido al aumento de la tasa de incidencia en la tercera edad y al brote de la infección en grupos de jóvenes que no han contraído la infección tuberculosa.
Por otro lado, también se sabe que además de Mycobacterium tuberculosis, hay otras micobacterias no tuberculosas, tales como Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare y Mycobacterium kansasii que también presentan patogenicidad que afecta a los seres humanos. Además, también ha surgido el gran problema de las micobacterias no tuberculosas que desarrollan la enfermedad en pacientes infectados por el virus del SIDA. Como la mayoría de estas micobacteriosis no tuberculosas presentan resistencia contra los agentes antituberculosos, ha cobrado importancia el diagnóstico diferencial entre la micobacteriosis tuberculosa y no tuberculosa para la determinación de la estrategia terapéutica. Sin embargo, como la diferenciación de la tuberculosis en base a las observaciones histopatológicas y de los síntomas clínicos es bastante complicada, el diagnóstico tiene que ser determinado con la identificación de las bacterias.
Cuando se realiza el diagnóstico diferencial entre la micobacteriosis tuberculosa y la no tuberculosa, las muestras se cultivan generalmente por separado en el medio de Ogawa, y luego se someten a pruebas bioquímicas para la identificación de las especies. Sin embargo, como el crecimiento del género Mycobacterium es generalmente lento, se requiere un tiempo considerablemente largo de cultivo. Por esa razón, cuando se realizan pruebas fundamentales convencionales, tales como el examen de frotis y el examen de cultivos, el aislamiento y el cultivo de las bacterias para obtener el resultado diagnostico que determine o no la tuberculosis requiere al menos de 3 a 4 semanas, y después, se requiere un periodo de tiempo de más de 2 a 3 semanas para realizar las diversas pruebas sobre la identificación de las especies.
Aunque se conoce otro procedimiento para detectar los bacilos tuberculosos en el que se usa el antígeno–anticuerpo contra el género Mycobacterium, la especificidad hacia el bacilo tuberculoso es deficiente debido a la reacción cruzada entre las especies del género Mycobacterium, y como consecuencia de ello, a que la sensibilidad es insuficiente.
Recientemente, se ha examinado una técnica de diagnóstico mediante la aplicación de técnicas de amplificación de ácido nucleico, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como un procedimiento útil, así como su aplicación en el diagnóstico del bacilo tuberculoso. Se ha estudiado si es posible usar diversas regiones de los genomas de ADN del bacilo tuberculoso como diana para detectar el bacilo tuberculoso mediante PCR.
Por ejemplo, se ha publicado un procedimiento para detectar la región genética que codifica el antígeno de 65 kDa del género Mycobacterium (al que se hace referencia, p.ej., en el Documento no de patente 1, Documento no de patente 2, Documento no de patente 3, Documento no de patente 4 y Documento no de patente 5). Sin embargo, se sabe que el mismo género, tal como M. avium, M. fortuitum, M. paratuberculosis, M. kansasii, M. malmoense, BCG y
M. marinum, así como Mycobacterium tuberculosis, tiene el gen del antígeno de 65 kDa conocido. Especialmente, como el antígeno de 65 kDa tiene una alta reactividad cruzada con M. avium o M. kansasii, que son los microorganismos representativos causantes de la micobacteriosis no tuberculosa, el procedimiento para detectar el gen del antígeno de 65 kDa sigue presentando un problema como procedimiento para detectar específicamente Mycobacterium tuberculosis.
Además, se ha realizado un examen de prueba para identificar M. tuberculosis usando una secuencia genética que codifica la proteína MPB70, que fue identificada mediante ADN de Mycobacterium bovis (al que se hace referencia, por ejemplo, en el Documento no de patente 6). Sin embargo, Kulski, et al. publicaron el resultado en FEMS Microbiol. Lett., 1 de marzo de 1997; 148(1): 43–48 (Documento no de patente 7). Concretamente, como resultado de un examen por PCR, se encontró la reacción cruzada con la secuencia similar en ADN de M. kansasii al usar la proteína MPB70 como diana. Por consiguiente, este procedimiento continúa teniendo un problema como procedimiento para detectar específicamente Mycobacterium tuberculosis.
Alternativamente, se ha publicado un procedimiento para detectar M. tuberculosis I bovis usando una secuencia de genes que codifica un antígeno proteico b (Pab) como marcador (al que se hace referencia, p. ej., en el Documento no de patente 8) y se ha confirmado la utilidad de este marcador para la detección de M. tuberculosis I Bovis.Sin embargo, como, en el caso del gen Pab, sólo puede existir una copia en el genoma de M. tuberculosis, no se considera tan preferible como material para dirigir la amplificación de ácidos nucleicos (por el contrario, en el caso de la secuencia de IS6110 descrita a continuación, existen diez copias en el genoma de M. tuberculosis).
Además, se publicó que se puede utilizar la RFLP (Polimerización de longitudes de fragmentos de restricción), mediante el uso de IS6110 como sonda, para el diagnóstico de bacilos tuberculosos (a lo que se hace referencia en el Documento no de patente 9). Esta secuencia se ha usado ampliamente como importante herramienta para el estudio epidemiológico de la tuberculosis en muchos países del mundo. IS6110 es una secuencia de inserción específica del bacilo tuberculoso y existe de manera plural en el ADN cromosómico, con diferente número y ubicación en función de la cepa, y este carácter genético se hereda en cierto grado de manera estable. Por lo tanto, se muestran diferentes patrones de RFLP en función de la diferencia en la cepa, y puede ser posible el agrupamiento en base a sus orígenes. Existen muchos informes sobre el procedimiento de detección del bacilo tuberculoso usando IS6110 que indican una sensibilidad que supera el 75%, así como una especificidad de casi el 100%. Sin embargo, entretanto, también se ha publicado el resultado de un estudio que indica la posibilidad de que el procedimiento de detección genere falsos positivos con el uso de IS6110 (al que se hace referencia en el Documento no de patente 10). Aunque también se conoce un procedimiento de detección con PCR mediante el diseño de un cebador específico de IS6110 (al que se hace referencia, p. ej., en el Documento de patente 1, Documento de patente 2, Documento de patente 3 y Documento de patente 4), este procedimiento plantea el problema de que también se amplifican las secuencias relativas a IS6110 derivadas del género Mycobacterium que no pertenecen a M. tuberculosis. Además, las secuencias de tipo IS6110 existen en otras especies de microorganismos distintas del bacilo tuberculoso, y es por ello que se ha sugerido que estos microorganismos podrían ser detectables mediante el procedimiento de detección dirigido a IS6110. Por consiguiente, todos los procedimientos convencionales para detectar IS6110 presentan el problema de ser insuficientes en la detección específica de Mycobacterium tuberculosis. Además, el documento WO00/29613 (Documento de patente 16) revela una secuencia de oligonucleótido que abarca la secuencia complementaria de SEC ID N.º 1, que se usa como una sonda estándar para M. tuberculosis.
Por consiguiente, existe la necesidad de establecer un procedimiento nuevo para detectar específicamente Mycobacterium tuberculosis.
[Documento de patente 1]: JP–A–05–507617.
[Documento de patente 2]: JP–A–11–514522.
[Documento de patente 3]: JP No. 2814422.
[Documento de patente 4]: USP No. 5370998.
[Documento de patente 5]: JP–A–60–500717.
[Documento de patente 6]: JP–A–60–281.
[Documento de patente 7]: USP No. 5.210.015.
[Documento de patente 8]: USP No. 5538848.
[Documento de patente 9]: USP No. 5.801.155.
[Documento de patente 10]: USP No. 5925517.
[Documento de patente 11]: USP No. 6.492.121.
[Documento de patente 12]: JP No. 2650159.
[Documento de patente 13]: JP–B–07–114718.
[Documento de patente 14]: JP–A–58–040099.
[Documento de patente 15]: JP–A–62–265999.
[Documento de patente 16]: WO00/29613.
[Documento no de patente 1]: Chia et al., J. Clin. Microbiol., 1990, 28(9), 1877–1880.
[Documento no de patente 2]: Brisson–Noel et al., Lancet, 1989, 334, 1069–1071.
[Documento no de patente 3]: Hackel et al., “Molecular and cellular Probes”, 1990, 4, 205–210.
[Documento no de patente 4]: Woods, Cole, FEMS Mycrobiology Letters, 1989, 65, 305–310.
[Documento no de patente 5]: Hance et al., “Molecular Microbioloby”, 1989, 3(7), 843–849.
[Documento no de patente 6]: Kulski et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33, 668–674.
[Documento no de patente 7]: Kulski et al., FEMS Microbiol. Lett. 1 de marzo de 1997, 148(1), 43–48.
[Documento no de patente 8]: Sjobring et al., J. Clin. Microbiol., 1990, 28(10), 2200–2204.
[Documento no de patente 9]: Hermans PWM et al., J. Clin. Microbiol., 1990, 28, 2051–2058.
[Documento no de patente 10]: Lee et al., “Neurological Sciences”, 1994, 123, 173–179.
[Documento no de patente 11]: Thierry et al., Nucleic acid Res., 1990, 18(1), 188.
[Documento no de patente 12]: Nucleic acids Res., 1986, 14, 6115–6128.
[Documento no de patente 3]: Kent PT, Kubica GP, “Public Health Mycobacteriology, A Guide for the Level III
Laboratory”, Departamento estadounidense de Salud y Servicios Sociales, Servicio de Salud Pública, Centro
de Control de Enfermedades, Atlanta, EE.UU. 1985, p.31–55. Revelación de la invención Problemas por resolver mediante la invención La presente invención se ha realizado en las circunstancias anteriores y tiene por objeto proporcionar un nuevo cebador para detectar el bacilo tuberculoso sin dar un falso positivo en el diagnóstico, así como proporcionar un procedimiento fácil de usar, rápido y muy preciso para detectar Mycobacterium tuberculosis con el uso del mismo.
Procedimientos para resolver los problemas
La presente invención se ha creado para resolver los problemas anteriores y está constituida por los siguientes elementos.
- (1)
- Un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1 (en la que A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina y T representa timina, y T puede estar, en cualquier posición, sustituida por uracilo (U), y de aquí en adelante, se usarán las mismas abreviaturas), o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis.
- (2)
- El oligonucleótido de (1) anterior, que es un cebador para detectar Mycobacterium tuberculosis, que consiste en la secuencia de ácidos nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis.
- (3)
- El oligonucleótido de (1) anterior, que es una sonda para detectar Mycobacterium tuberculosis que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis.
- (4)
- un procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis, que comprende usar un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, como un cebador y/o una sonda.
- (5)
- un kit para detectar Mycobacterium tuberculosis, que comprende un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma,
oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, como un cebador y/o una sonda.
El inventor de la presente invención ha continuado las verificaciones teóricas y experimentales sobre las homologías de las diversas secuencias génicas identificadas hasta la fecha entre las especies, incluyendo Mycobacterium tuberculosis y otros organismos, y ha descubierto la existencia de una secuencia de bases que tiene la propiedad de hibridarse específicamente con una región específica de la secuencia de IS6110, que es la secuencia de inserción y la secuencia repetida en Mycobacterium tuberculosis, y la secuencia de bases es útil en la detección de Mycobacterium tuberculosis.
Como resultado de amplios estudios basados en estos descubrimientos, el inventor ha desarrollado un oligonucleótido con especificidad por Mycobacterium tuberculosis y que es útil en su detección (secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1), un cebador de ácido nucleico y una sonda marcada para detectar Mycobacterium tuberculosis utilizando esta secuencia, y ha establecido un procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis usando los mismos.
Según el procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención, es posible excluir el diagnóstico falso positivo, y como consecuencia de ello, se puede efectuar una detección más específica y precisa de Mycobacterium tuberculosis en comparación con los procedimientos convencionales para detectar Mycobacterium tuberculosis dirigidos a IS6110.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 muestra los resultados electroforéticos obtenidos en el Ejemplo 1. En la Fig. 1, el número de cada carril muestra los resultados obtenidos mediante el uso de las siguientes muestras, respectivamente; M4: Marcador del peso molecular (Marcador 4); a: Escherichia coli; b: Mycobacterium tuberculosis; c: Mycobacterium kansasii; d: Mycobacterium marinum; e: Mycobacterium simiae; f: Mycobacterium scrofulaceum; g: Mycobacterium gordonae; h: Mycobacterium szulgai; i: Mycobacterium avium; j: Mycobacterium intracellulare; k: Mycobacterium gastri; l: Mycobacterium xenopi; m: Mycobacterium nonchromogenicum; n: Mycobacterium terrae; o: Mycobacterium triviale; p: Mycobacterium fortuitum; q: Mycobacterium chelonei; r: Mycobacterium abscessus; s: Mycobacterium peregrinum.
La Fig. 2 muestra los electroforetogramas obtenidos en el Ejemplo 2. En la Fig. 2, el número de cada carril muestra los resultados obtenidos mediante el uso de las siguientes muestras, respectivamente; M1: Marcador del peso molecular (Marcador 1); M4: Marcador del peso molecular (Marcador 4); a: Escherichia coli; b: Mycobacterium tuberculosis; c: Mycobacterium kansasii; d: Mycobacterium marinum; e: Mycobacterium simiae; f: Mycobacterium scrofulaceum; g: Mycobacterium gordonae; h: Mycobacterium szulgai; i: Mycobacterium avium; j: Mycobacterium intracellulare; k: Mycobacterium gastri; l: Mycobacterium xenopi; m: Mycobacterium nonchromogenicum; n: Mycobacterium terrae; o: Mycobacterium triviale; p: Mycobacterium fortuitum; q: Mycobacterium chelonei; r: Mycobacterium abscessus; s: Mycobacterium peregrinum.
La Fig. 3–1 muestra los electroforetogramas obtenidos en el Ejemplo comparativo 1. En la Fig. 3–1, el número de cada carril muestra los resultados obtenidos usando las siguientes mezclas, respectivamente. El círculo de puntos indica una banda (m) obtenida con la muestra de Mycobacterium nonchromogenicum. El círculo de puntos marcado con la flecha indica una banda (o) obtenida con la muestra de Mycobacterium triviale.M1: Marcador del peso molecular (Marcador 1); M4: Marcador del peso molecular (Marcador 4); a: Escherichia coli; b: Mycobacterium tuberculosis; c: Mycobacterium kansasii; d: Mycobacterium marinum; e: Mycobacterium simiae; f: Mycobacterium scrofulaceum; g: Mycobacterium gordonae; h: Mycobacterium szulgai; i: Mycobacterium avium; j: Mycobacterium intracellulare; k: Mycobacterium gastri; l: Mycobacterium xenopi; m: Mycobacterium nonchromogenicum; n: Mycobacterium terrae; o: Mycobacterium triviale; p: Mycobacterium fortuitum; q: Mycobacterium chelonei; r: Mycobacterium abscessus; s: Mycobacterium peregrinum.
La Fig. 3–2 muestra el listado de secuencias de ácidos nucleicos obtenidas mediante la purificación y el análisis del producto de PCR de la fracción, que resultó ser la fracción obtenida mediante la electroforesis anterior del producto PCR usando la muestra (o) de Mycobacterium riviare, y se determinó que la fracción era muy similar en cuanto al tamaño de la fracción amplificada a la banda positiva de la muestra derivada de Mycobacterium tuberculosis. La secuencia del producto de la PCR derivado de Mycobacterium tuberculosis de la fracción (b) está designada por 1ª secuencia de nucleótidos, que se muestra en la parte superior del listado de secuencias a modo comparativo. Además, la secuencia del producto de la PCR derivado de Mycobacterium triviale de la fracción (o) está designada por 2ª secuencia de nucleótidos, y se muestra en la parte inferior de este listado de secuencias.
La Fig. 4 muestra el resultado de la detección por PCR en tiempo real realizada en el Ejemplo 3, que es una curva de calibración obtenida representando el valor de Ct (eje Y) frente al número de copias del genoma de cada muestra de ADN para la PCR (eje X, valor logarítmico).
La Fig. 5 muestra el resultado de la electroforesis obtenida en el Ejemplo 4. La Fig. 5, el número de cada carril muestra los resultados obtenidos mediante el uso de las siguientes mezclas, respectivamente. M: Marcador del peso molecular
- (1)
- Sin muestra
- (2)
- Mycobacterium tuberculosis + M. avium + M. intracellulare + M. kansasii
- (3)
- Mycobacterium tuberculosis
- (4)
- M. avium + M. intracellulare + M. kansasii
- (5)
- Mycobacterium tuberculosis (10 copias) + M. avium+ M. intracellulare + M. kansasii
- (6)
- M. avium
- (7)
- Mycobacterium tuberculosis + M. intracellulare + M. kansasii
La dirección de la migración electroforética se indica a la izquierda del patrón electroforético, y se muestra el orden de aparición de la fracción de cada producto amplificado. "TB" indica M. tuberculosis; "avium" indica M. avium; "intra" indica M. intracellulare; y "kansasii" indica M. kansasii.
La Fig. 6 muestra el resultado de la detección por PCR en tiempo real realizada en el Ejemplo 5, que es una curva de calibración obtenida representando el valor de Ct (eje Y) frente al número de copias del genoma de cada muestra de ADN para la PCR (eje X, valor logarítmico).
Mejor modo de llevar a cabo la invención
El gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis de la presente invención consiste en una secuencia de bases con una longitud completa de 885 pares de bases, cuya secuencia total de bases se encuentra descrita, por ejemplo, en el artículo publicado por el Instituto Pasteur, "Nucleic acid Res. 1990, 18(1): p.188" (Documento no de patente 11).
El oligonucleótido de la presente invención incluye un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis (denominado de aquí en adelante un oligonucleótido de la presente invención).
La secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1 de la presente invención incluye, por ejemplo, una secuencia de oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con el oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1 de la presente invención.
La secuencia de ácido nucleico descrita anteriormente que tiene la propiedad de hibridarse con el oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1 de la presente invención incluye, específicamente, un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene la propiedad de hibridarse en condiciones muy restrictivas o en condiciones restrictivas con el oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1 de la presente invención.
Con respecto a esto, la expresión “condiciones muy restrictivas” significa condiciones de hibridación en formamida al 50% a una temperatura de 42 a 700C, preferiblemente, de 60 a 700C, seguidas por el lavado con dodecilsulfato de sodio al 0,1% (SDS) de 25 a 70ºC en 0,2 a 2 x SSC.
Además, la expresión “condiciones restrictivas” significa específicamente, por ejemplo, las condiciones en las que la hibridación se realiza a una temperatura de 50 a 700C durante 16 horas en la solucion de hibridacion de 6 x SSC o una concentración salina equivalente a la misma, y el producto hibridado se lava con 1 x SSC o una concentración salina equivalente a la misma, si es necesario, tras lavar previamente con la solución de 6 x SSC o una concentración salina equivalente a la misma.
El oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis de la presente invención incluye un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene la propiedad de hibridarse en condiciones muy restrictivas o en condiciones restrictivas con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis descrita anteriormente en la presente memoria. Las condiciones muy restrictivas o restrictivas son las descritas anteriormente en la presente memoria.
El oligonucleótido de la presente invención puede ser ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). En el ácido ribonucleico, el residuo de timidina (T) ha de estar sustituido de manera natural para que se lea como un residuo de uridina (U). El ADN puede ser ADN que contenga un residuo de uridina en el que T de cualquier posición sea sustituida por U en la síntesis. El ARN también puede ser ARN que contenga un residuo de timidina en el que U de cualquier posición se haya sustituido por T en la síntesis. Además, se pueden eliminar, insertar o sustituir uno o varios nucleótidos, o puede haber un nucleótido modificado, tal como inosina (I).
Para obtener el oligonucleótido de la presente invención, se puede usar el oligonucleótido preparado según la síntesis química conocida hecha pública. Por consiguiente, se puede obtener fácilmente el oligonucleótido de la misma calidad, en gran cantidad y a un bajo precio, en comparación con el procedimiento de clonación para obtener un oligonucleótido o un polinucleótido.
Por ejemplo, el oligonucleótido deseado de la presente invención se puede obtener usando un sintetizador de ADN elaborado convencionalmente en la síntesis de ADN, sintetizando el oligonucleótido mediante el procedimiento convencional de la fosfoamidita y purificando mediante cromatografía en columna de intercambio aniónico.
El cebador para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención (denominado de aquí en adelante el cebador de la presente invención) incluye un cebador para detectar Mycobacterium tuberculosis que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, y es un oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de
Mycobacterium tuberculosis
El ejemplo específico del oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1,
o una secuencia complementaria a la misma, que es un oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis usado como el cebador de la presente invención es como se describe en la explicación del oligonucleótido de la presente invención descrito anteriormente en la presente memoria.
Además, el cebador de la presente invención se puede usar en una región apropiada y una longitud apropiada seleccionada entre el oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrito en SEC ID N.º 1 o la secuencia complementaria a la misma, de acuerdo con las condiciones deseadas de hibridación del ácido nucleico y teniendo en cuenta la temperatura de disociación (valor de Tm).
En un ejemplo de cebador de la presente invención para su uso en la PCR, etc., por ejemplo, el cebador directo es, preferiblemente, un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1 o la secuencia complementaria a la misma; y el cebador inverso es preferiblemente un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3 o SEC ID N.º 4, o una parte o la totalidad de la secuencia complementaria a la misma.
Entre ellos, el cebador directo es preferiblemente un oligonucleótido cuya secuencia de ácido nucleico se describe en SEC ID N.º 1, y el cebador inverso es preferiblemente un oligonucleótido cuya secuencia de ácido nucleico se describe en SEC ID N.º 3 o SEC ID N.º 4.
La combinación de los cebadores particularmente preferible incluye una combinación del cebador directo, que es un oligonucleótido de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, y el cebador inverso, que es un oligonucleótido de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 3.
Un procedimiento para obtener el cebador de la presente invención es como el que se describe anteriormente en la presente memoria en el procedimiento para obtener el nucleótido de la presente invención.
El cebador de la presente invención puede estar marcado con una sustancia de marcaje.
Los ejemplos de sustancias de marcaje usadas para marcar el cebador de la presente invención pueden ser cualquier sustancia de marcaje, tal como un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente y una biotina.
El radioisótopo incluye, por ejemplo, 32P, 33P y 35S; la enzima incluye una fosfatasa alcalina, una peroxidasa de rábano picante, etc.; la sustancia fluorescente incluye una serie de colorantes de cianina, tales como Cy3 y Cy5 (Amersham Bioscience Inc.), una fluoresceína; y la sustancia luminiscente incluye reactivos quimioluminiscentes que incluyen un éster de acridinio.
Un procedimiento para marcar el cebador de la presente invención con el radioisótopo incluye un procedimiento para marcar el cebador mediante la incorporación de un nucleótido marcado con un radioisótopo en la síntesis del cebador, o un procedimiento para realizar el marcaje con el radioisótopo después de la síntesis del cebador. Específicamente, el procedimiento incluye el procedimiento comúnmente usado de cebador aleatorio, el procedimiento de traducción de muescas, un procedimiento de marcaje del terminal 5’ usando la polinucleótido quinasa de T4, un procedimiento de marcaje del terminal 3’ usando una desoxinucleotidil transferasa terminal y un procedimiento de marcaje de ARN.
En caso de marcar el cebador de la presente invención con una enzima, se puede usar un procedimiento de marcaje directo que es convencional en este campo, y el procedimiento incluye, por ejemplo, un procedimiento para unir una molécula enzimática, tal como fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante, con el cebador que se va a marcar directamente mediante enlace covalente.
En el caso de marcar el cebador con una sustancia fluorescente, se puede incorporar en el cebador, por ejemplo, un nucleótido marcado con fluoresceína mediante el procedimiento de marcaje convencional en este campo. Se puede marcar el nucleótido con la sustancia fluorescente mediante un procedimiento para sustituir el nucleótido que tiene un brazo ligador como miembro en la secuencia del oligonucleótido (al que se hace referencia, p.ej., en el Documento no de patente 12). En este caso, también se puede usar un procedimiento en el que se sintetice químicamente una uridina que tenga un brazo ligador en la posición 5 a partir de desoxiuridina mediante el procedimiento sintético revelado en el documento JP–A–60–500717 (Documento de patente 5) para introducir la sustancia de fluorescente en la cadena de oligonucleótido anteriormente descrita.
El procedimiento para marcar el cebador con la sustancia luminiscente y el procedimiento para marcar el cebador con una biotina se pueden llevar a cabo mediante un procedimiento convencional para el marcaje de nucleótidos con una sustancia luminiscente o una biotina.
La sonda para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención (denominada de aquí en adelante la sonda de la presente invención) incluye una sonda que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en la que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis (el oligonucleótido de la presente invención).
El ejemplo específico de oligonucleótido de la presente invención usado en la sonda de la presente invención el como el descrito en la explicación del oligonucleótido de la presente invención que aparece anteriormente en la presente memoria.
La sonda de la presente invención se puede usar en una región apropiada y con una longitud apropiada seleccionada entre el oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrito en SEC ID N.º 1 o la secuencia complementaria a la misma, de acuerdo con las condiciones deseadas de hibridación del ácido nucleico y calculando la temperatura de disociación (valor de Tm).
Además, la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 6 es una secuencia de ácido nucleico amplificada mediante PCR con el uso del cebador de la presente invención. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 6 es una secuencia amplificada mediante PCR con el uso del oligonucleótido de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1 como cebador directo y el oligonucleótido de la secuencias de ácidos nucleico descrita en SEC ID N.º 3 como cebador inverso.
Un procedimiento para obtener la sonda de la presente invención es como el que se describe en el procedimiento para obtener el nucleótido de la presente invención presentado anteriormente en la presente memoria.
La sonda de la presente invención puede estar marcada con una sustancia de marcaje.
Los ejemplos de sustancias de marcaje usadas para marcar la sonda de la presente invención pueden ser cualquier sustancia de marcaje conocida, tal como un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente y una biotina.
El ejemplo específico de sustancia de marcaje para marcar la sonda de la presente invención y un procedimiento para marcar la sonda son iguales a los descritos en la explicación del procedimiento de marcaje del cebador de la presente invención.
Además, la sonda marcada usada en el procedimiento de detección por PCR en tiempo real descrita en la presente memoria incluye la sonda de la presente invención marcada con una sustancia de marcaje usada convencionalmente en el procedimiento de detección en tiempo real. Cabe mencionar, por ejemplo, el oligonucleótido de la presente invención, en el que el terminal 5’ está marcado con una sustancia fluorescente indicadora (carboxifluoresceína (FAM), hexaclorofluoresceína (HEX), tetraclorofluoresceína (TET) y similares) y el terminal 3’ está marcado con un colorante atenuador (p.ej., una sustancia fluorescente, tal como carboxitetrametil–rodamina (TAMRA), una sustancia no fluorescente, tal como pigmento atenuador Black Hole (BHQ) y ácido 4–((4–(dimetilamino)fenil)azo)benzoico (DABCYL)).
Las muestras usadas para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención son diversas muestras clínicas, tales como esputo, sangre y aspirado transbronquial humanos. Además, como muestras, se pueden usar células bacterianas aisladas y cultivadas, un ácido nucleico aislado y purificado de las mismas o un ácido nucleico amplificado mediante amplificación de ácidos nucleicos y un sistema de detección.
La extracción y purificación del ADN de las muestras anteriores se pueden realizar mediante el procedimiento convencional usado en la extracción de ADN de bacterias ácidas (bacilos tuberculosos).
Por ejemplo, cuando se usa una muestra de células bacterianas, se puede usar, por ejemplo, un procedimiento en el que las células bacterianas se traten con un agente tensioactivo tal como SDS o una proteína desnaturalizada, tal como tiocianato de guanidina (GTC) para descomponer la estructura de la membrana del bacilo tuberculoso, o un procedimiento de interrupción física de las células bacterianas mediante el uso de perlas de vidrio.
Cuando se usa esputo como muestra, se puede realizar preferiblemente la homogenización de la muestra por medio del procedimiento con (N–acetil–L–cisteína)–NaOH (NALC) (Documento no de patente 13) como tratamiento preliminar recomendado por los centros estadounidenses de control y prevención de enfermedades (CDC).
Después se puede realizar la extracción y purificación del ADN usando el procedimiento de preparación común de ADN (extracción en fenol–cloroformo, procedimiento de precipitación en etanol, etc. "Rapid and simple method for purification of nucleic acids", J. Clin. Microbiol., 1990, Mar:28(3), 495–503, Boom R., Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheimvan Dillen PM, van der Noordaa J).
A modo de ejemplo, se explica un caso en el que, como muestra para detectar Mycobacterium tuberculosis, se usan células bacterianas cultivadas aisladas de la muestra y cultivadas. Tras recoger las colonias del medio de Ogawa, suspender la colonia en agua destilada esterilizada y luego recoger las células bacterianas mediante centrifugación. Se vuelven a suspender las células bacterianas en el agua destilada y se tratan en un autoclave. Se interrumpen las células bacterianas (por ejemplo, mediante interrupción física usando perlas de vidrio) y se centrifugan para recoger el sobrenadante. El ADN se puede extraer del sobrenadante obtenido mediante purificación. Se pueden usar los diversos kits para la extracción y purificación de ADN que se encuentran comercialmente disponibles o, alternativamente, se pueden aplicar los procedimientos convencionales (p.ej., procedimiento de extracción en fenol– cloroformo, procedimiento de precipitación con etanol, isopropanol, etc.). Por ejemplo, se puede usar el kit Genomic– tip (un kit para la extracción y purificación de ADN, tipo de resina de intercambio iónico, QIAGEN Inc.) para la extracción y purificación de ADN.
El procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención incluye un procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis que comprende usar un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, o la secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, como cebador y/o sonda (un procedimiento que usa el cebador y/o la sonda de la presente invención).
Como es posible amplificar la secuencia de la región específica de la secuencia de ácido nucleico de IS6110 de Mycobacterium tuberculosis mediante la hibridación del ácido nucleico de la muestra con el cebador de la presente invención, y luego realizar la prolongación del cebador llevando a cabo la amplificación del ácido nucleico con ADN polimerasa (p.ej., PCR; Documento de patente 6), es posible detectar Mycobacterium tuberculosis midiendo el producto de la prolongación del cebador.
El ejemplo específico del procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención usando el cebador de la presente invención incluye:
“Un procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis caracterizado por comprender las siguientes etapas:
- (1)
- realizar la PCR usando como cebador un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, y un ácido nucleico de una muestra como molde; y.
- (2)
- realizar la electroforesis del producto de la prolongación del cebador obtenido en el apartado (1) anterior y determinar la existencia de Mycobacterium tuberculosis en base al resultado obtenido”.
El ejemplo específico del cebador de la presente invención usado en el procedimiento anterior se describe anteriormente en la presente memoria.
Un ejemplo preferible de cebador directo es un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o la secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, y el cebador inverso es un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3 o SEC ID N.º 4, o una parte o la totalidad de la secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis.
Las condiciones y los procedimientos operativos de la PCR en la que se usa el cebador anteriormente descrito y, posteriormente, la electroforesis pueden ser aquéllos conforme al procedimiento convencional en este campo.
El procedimiento para determinar la existencia de Mycobacterium tuberculosis a partir del resultado obtenido mediante la electroforesis incluye, por ejemplo, (a) un procedimiento para la detección mediante la confirmación de una fracción del producto de prolongación del cebador que tenga el número de pares de bases deseado, (b) un procedimiento para la detección mediante la hibridación usando la sonda marcada, etc.
El procedimiento para realizar la detección mediante la confirmación de una fracción del producto de prolongación del cebador que tenga el número de pares de bases deseado del apartado (a) anterior incluye, por ejemplo, un procedimiento de detección que comprende, tras realizar la PCR con el oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 1 como cebador directo y con el oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 3 como cebador inverso, realizar la electroforesis del producto obtenido de la prolongación del cebador y determinar si la muestra es positiva mediante la confirmación de que contiene una fracción de 178 pares de bases.
El procedimiento de detección mediante hibridación con la sonda marcada del apartado (b) anterior incluye un procedimiento de detección que comprende, tras realizar la electroforesis, hibridar la fracción electroforética obtenida con la sonda marcada que es el oligonucleótido de la presente invención marcado con la sustancia de marcaje, detectar la sustancia de marcaje de la sonda marcada y determinar si la muestra es positiva mediante la confirmación de la existencia de una fracción hibridada con la sonda marcada.
Por ejemplo, cuando se realiza la PCR usando el oligonucleótido descrito en la SEC ID N.º 1 como cebador directo y el oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 3 como cebador inverso, se puede realizar un procedimiento de detección que comprende, tras realizar la PCR, realizar una electroforesis, hibridar la fracción electroforética obtenida con la sonda marcada que es el oligonucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 6 y que está marcado con una sustancia de marcaje, detectar la sustancia de marcaje de la sonda marcada y determinar si la muestra es positiva mediante la confirmación de la existencia de una fracción hibridada con la sonda marcada.
En primer lugar, según el procedimiento descrito anteriormente en la presente memoria, se obtiene una muestra de ADN purificado de la muestra en la que se va a detectar Mycobacterium tuberculosis. Por separado, se puede sintetizar un oligonucleótido que tenga la secuencia descrita en SEC ID N.º 2 (denominado de aquí en adelante IS_F6) y un oligonucleótido que tenga la secuencia descrita en SEC ID N.º 4 (denominado de aquí en adelante IS_R6) mediante el procedimiento de fosfoamidita usando un sintetizador de ADN según el procedimiento descrito anteriormente en la presente memoria.
Como solución de reacción para la PCR, se preparan 10mM de solución de tampón Tris–HCl (pH 8,9) que contiene 0,2 a 2,01M de IS_F6 y IS_R6, 1,0 a 4,0mM de MgCl2, 80mM de KCl, 500 1g/ml de ASB, 0,1% de colato de sodio, del 0,005 al 0,2% de Triton X–100 (polioxietilenoctilfeniléter, nombre comercial, Rohm and Haas Co.), 0,1 a 0,6mM de cada uno entre dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y 10 a 80 unidades/ml de ADN polimerasa de Taq.
Se usa una solución obtenida al añadir 1 ng de la muestra de ADN purificada a la solución de reacción para la PCR como muestra para la PCR y se realizan de 20 a 40 ciclos de PCR con termociclador de ADN. Se someten a electroforesis los 5 1l de la solucimediante PCR usando gel de agarosa al 1,5%.
ón de reacción obtenida Posteriormente, tras el tratamiento con tinción de bromuro de etidio, se detecta la fluorescencia inducida por radiación ultravioleta. Simultáneamente, se somete a electroforesis el marcador del peso molecular junto con la solución de reacción, y se calcula la longitud del fragmento de ADN detectado comparando con la velocidad de migración relativa. Se predice el fragmento de ADN de 182 pares de bases (SEC ID N.º 7) de la secuencia de ácido nucleico de IS6110 para su amplificación como resultado de la PCR usando IS_F6 como cebador directo e IS_R6 como cebador inverso. Por consiguiente, se puede determinar como positiva una muestra en la que se confirme la banda fluorescente correspondiente a 182 pares de bases.
A continuación, se muestra otra realización del procedimiento de detección de Mycobacterium tuberculosis que usa el oligonucleótido de la presente invención como cebador. Es decir, la PCR se realiza usando el cebador marcado que es el oligonucleótido marcado de la presente invención mediante el procedimiento de marcaje descrito anteriormente en la presente memoria, y usando el ácido nucleico de la muestra como molde, y se mide la cantidad de sustancia de marcaje del producto obtenido de la prolongación del cebador. Cuando se puede detectar la sustancia de marcaje, se determina la muestra como positiva en Mycobacterium tuberculosis.
En el procedimiento anterior, tras realizar la PCR, se retira el cebador marcado libre y se mide la cantidad de sustancia de marcaje del producto de prolongación del cebador. Cuando se puede detectar la sustancia de marcaje, se determina la muestra como positiva en Mycobacterium tuberculosis.
Un procedimiento para retirar el cebador marcado libre incluye, por ejemplo, el siguiente procedimiento: se hace precipitar el producto de prolongación del cebador de la mezcla de reacción obtenido mediante la reacción PCR con el procedimiento convencional para precipitar ácido nucleico (procedimiento de precipitación con etanol, procedimiento de precipitación usando isopropanol, etc.) y luego se retira el sobrenadante que contiene el cebador marcado libre no precipitado.
Además, cabe mencionar un procedimiento para la separación del producto de la prolongación del cebador y el cebador marcado libre tratando el producto de reacción obtenido mediante la reacción PCR con una cromatografía sobre gel en condiciones apropiadas, y también un procedimiento de separación mediante electroforesis.
En el procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención, también se puede realizar un sistema de detección mediante amplificación en tiempo real (al que se hace referencia en la descripción, p.ej., del Documento de patente 7 y el Documento de patente 8).
Como ejemplo del sistema de detección por medio del sistema de detección mediante amplificación en tiempo real, cabe mencionar, por ejemplo, el sistema de detección por PCR en tiempo real.
Se pueden usar diversos procedimientos de detección por PCR en tiempo real para el procedimiento de detección de Mycobacterium tuberculosis de la presente invención, por ejemplo el procedimiento de PCR en tiempo real TaqManTM (al que se hace referencia, p. ej., en la descripción del Documento de patente 8), el procedimiento de sistema de sondas MGB Eclipse (al que se hace referencia, p.ej., en la descripción del Documento de patente 9), el procedimiento de tecnología de sondas de Molecular Beacons (al que se hace referencia, p.ej., en la descripción del Documento de patente 10), el procedimiento de cebadores fluorogénicos LUX (Invitrogen Corporation) y el procedimiento de PCR mediante sonda atenuadora (QP) (al que se hace referencia, p.ej., en la descripción del Documento de patente 11).
Más específicamente, la cantidad traza deseada de ADN se puede detectar cuantitativamente y con alta sensibilidad por medio del procedimiento PCR en tiempo real TagMan™ usando la sonda marcada con FAM en el terminal 5’ y TAMRA en el terminal 3’ (al que se hace referencia p.ej., en la descripción del Documento de patente 8).
En concreto, el procedimiento comprende realizar la PCR con el uso del ácido nucleico de la muestra como molde y del oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o la secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis como cebador (el cebador de la presente invención) y con el uso de un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis (el oligonucleótido de la presente invención), en el que el terminal 5’ está marcado con un colorante fluorescente indicador y el terminal 3’ está marcado con un colorante atenuador como sonda marcada, detectándose así la sustancia de marcaje liberada por la sonda marcada.
El principio del anterior procedimiento de PCR en tiempo real TagMan™ es el siguiente. Se usa una sonda de oligonucleótido marcada con colorante fluorescente (indicador) en el terminal 5’ y colorante atenuador en el terminal 3' y que tiene la propiedad de hibridarse a una región específica del gen diana. En la sonda, se inhibe la fluorescencia emitida desde el indicador mediante el colorante atenuador en las condiciones habituales. Se realiza la PCR con ADN polimerasa de Taq del exterior con la condición de que la sonda marcada fluorescentemente esté completamente hibridada con el gen diana. Como resultado de la progresión de la reacción de prolongación mediante la acción de la ADN polimerasa de Taq, se hidroliza la sonda marcada fluorescentemente desde el terminal 5’ mediante la acción de la actividad exonucleasa, y luego se libera el colorante indicador para generar fluorescencia. En el procedimiento de PCR en tiempo real, se puede cuantificar con exactitud la cantidad inicial de molde de ADN mediante el control de la intensidad de la fluorescencia en tiempo real.
La sonda marcada con el colorante fluorescente (indicador) en el terminal 5’ y el colorante atenuador en el terminal 3’ usada en el sistema de detección PCR en tiempo real de la presente invención puede ser la sonda de la presente invención descrita anteriormente en la presente memoria, o se puede diseñar una sonda en base a la secuencia de tal sonda. Por ejemplo, se puede usar la secuencia descrita en SEC ID N.º 11 diseñada en base a la secuencia de SEC ID N.º 6. La sustancia fluorescente indicadora que se usa para marcar el terminal 5’ incluye FAM, HEX, TET, etc., y entre todos ellas, se prefiere FAM. El colorante atenuador que se usa para marcar el terminal 3’ incluye una sustancia fluorescente tal como TAMRA y una sustancia no fluorescente, tal como BHQ y DAVCYL, y entre ellas, se prefiere TAMPA.
El ejemplo preferible de cebador directo usado en el sistema de detección de PCR en tiempo real de la presente invención incluye un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis. Un ejemplo preferible de cebador inverso incluye un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3 o SEC ID N.º 4, o una parte o la totalidad de secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis.
Otros reactivos usados en el sistema de detección de PCR en tiempo real, tales como desoxirribonucleósido– trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y ADN polimerasa, pueden ser uno convencionalmente usado en la PCR en tiempo real, y es posible realizar un procedimiento de PCR en tiempo real según el protocolo común de PCR en tiempo real, con la excepción de usar el cebador y la sonda de la presente invención.
A continuación, se explicará un ejemplo ilustrativo del procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis conforme al sistema de detección de PCR en tiempo real (procedimiento PCR en tiempo real TagMan™) de la presente invención.
En primer lugar, según el procedimiento descrito anteriormente en la presente memoria, se obtiene una muestra de ADN purificado de la muestra en la que se va a detectar Mycobacterium tuberculosis. Por separado, se sintetizan un oligonucleótido que tenga la secuencia descrita en SEC ID N.º 1 (IS_F5) y un oligonucleótido que tenga la secuencia descrita en SEC ID N.º 3 (IS_R5) mediante el procedimiento de fosfoamidita usando un sintetizador de ADN según el procedimiento descrito anteriormente en la presente memoria.
La secuencia que se utiliza como sonda (SEC ID N.º 11) se diseña a partir de la secuencia de oligonucleótido de SEC ID N.º 6, que será amplificada mediante PCR usando IS_F5 e IS_R5 como cebador, y se sintetiza el oligonucleótido que tenga esta secuencia. Tras ello, se une el colorante indicador FAM con el terminal 5' del oligonucleótido, y se une el atenuador indicador TAMRA al terminal 3' del oligonucleótido mediante procedimientos convencionales para obtener la sonda marcada fluorescentemente.
La PCR en tiempo real se realiza usando, por ejemplo, IS_F5 preparado anteriormente en la presente memoria como cebador directo e IS_R5 como cebador inverso de la siguiente manera.
Concretamente, se preparan como solución de reacción 10mM de solución tamponadora Tris–HCl (pH 8,9) que contiene 11M de cada cebador IS_F5 e IS_R5; de 100 a 1000nM de sonda marcada fluorescentemente, de 1,0 a 4,0mM de MgCl2; 80mM de KCl; 500 1g/ml de ASB; 0,1% de colato de sodio; de 0,005 al 0,2% de Triton X–100; 0,2mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y de 10 a 80 unidades/ml de ADN polimerasa de Taq. Se usa una solución obtenida al añadir 1 ng de la muestra de ADN purificada a 20 1l de la solución de reacción como muestra para la PCR. Se añade la muestra para la PCR a la placa de reacción de 96 pocillos y se realiza la PCR en tiempo real usando el detector de PCR en tiempo real especificado en la PCR TagMan™. Se repite la reacción durante de 30 a 50 ciclos, y se mide la fluorescencia generada por el colorante indicador en cada ciclo.
En la determinación de Mycobacterium tuberculosis, cuando se mide la fluorescencia generada por el colorante indicador, es posible determinar la muestra como positiva en Mycobacterium tuberculosis.
Como es posible preparar una curva de calibración en el procedimiento de PCR en tiempo real, se puede obtener un número de ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis de la muestra (número de copias). Además, como el número es proporcional al número de Mycobacterium tuberculosis, se puede obtener un número de Mycobacterium tuberculosis de la muestra. La curva de calibración se puede preparar conforme al procedimiento convencional en el procedimiento de PCR en tiempo real. Por ejemplo, con la muestra de ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis que tiene un número de copias conocido, se prepara como patrón una muestra de ADN para la PCR con la concentración (número de copias) de las series de dilución. Posteriormente, se realiza la PCR en tiempo real según el procedimiento descrito anteriormente, usando la muestra de ADN para PCR en cada serie de dilución, y se mide el valor de fluorescencia generada por el colorante indicador. Para preparar una curva de amplificación, se representa el valor medido de fluorescencia (Rn, eje Y) frente a cada número de ciclo de la PCR (eje X) en cada muestra de ADN para la PCR de cada serie de dilución. Posteriormente, se selecciona la región Rn en la que el valor de la fluorescencia se amplifica exponencialmente, y se traza una línea umbral (Th). Se establece como ciclo umbral (Ct) el punto de cruce de Th con cada curva de amplificación de cada muestra de ADN para la PCR. Posteriormente, se representa el valor de Ct (eje Y) frente al logaritmo del número de copias de cada muestra de ADN usada para la PCR (eje X), pudiéndose usar la curva aproximada obtenida a cada Ct como curva de calibración.
Para determinar cuantitativamente el número de ADN genómico (número de copias) de Mycobacterium tuberculosis en la muestra, primero se aísla el ADN y se purifica de la muestra en la que se va a detectar Mycobacterium tuberculosis, y luego se realiza la PCR en tiempo real sobre la muestra de ADN obtenida, y se prepara la curva de amplificación mediante el mismo procedimiento mostrado anteriormente en la presente memoria. Se obtiene el valor de Ct que cruza el Th obtenido a partir de la curva de calibración con la curva de amplificación obtenida anteriormente. Se aplica tal valor Ct a la curva de calibración para obtener la cantidad de ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis de la muestra (número de copias de la muestra).
Además, es posible aplicar el procedimiento de detección utilizando el producto de la transcripción del ARN al procedimiento de amplificación de ácido nucleico de la presente invención. Por ejemplo, se pueden usar el procedimiento NASBA (amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos) (Documento de patente 12) y el procedimiento 3SR (replicación de secuencia autosostenida) (Documento de patente 13). Entre ellos, la amplificación de ácidos nucleicos a temperatura constante que utiliza la reacción concertada de la transcriptasa inversa y la ARN polimerasa es adecuada para el sistema de medición automático (la reacción se realiza en condiciones de reacción concertada con transcriptasa inversa y ARN polimerasa).
Además, el procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención incluye un procedimiento que comprende usar un oligonucleótido marcado con una sustancia de marcaje que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o la secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis (el oligonucleótido de la presente invención) como sonda marcada, hibridar la sonda marcada con el ácido nucleico de la muestra, retirar la sonda marcada libre y detectar la sustancia de marcaje del complejo hibridado.
Específicamente, por ejemplo, cabe mencionar (a) un procedimiento de detección en el que el oligonucleótido de la presente invención se une a un vehículo sólido para usarlo como sonda de captura, que se hibrida con el ácido nucleico de la muestra, de modo que el ácido nucleico obtenido de Mycobacterium tuberculosis de la muestra se inmoviliza sobre la fase sólida (p. ej., a lo que se hace referencia en la descripción del Documento de patente 15); y
(b) un procedimiento para realizar un análisis de tipo sándwich en el que, con el uso de la sonda de captura del apartado (a) anterior y la sonda marcada de la presente invención, el ácido nucleico de la muestra se hibrida con la misma para formar un complejo de sonda de captura, del ácido nucleico obtenido de Mycobacterium tuberculosis y de la sonda marcada sobre el vehículo sólido, para medir el marcaje de la sonda marcada (p.ej., al que se hace referencia en la descripción del Documento de patente 14). Además, también se puede usar (c), un procedimiento en el que tras la hibridación del ácido nucleico de la muestra con la sonda marcada de la presente invención con una biotina, se captura el ácido nucleico de la muestra mediante un vehículo unido a avidina.
Como reactivos usados para el procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención, se pueden usar los reactivos usados convencionalmente en este campo. Por ejemplo, agentes estabilizadores, tales como agentes de tamponamiento y conservantes que no inhiban la estabilidad de los reactivos coexistentes o que no inhiban la reacción de PCR ni de hibridación. Además, su concentración se puede seleccionar preferiblemente del intervalo de concentraciones usado convencionalmente en este campo.
El ejemplo específico de solución tamponadora incluye todas las soluciones tamponadoras usadas en la realización de la reacción PCR y de hibridación convencionales, siendo, por ejemplo, tampón Tris, tampón de fosfato, tampón de veronal, tampón de borato y tampón de Good, y su pH no está particularmente determinado, estando preferiblemente en un intervalo de pH 5 a 9 en general.
Además, si fuera necesario, se podrían usar polimerasa de ácido nucleico (ADN polimerasa, ARN polimerasa, transcriptasa inversa, etc.), sustratos de las correspondientes enzimas (dNTP, rNTP, etc.), agentes de intercalación bicatenarios (bromuro de etidio, verde SYBR™, etc.) o sustancias de detección mediante marcaje, tales como FAM y TAMRA.
El ejemplo de kit para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención incluye “un kit para detectar Mycobacterium tuberculosis que comprende un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, como cebador (el cebador de la presente invención)”. El cebador se puede marcar con una sustancia de marcaje.
El kit anteriormente mencionado puede comprender el oligonucleótido de la presente invención marcado con una sustancia de marcaje como una sonda marcada.
Además, el kit anteriormente mencionado incluye “un kit que comprende como reactivos constituyentes: (1) un cebador directo que es un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o la secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, y (2) un cebador inverso que es un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3 o SEC ID N.º 4, o una parte o la totalidad de una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis”.
El kit anterior puede comprender además el oligonucleótido de la presente invención marcado con una sustancia de marcaje como sonda marcada.
Además, el equipo anterior incluye “un equipo para detectar Mycobacterium tuberculosis que comprende el oligonucleótido de la presente invención como sonda”. La sonda se puede marcar con una sustancia de marcaje.
Las realizaciones preferibles y los ejemplos específicos de los reactivos que constituyen estos kits son como se describen anteriormente en la presente memoria.
Además, el kit de reactivos para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención puede contener, por ejemplo, agentes estabilizadores, tales como agentes de tamponamiento y conservantes que no inhiban la estabilidad de los reactivos coexistentes y que no inhiban la reacción PCR ni la hibridación. Su concentración se puede seleccionar preferiblemente del intervalo de concentraciones usado convencionalmente en este campo.
El ejemplo específico de solución tamponadora incluye todas las soluciones tamponadoras usadas en la realización de la reacción PCR y de hibridación convencionales, siendo, por ejemplo, tampón Tris, tampón de fosfato, tampón de veronal, tampón de borato y tampón de Good, y su pH no se especifica concretamente, estando, en general, preferiblemente en un intervalo de pH de 5 a 9. Además, si fuera necesario, puede contener polimerasa de ácido nucleico (ADN polimerasa, ARN polimerasa, transcriptasa inversa, etc.), sustratos enzimáticos (dNTP, rNTP), agentes de intercalación bicatenarios (bromuro de etidio, verde SYBR™, etc.) o sustancias de detección mediante marcaje, tales como FAM y TAMRA.
A continuación, la presente invención se explica más detalladamente. Los ejemplos que no pertenecen al alcance de las reivindicaciones se mantuvieron a efectos ilustrativos.
Ejemplo 1
- (1)
- Síntesis del cebador de la PCR para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se sintetizaron un oligonucleótido que tenía una secuencia descrita en SEC ID N.º 2 (ACCTCACCTATGTGTCGACC, denominado de aquí en adelante IS_F6) y un oligonucleótido que tenía una secuencia descrita en SEC ID N.º 4 (AACGTCTTTCAGGTCGAGTACG, denominado de aquí en adelante IS_R6) según el procedimiento de la fosfoamidita usando el sintetizador de ADN de ABI Tipo 392. La síntesis se realizó según el procedimiento descrito en el manual de ABI Inc., y se realizó la desprotección de cada tipo de oligonucleótido mediante el procedimiento de calentamiento de una solución de amoniaco del oligonucleótido a 550C durante una noche. Posteriormente, se purificaron los oligonucleótidos sintetizados usando una cromatografía en columna de intercambio aniónico con HFPLC de Pharmacia Corp.
- (2)
- Preparación de muestras
Con las bacterias mostradas a continuación en la presente memoria, se extrajo el ADN y se purificó mediante los siguientes procedimientos para obtener las muestras de ADN. Todas las bacterias eran aislados clínicos y sus especies ya habían sido diferenciadas tras su cultivo en forma de colonias, las pruebas bioquímicas convencionales, etc.
Respecto a las bacterias pertenecientes al género Mycobacterium, se suspendieron colonias en medio de Ogawa en agua purificada, se introdujeron en un autoclave (a 1200C durante 20 minutos bajo 2 presiones atmosféricas), luego se perturbaron las células bacterianas (mediante ruptura física con perlas de vidrio de 2 mm de diámetro) y se centrifugaron para obtener un sobrenadante. La extracción y purificación del ADN del sobrenadante obtenido se realizaron usando Genomic–tip (un kit para la extracción y purificación de ADN, tipo de resina de intercambio iónico, QIAGEN Inc.). Con respecto a Escherichia coli, el ADN se extrajo y se purificó según el procedimiento de extracción de ADN convencional para Escherichia coli.
Se preparó el ADN purificado así obtenido para producir una concentración final de 1 ng/1l (tampón de Tris–HCl 10mM, pH 8,9) y se usó como muestra de ADN.
a: Escherichia coli
b: Mycobacterium tuberculosis
c: Mycobacterium kansasii
d: Mycobacterium marinum
e: Mycobacterium simiae
f: Mycobacterium scrofulaceum
g: Mycobacterium gordonae
h: Mycobacterium szulgai
i: Mycobacterium avium
j: Mycobacterium intracellulare
k: Mycobacterium gastri
l: Mycobacterium xenopi
m: Mycobacterium nonchromogenicum
n: Mycobacterium terrae
o: Mycobacterium triviale
p: Mycobacterium fortuitum
q: Mycobacterium chelonei
r: Mycobacterium abscessus
s: Mycobacterium peregrinum
(3) PCR
Se usó el IS_F6 preparado en el apartado (1) anterior como cebador directo y el IS_R6 preparado en el apartado (1) anterior se usó como cebador inverso, y la PCR se realizó de la siguiente manera.
En primer lugar, como solución de reacción para la PCR, se prepararon 10mM de tampón Tris–HCl (pH 8,9) que contenía 11M de cada cebador IS_F6 e IS_R6, 1,5mM de MgCl2, 80mM de KCl, 500 1g/ml de ASB, colato de sodio al 0,1%, 0,1% de Triton X–100 (polioxietilenoctilfeniléter, nombre comercial, Rohm and Haas Co.), 0,2mM de cada uno entre dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y 40 unidades/ml de ADN polimerasa de Taq (Nippon Gene Co. Ltd.).
Como muestra para la PCR, se usó una solución obtenida al añadir 1 ng de la muestra de ADN a 20 1l de la solución de reacción para la PCR, y se realizaron 30 ciclos de PCR con el termociclador de ADN (DNA Engine PTC200) de
M.J. Research en las siguientes condiciones de reacción. Condiciones de la reacción PCR: Desnaturalización térmica: 940C, 0,5 minutos Apareamiento: 550C, 1 minuto Reacción de polimerización: 750C, 0,5 minutos
- (4)
- Detección
Se sometieron a electroforesis los 5 1l de la solución de reacción obtenidos mediante PCR en el apartado (3) anterior usando gel de agarosa al 1,5%. Las condiciones eléctricas de la electroforesis fueron de un voltaje constante de 100 V durante 30 minutos. El procedimiento operativo y otras condiciones se realizaron conforme al procedimiento de uso extendido descrito en "Bio–Experiments Illustrated”, Vol. 2, p. 53–63 (por Nakayama Hiroki, Shujunsha Co. Ltd.). Posteriormente, tras tratar con tinción de bromuro de etidio, se detectó la fluorescencia inducida por radiación ultravioleta usando el dispositivo de imágenes de muestras por UV, el sistema FAS–III (Toyobo Co. Ltd.): Se sometió el marcador del peso molecular a electroforesis simultáneamente junto con la solución de reacción y se calculó la longitud de la fracción de ADN detectada mediante la comparación con estas velocidades de migración relativas. Se usó el digesto X 174/HacIII (marcador 4, Nippon Gene Co. Ltd) como marcador del peso molecular.
- (5)
- Resultados En la Fig. 1, se muestran los resultados así obtenidos por electroforesis.
En la Fig. 1, el número de cada carril muestra los resultados obtenidos mediante el uso de las siguientes mezclas, respectivamente.
M4: Marcador del peso molecular (marcador 4)
a: Escherichia coli
b: Mycobacterium tuberculosis
c: Mycobacterium kansasii
d: Mycobacterium marinum
e: Mycobacterium simiae
f: Mycobacterium scrofulaceum
g: Mycobacterium gordonae
h: Mycobacterium szulgai
i: Mycobacterium avium
j: Mycobacterium intracellulare
k: Mycobacterium gastri
l: Mycobacterium xenopi
m: Mycobacterium nonchromogenicum
n: Mycobacterium terrae
o: Mycobacterium triviale
p: Mycobacterium fortuitum
q: Mycobacterium chelonei
r: Mycobacterium abscessus
s: Mycobacterium peregritium
Se predijo la amplificación del fragmento de ADN de 182 pares de bases (SEC ID N.º 7) de la secuencia de ácido nucleico de IS6110 como resultado de la PCR usando IS_F6 como cebador directo e IS_R6 como cebador inverso. Por consiguiente, se determinó como positiva una muestra en la que se confirmó la banda fluorescente correspondiente a 182 pares de bases.
Como resulta evidente al observar los resultados de la Fig. 1, como resultado de realizar la PCR usando el cebador IS_F6 y el cebador IS_R6 de la presente invención, sólo cuando se usó Mycobacterium tuberculosis con muestra (b), se puedo confirmar una banda fluorescente de 182 pares de bases, determinándose la muestra como positiva. Por el contrario, cuando se usaron otras especies bacterianas del género Mycobacterium y una bacteria de otro género, Escherichia coli, como muestras (a y c a s), no se pudo confirmar la correspondiente banda fluorescente, siendo por consiguiente, estas muestras determinadas como negativas.
A partir de los resultados anteriores, se entiende que es posible detectar específicamente Mycobacterium tuberculosis mediante el uso del oligonucleótido de la presente invención como cebador en la PCR. Además, como se puede esperar una detección de alta sensibilidad mediante un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos tal como la PCR, no es necesario realizar un procedimiento de aislamiento de las bacterias, pudiéndose usar las muestras clínicas directamente para la detección. Por consiguiente, la detección de Mycobacterium tuberculosis, que, en el procedimiento convencional de detección, requiere varias semanas de cultivo tras el cultivo de las bacterias, se puede completar en un día como máximo.
Ejemplo 2
- (1)
- Síntesis del cebador de la PCR para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se sintetizaron un oligonucleótido que tenía la secuencia descrita en SEC ID N.º 1 (TGGGTAGCAGACCTCACCTAT, de aquí en adelante, denominado IS_F5) y un oligonucleótido que tenía la secuencia descrita en SEC ID N.º 3 (CGAGTACGCTTTCTTGTTGG, de aquí en adelante, denominado IS_R5) mediante el mismo procedimiento del Ejemplo 1 usando el mismo equipo del Ejemplo 1.
- (2)
- Preparación de muestras Se usaron las muestras de ADN obtenidas en el Ejemplo 1 (2).
- (3)
- PCR
Se usó el IS_F5 preparado en el apartado (1) anterior como cebador directo y el IS_R5 preparado en el apartado (1) anterior, como cebador inverso, y la PCR se realizó como se explica a continuación.
En primer lugar, como solución de reacción para la PCR, se prepararon 10mM de tampón Tris–HCl (pH 8,9) que contenía 11M de cada cebador IS_F5 e IS_R5, 1,5mM de MgCl2, 80mM de KCl, 500 1g/ml de ASB, 0,1% de colato de sodio, 0,1% de Triton X–100, 0,2mM de cada uno entre dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y 40 unidades/ml de ADN polimerasa de Taq (Nippon Gene Co. Ltd.).
Como muestra para la PCR, se usó una solución obtenida mediante la adición de 1 ng de muestra de ADN a 20 1l de
la solución de reacción para PCR, y se realizó la PCR mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1(3),
usando el mismo equipo del Ejemplo 1(3) en las mismas condiciones de reacción.
- (4)
- Detección
La detección se realizó mediante el mismo procedimiento del Ejemplo 1(4). Es decir, electroforesis con agarosa al
1,5%, tinción de bromuro de etidio y detección de fluorescencia inducida por ultravioleta.
- (5)
- Resultados
En la Fig. 2, se muestran los resultados así obtenidos por electroforesis. En la Fig. 2, el número de cada carril
muestra los resultados obtenidos mediante el uso de las siguientes mezclas, respectivamente.
M4: Marcador del peso molecular (marcador 4)
a: Escherichia coli
b: Mycobacterium tuberculosis
c: Mycobacterium kansasii
d: Mycobacterium marinum
e: Mycobacterium simiae
f: Mycobacterium scrofulaceum
g: Mycobacterium gordonae
h: Mycobacterium szulgai
i: Mycobacterium avium
j: Mycobacterium intracellulare
k: Mycobacterium gastri
l: Mycobacterium xenopi
m: Mycobacterium nonchromogenicum
n: Mycobacterium terrae
o: Mycobacterium triviale
p: Mycobacterium fortuitum
q: Mycobacterium chelonei
r: Mycobacterium abscessus
s: Mycobacterium peregrinum
Según los resultados de la PCR usando el cebador directo IS_F5 y el cebador inverso IS_R5, se puede predecir que hay un fragmento de ADN amplificado de 178 pares de bases (SEC ID N.º 6) en la secuencia de ácido nucleico de IS6110. Por consiguiente, se determinó como positiva una muestra en la que se confirmó la banda fluorescente correspondiente a 178 pares de bases.
Ejemplo comparativo 1
La detección de Mycobacterium tuberculosis se realizó mediante un procedimiento de detección en el que se usó una secuencia de cebador preparada en base a la secuencia de IS6110 conocida públicamente (JP–A–11–514522, Documento de patente 11).
(1) Síntesis del cebador de la PCR para detectar Mycobacterium tuberculosis
Entre las secuencias de cebador reveladas en el documento JP–A–11–514522, se sintetizaron un oligonucleótido que tenía la secuencia de "TTCGGACCACCAGCACCTAACC" (SEC ID N.º 9, denominado de aquí en adelante IS_F2) y un oligonucleótido que tenía la secuencia de "CCTTCTTGTTGGCGGGTCCAG" (SEC ID N.º 10, denominado de aquí en adelante IS_R2).
La síntesis se realizó mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1(1).
- (2)
- Preparación de muestras Se usaron las muestras de ADN obtenidas en el Ejemplo 1 (2).
- (3)
- PCR
Se usó el IS_F2 preparado en el apartado (1) anterior como cebador directo y el IS_R2 preparado en el apartado (1) anterior, como cebador inverso, y la PCR se realizó como se explica a continuación.
En primer lugar, como solución de reacción para la PCR, se prepararon 10mM de tampón Tris–HCl (pH 8,9) que contenía 11M de cada cebador IS_F2 e IS_R2, 1,5mM de MgCl2, 80mM de KCl, 500 1g/ml de ASB, 0,1% de colato de sodio, 0,1% de Triton X–100, 0,2mM de cada uno entre dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y 40 unidades/ml de ADN polimerasa de Taq (Nippon Gene Co. Ltd.).
Como muestra para la PCR, se usó una solución obtenida mediante la adición de 1 ng de muestra de ADN a 20 1l de la solución de reacción para PCR, y se realizó la PCR con el mismo equipo usado en el Ejemplo 1(3) en las mismas condiciones de reacción.
(4) Detección
La detección se realizó mediante el mismo procedimiento del Ejemplo 1(4). Es decir, electroforesis con agarosa al 1,5%, tinción de bromuro de etidio y detección de fluorescencia inducida por ultravioleta. Se usaron el digesto AlHindIII (marcador 1) (carril M1) Yel digesto X174lHae III (marcador 4) (Nippon gene Co. Ltd.) como marcadores del peso molecular.
(5) Resultados
En la Fig. 3–1, se muestran los resultados así obtenidos por electroforesis.
En la Fig. 3–1, el número de cada carril muestra los resultados obtenidos mediante el uso de las siguientes
muestras, respectivamente.
M1: Marcador del peso molecular (marcador 1)
M4: Marcador del peso molecular (marcador 4)
a: Escherichia coli
b: Mycobacterium tuberculosis
c: Mycobacterium kansasii
d: Mycobacterium marinum
e: Mycobacterium simiae
f: Mycobacterium scrofulaceum
g: Mycobacterium gordonae
h: Mycobacterium szulgai
5 i: Mycobacterium avium
j: Mycobacterium intracellulare
k: Mycobacterium gastri
l: Mycobacterium xenopi
m: Mycobacterium nonchromogenicum
10 n: Mycobacterium terrae
o: Mycobacterium triviale
p: Mycobacterium fortuitum
q: Mycobacterium chelonei
r: Mycobacterium abscessus
15 s: Mycobacterium peregrinum
Según los resultados de la PCR duplicada usando el cebador directo IS_F2 y el cebador inverso IS_R2, se puede predecir que hay un fragmento de ADN amplificado de 197 pares de bases (SEC ID N.º 6) en la secuencia de ácido nucleico de IS6110. Por consiguiente, se determinó como positiva una muestra en la que se confirmó la banda fluorescente correspondiente a 197 pares de bases. Como resulta evidente al observar los resultados de la Fig. 2 20 obtenidos en el Ejemplo 2, como resultado de realizar la PCR usando el cebador IS_F5 y el cebador IS_R5 de la presente invención, sólo cuando se usó Mycobacterium tuberculosis con muestra (b), se pudo confirmar una banda fluorescente de 178 pares de bases y determinar la muestra como positiva. Por el contrario, cuando se usaron otras especies bacterianas del género Mycobacterium y una bacteria de otro género, Escherichia coli, como muestras (a y c a s), no se pudo confirmar la correspondiente banda fluorescente, y por consiguiente, estas muestras se
25 determinaron como negativas.
Por el contrario, como es obvio según los resultados de la Fig. 3–1 obtenidos en el Ejemplo comparativo 1, como resultado de realizar la PCR con el cebador IS_F2 y el cebador IS_R2, que son cebadores conocidos públicamente, fue posible determinar la muestra como positiva al usar Mycobacterium tuberculosis como muestra. Sin embargo, en otros casos, por ejemplo, cuando se usó Mycobacterium nonchromogenicum como muestra (m) y cuando se usó 30 Mycobacterium triviale como muestra (o), se observaron bandas aparentes, siendo estas muestras también determinadas como falsos positivos. En la Fig. 3–1, se muestra con un círculo de puntos la banda obtenida mediante el uso de la muestra de Mycobacterium nonchromogenicum (m). La banda obtenida usando la muestra de Mycobacterium triviale (o) se muestra con el círculo de puntos señalado con la flecha. Concretamente, se entiende que la detección específica de Mycobacterium tuberculosis es difícil mediante el procedimiento del Ejemplo
35 comparativo 1.
A partir de los resultados obtenidos mediante electroforesis en el Ejemplo comparativo 1, se advirtió, en particular, el resultado obtenido usando la muestra de Mycobacterium triviale (o), que se determinó como muy similar en tamaño del fragmento amplificado a la banda positiva de Mycobacterium tuberculosis. En la Fig. 3–1, se indica la banda con una flecha. Para seguir analizando este producto de la PCR, se cortó el producto de la PCR de la fracción sometida
40 a electroforesis y se purificó el ADN. Se analizó su secuencia mediante el procedimiento de secuenciación directa de PCR usando el kit Sequence de ABI Inc.
En la Fig. 3–2, se muestra la secuencia obtenida. Entre las secuencias mostradas en la Fig. 3–2, la secuencia del producto de la PCR derivado la muestra de de Mycobacterium tuberculosis de la fracción (b) está designada por la 1ª secuencia de nucleótidos, que se muestra en la parte superior del listado de secuencias (SEC ID N.º 12). Además, la
45 secuencia del producto de la PCR obtenido de la muestra de Mycobacterium triviale de la fracción (o) está designada por 2ª secuencia de nucleótidos, y se muestra en la parte inferior de este listado de secuencias (SEC ID N.º 13).
Como resultado del análisis secuencial del fragmento de ADN, se confirma que esta secuencia es la secuencia de ácido nucleico derivada de Mycobacterium triviale y se confirma que es idéntica a la secuencia de ácido nucleico de IS6110 específica de Mycobacterium tuberculosis sólo en la región de la secuencia que corresponde al cebador IS_F2 y al cebador IS_R2 usados en el Ejemplo comparativo 1. Por consiguiente, se entiende que cuando se realiza la PCR usando los cebadores públicamente conocidos IS_F2 e IS_R2, también se amplifica una secuencia de ácido nucleico distinta de Mycobacterium tuberculosis y que, por tanto, el cebador tiene un defecto obvio en su diseño.
Teniendo en cuenta lo anterior, se entiende que se puede excluir la consideración del falso positivo, y que es posible detectar Mycobacterium tuberculosis de manera específica y precisa en comparación con los cebadores convencionales y el procedimiento de detección de Mycobacterium tuberculosis usando los cebadores, cuando la detección de Mycobacterium tuberculosis se realiza mediante PCR con el oligonucleótido de la presente invención como cebador. En este aspecto, el procedimiento de la presente invención es sumamente superior en comparación con el procedimiento de detección de Mycobacterium tuberculosis que usa los cebadores convencionales.
Ejemplo 3
Detección de Mycobacterium tuberculosis mediante un sistema de amplificación de PCR en tiempo real
- (1)
- Síntesis del cebador de la PCR para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se sintetizaron los oligonucleótidos de IS_F5 e IS_R5 mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, usando el mismo equipo que en el Ejemplo 1(1).
- (2)
- Preparación de sonda para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se diseñó una secuencia de "ACCGACGCCTACGCTCGCAG" para utilizarla como sonda a partir de la secuencia de oligonucleótido de SEC ID N.º 6, que sería amplificada por PCR usando IS_F5 e IS_R5 como cebadores, y luego se sintetizó el oligonucleótido que tenía esta secuencia (denominado de aquí en adelante IS_F5R5_FANTAM, SEC ID N.º 11). Se ligó el colorante indicador FAM al terminal 5’ de este oligonucleótido y se ligó el indicador atenuador TAMRA al terminal 3’ para obtener una sonda de oligonucleótido marcada (sonda marcada fluorescente TaqMan™, Applied Biosystems Japan Inc.).
- (3)
- Preparación de la muestra de ADN para la PCR
Con respecto a la muestra de ADN obtenida de Mycobacterium tuberculosis, preparada en el Ejemplo 1(2), se midió una cantidad de ADN de la muestra midiendo la absorbancia. Se determinó la cantidad de ADN genómico (número de copias del genoma) comparando la cantidad de ADN obtenido con la cantidad conocida del ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis. Se obtuvo ADN genómico que tenía 108 copias/1l.
Posteriormente, se diluyó la muestra de ADN para dar series de dilución de 105, 104, 103, 102, 10, 5 y 2 copias/1l usando 10mM de tampón Tris–HCl, pH 8,9 para preparar las muestras de ADN para la PCR.
- (4)
- PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real se realizó usando el IS_F5 preparado anteriormente en la presente memoria en el apartado
- (1)
- como cebador directo e IS_R5 preparado anteriormente en el apartado (1) como cebador inverso de la siguiente manera.
En concreto, como solución de reacción, se prepararon 10mM de tampón Tris–HCl (pH 8,9) que contenía 11M de cada cebador IS_F5 e IS_R5, 195nM de sonda marcada fluorescente IS_F5R5FAMTAM preparada en (1) anterior, 1,5mM de MgCl2, 80mM de KCl, 500 1g/ml de ASB, 0,1% de colato de sodio, 0,1% de Triton X–100, 0,2mM de cada uno entre dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y 40 unidades/ml de ADN polimerasa de Taq (Nippon Gene Co. Ltd). Como muestra para la PCR, se usó una solución preparada mediante la adición de 1 ng de la muestra de ADN de cada serie de dilución a 20 1l de la solución de reacción. Se añadió la muestra para la PCR al pocillo de una placa de reacción de 96 pocillos (placa de reacción de 96 pocillos MicroAmp Optical, Applied Biosystems Japan, Inc.) y se realizó la PCR en tiempo real usando el termociclador -sistema de detección de secuencias especificado para la PCR TagMan™ (ABI7000, Applied Biosystems Japan, Inc.). Las condiciones de los ciclos de la PCR fueron 95
0C durante 10 minutos para mantener el calor, seguidos por 50 ciclos de reacción a 950C durante 15 segundos Y a 600C durante 1 minuto, con la medición del valor de fluorescencia generado por el colorante indicador en cada ciclo. Se midió el valor de fluorescencia en cada uno de los pocillos de la placa de reacción de 96 pocillos usando la función del termiciclador usado en la medición para digitalizar la proporción relativa de la intensidad de fluorescencia.
(5) Resultados y análisis Se preparó la curva de calibración según el procedimiento convencional usado en la PCR en tiempo real. Concretamente, para preparar una curva de amplificación, se representa el valor de la fluorescencia generada por el colorante indicador (Rn, eje Y) frente a cada número de ciclo de la PCR (eje X) en cada muestra de ADN para la PCR. Posteriormente, se seleccionó la región Rn en la que el valor de la fluorescencia se amplificó exponencialmente, y se trazó una línea umbral (Th). Se estableció como ciclo umbral (Ct) el punto de cruce con Th y el valor de fluorescencia de cada muestra de ADN para la PCR. Se representó el valor Ct (eje Y) frente al número de copias del genoma de cada muestra de ADN para la PCR (eje X, valor logarítmico), y como curva de calibración, se usó la curva aproximada obtenida con respecto a cada valor Ct . En la Fig. 4, se muestra la curva de calibración obtenida.
y = –3,555x + 39,13
R2 = 0,996
A partir de los resultados anteriores, como se detectó fluorescencia en la PCR en tiempo real, se entiende que es posible detectar Mycobacterium tuberculosis con el uso del oligonucleótido de la presente invención como cebador en la PCR, el diseño de la sonda marcada de la secuencia de la región de amplificación y la realización de la PCR en tiempo real.
Además, como se pudo preparar la curva de calibración, se entiende que es posible determinar cuantitativamente Mycobacterium tuberculosis aplicando la PCR en tiempo real con el uso del cebador y la sonda de la presente invención. Además, observando la Fig. 4, se entiende que es posible detectar Mycobacterium tuberculosis mediante la PCR en tiempo real con el uso del cebador y la sonda de la presente invención, incluso en caso de que sólo existan dos copias de ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis como nivel inicial. Además, cuando se utiliza la PCR en tiempo real, es posible determinar cuantitativamente un nivel inicial de un molde de ADN con exactitud mediante la monitorización de la intensidad de la fluorescencia en tiempo real y, por tanto, el procedimiento es eficaz para detectar Mycobacterium tuberculosis.
Ejemplo 4
Se intentó realizar un diagnóstico simultáneo (diagnóstico selectivo) entre la micobacteriosis tuberculosa y la no tuberculosa (NTM) utilizando Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium avium (M. avium), Mycobacterium intracellulare (M. intracellulare) o Mycobacterium kansasii (M. kansasii) mediante PCR multiplex, que fue un procedimiento que amplificó simultáneamente múltiples fragmentos en un solo tubo usando varios pares del cebador.
- (I)
- Síntesis del cebador
- (i)
- Síntesis del cebador de la PCR para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se prepararon IS_F5 (SEC ID N.º 1) E IS_R6 (SEC ID N.º 4) mediante el mismo procedimiento del Ejemplo 1 (1), y se usaron como cebador directo y cebador inverso.
- (ii)
- Síntesis de cebador de la PCR para detectar M. avium
Se prepararon MAV19K F1 (CGGCTGTTCGAGTGGCAACAAGTC mostrada como SEC ID N.º 15 en la presente memoria, denominado de aquí en adelante "cebador directo para detectar M. avium") y MAV19K R1 (CCGTCGATGATGACCTTGGTCCC mostrada como SEC ID N.º 16 en la presente memoria, denominado de aquí en adelante "cebador inverso para detectar M. avium"), que eran "los cebadores de oligonucleótido específicos de la región genética de la proteína de 19 kDa de avium" descritos en la reivindicación 5 del documento JP–A–11–69999, mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1 (1), y se usaron como cebador directo y cebador inverso.
(iii) Síntesis de cebador de PCR para detectar M. intracellulare
La secuencia rps1 F1 (CGGGACAAGGTCGCCAAGGTCAAGA mostrada como SEC ID N.º 17 en la presente memoria, denominada de aquí en adelante "cebador directo para detectar M. intracellulare") y la secuencia rpsl R1 (GGGATGTAGGCCGTCACCTCAAC mostrada como SEC ID N.º 18, denominada de aquí en adelante "cebador inverso para detectar M. intracellulare"), que eran “los cebadores de oligonucleótido específicos de la región genética de la proteína ribosómica intracelular s1" descritos en la reivindicación 6 del documento JP–A–11–69999, mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1 (1), y se usaron como cebador directo y cebador inverso.
(iv) Síntesis de cebador de la PCR para detectar M. kansasii
Se prepararon la secuencia (GTCCCTGGCTGCTCTTGA mostrada como SEC ID N.º 19 en la presente memoria, denominada de aquí en adelante "cebador directo para detectar M. kansasii"), que era la secuencia en la que se desplazó una base en sentido 5’ en el cebador 15 y que se denomina secuencia KATS2 de M. kansasii descrita en la
Fig. 1 del documento JP–A–11–155589, y el cebador E3 (GCTGGTGGAGATGGAGATGTT mostrada como SEC ID N.º 20 de la presente memoria, denominado en lo sucesivo "cebador inverso para detectar M. kansasii"), mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1 (1), y se usaron como cebador directo y cebador inverso.
- (2)
- Preparación de muestras
Se usaron las muestras de ADN de Mycobacterium tuberculosis, M. avium, M intracellulare y M kansasii obtenidas en el Ejemplo 1 (2).
- (3)
- PCR
Se preparó una solución que contenía 11M de cada concentración final del cebador directo y el cebador inverso sintetizados anteriormente en la presente memoria (1), 10mM de Tris–HCl (pH 8,9), 1,5mM de MgCl2, 80mM de KCl, 500 1g/ml de ASB, 0,1% de colato de sodio, 0,1% de Triton X–100, 0,2mM de cada uno entre dATP, dCTP, dGTP, dTTP y 40 unidades/ml de polimerasa de Taq (Nippon Gene Co. Ltd.), y se usó como solución de reacción para la PCR. Se prepararon las muestras para PCR (1) a (7) añadiendo 1 1l (0 a 1.000 copias) de cada una de las muestras de ADN a 20 1l de la solución de reacción para PCR como se muestra en la Tabla 1 que figura a continuación, y se realizó la PCR para cada muestra usando el mismo equipo usado en el Ejemplo 1(3) en las mismas condiciones de reacción. A este respecto, en la Tabla 1, los términos avium, intracellulare y kansasii indican M. avium, M. intracellulare y M. kansasii, respectivamente. Del mismo modo, X indica sin adición de muestra de ADN; O indica con adición de muestra de ADN; y el número entre paréntesis de debajo de la marca O indica la concentración de la muestra de ADN añadida (número de copias).
(Tabla 1)
- Adición de muestra de ADN
- Muestra de ADN
- (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)
- O
- O
- O
- O
- kansasii
- X X X
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- O
- O
- O
- O
- M. tuberculosis
- X X X
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- O
- O
- O
- O
- Intracellulare
- X X X
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- O
- O
- O
- O
- avium
- X X X
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- (1.000 copias)
- (4)
- Detección
La detección se realizó mediante el mismo procedimiento del Ejemplo 1(4). Es decir, electroforesis con agarosa al 1,5%, tinción de bromuro de etidio y detección de fluorescencia inducida por ultravioleta.
- (5)
- Resultados
En la Fig. 5, se muestran los resultados así obtenidos por electroforesis. En la Fig. 5, el número de cada carril muestra los resultados obtenidos usando cada uno de los 7 tipos de muestra de ADN (1) a (7) de la Tabla 1 expuesta anteriormente. Además, cuando está presente la muestra de ADN obtenida de Mycobacterium tuberculosis en la muestra de ADN, se predice la obtención del producto de amplificación de 193 pb en la PCR usando los cebadores IS_F5 e IS_R6. Cuando está presente la muestra de ADN obtenida de M. avium en la muestra de ADN, se predice la obtención de un producto de amplificación de 106 pb en la PCR usando el cebador directo para detectar M. avium y el cebador inverso para detectar M. avium. Cuando está presente la muestra de ADN obtenida de M. intracellulare en la muestra de ADN, se predice la obtención de un producto de amplificación de 160 pb en la PCR usando el cebador directo para detectar M. intracellulare y el cebador inverso para detectar M. intracellulare. Cuando está presente la muestra de ADN obtenida de M. kansasii en la muestra de ADN, se predice la obtención de un producto de amplificación de 235 pb en la PCR usando el cebador directo para detectar M. kansasii y el cebador
inverso para detectar M. kansasii. Por lo tanto, en el lado de los patrones electroforéticos de la Fig. 5, se muestra el orden de aparición de cada fracción del producto de amplificación, junto con el sentido de la migración electroforética. Cada uno de los términos, "kansasii", "TB", "intra" y "avium" indica M. kansasii, M. tuberculosis, M. intracellulare y M avium, respectivamente.
Como resulta evidente al observar la Fig. 5, cuando se realizó la PCR añadiendo al mismo tiempo todas las muestras de ADN obtenidas de M. tuberculosis, M avium, M. intracellulare y M. kansasii en un solo tubo, se pudieron confirmar las cuatro bandas fluorescentes correspondientes a los productos amplificados, cuya amplificación fue predicha cuando las correspondientes células bacterianas estuvieron presentes (carriles (2) y (5)). Como la banda de Mycobacterium tuberculosis se confirmó en el carril (5), se descubrió que incluso cuando la concentración de muestra de ADN era del 1/100 de la del carril (2), se pudo detectar Mycobacterium tuberculosis con una alta sensibilidad. Cuando se realizó la PCR usando sólo la muestra de ADN derivada de Mycobacterium tuberculosis, incluso estando presentes los cebadores para detectar M. avium, M. intracellulare y M. kansasii, sólo se confirmó la banda fluorescente correspondiente a 193 pb que corresponde a un producto de la reacción PCR en la que se usan IS_F5 e IS_R6, que son los cebadores para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención (carril (3)). Por el contrario, cuando se realizó la PCR usando muestras que no contenían la muestra de ADN obtenida de Mycobacterium tuberculosis (carriles (4) y (6)), se pudieron observar la banda fluorescente correspondiente a 106 pb obtenida de la PCR en la que se usaron los cebadores directo e inverso para detectar M. avium, la banda fluorescente correspondiente a 160 pb obtenida de la PCR en la que se usaron los cebadores directo e inverso para detectar M. intracellulare y la banda fluorescente correspondiente a 235 pb obtenida de la PCR en la que se usaron de los cebadores directo e inverso para detectar M. kansasii al realizar la PCR usando cada una de las respectivas muestras de ADN. Sin embargo, no se pudo detectar la banda fluorescente correspondiente a 193 pb, que fue observada cuando Mycobacterium tuberculosis estuvo presente.
Como resulta evidente a partir de lo anterior, se entiende que es posible la detección específica de Mycobacterium tuberculosis mediante el uso del cebador de la presente invención, incluso aún estando presentes las muestras de ADN derivadas de varias clases de bacterias en un único tubo. Además, al realizar la PCR con un solo tubo se pudo detectar simultáneamente el ADN genómico obtenido de cada una de las cuatro bacterias causantes, i.e., Mycobacterium tuberculosis, el grupo MAC (M. avium y M. intracellulare), que son las bacterias causantes de la micobacteriosis no turberculosa y M. kansasii.
Ejemplo 5
Se intentó realizar un diagnóstico simultáneo (diagnóstico selectivo) entre la micobacteriosis tuberculosa y la no tuberculosa (NTM) realizando la PCR multiplex con el uso de la sonda marcada fluorescente en la amplificación por PCR en tiempo real. El objeto del diagnóstico son Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium (M. avium), Mycobacterium intracellulare (M. intracellulare) y Mycobacterium kansasii (M. kansasii).
- (1)
- Cebador para la PCR
- (i)
- Cebador de la PCR para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se prepararon IS_F5 (SEC ID N.º 1) e IS_R5 (SEC ID N.º 3) mediante el mismo procedimiento del Ejemplo 1 (1), y se usaron como cebador directo e inverso.
- (ii)
- Cebador de la PCR para detectar M. avium
Se usó el mismo cebador que en el Ejemplo 4(1) (ii).
(iii) Cebador de la PCR para detectar M. intracellulare
Se usó el mismo cebador que en el Ejemplo 4(1) (iii).
- (iv)
- Cebador de la PCR para detectar M. kansasii
Se usó el mismo cebador que en el Ejemplo 4(1) (iv).
- (2)
- Preparación de la sonda
- (i)
- Preparación de sonda para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se diseñó la secuencia " ACCGACGCCTACGCTCGCAG", para utilizarla como sonda, a partir de la secuencia de oligonucleótido de SEC ID N.º 6 que sería amplificada por PCR usando IS_F5 e IS_R5 como cebadores, y luego se sintetizó el oligonucleótido que tenía esta secuencia (denominado de aquí en adelante IS_F5R5_FANTAM, SEC ID N.º 11). Se ligó el colorante indicador FAM al terminal 5’ de este oligonucleótido y se ligó el indicador atenuador TAMRA al terminal 3’ para obtener una sonda de oligonucleótido marcada (sonda marcada fluorescente TaqMan™, Applied Biosystems Japan Inc.).
(ii) Preparación de sonda para detectar Mycobacterium avium
Se diseñó la secuencia "CAGCTCGAGCACCAGTGCGTCGG", para utilizarla como sonda, a partir de la secuencia de oligonucleótido que sería amplificada mediante PCR usando el cebador directo para detectar M. avium y el cebador inverso para detectar M. avium como cebadores, y se sintetizó el oligonucleótido que tenía esta secuencia (denominado de aquí en adelante, Mab_F1R1m2_Cy5BHQ, SEC ID N.º 21). Se ligó el colorante indicador Cy5 al terminal 5' de este oligonucleótido y el indicador atenuador BHQ2, al terminal 3’ para obtener una sonda de oligonucleótido marcada (sonda marcada terminalmente dual para la PCR en tiempo real, SIGMA GENOSYSInc.).
(iii) Preparación de la sonda para detectar M. intracellulare
Se diseñó la secuencia " CTGGCTCGTCAGCTTCACGCG", para utilizarla como sonda, a partir de la secuencia de oligonucleótido que sería amplificada mediante PCR usando el cebador directo para detectar M. intracellulare y el cebador inverso para detectar M. intracellulare como cebadores, y se sintetizó el oligonucleótido que tenía esta secuencia (denominado de aquí en adelante, Int_F 1Rlm_VICMGB, SEC ID N.º 22). Se ligó el colorante indicador VIC al terminal 5' de este oligonucleótido y el indicador atenuador MGB, al terminal 3’ para obtener una sonda de oligonucleótido marcada (sonda marcada terminalmente TaqMan™, Applied Biosystems Japan Inc.).
- (iv)
- Preparación de sonda para detectar M. kansasii
Se diseñó la secuencia " ATCGTATCCACCATCCTCGACAGCGT", para utilizarla como sonda, a partir de la secuencia de oligonucleótido que sería amplificada mediante PCR usando el cebador directo para detectar M. kansasii y el cebador inverso para detectar M. kansasii como cebadores, y se sintetizó el oligonucleótido que tenía esta secuencia (denominado de aquí en adelante, KATS2_TAMBHQ2, SEC ID N.º 23). Se ligó el colorante indicador TAMRA al terminal 5' de este oligonucleótido y el indicador atenuador BHQ2, al terminal 3’ para obtener una sonda de oligonucleótido marcada (sonda marcada terminalmente dual para la PCR en tiempo real, SIGMA GENOSYSInc.).
- (3)
- Preparación de muestras
Con respecto a las muestras de ADN obtenidas de Mycobacterium tuberculosis, M avium, M. intracellulare y M. kansasii preparadas en el Ejemplo 1(2), se midió una cantidad de ADN de cada muestra midiendo la absorbancia. Se determinó la cantidad de ADN genómico (número de copias del genoma) de la muestra comparando la cantidad de ADN obtenida con la cantidad conocida del ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis. Se obtuvo ADN genómico que tenía 108 copias/1l.
Posteriormente, se diluyó la muestra de ADN para dar series de dilución de 105, 104, 103, 102, 10, 5 y 2 copias/1l usando 10mM de tampón Tris–HCl, pH 8,9 para preparar las muestras de ADN para la PCR.
(4) Detección mediante PCR en tiempo real
Se preparó una solución que contenía 11M de cebador directo Y 11M de cebador inverso a la concentración final sintetizados anteriormente en la presente memoria (1), 195mM de sonda marcada fluorescentemente la concentración final, 10mM de Tris–HCl (pH 8,9), 1,5mM de MgCl2, 80mM de KCl, 500 1g/ml de ASB, 0,1% de colato de sodio, 0,1% de Triton 100, 0,2mM de cada uno entre dATP, dCTP, dGTP, dTTP y 40 unidades/ml de polimerasa de Taq (Nippon Gene Co. Ltd.), y se usó como solución de reacción. Como muestra para la PCR, se usó una solución preparada añadiendo 1 1l de muestra de ADN de cada serie de dilución a 20 1l de la solución de reacción. Se añadió la muestra para la PCR al pocillo de una placa de reacción de 96 pocillos (placa de reacción de 96 pocillos MicroAmp Optical, Applied Biosystems Japan, Inc.) y se realizó la PCR en tiempo real usando el termociclador sistema de detección de secuencias especificado para la PCR TagMan™ (ABI7000, Applied Biosystems Japan, Inc.). Las condiciones de los ciclos de la PCR fueron 950C durante 10 minutos para mantener el calor, seguidos por 50 ciclos de reacción a 95valor de
0C durante 15 segundos Y a 600C durante 1 minuto, con la medicion del fluorescencia generada por el colorante indicador en cada ciclo. Se midió el valor de fluorescencia en cada uno de los pocillos de la placa de reacción de 96 pocillos usada para la medición usando la función del termiciclador para digitalizar la proporción relativa de la intensidad de fluorescencia usada en la medición.
(5) Resultados y análisis
Como los colorantes indicadores del cebador para detectar cada célula bacteriana son diferentes entre sí, cuando se obtuvo un valor de fluorescencia de cuatro longitudes de onda diferentes de cada colorante indicador arc controlado en cada ciclo, se confirmó la amplificación del fragmento de ADN dirigido a la secuencia genómica obtenida de Mycobacterium tuberculosis y la amplificación del DNA genómico obtenido de cuatro bacterias causantes que incluían micobacteriosis no tuberculosa, el grupo MAC (M. avium y M. intracellulare)y M. kansasii. Por lo tanto, se midió el valor de fluorescencia generada por cada colorante indicador. Y después, se preparó una curva de amplificación que indicaba la relación ente la serie de dilución del ADN genómico obtenido de cada bacteria y el valor de fluorescencia generada por cada colorante indicador mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 3(5). Como curva de calibración, se representó el valor Ct (eje Y) frente al número de copias de genoma (eje X, expresión logarítmica) mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 3(5) a partir de la curva de amplificación obtenida y la curva aproximada obtenida a cada valor Ct. En la Fig. 6, se muestran los resultados.
Como se puede observar de los resultados (curva de calibración) sobre el ADN de M. tuberculosis de la Fig. 6, se entiende que como se podía detectar la fluorescencia del colorante indicador del cebador para detectar Mycobacterium tuberculosis incluso aún estando presentes los ADN obtenidos de varios tipos de células bacterianas distintas de Mycobacterium tuberculosis en un solo tubo, es posible detectar Mycobacterium tuberculosis con el uso del oligonucleótido de la presente invención como cebador, el diseño de la sonda marcada de la secuencia que será la región de amplificación de la misma y la realización de la PCR en tiempo real. Además, como fue posible preparar la curva de calibración, se entiende que se puede determinar cuantitativamente Mycobacterium tuberculosis aplicando la PCR en tiempo real con el uso del cebador y de la sonda de la presente invención. Además, observando la Fig. 6, se entiende que es posible detectar Mycobacterium tuberculosis mediante una PCR en tiempo real con el uso del cebador y de la sonda de la presente invención incluso en el caso de que sólo estén presentes dos copias de ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis como nivel inicial (2 copias/reacción).
Además, cuando se utiliza la PCR en tiempo real, es posible determinar cuantitativamente un nivel inicial de un molde de ADN con exactitud mediante la monitorización de la intensidad de la fluorescencia en tiempo real y, por tanto, el procedimiento es eficaz para detectar Mycobacterium tuberculosis. Es más, incluso mezclando ADN genómicos obtenidos del grupo MAC (M. avium y M. intracellulare), que son bacterias causantes de Micobacteriosis no tuberculosa, y M. kansasii (infección concurrente), se mantiene la linealidad de cada curva de calibración sin interferir en la reacción de amplificación de cada una, y como resultado de ello, se puede controlar el ADN genómico obtenido de cada una de las cuatro bacterias causantes en la reacción con un solo tubo. En este caso, se puede presentar una sensibilidad de detección con dos copias/reacción en cualquier especie bacteriana. Concretamente, se puede entender que se pueden llevar a cabo simultáneamente la detección de Mycobacterium tuberculosis y la identificación de micobacterias no tuberculosas realizando una PCR en tiempo real en una muestra en la que haya mezclados varios números de células bacterianas.
Aplicabilidad industrial
Según el procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención, se pueden excluir los falsos positivos del diagnóstico, y como resultado de ello, se hace posible la detección de Mycobacterium tuberculosis con una especificidad y una exactitud mayores a las del procedimiento convencional de bacilos tuberculosos dirigidos hacia IS6110. Además, como el procedimiento de detección de la presente invención es específico de Mycobacterium tuberculosis, se puede realizar la detección de Mycobacterium tuberculosis y el diagnóstico simultáneo (diagnóstico selectivo) de micobacterias no tuberculosas usando una muestra mediante la realización de la detección de Mycobacterium tuberculosis con el cebador y la sonda de la presente invención mediante PCR en tiempo real.
<110> WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.
<120> Procedimiento para determinar Mycobacterium tuberculosis
<130> F1620WAKOPAT
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<151> 26–04–2004
<160> 23
<170> PatentIn versión 3.1
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<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótido
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótido
<400> 2
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<210> 3 <212> ADN
- <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
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- 5
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- 10
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- 25
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- 23
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- 23
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- 21
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- <220> <223> Sonda de oligonucleótido
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- 26
Listado de secuencias
<110> WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD
<120> Procedimiento para determinar Mycobacterium tuberculosis
<130> F1620WAKOPAT
<150> JP2004–129272
<151> 2004–04–26
<160> 23
<170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
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<212> ADN
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<223> Cebador de oligonucleótido
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<400> 23 atcgtatcca ccatcctcga cagcgt 26
Claims (16)
- REIVINDICACIONES1.– Un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, en la que A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina y T representa timina, y T puede estar, en cualquier posición, sustituida por uracilo (U), y de aquí en adelante, se usarán las mismas abreviaturas, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis.
- 2.– El oligonucleótido de la reivindicación 1, que es un cebador para detectar Mycobacterium tuberculosis que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 deMycobacterium tuberculosis.
- 3.– El oligonucleótido según la reivindicación 2, en el que el cebador está marcado con una sustancia de marcaje que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente y una biotina.
- 4.– El oligonucleótido de la reivindicación 1, que es una sonda para detectar Mycobacterium tuberculosis que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 deMycobacterium tuberculosis.
- 5.– El oligonucleótido según la reivindicación 4, en el que la sonda está marcada con una sustancia de marcaje, preferiblemente,
- (i)
- la sustancia de marcaje se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, una enzima, una
- sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente y una biotina; o
- (ii)
- el terminal 5’ está marcado con un colorante fluorescente indicador y el terminal 3' está marcado con un
colorante atenuador. - 6.– Un procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis, que comprende usar un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, como un cebador o/y una sonda.
- 7.– El procedimiento de detección según la reivindicación 6, procedimiento que incluye los siguientes procedimientos:
- (1)
- realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando como cebador un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en la que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis; y un ácido nucleico de una muestra como molde; y
- (2)
- realizar una electroforesis del producto de la prolongación del cebador obtenido en el apartado (1) anterior y determinar la existencia de Mycobacterium tuberculosis en base al resultado obtenido,
en el que en el apartado (1) anterior, preferiblemente, se usa como cebador directo un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis; y como cebador inverso, se usa un oligonucleótido que comprende parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3 o SEC ID N.º 4, o parte o la totalidad de la secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis. - 8.– El procedimiento de detección según la reivindicación 7, que comprende además, tras realizar la electroforesis, confirmar que una fracción del producto de prolongación del cebador tiene un número de pares de bases deseado en la fracción electroforética obtenida, procedimiento que comprende preferiblemente:
- (1)
- realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 1 como cebador directo y usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º: 3 como cebador inverso,
realizar una electroforesis del producto de prolongación del cebador obtenido y determinar si la muestra es una muestra positiva confirmando la existencia de una fracción de 178 pares de bases, o- (2)
- realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 1 como cebador directo y usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º: 4 como cebador inverso,
realizar una electroforesis del producto de prolongación del cebador obtenido y determinar si la muestra es una muestra positiva confirmando la existencia de una fracción de 193 pares de bases. - 9.– El procedimiento de detección según la reivindicación 7, que comprende además, después de realizar la electroforesis, hibridar la fracción electroforética obtenida con una sonda marcada, que es un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, SEC ID N.º 3, SEC ID N.º 4, SEC ID N.º 6, o una parte o la totalidad de la secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, y que está marcado con una sustancia de marcaje,detectar la sustancia de marcaje de la sonda marcada ydeterminar si la muestra es una muestra positiva mediante la confirmación de una fracción hibridada con la sonda marcada; procedimiento que, preferiblemente, comprende realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 1 COMO cebador directo y usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 3 como cebador inverso,realizar la electroforesis,hibridar la fracción electroforética obtenida con una sonda marcada que sea un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 6 y que está marcado con una sustancia de marcaje, detectar la sustancia de marcaje de la sonda marcada ydeterminar si la muestra es una muestra positiva mediante la confirmación de una fracción hibridada con la sonda marcada.
- 10.– El procedimiento de detección según la reivindicación 6, en el que el cebador está marcado con una sustancia de marcaje y el procedimiento incluye el procedimiento para realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando el cebador marcado y el ácido nucleico de la muestra como molde, y medir la sustancia de marcaje del producto de prolongación del cebador obtenido; procedimiento que, preferiblemente, comprende además, tras realizar la reacción en cadena de la polimerasa, retirar un cebador marcado libre y medir la sustancia de marcaje del producto de prolongación del cebador, siendo lo más preferible que:
- (i)
- el procedimiento para retirar el cebador marcado libre tras realizar la reacción en cadena de la polimerasa incluya un procedimiento para precipitar el producto de prolongación del cebador en la mezcla de reacción obtenida y eliminar un sobrenadante; o
- (ii)
- el procedimiento para retirar el cebador marcado libre tras realizar la reacción en cadena de la polimerasa sea un procedimiento para tratar el producto de reacción obtenido por medio de cromatografía en gel.
- 11.– El procedimiento de detección según la reivindicación 6, en el que la sonda está marcada con una sustancia de marcaje, y que incluye el procedimiento para hibridar la sonda marcada con el ácido nucleico de la muestra, retirar una sonda marcada libre y detectar la sustancia de marcaje del complejo hibridado.
- 12.– un kit para detectar Mycobacterium tuberculosis, que comprende un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, como un cebador o/y una sonda.
- 13.– El kit según la reivindicación 12, en el que
- (i)
- el cebador está marcado con una sustancia de marcaje; o
- (ii)
- la sonda está marcada con una sustancia de marcaje.
- 14.– El kit según la reivindicación 12, que comprende los siguientes reactivos constituyentes:
- (1)
- un cebador directo que es un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, y
- (2)
- un cebador inverso que es un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3 o SEC ID N.º 4, o una parte o la totalidad de la secuencia
complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis; preferiblemente, dicho kit comprende además una sonda marcada obtenida mediante el marcaje de un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, SEC ID N.º 3, SEC ID N.º 4 o SEC ID N.º 6, o una parte o la totalidad de la secuencia complementaria a la misma, en la que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis mediante una sustancia de marcaje. - 15.– El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el procedimiento se realiza usando un par de cebadores que comprende:
- (1)
- oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, y
- (2)
- un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3, SEC ID N.º 4, o una parte o la totalidad de la secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de
Mycobacterium tuberculosis. - 16.– El procedimiento de detección según la reivindicación 6, procedimiento que incluye los siguientes procedimientos:
- (1)
- realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando como cebador directo un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma; y como cebador inverso, un oligonucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3, o la secuencia complementaria a la misma; y un ácido nucleico de una muestra como molde; y una sonda marcada obtenida mediante el marcaje de un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 11, o una secuencia complementaria a la misma, con una sustancia de marcaje, y
- (2)
- detectar una señal procedente de la sonda marcada y
- (3)
- determinar si la muestra es una muestra positiva mediante la confirmación de la señal procedente de la sonda marcada.
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