KR20070037238A - 결핵균 특이 유전자 검출키트 - Google Patents

결핵균 특이 유전자 검출키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PCR 반응혼합물, 결핵균의 IS 6110 부위(IS 6110 region) 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 양성대조군 유전자시료, 내부대조군 유전자시료 및 반응용 멸균수를 포함하는 결핵균 특이 유전자 검출키트 및 전기 키트를 이용하여 결핵균 특이 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 결핵균 검출키트를 사용할 경우, 결핵 특이적인 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 검출할 수 있으므로, 결핵의 정확한 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
결핵균 특이 유전자, 결핵균 특이 유전자 검출키트

Description

결핵균 특이 유전자 검출키트{Kit for Detecting of M. tuberculosis Specific Gene}
본 발명은 결핵균 특이 유전자 검출키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 PCR 반응혼합물, 결핵균의 IS 6110 부위(IS 6110 region) 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 양성대조군 유전자시료, 내부대조군 유전자시료 및 반응용 멸균수를 포함하는 결핵균 특이 유전자 검출키트 및 전기 키트를 이용하여 결핵균 특이 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 포유동물에서 결핵을 일으키는 균을 MTB 복합균(MTB complex,M. tuberculosis complex) 또는 결핵균이라고 통칭하며, M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti 등을 포함한다. 이들 마이코박테리아속 미생물(Mycobacteria)은 2~5μm의 크기를 갖는 간균으로서, 세포벽의 특성에서 기인하는 항산성 염색성을 갖는다. 또한, 마이코박테리아속 미생물의 세포벽은 약 60%가 미 콜린산(mycolic acid, MA), 당지질, 당단백지질(peptidoglycolipids) 등의 지방화합물로 이루어져 있어 소수성을 띠고, 다당류 등의 다양한 고분자와 함께 세포벽에 약 10nm두께의 표층을 이루어 구조적인 투과장벽이 되며, 이러한 세포벽의 특성으로 인하여, 결핵균은 항산성 염색성과 유해한 환경이나 숙주방어수단에 대한 저항력 등의 특성을 나타낸다. 전기 결핵균은 세대시간이 17-18시간에 이르고, 호기성 대사를 하며, 휴면상태로 오랫동안 생존할 수 있는 특성을 가지고 있다.
결핵균은 전적으로 숙주에 의존해 생존하는 절대병원균이며, 결핵균의 병원성은 다른 병원균들처럼 내외독소를 생산함으로써 나타나는 것이 아니라, 균이 숙주의 방어기전을 이겨내고 조직내에서 증식할 수 있는 능력과 숙주의 면역반응에 의해 결정된다. 이처럼, 결핵균은 동일한 균주가 감염될 경우에도, 숙주의 건강상태에 따라 체내에서 약독화되거나 또는 결핵을 발병시킬 수 있으며, 잠복기간이 길다는 특징으로 인하여, 결핵균의 감염여부만으로는 결핵의 발병여부를 판단할 수 없기 때문에, 결핵에 대한 조기진단에 큰 어려움을 겪고 있어, 이를 해결하려는 연구가 활발히 진행되었다.
예를 들어, 대한민국 특허등록 제 254414호에는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 파쇄항원에 대한 항혈청으로부터 정제한 항-결핵균 항체를 유효성분으로 포함하는 결핵균 항원검출용 진단키트가 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제 285254호에는 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis complex)의 136bp의 DNA 분절의 PCR 증폭여부를 확인할 수 있는 결핵균군과 비결핵 항산성균을 감별-탐지하기 위한 진단시약이 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제 361345호에는 결핵균의 38kD 항원을 1-2 중량부, 16kD 항원을 1-2 중량부, 6kD 항원을 0.5-1 중량부, 23kD, 19kD, 85A 및 85C 항원 각각을 0.125-0.5 중량부로 포함하는 결핵진단용 항원 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제 454585호에는 마이코박테리아의 균주 감별 및 결핵균의 항생제 내성을 검출할 수 있는 마이크로어레이 및 이를 이용하여 결핵균을 검출하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제 455032호에는 마이코박테리아 관련 3종의 유전자(MTP40, IS6110, HSP65) 각각을 표적으로 하는 3종의 특이 프라이머쌍을 동시에 사용하는 다중-이중 중합효소연쇄 반응(MULTIPLEX-NESTED PCR)에 의한 결핵균과 비결핵균의 동시검출방법이 개시되어 있다. 이처럼 개발된 방법중에서, 특히 PCR을 이용한 기술은 결핵균 검출에 소요되는 시간이 짧고, 결핵균의 유전자를 대상으로 하여 결핵균의 변종까지도 검출할 수 있다는 장점이 있는 반면, 결핵균에 충분히 감염되지 않은 초기 환자로부터 수득한 시료에서는 검출이 용이하지 않아 경우에 따라서는 대량의 시료를 필요로 할 수도 있고, 시료의 미세한 오염만으로도 큰 오차를 나타낸다는 단점이 제기되었다.
상술한 단점을 극복하기 위한 방법으로, 최근에는 미량의 시료로부터 표적 RNA의 정량까지 가능한 실시간 RT-PCR 방법을 활용한 진단 키트들이 개발되어 시판되고 있다. 그러나, 상기 진단키트들은 표준 유전자로 RNA를 제공함으로써 안정성 및 재현성의 문제점을 내포하고 있거나, 표준화에 사용되는 참조 유전자정량용 프라이머 및 프로브가 포함되어 있지 않아, 정확한 진단이 수행될 수 없다는 단점이 지적되어, 보다 간편하고, 정확하게 환자에 감염된 결핵균 특이 유전자를 검출할 수 있는 방법을 개발하려는 노력이 계속되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다.
따라서, 보다 간편하고, 정확하게 환자에 감염된 결핵균 특이 유전자를 검출할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 보다 간편하고, 정확하게 환자에 감염된 결핵균 특이 유전자를 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 결핵균 특이 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브와 내부대조군 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브를 포함하는 결핵균 특이 유전자 검출키트를 사용할 경우, 보다 간편하고, 정확하게 결핵균 특이 유전자를 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 간편하면서도 정확하게 결핵균 특이 유전자를 검출할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 키트를 이용하여, 결핵균 특이 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 결핵균 검출키트는 (ⅰ) 완충용액, DNA 중합효소, KCl, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 포함하는 PCR 반응혼합물; (ⅱ) 결핵균의 IS 6110 부위(IS 6110 region) 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 1), 안티센스프라이머(서열번호 2) 및 프로브(서열번호 3)로 구성된 결핵균 프로브 및 프라이머 혼합물; (ⅲ) 내부대조군 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 4), 안티센스프라이머(서열번호 5) 및 TaqMan프로브(서열번호 6)로 구성된 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물; (ⅳ) 결핵균 IS 6110 부위(IS 6110 region) 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 양성대조군 유전자시료; (ⅴ) 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 융합유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 내부대조군 유전자시료; 및, (ⅵ) 반응용 멸균수를 포함한다. 이때, 완충용액은 특별히 이에 제한되지 않으나, pH 7 내지 8의 중성완충용액을 사용함이 바람직하고, PCR 반응혼합물에 (NH4)2SO4, 송아지혈청알부민, EDTA, ROX(6-carboxy-X-rhodamine) 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수도 있다. 또한, 결핵균 특이적 프로브는 특별히 이에 제한되지 않으나, 5' 말단이 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein) 또는 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein)으로 표지되고, 3' 말단이 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine)으로 표지된 것을 사용함이 바람직하고, 내부대조군 특이적 프로브는 특별히 이에 제한되지 않으나, 5'말단이 형광물질인 6-카르복시플루오레세인으로 표지되고, 5'말단으로부터 19번째 티민염기를 형광 물질인 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지되며, 3'말단이 인산화된 것을 사용함이 바람직하다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 환자에게서 결핵균을 검출할 수 있는 방법을 다각적으로 연구하던 중, 종래의 키트를 개량하는 방법을 모색하게 되었다.
지금까지 사용된 환자에게서 결핵균을 검출하는 키트 중에서 실시간 중합효소 연쇄반응기기를 이용하는 키트의 경우, 상대적으로 정확도가 우수함이 알려져 있는데, 이의 기술적 원리는 다음과 같다: 먼저, 시료에 존재하는 결핵균 특이 유전자를 주형으로 하고, 적절한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행할 때, 결핵균 특이 유전자와 결합할 수 있는 프로브를 첨가한다. 이때, 사용되는 프로브는 3'말단과 5'말단에 각각 서로 다른 2종류의 형광물질로 표지하도록 제조되는데, 사용되는 2종류의 형광물질은 일정한 간격내에 존재할 경우, 발색되는 형광이 상호 간섭현상을 나타내어, 형광이 발색되지 않는 것을 사용하게 된다. 결과적으로, 중합효소 연쇄반응을 수행할 때, 주형의 일측방 말단에는 프라이머가 결합하고 이를 인식하는 DNA 중합효소에 의하여 중합효소 연쇄반응이 순차적으로 수행되고, 주형의 가운데 부분에는 2종류의 형광물질로 표지된 프로브가 결합된다. 이어, 중합효소가 전기 프로브가 결합된 부위에 도달하면, 프로브를 형광물질이 표지된 5'말단부터 순차적으로 분해시키면서, 중합반응을 계속적으로 수행하게 되므로, 5'말단에 표지된 형광물질이 소실되는 결과를 초래한다. 이에 따라, 간섭현상이 소실되어, 3' 말단에 표지된 형광물질이 발색반응을 수행하여, 결핵균 특이 유전자 가 증폭되고 있음을 나타내게 된다.
또한, 본 발명자들은 PCR이 정상적으로 수행되었는지의 여부를 확인할 수 있도록, 내부대조군을 이용하였다. 즉, 환자로부터 수득한 검체시료에서 결핵균의 감염여부에 상관없이 정상적으로 발현되는 유전자를 내부대조군으로 활용하여, 결핵균 특이 유전자와 함께 PCR을 수행하였을 경우, 내부대조군이 증폭되지 않았다면, PCR이 정상적으로 수행되지 않은 것으로 간주할 수 있으므로, 검출된 결과에 대한 신뢰성을 높일 수 있었다.
본 발명의 결핵균 검출키트를 사용할 경우, 결핵 특이적인 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 검출할 수 있으므로, 결핵의 정확한 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다: 즉, 유전자분석시료 및 전기 결핵균 검출키트의 양성대조군 유전자시료와 내부대조군 유전자시료에, 각각 전기 결핵균 검출키트의 결핵균 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 및 PCR 반응혼합물을 가하고 혼합한 다음, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여, 유전자분석시료 및 양성대조군의 결핵균 PCR 산물과 내부대조군 PCR 산물을 각각 수득하고, 전기 유전자분석시료, 양성대조군 유전자시료 및 내부대조군 유전자시료의 증폭여부를 확인함으로써, 유전자분석시료에 존재하는 결핵균 특이 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 검출할 수 있다.
아울러, 이러한 측정방법은 시판되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응기기를 사용하여 실행될 수 있는데, 실시간 중합효소 연쇄반응기기는 특별히 이에 제한되지는 않으나, LightCyclerTM(Roche, Germany), ABI PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems, USA), iCyclerTM(Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM(PharmaTech, USA) 등을 사용함이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 결핵균 검출키트의 제조
PCR 반응혼합물 1.25㎖, 결핵균 프로브 및 프라이머 혼합물 300㎕, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 300㎕, 양성대조군 유전자시료 50㎕, 내부대조군 유전자시료 400㎕ 및 반응용 멸균수 l㎖로 구성된 결핵균 검출키트를 제조하였다.
실시예 1-1: PCR 반응혼합물, 결핵균 프로브 및 프라이머 혼합물 및 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물의 제조
먼저, PCR 반응혼합물은 100mM Tris/HCl(pH 8.3), 20mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 7mM MgCl2, 1.625U DNA 중합효소, 0.8mM dUTP, 0.8mM dATP, 0.8mM dCTP 및 0.8mM dGTP를 혼합하여 제조하였다.
다음으로, 결핵균 프로브 및 프라이머 혼합물은 하기의 염기서열을 갖는 결핵균 특이 유전자에 특이적인, 센스프라이머(서열번호 1), 안티센스프라이머(서열번호 2) 및 프로브(서열번호 3)를 혼합하여 제조하고, 이들의 5' 말단을 VIC(TaqMan, USA)로 표지하고, 3' 말단을 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지하였다.
센스 프라이머 : 5'-cgagacgatcaacggcctat-3'(서열번호 1)
안티센스 프라이머 : 5'-gccaactcgacatcctcgat-3'(서열번호 2)
프로브 : 5'-tgatcaaacccggcaagccctg-3'(서열번호 3)
끝으로, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물은 하기의 염기서열을 갖는 내부대조군 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 4), 안티센스프라이머(서열번호 5) 및 프로브(서열번호 6)를 혼합하여 제조하였다. 이때, 프로브의 5'말단은 형광물질인 6-카르복시플루오레세인으로 표지하고, 5'말단으로부터 19번째 티민염 기를 형광물질인 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지시켰으며, 3'말단을 인산화시켰다.
센스 프라이머 : 5'-cagactgtccacagcattcc-3'(서열번호 4)
안티센스 프라이머 : 5'-ccaacgagcggcttcact-3'(서열번호 5)
프로브 : 5'-agaccctgaggctcaaagtcagatgctact-3'(서열번호 6)
실시예 1-2: 양성대조군 유전자시료의 제조
양성대조군 유전자시료로는 80bp의 결핵균의 IS 6110 유전자의 일부를 포함하는 재조합 플라스미드를 사용하였다. 구체적으로, 결핵환자의 객담 검체로부터 결핵균 DNA를 분리하여, 이를 주형으로 사용하고, 하기의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 80bp의 결핵균의 IS 6110 유전자의 일부를 얻었으며, 이를 발현벡터(PCR 2.1 TOPO vector)에 삽입하여 제조한 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조군 유전자시료로 사용하였다.
센스 프라이머 : 5'-cgagacgatcaacggcctat-3'(서열번호 7)
안티센스 프라이머 : 5'-gccaactcgacatcctcgat-3'(서열번호 8)
실시예 1-3: 내부대조군 유전자시료의 제조
내부대조군 유전자시료로는 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 융합유전자인 b3a2 융합 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 사용하였다. 구체적으로, RNA 추출키트(RNAqueous kit, Ambion, USA)을 사용하여, K-562 세포주 (ATCC No. CCL-243)로부터 K562 RNA를 추출하고, 전기 K562 RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하여 443bp의 b3a2 융합 유전자를 얻었으며, 이를 발현벡터(PCR 2.1 TOPO vector)에 삽입하여 재조합 플라스미드 DNA를 수득한 다음, 이를 200카피수로 희석시켜 내부대조군 유전자시료를 제조하였다.
실시예 1-4: 결핵균 검출키트의 제조
전기 실시예 1-1에서 제조한 PCR 반응혼합물 1.25㎖, 전기 실시예 1-1에서 제조한 결핵균 프로브 및 프라이머 혼합물 300㎕, 전기 실시예 1-1에서 제조한 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 300㎕, 전기 실시예 1-2에서 제조한 양성대조군 유전자시료 50㎕, 전기 실시예 1-3에서 제조한 내부대조군 유전자시료 400㎕ 및 반응용 멸균수 l㎖로 구성된 결핵균 검출키트를 제조하였다.
실시예 2: 결핵균 검출키트를 이용한 결핵균 특이 유전자의 검출
전기 실시예 1에서 제조한 결핵균 검출키트를 이용하여, 정상인과 결핵환자 의 시료로부터 결핵균 특이 유전자를 검출하여, 정상인과 결핵환자를 구별할 수 있는지의 여부를 확인하였다.
실시예 2-1: 측정할 시료의 준비
먼저, 치료된 결핵 환자의 객담 1, 0.5 및 0.2ml(실험군 1-1 내지 1-3)과 치료되지 않은 결핵 환자의 객담 1, 0.5 및 0.2ml(실험군 2-1 내지 2-3)를 각각 수득하고, 전기 각 객담을 DNA 정제키트(High pure nucleic acid purification kit, Roche, Germany)에 적용하여 각각의 DNA를 추출하고, 이를 시료로서 사용하였다.
실시예 2-2: 시료의 증폭 및 증폭결과의 분석
PCR용 튜브에 전기 실시예 1-1에서 제조한 PCR 반응혼합물 12.5㎕, 결핵균 프로브 및 프라이머 혼합물 3㎕, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 3㎕, 및 멸균수 1.5㎕를 분주하여, 반응용 튜브를 준비하였다. 이어, 전기 준비된 각각의 반응용 튜브에 전기 실시예 1-2에서 제조한 양성대조군 유전자시료, 전기 실시예 1-3에서 제조한 내부 대조군 유전자시료 및 전기 실시예 2-1에서 수득한 실험군 1-1 내지 2-3의 DNA를 각각 5㎕씩 분주하고, 이를 실시간 중합효소 연쇄반응기기인 ABI PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems, USA)에 적용하고, PCR을 수행하여, 결 핵균 양성대조군 PCR 산물과 시료 PCR 산물을 각각 수득하였다. 이때, PCR은 95℃에서 10분간 변성(denaturation)시키고, 95℃에서 20초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 30초동안 반응시키는 일련의 과정을 45회 반복수행하여 증폭(amplification)을 수행하였다. 증폭을 수행하는 중, 3' 말단에 표지된 6-카르복시테트라메틸-로다민으로부터 유래된 형광이 지속적으로 발색됨을 확인하였으므로, 정상적으로 증폭이 수행됨을 알 수 있었다. 이어, 전기 증폭된 PCR 절편을 수득한 다음, 전기영동하여, 목적하는 절편의 존재유무를 확인하여 O와 X로 표시하였다(참조: 표 1). 이때, O는 목적 유전자가 증폭되어 전기영동상에 밴드로 확인됨을 의미하고, X는 목적 유전자가 증폭되지 않아 전기영동상에 밴드로 확인되지 않음을 의미한다.
각 시료의 PCR 증폭 결과
실험군 양성대조군 유전자 내부대조군 유전자 시료 유전자
실험군 1-1 O O X
실험군 1-2 O O X
실험군 1-3 O O X
실험군 2-1 O O O
실험군 2-2 O O O
실험군 2-3 O O O
상기 표 1에서 보듯이, 정상인을 대상으로 한, 실험군 1-1 내지 1-3의 시료 유전자는 증폭되지 않았고, 결핵환자를 대상으로 한, 실험군 2-1 내지 2-3의 시료 유전자는 증폭되었으므로, 본 발명의 결핵균 검출키트를 이용할 경우, 결핵환자를 구별할 수 있음을 알 수 있었다.
한편, 모든 실험군에서 80bp의 양성대조군 유전자와 443bp의 내부대조군 유전자가 모두 증폭됨을 알 수 있었다. 이때, 양성대조군 유전자는 센스프라이머(서열번호 1)에 의하여 증폭되는데, 증폭된 양성대조군 유전자로부터 시료 유전자가 비특이적으로 증폭되지 않았다고 분석되었고, 증폭된 내부대조군 유전자로부터 전기 PCR 증폭에 오류가 없다고 분석되었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 PCR 반응혼합물, 결핵균의 IS 6110 부위(IS 6110 region) 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 양성대조군 유전자시료, 내부대조군 유전자시료 및 반응용 멸균수를 포함하는 결핵균 특이 유전자 검출키트 및 전기 키트를 이용하여 결핵균 특이 유전자를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 결핵균 검출키트를 사용할 경우, 결핵 특이적인 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 검출할 수 있으므로, 결핵의 정확한 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
<110> BIOSEWOOM INC. <120> Kit for Detecting of M. tuberculosis Specific Gene <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgagacgatc aacggcctat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gccaactcga catcctcgat 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 tgatcaaacc cggcaagccc tg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cagactgtcc acagcattcc 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccaacgagcg gcttcact 18 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 agaccctgag gctcaaagtc agatgctact 30 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgagacgatc aacggcctat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gccaactcga catcctcgat 20

Claims (3)

  1. (ⅰ) 완충용액, DNA 중합효소, KCl, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 포함하는 PCR 반응혼합물;
    (ⅱ) 결핵균의 IS 6110 부위(IS 6110 region) 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 1), 안티센스프라이머(서열번호 2) 및 프로브(서열번호 3)로 구성된 결핵균 프로브 및 프라이머 혼합물;
    (ⅲ) 내부대조군 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 4), 안티센스프라이머(서열번호 5) 및 TaqMan프로브(서열번호 6)로 구성된 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물;
    (ⅳ) 결핵균 IS 6110 부위(IS 6110 region) 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 양성대조군 유전자시료;
    (ⅴ) 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 융합유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 내부대조군 유전자시료; 및,
    (ⅵ) 반응용 멸균수를 포함하는, 결핵균 검출키트.
  2. 제 1항에 있어서,
    결핵균 특이적 프로브는 5' 말단이 6-카르복시플루오레세인(6- carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein) 또는 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein)으로 표지되고, 5'으로부터 10 내지 20번째 염기중 티민이 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine)으로 표지되며, 3'말단이 인산화되고, 내부대조군 특이적 프로브는 5'말단이 형광물질인 6-카르복시플루오레세인으로 표지되고, 5'말단으로부터 19번째 티민염기를 형광물질인 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지되며, 3'말단이 인산화된 것을 특징으로 하는
    결핵균 검출키트.
  3. 유전자분석시료, 제 1항의 양성대조군 유전자시료 및 제 1항의 내부대조군 유전자시료에, 각각 제 1항의 결핵균 검출키트의 결핵균 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 및 PCR 반응혼합물을 가하고 혼합한 다음, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여, 유전자분석시료 및 양성대조군의 결핵균 PCR 산물과 내부대조군 PCR 산물을 각각 수득하고, 전기 유전자분석시료, 양성대조군 유전자시료 및 내부대조군 유전자시료의 증폭여부를 확인하는 단계를 포함하는, 결핵균 특이 유전자의 검출방법.
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WO2011004957A2 (ko) * 2009-07-07 2011-01-13 엠앤디(주) 결핵균 약제 내성 진단용 프로브 및 그 키트
WO2011004957A3 (ko) * 2009-07-07 2011-05-26 엠앤디(주) 결핵균 약제 내성 진단용 프로브 및 그 키트

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