JP2686428B2 - マイコバクテリウムカンサシイの種特異的検出 - Google Patents
マイコバクテリウムカンサシイの種特異的検出Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸標的配列を増
幅させるための増幅プライマーおよび方法に関する。特
に、本発明は、マイコバクテリウム カンサシイ標的配
列の種特異的増幅に関する。
幅させるための増幅プライマーおよび方法に関する。特
に、本発明は、マイコバクテリウム カンサシイ標的配
列の種特異的増幅に関する。
【０００２】
【従来の技術】マイコバクテリウムは、抗酸性、非運動
性、グラム陽性桿菌の細菌の一つの属である。属は、マ
イコバクテリウム アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、トリ結核菌（マイコ
バクテリウム アビウム、Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ウシ結核
菌（マイコバクテリウム ボビス、Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、
ウシ結核菌ＢＣＧ（マイコバクテリウム ボビス−ＢＣ
Ｇ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ）、マイコバクテリウム
ケロナエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウ
ム フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイ
コバクテリウムゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、
マイコバクテリウム イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔ
ｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム カン
サシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム
ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウ
ム スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕ
ｍ）、パラ結核菌（マイコバクテリウム パラツベルク
ロシス、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、お
よびヒト結核菌（マイコバクテリウム ツベルクロシ
ス、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む幾つかの種
を含むが、これらの種に限られるわけではない。これら
の生物体のうちのあるものは、病気の原因となる。米国
では、１９５３年に初めて見つかって以来、マイコバク
テリウム感染患者は増加している。とくに重要なものは
結核であり、その病因学的原因はヒト結核菌である。し
かしながら、結核以外のマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉａ ｏｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ，ＭＯＴＴ）による感染症もまた増加して
いる。これらの新しい患者の多くはＡＩＤＳの流行に関
係しており、ＡＩＤＳの流行はマイコバクテアによる感
染症に特に感染しやすい免疫性の傷ついた母集団を提供
する。トリ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖ
ｉｕｍ）、マイコバクテリウム カンサシイおよびその
他の非結核性マイコバクテアは、ＨＩＶ−感染およびそ
の他の免疫性の傷ついた患者の中に日和見的病原菌とし
て見出だされた。これらの感染症は急速に広がり、かつ
短期間内に致命傷になる可能性があるので、これらの感
染症を短期間内に診断する必要性が増加している。
性、グラム陽性桿菌の細菌の一つの属である。属は、マ
イコバクテリウム アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、トリ結核菌（マイコ
バクテリウム アビウム、Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ウシ結核
菌（マイコバクテリウム ボビス、Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、
ウシ結核菌ＢＣＧ（マイコバクテリウム ボビス−ＢＣ
Ｇ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ）、マイコバクテリウム
ケロナエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウ
ム フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイ
コバクテリウムゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、
マイコバクテリウム イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔ
ｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム カン
サシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム
ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウ
ム スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕ
ｍ）、パラ結核菌（マイコバクテリウム パラツベルク
ロシス、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、お
よびヒト結核菌（マイコバクテリウム ツベルクロシ
ス、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む幾つかの種
を含むが、これらの種に限られるわけではない。これら
の生物体のうちのあるものは、病気の原因となる。米国
では、１９５３年に初めて見つかって以来、マイコバク
テリウム感染患者は増加している。とくに重要なものは
結核であり、その病因学的原因はヒト結核菌である。し
かしながら、結核以外のマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉａ ｏｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ，ＭＯＴＴ）による感染症もまた増加して
いる。これらの新しい患者の多くはＡＩＤＳの流行に関
係しており、ＡＩＤＳの流行はマイコバクテアによる感
染症に特に感染しやすい免疫性の傷ついた母集団を提供
する。トリ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖ
ｉｕｍ）、マイコバクテリウム カンサシイおよびその
他の非結核性マイコバクテアは、ＨＩＶ−感染およびそ
の他の免疫性の傷ついた患者の中に日和見的病原菌とし
て見出だされた。これらの感染症は急速に広がり、かつ
短期間内に致命傷になる可能性があるので、これらの感
染症を短期間内に診断する必要性が増加している。
【０００３】現在、マイコバクテリウム感染症の診断
は、生物体の抗酸性染色および培養、次いで生化学的ア
ッセイによって行われている。これらの方法は時間を浪
費し、従来の培養法を用いる典型的な診断には６週間を
要する。ＢＡＣＴＥＣシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）のような自動培養システム
は、診断に要する時間を１−２週間に短縮した。しかし
ながら、マイコバクテリウム感染症の診断に要する時間
は、１週間以内、望ましくは約１日に、さらに短縮する
必要がある。サザン−ハイブリダイゼーション（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）またはドッ
トブロット（ｄｏｔ ｂｌｏｔｓ）のようにオリゴヌク
レオチドプローブを用いるアッセイは、迅速に（即ち１
日またはそれより短い期間で）結果を得ることができ
る。また、属特異的および種特異的プライマーを、核酸
増幅による医療サンプルの直接アッセイに用いても良
い。しかしながら、これらの迅速な検出法および同定法
は、生物体の特異的同定を所望する場合、マイコバクテ
リウム属（結核および非結核）に特異的あるいは特定の
マイコバクテリウム種に特異的な、オリゴヌクレオチド
プローブまたはプライマーを必要とする。
は、生物体の抗酸性染色および培養、次いで生化学的ア
ッセイによって行われている。これらの方法は時間を浪
費し、従来の培養法を用いる典型的な診断には６週間を
要する。ＢＡＣＴＥＣシステム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）のような自動培養システム
は、診断に要する時間を１−２週間に短縮した。しかし
ながら、マイコバクテリウム感染症の診断に要する時間
は、１週間以内、望ましくは約１日に、さらに短縮する
必要がある。サザン−ハイブリダイゼーション（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）またはドッ
トブロット（ｄｏｔ ｂｌｏｔｓ）のようにオリゴヌク
レオチドプローブを用いるアッセイは、迅速に（即ち１
日またはそれより短い期間で）結果を得ることができ
る。また、属特異的および種特異的プライマーを、核酸
増幅による医療サンプルの直接アッセイに用いても良
い。しかしながら、これらの迅速な検出法および同定法
は、生物体の特異的同定を所望する場合、マイコバクテ
リウム属（結核および非結核）に特異的あるいは特定の
マイコバクテリウム種に特異的な、オリゴヌクレオチド
プローブまたはプライマーを必要とする。
【０００４】マイコバクテリウム カンサシイの同定
は、従来の研究室では、生化学的試験および増殖特性の
測定によって行われている。これらには、カタラーゼ生
成、ウレアーゼ活性、ＴＷＥＥＮ加水分解、硝酸塩還
元、および細菌を光に晒した時に色素を生成する細菌の
能力（光発色能）が含まれる。数種のその他のマイコバ
クテリウムが同様の生化学的プロフィールを示すため、
光発色能は、マイコバクテリウム カンサシイを同定す
るための決定的な特徴として、従来から行われてきた。
しかしながら、光発色能の決定には、生物体の純粋培養
が必要であり、さらに、この表現型は、変化し易く、主
観的であり、かつ確実に決定することが難しい。これら
の理由により、オリゴヌクレオチドプローブを用いた種
特異的ハイブリダイゼーションまたは核酸増幅によって
マイコバクテリウム カンサシイを同定する試みがなさ
れてきた。Ｚ．Ｈ．Ｈｕａｎｇら（１９９１，Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９，２１２５−２１２
９）は、ゲノムライブラリーからマイコバクテリウム
カンサシイにある程度の種特異性を持つＤＮＡプローブ
を得たと報告している。このクローン（ｐＭＫ１−９）
は、マイコバクテリウムガスツリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）
を含むその他の種とも多少のクロス−ハイブリダイズ
し、かつマイコバクテリウム カンサシイの遺伝的に遠
いサブグループを検出しなかった。ｐＭＫ１−９のヌク
レオチド配列は報告されておらず、それから誘導される
であろう遺伝子も同定されなかった。また、Ｂ．Ｃ．Ｒ
ｏｓｓら（１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，３０，２９３０−２９３３）は、ｐＭＫ１−９プ
ローブ、６５ｋＤａ抗原遺伝子プローブ、およびｒＲＮ
Ａに特異的にハイブリダイズするプローブを用いた商品
として入手可能なＤＮＡプローブ試験（ＡＣＣＵ−ＰＲ
ＯＢＥ、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃ
Ａ）、を用いてマイコバクテリウム カンサシイの遺伝
的に遠い亜種を同定したと報告している。１６ＳｒＲＮ
Ａ遺伝子にハイブリダイズする増幅プライマーを用い
て、研究されているマイコバクテリウム カンサシイ変
異体の１６ＳｒＲＮＡの遺伝子配列をシークエンシング
し比較した。Ｍ．Ｙａｎｇら（１９９３、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１，２７６９−２７７
２）は、患者より得た分離菌より一つの配列を分離し、
この分離物をハイブリダイゼーションプローブとして用
いた場合、マイコバクテリウム カンサシイに種特異的
を示したと報告している。このプローブ（ｐ６１２３）
は、ｐＭＫ１−９にハイブリダイズしなかったサブグル
ープを含む、試験したすべてのマイコバクテリウム カ
ンサシイ株にハイブリダイズした。
は、従来の研究室では、生化学的試験および増殖特性の
測定によって行われている。これらには、カタラーゼ生
成、ウレアーゼ活性、ＴＷＥＥＮ加水分解、硝酸塩還
元、および細菌を光に晒した時に色素を生成する細菌の
能力（光発色能）が含まれる。数種のその他のマイコバ
クテリウムが同様の生化学的プロフィールを示すため、
光発色能は、マイコバクテリウム カンサシイを同定す
るための決定的な特徴として、従来から行われてきた。
しかしながら、光発色能の決定には、生物体の純粋培養
が必要であり、さらに、この表現型は、変化し易く、主
観的であり、かつ確実に決定することが難しい。これら
の理由により、オリゴヌクレオチドプローブを用いた種
特異的ハイブリダイゼーションまたは核酸増幅によって
マイコバクテリウム カンサシイを同定する試みがなさ
れてきた。Ｚ．Ｈ．Ｈｕａｎｇら（１９９１，Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９，２１２５−２１２
９）は、ゲノムライブラリーからマイコバクテリウム
カンサシイにある程度の種特異性を持つＤＮＡプローブ
を得たと報告している。このクローン（ｐＭＫ１−９）
は、マイコバクテリウムガスツリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）
を含むその他の種とも多少のクロス−ハイブリダイズ
し、かつマイコバクテリウム カンサシイの遺伝的に遠
いサブグループを検出しなかった。ｐＭＫ１−９のヌク
レオチド配列は報告されておらず、それから誘導される
であろう遺伝子も同定されなかった。また、Ｂ．Ｃ．Ｒ
ｏｓｓら（１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，３０，２９３０−２９３３）は、ｐＭＫ１−９プ
ローブ、６５ｋＤａ抗原遺伝子プローブ、およびｒＲＮ
Ａに特異的にハイブリダイズするプローブを用いた商品
として入手可能なＤＮＡプローブ試験（ＡＣＣＵ−ＰＲ
ＯＢＥ、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃ
Ａ）、を用いてマイコバクテリウム カンサシイの遺伝
的に遠い亜種を同定したと報告している。１６ＳｒＲＮ
Ａ遺伝子にハイブリダイズする増幅プライマーを用い
て、研究されているマイコバクテリウム カンサシイ変
異体の１６ＳｒＲＮＡの遺伝子配列をシークエンシング
し比較した。Ｍ．Ｙａｎｇら（１９９３、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１，２７６９−２７７
２）は、患者より得た分離菌より一つの配列を分離し、
この分離物をハイブリダイゼーションプローブとして用
いた場合、マイコバクテリウム カンサシイに種特異的
を示したと報告している。このプローブ（ｐ６１２３）
は、ｐＭＫ１−９にハイブリダイズしなかったサブグル
ープを含む、試験したすべてのマイコバクテリウム カ
ンサシイ株にハイブリダイズした。
【０００５】Ｔ．Ｒｏｇａｌｌら（１９９０，Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３６，１９１５−１９２
０）は、マイコバクテリウム種を同定するための、ポリ
メラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に基く、配列決定法において
１６ＳｒＲＮＡ配列を用いた。しかしながら、これらの
プライマーはマイコバクテリウム カンサシイからマイ
コバクテリウム ガスツリを識別するために用いること
は出来なかった。なぜなら、これら２種の１６ＳｒＲＮ
Ａは、これらの２種の菌が異なる表現型特性を示すにも
かかわらず、同一であるためである。同様の研究がＢ．
Ｂｏｄｄｉｎｇｈａｕｓら（１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８，１７５１−１７５９）に
よっても公表されており、彼等は、ヒト結核菌のグルー
プ、即ち、トリ結核菌、パラ結核菌、およびマイコバク
テリウム イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌ
ｌｕｌａｒｅ）、に特異的な１６ＳｒＲＮＡから誘導し
たオリゴヌクレオチドについて報告している。
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３６，１９１５−１９２
０）は、マイコバクテリウム種を同定するための、ポリ
メラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に基く、配列決定法において
１６ＳｒＲＮＡ配列を用いた。しかしながら、これらの
プライマーはマイコバクテリウム カンサシイからマイ
コバクテリウム ガスツリを識別するために用いること
は出来なかった。なぜなら、これら２種の１６ＳｒＲＮ
Ａは、これらの２種の菌が異なる表現型特性を示すにも
かかわらず、同一であるためである。同様の研究がＢ．
Ｂｏｄｄｉｎｇｈａｕｓら（１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８，１７５１−１７５９）に
よっても公表されており、彼等は、ヒト結核菌のグルー
プ、即ち、トリ結核菌、パラ結核菌、およびマイコバク
テリウム イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌ
ｌｕｌａｒｅ）、に特異的な１６ＳｒＲＮＡから誘導し
たオリゴヌクレオチドについて報告している。
【０００６】本発明は、マイコバクテリウム カンサシ
イを種特異的に検出し同定するための増幅プライマーと
して有用な核酸配列を提供する。種特異的とは、本発明
のプライマーが、マイコバクテリウム ガスツリ、ロド
コッカス ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈ
ｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）およびノカルディア アステロイ
デス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）のよ
うな、マイコバクテリウムのその他の種または非常に近
種の微生物の標的配列の増幅をほとんどまたはまったく
検出しないで、マイコバクテリウム カンサシイ核酸の
標的配列を増幅することを意味する。本発明の増幅プラ
イマーは、Ｙａｎｇら（１９９３）によって以前に報告
されているｐ６１２３配列より誘導したが、Ｙａｎｇら
は、以前は、全長のｐ６１２３配列のみを用いて、プロ
ーブハイブリダイゼーション（即ち、サザン ブロッ
ト）による種特異性について示した。本発明以前には、
種特異性を残存しかつＳＤＡのプライマーとしても機能
する短い増幅プライマーをデザインできるか否かについ
ては、知られていなかった。
イを種特異的に検出し同定するための増幅プライマーと
して有用な核酸配列を提供する。種特異的とは、本発明
のプライマーが、マイコバクテリウム ガスツリ、ロド
コッカス ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈ
ｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）およびノカルディア アステロイ
デス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）のよ
うな、マイコバクテリウムのその他の種または非常に近
種の微生物の標的配列の増幅をほとんどまたはまったく
検出しないで、マイコバクテリウム カンサシイ核酸の
標的配列を増幅することを意味する。本発明の増幅プラ
イマーは、Ｙａｎｇら（１９９３）によって以前に報告
されているｐ６１２３配列より誘導したが、Ｙａｎｇら
は、以前は、全長のｐ６１２３配列のみを用いて、プロ
ーブハイブリダイゼーション（即ち、サザン ブロッ
ト）による種特異性について示した。本発明以前には、
種特異性を残存しかつＳＤＡのプライマーとしても機能
する短い増幅プライマーをデザインできるか否かについ
ては、知られていなかった。
【０００７】プライマーは、サンプルを培養した後に、
培養物の同一性を確認する手段として用いられるであろ
う。代わりに、当業者に既知の核酸増幅技術を用いてマ
イコバクテリウムＤＮＡを検出および同定するために培
養する前にプライマーを用いても良い。いずれの場合
も、本発明のプライマーおよび診断方法は、マイコバク
テリウム カンサシイとその他のマイコバクテリウム種
との間の迅速な識別手段を提供し、開業医が従来より行
われてきた時間の掛かる表現型や生化学的な方法を行わ
ずにこの微生物を迅速に同定できるようにする。そのよ
うなマイコバクテリウム感染症を含む明確な病因学的原
因を迅速に同定することは、短時間内に適切な治療法を
決定するために用いられうる情報を提供する。
培養物の同一性を確認する手段として用いられるであろ
う。代わりに、当業者に既知の核酸増幅技術を用いてマ
イコバクテリウムＤＮＡを検出および同定するために培
養する前にプライマーを用いても良い。いずれの場合
も、本発明のプライマーおよび診断方法は、マイコバク
テリウム カンサシイとその他のマイコバクテリウム種
との間の迅速な識別手段を提供し、開業医が従来より行
われてきた時間の掛かる表現型や生化学的な方法を行わ
ずにこの微生物を迅速に同定できるようにする。そのよ
うなマイコバクテリウム感染症を含む明確な病因学的原
因を迅速に同定することは、短時間内に適切な治療法を
決定するために用いられうる情報を提供する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸増幅反
応でマイコバクテリウム カンサシイに特異性を示すオ
リゴヌクレオチド増幅プライマーを提供する。また、本
発明の増幅プライマーを用いて、マイコバクテリウム
カンサシイ核酸を検出および同定するための方法を提供
する。患者および環境より得たマイコバクテリウム カ
ンサシイ分離菌のうち試験した菌の１００％が、本発明
の増幅プライマーを用いた増幅アッセイで陽性を示し
た。
応でマイコバクテリウム カンサシイに特異性を示すオ
リゴヌクレオチド増幅プライマーを提供する。また、本
発明の増幅プライマーを用いて、マイコバクテリウム
カンサシイ核酸を検出および同定するための方法を提供
する。患者および環境より得たマイコバクテリウム カ
ンサシイ分離菌のうち試験した菌の１００％が、本発明
の増幅プライマーを用いた増幅アッセイで陽性を示し
た。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明のオリゴヌクレオ
チドは、マイコバクテリウムを含むと予想されるサンプ
ル内のマイコバクテリウム カンサシイの標的核酸配列
を検出するための増幅プライマーとして特に有用であ
る。サンプルは、分離した核酸、分離した微生物からな
って良く、医療サンプルであってもよい。典型的には、
医療サンプルは、体液またはその組織の形、例えば、
痰、気管支洗浄液、胃洗浄液、血液、乳汁、リンパ、皮
膚および柔組織、である。核酸が遊離した状態ではなく
むしろ微生物がそのままの状態で含まれていると予想さ
れるサンプルは、一般的には、本発明のプライマーとハ
イブリダイズさせる前に、この技術分野で既知の方法を
用いて処理して、存在するであろうと思われる任意の微
生物から核酸を遊離させる。さらに、サンプルが痰であ
る場合には、分析のために核酸を遊離させる前に、液体
化するのが典型的である。適切な液体化法は、この技術
分野で既知である。マイコバクテリウムはヒトおよびヒ
ト以外の動物種の両方に感染するため、本発明はヒトお
よび動物の両方の診断法として応用でき、サンプルはど
ちらから得ても良い。ヒトは、ヒト結核菌、マイコバク
テリウム カンサシイ、トリ結核菌、マイコバクテリウ
ム イントラセルラーレ、マイコバクテリウム スクロ
フラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、および
マイコバクテリウム ホルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉ
ｔｕｍ）を含む、さまざまなマイコバクテリウムに感染
する可能性があるので、即時に用いることの出来るプラ
イマーおよび診断法は、マイコバクテリウム カンサシ
イが病因学的原因である患者を迅速に同定するために用
いられ、それ故、適切な治療法の選択することを助ける
であろう。
チドは、マイコバクテリウムを含むと予想されるサンプ
ル内のマイコバクテリウム カンサシイの標的核酸配列
を検出するための増幅プライマーとして特に有用であ
る。サンプルは、分離した核酸、分離した微生物からな
って良く、医療サンプルであってもよい。典型的には、
医療サンプルは、体液またはその組織の形、例えば、
痰、気管支洗浄液、胃洗浄液、血液、乳汁、リンパ、皮
膚および柔組織、である。核酸が遊離した状態ではなく
むしろ微生物がそのままの状態で含まれていると予想さ
れるサンプルは、一般的には、本発明のプライマーとハ
イブリダイズさせる前に、この技術分野で既知の方法を
用いて処理して、存在するであろうと思われる任意の微
生物から核酸を遊離させる。さらに、サンプルが痰であ
る場合には、分析のために核酸を遊離させる前に、液体
化するのが典型的である。適切な液体化法は、この技術
分野で既知である。マイコバクテリウムはヒトおよびヒ
ト以外の動物種の両方に感染するため、本発明はヒトお
よび動物の両方の診断法として応用でき、サンプルはど
ちらから得ても良い。ヒトは、ヒト結核菌、マイコバク
テリウム カンサシイ、トリ結核菌、マイコバクテリウ
ム イントラセルラーレ、マイコバクテリウム スクロ
フラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、および
マイコバクテリウム ホルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉ
ｔｕｍ）を含む、さまざまなマイコバクテリウムに感染
する可能性があるので、即時に用いることの出来るプラ
イマーおよび診断法は、マイコバクテリウム カンサシ
イが病因学的原因である患者を迅速に同定するために用
いられ、それ故、適切な治療法の選択することを助ける
であろう。
【００１０】望ましくは、本発明のオリゴヌクレオチド
プライマーは、マイコバクテリウム核酸標的配列を増幅
させることによって、マイコバクテリウム カンサシイ
を検出および／または同定するために用いられる。しか
しながら、標的配列とハイブリダイズするプライマーの
一部分を、種々の核酸ハイブリダイゼーション法でマイ
コバクテリウム カンサシイ標的核酸を直接検出するた
めのハイブリダイゼーションプローブとして用いても良
い。ハイブリダイゼーション法には、ＤＮＡを検出する
サザンブロット、ＲＮＡを検出するノーザンブロット、
およびＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを検出するドット
ブロットが含まれる。それらの方法はこの技術分野では
一般的に良く知られており、かつＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，第２版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉ
ｔｓｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，１９８９に記載されている。望ましい実施態様で
は、サンプル内のマイコバクテリウム カンサシイの存
在が、標的核酸配列の種特異的増幅によって、検出およ
び／または同定される。この実施態様では、本発明の増
幅プライマーは従来から行われている核酸増幅のプロト
コールで用いられる。プライマーの標的核酸への特異的
ハイブリダイゼーションを繰返して行うための任意の増
幅のプロトコール、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｐ
ＣＲ：米国特許第４，６８３，１９５；４，６８３，２
０２；４，８００，１５９；４，９６５，１８８号）、
ストランド置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅ
ｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）
（Ｇ．Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９
６；Ｇ．Ｗａｌｋｅｒら、１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６；米国特許
第５，２７０，１８４号、ここに参照として取り入れ
る）、核酸を基本とした配列増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａ
ｃｉｄ ｂａｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ：米国特許第５，１３０，
２３８号、ｔｏ Ｃａｎｇｅｎｅ）、転写を基本とした
増幅（Ｄ．Ｋｗｏｈら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１
７７）、自己持続する配列複製（Ｊ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ
ら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８）、またはＱβ
レプリカーゼシステム（Ｐ．Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８
８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７−１２
０２）が用いられて良い。本発明のプライマーを用いる
に当たっての望ましい増幅法は、プライマーの標的配列
への特異的ハイブリダイゼーションが繰り返し起こるこ
と、鋳型として標的配列を用いてプライマーを伸長させ
ること、および標的配列からの伸長したプライマーを置
換することによる方法、例えばＰＣＲおよびＳＤＡ、で
ある。
プライマーは、マイコバクテリウム核酸標的配列を増幅
させることによって、マイコバクテリウム カンサシイ
を検出および／または同定するために用いられる。しか
しながら、標的配列とハイブリダイズするプライマーの
一部分を、種々の核酸ハイブリダイゼーション法でマイ
コバクテリウム カンサシイ標的核酸を直接検出するた
めのハイブリダイゼーションプローブとして用いても良
い。ハイブリダイゼーション法には、ＤＮＡを検出する
サザンブロット、ＲＮＡを検出するノーザンブロット、
およびＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを検出するドット
ブロットが含まれる。それらの方法はこの技術分野では
一般的に良く知られており、かつＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，第２版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉ
ｔｓｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，１９８９に記載されている。望ましい実施態様で
は、サンプル内のマイコバクテリウム カンサシイの存
在が、標的核酸配列の種特異的増幅によって、検出およ
び／または同定される。この実施態様では、本発明の増
幅プライマーは従来から行われている核酸増幅のプロト
コールで用いられる。プライマーの標的核酸への特異的
ハイブリダイゼーションを繰返して行うための任意の増
幅のプロトコール、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｐ
ＣＲ：米国特許第４，６８３，１９５；４，６８３，２
０２；４，８００，１５９；４，９６５，１８８号）、
ストランド置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅ
ｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）
（Ｇ．Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９
６；Ｇ．Ｗａｌｋｅｒら、１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６；米国特許
第５，２７０，１８４号、ここに参照として取り入れ
る）、核酸を基本とした配列増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａ
ｃｉｄ ｂａｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ：米国特許第５，１３０，
２３８号、ｔｏ Ｃａｎｇｅｎｅ）、転写を基本とした
増幅（Ｄ．Ｋｗｏｈら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１
７７）、自己持続する配列複製（Ｊ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ
ら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８）、またはＱβ
レプリカーゼシステム（Ｐ．Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８
８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７−１２
０２）が用いられて良い。本発明のプライマーを用いる
に当たっての望ましい増幅法は、プライマーの標的配列
への特異的ハイブリダイゼーションが繰り返し起こるこ
と、鋳型として標的配列を用いてプライマーを伸長させ
ること、および標的配列からの伸長したプライマーを置
換することによる方法、例えばＰＣＲおよびＳＤＡ、で
ある。
【００１１】増幅プライマーは、プライマーを伸長させ
ること、または標的配列にハイブリダイズした隣接位置
のプライマー同士を結合させること、によって標的配列
を増幅させるためのプライマーである。ＳＤＡによる増
幅では、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＧＣ含有率
が低い、好適にはプローブの全ヌクレオチド組成の７０
％より小さくなるように選択されることが望ましい。同
様に、ＳＤＡの場合、標的配列は、二次構造を最小にす
るために、ＧＣ含有率が低いことが望ましい。ＳＤＡ増
幅プライマーの３' 末端（標的結合配列）は、標的配列
の３' 末端にハイブリダイズする。標的結合配列は、増
幅プライマーに標的特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライ
マーは、さらに、その５' 末端近くに制限エンドヌクレ
アーゼの認識サイトを含む。認識サイトは、Ｗａｌｋｅ
ｒら（１９９２，ＰＮＡＳ ８９，３９２−３９６）に
記載されているように、認識サイトの片方の鎖が修飾さ
れる場合にＤＮＡ二重らせんの一本鎖にニックを入れる
であろう制限エンドヌクレアーゼのためのものである。
ＳＤＡ反応の大部分において、増幅プライマーは標的配
列を指数的に増幅させる。また、ＳＤＡ増幅プライマー
は、“Ｓ”プライマーと呼ばれ、例えば一対の増幅プラ
イマーが二本鎖の配列の増幅に用いられる場合にはＳ１
およびＳ２と呼ばれる。標的の末端に特別な配列を持つ
必要のないその他の増幅方法では、一般的に、増幅プラ
イマーは標的結合配列のみからなる。例えば、本発明で
は、ＰＣＲによるマイコバクテリウム カンサシイの特
異的増幅には、ＳＤＡプライマーの標的結合配列からな
る増幅プライマーが用いられるであろう。これらは、標
的配列にハイブリダイズし、ポリメラーゼによって伸長
され、さらに伸長生成物はＰＣＲで慣習的に行われてい
るように、加熱によって置換される。
ること、または標的配列にハイブリダイズした隣接位置
のプライマー同士を結合させること、によって標的配列
を増幅させるためのプライマーである。ＳＤＡによる増
幅では、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＧＣ含有率
が低い、好適にはプローブの全ヌクレオチド組成の７０
％より小さくなるように選択されることが望ましい。同
様に、ＳＤＡの場合、標的配列は、二次構造を最小にす
るために、ＧＣ含有率が低いことが望ましい。ＳＤＡ増
幅プライマーの３' 末端（標的結合配列）は、標的配列
の３' 末端にハイブリダイズする。標的結合配列は、増
幅プライマーに標的特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライ
マーは、さらに、その５' 末端近くに制限エンドヌクレ
アーゼの認識サイトを含む。認識サイトは、Ｗａｌｋｅ
ｒら（１９９２，ＰＮＡＳ ８９，３９２−３９６）に
記載されているように、認識サイトの片方の鎖が修飾さ
れる場合にＤＮＡ二重らせんの一本鎖にニックを入れる
であろう制限エンドヌクレアーゼのためのものである。
ＳＤＡ反応の大部分において、増幅プライマーは標的配
列を指数的に増幅させる。また、ＳＤＡ増幅プライマー
は、“Ｓ”プライマーと呼ばれ、例えば一対の増幅プラ
イマーが二本鎖の配列の増幅に用いられる場合にはＳ１
およびＳ２と呼ばれる。標的の末端に特別な配列を持つ
必要のないその他の増幅方法では、一般的に、増幅プラ
イマーは標的結合配列のみからなる。例えば、本発明で
は、ＰＣＲによるマイコバクテリウム カンサシイの特
異的増幅には、ＳＤＡプライマーの標的結合配列からな
る増幅プライマーが用いられるであろう。これらは、標
的配列にハイブリダイズし、ポリメラーゼによって伸長
され、さらに伸長生成物はＰＣＲで慣習的に行われてい
るように、加熱によって置換される。
【００１２】バンパーまたは外部プライマーは、増幅プ
ライマーの上流で、標的配列にアニールする、ＳＤＡで
用いられるプライマーであり、バンパープライマーの伸
長物は、下流の増幅プライマーおよびその伸長生成物を
置換する。また、バンパープライマーは、“Ｂ”プライ
マーと呼ばれ、例えば一対のバンパープライマーが一対
の増幅プライマーの伸長生成物を置換する場合にはＢ１
およびＢ２とも呼ばれる。バンパープライマーの伸長
は、増幅プライマーの伸長生成物を置換するための一つ
の方法であるが、加熱法もまた適当である。
ライマーの上流で、標的配列にアニールする、ＳＤＡで
用いられるプライマーであり、バンパープライマーの伸
長物は、下流の増幅プライマーおよびその伸長生成物を
置換する。また、バンパープライマーは、“Ｂ”プライ
マーと呼ばれ、例えば一対のバンパープライマーが一対
の増幅プライマーの伸長生成物を置換する場合にはＢ１
およびＢ２とも呼ばれる。バンパープライマーの伸長
は、増幅プライマーの伸長生成物を置換するための一つ
の方法であるが、加熱法もまた適当である。
【００１３】標的または標的配列という言葉は、増幅プ
ライマーによって増幅される核酸配列を指す。これら
は、増幅されるマイコバクテリウム本来の核酸配列、増
幅されるマイコバクテリウムの核酸配列の相補的な第二
の鎖、および増幅反応によって生成される本来の配列の
いずれかのコピー鎖、を含む。また、これらのコピー
は、増幅プライマーがハイブリダイズする本来の標的配
列のコピーをも含むと言う事実によって、増幅されうる
標的配列として提供される。
ライマーによって増幅される核酸配列を指す。これら
は、増幅されるマイコバクテリウム本来の核酸配列、増
幅されるマイコバクテリウムの核酸配列の相補的な第二
の鎖、および増幅反応によって生成される本来の配列の
いずれかのコピー鎖、を含む。また、これらのコピー
は、増幅プライマーがハイブリダイズする本来の標的配
列のコピーをも含むと言う事実によって、増幅されうる
標的配列として提供される。
【００１４】増幅反応の間に生成される標的配列のコピ
ーは、増幅生成物、アンプリマー（ａｍｐｌｉｎｅｒ）
またはアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）と呼ばれる。
ーは、増幅生成物、アンプリマー（ａｍｐｌｉｎｅｒ）
またはアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）と呼ばれる。
【００１５】伸長生成物という言葉は、増幅プライマー
のハイブリダイゼーションおよび鋳型として標的配列を
用いたポリメラーゼによる増幅プライマーの伸長によっ
て生成した標的配列の一本鎖のコピーを指す。
のハイブリダイゼーションおよび鋳型として標的配列を
用いたポリメラーゼによる増幅プライマーの伸長によっ
て生成した標的配列の一本鎖のコピーを指す。
【００１６】マイコバクテリウム カンサシイ標的配列
の増幅に望ましい方法は、ストランド置換増幅（ＳＤ
Ａ）である。ＳＤＡ標的生成物および増幅反応の略図を
図１に示す。標的ＤＮＡは過剰の４種のプライマー（Ｂ
１、Ｂ２、Ｓ１およびＳ２）存在下で加熱変性させる。
Ｓ１およびＳ２は、増幅プライマーの３' 末端に標的結
合配列を、および標的結合配列の５' 側に制限エンドヌ
クレアーゼ認識サイト（例えば、ＨｉｎｃＩＩ−5'ＧＴ
ＴＧＡＣ）を含む増幅プライマーである。制限エンドヌ
クレアーゼ認識サイトは、盛り上がったボックスで示し
ている。便宜上、以下の記述では、例としてＨｉｎｃＩ
Ｉおよびｅｘｏ−クレノウポリメラーゼを用いるが、Ｓ
ＤＡでの使用に既知の任意の制限エンドヌクレアーゼお
よび３'-５' エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを用
いても良い。
の増幅に望ましい方法は、ストランド置換増幅（ＳＤ
Ａ）である。ＳＤＡ標的生成物および増幅反応の略図を
図１に示す。標的ＤＮＡは過剰の４種のプライマー（Ｂ
１、Ｂ２、Ｓ１およびＳ２）存在下で加熱変性させる。
Ｓ１およびＳ２は、増幅プライマーの３' 末端に標的結
合配列を、および標的結合配列の５' 側に制限エンドヌ
クレアーゼ認識サイト（例えば、ＨｉｎｃＩＩ−5'ＧＴ
ＴＧＡＣ）を含む増幅プライマーである。制限エンドヌ
クレアーゼ認識サイトは、盛り上がったボックスで示し
ている。便宜上、以下の記述では、例としてＨｉｎｃＩ
Ｉおよびｅｘｏ−クレノウポリメラーゼを用いるが、Ｓ
ＤＡでの使用に既知の任意の制限エンドヌクレアーゼお
よび３'-５' エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを用
いても良い。
【００１７】Ｓ１およびＳ２配列は、増幅される領域に
隣接する、二本鎖の標的配列のそれぞれ別の鎖にハイブ
リダイズする。Ｂ１およびＢ２は、標的結合配列のみか
らなり、かつＳ１およびＳ２の５' 側の位置にハイブリ
ダイズする外部プライマーまたはバンパープライマーで
ある。プライマーを約４０℃で標的にアニーリングした
後、ＨｉｎｃＩＩを、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのエ
キソヌクレアーゼ欠損型のクレノウフラグメント（ｅｘ
ｏ- クレノウ）と共に加える。この段階では、図１−Ａ
の残存する標的生成段階は、単独のカスケードとして進
行する。ｅｘｏ- クレノウは、標的配列のモル数より大
過剰存在し、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ（またはＴ
ＴＰ）、およびｄＡＴＰαＳ（デオキシアデノシン
５'-［α−チオ］トリホスフェート）を用いて４つのプ
ライマーのすべてを同時に伸長する。Ｓ１およびＳ２は
伸長し、それらの伸長生成物はＢ１およびＢ２の伸長物
によって置換される。置換されたＳ１およびＳ２の伸長
生成物（Ｓ１−ｅｘｔおよびＳ２−ｅｘｔ）は、相対す
る別の増幅プライマー（Ｓ２およびＳ１）に結合する標
的として提供される。さらに、伸長、置換のサイクルを
繰り返すと、それぞれの末端にヘミホスホロチオ酸化Ｈ
ｉｎｃＩＩサイトを持つ二つの標的フラグメント、およ
び片側の末端のみにヘミホスホロチオ酸化ＨｉｎｃＩＩ
サイトを持つ二つのより長い標的フラグメントが生成さ
れる（図１−Ｂ）。ポリメラーゼによって二本鎖の内の
一本にｄＡＴＰの変わりにｄＡＴＰαＳを組み入れる
と、制限エンドヌクレアーゼは二重らせんの両ストラン
ドを切断するよりむしろ一本のストランドにニックを入
れるようになる。ニックを入れる（“Ｎｉｃｋｉｎ
ｇ”）とは、二本鎖を切断するのではなく、二本鎖ＤＮ
Ａの一本のストランドを切断することを指す。Ｈｉｎｃ
ＩＩは、修飾された相補鎖はそのままの状態に残したま
ま、ヘミホスホロチオ酸化認識サイトの未修飾のプライ
マーストランドにニックを入れる。次いで、ｅｘｏ- ク
レノウがニックの３' 末端から伸長し、下流を新たに合
成されたストランドに置換する。新たなＳ１およびＳ２
プライマーが置換されたストランドと結合し、伸長され
る。これに次いで、図１−Ｂ上に示すような４種類の二
重らせんが図１−Ｂ下に示すような増幅サイクルの定常
状態になるまで、さらなるニッキングの段階およびスト
ランドの置換の段階が引き続いて起こる。各ＳＤＡサイ
クルでは、Ｓ１の３' 末端は置換された標的ストランド
Ｔ２の３' 末端とハイブリダイズし、５' の突出した二
重らせんを形成する。同様に、Ｓ２は、置換されたＴ１
と結合する。ｅｘｏ- クレノウは、二重らせんの引っ込
んだ３' 末端を伸長し、ＨｉｎｃＩＩによってニックを
入れられるヘミホスホロチオ酸塩認識サイトを形成す
る。ニック位置での伸長がニックを入れ得るＨｉｎｃＩ
Ｉ認識サイトを再生するために、これらのニッキングお
よび伸長／置換の段階は、連続して循環する（図１−Ｂ
下に、短い曲線の矢印でしめす）。Ｓ１−Ｔ２二重らせ
んから置換されたストランドはＴ１と同一である。同様
に、Ｓ２−Ｔ１二重らせんから置換されたストランドは
Ｔ２と同一である。従って、置換されたＴ２はそれぞれ
新たなＳ１プライマーと結合し、置換されたＴ１はそれ
ぞれ新たなＳ２と結合する（図１−Ｂ下に長い曲線の矢
印で示す）ために、標的は指数的に増幅される。センス
ストランドおよびアンチセンスストランドを細い線およ
び太い線によって区別する。完全およびニックを入れた
ＨｉｎｃＩＩ認識サイトを
隣接する、二本鎖の標的配列のそれぞれ別の鎖にハイブ
リダイズする。Ｂ１およびＢ２は、標的結合配列のみか
らなり、かつＳ１およびＳ２の５' 側の位置にハイブリ
ダイズする外部プライマーまたはバンパープライマーで
ある。プライマーを約４０℃で標的にアニーリングした
後、ＨｉｎｃＩＩを、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのエ
キソヌクレアーゼ欠損型のクレノウフラグメント（ｅｘ
ｏ- クレノウ）と共に加える。この段階では、図１−Ａ
の残存する標的生成段階は、単独のカスケードとして進
行する。ｅｘｏ- クレノウは、標的配列のモル数より大
過剰存在し、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ（またはＴ
ＴＰ）、およびｄＡＴＰαＳ（デオキシアデノシン
５'-［α−チオ］トリホスフェート）を用いて４つのプ
ライマーのすべてを同時に伸長する。Ｓ１およびＳ２は
伸長し、それらの伸長生成物はＢ１およびＢ２の伸長物
によって置換される。置換されたＳ１およびＳ２の伸長
生成物（Ｓ１−ｅｘｔおよびＳ２−ｅｘｔ）は、相対す
る別の増幅プライマー（Ｓ２およびＳ１）に結合する標
的として提供される。さらに、伸長、置換のサイクルを
繰り返すと、それぞれの末端にヘミホスホロチオ酸化Ｈ
ｉｎｃＩＩサイトを持つ二つの標的フラグメント、およ
び片側の末端のみにヘミホスホロチオ酸化ＨｉｎｃＩＩ
サイトを持つ二つのより長い標的フラグメントが生成さ
れる（図１−Ｂ）。ポリメラーゼによって二本鎖の内の
一本にｄＡＴＰの変わりにｄＡＴＰαＳを組み入れる
と、制限エンドヌクレアーゼは二重らせんの両ストラン
ドを切断するよりむしろ一本のストランドにニックを入
れるようになる。ニックを入れる（“Ｎｉｃｋｉｎ
ｇ”）とは、二本鎖を切断するのではなく、二本鎖ＤＮ
Ａの一本のストランドを切断することを指す。Ｈｉｎｃ
ＩＩは、修飾された相補鎖はそのままの状態に残したま
ま、ヘミホスホロチオ酸化認識サイトの未修飾のプライ
マーストランドにニックを入れる。次いで、ｅｘｏ- ク
レノウがニックの３' 末端から伸長し、下流を新たに合
成されたストランドに置換する。新たなＳ１およびＳ２
プライマーが置換されたストランドと結合し、伸長され
る。これに次いで、図１−Ｂ上に示すような４種類の二
重らせんが図１−Ｂ下に示すような増幅サイクルの定常
状態になるまで、さらなるニッキングの段階およびスト
ランドの置換の段階が引き続いて起こる。各ＳＤＡサイ
クルでは、Ｓ１の３' 末端は置換された標的ストランド
Ｔ２の３' 末端とハイブリダイズし、５' の突出した二
重らせんを形成する。同様に、Ｓ２は、置換されたＴ１
と結合する。ｅｘｏ- クレノウは、二重らせんの引っ込
んだ３' 末端を伸長し、ＨｉｎｃＩＩによってニックを
入れられるヘミホスホロチオ酸塩認識サイトを形成す
る。ニック位置での伸長がニックを入れ得るＨｉｎｃＩ
Ｉ認識サイトを再生するために、これらのニッキングお
よび伸長／置換の段階は、連続して循環する（図１−Ｂ
下に、短い曲線の矢印でしめす）。Ｓ１−Ｔ２二重らせ
んから置換されたストランドはＴ１と同一である。同様
に、Ｓ２−Ｔ１二重らせんから置換されたストランドは
Ｔ２と同一である。従って、置換されたＴ２はそれぞれ
新たなＳ１プライマーと結合し、置換されたＴ１はそれ
ぞれ新たなＳ２と結合する（図１−Ｂ下に長い曲線の矢
印で示す）ために、標的は指数的に増幅される。センス
ストランドおよびアンチセンスストランドを細い線およ
び太い線によって区別する。完全およびニックを入れた
ＨｉｎｃＩＩ認識サイトを
【化１】 で表わす。部分的ＨｉｎｃＩＩ認識サイト（５'-ＧＡＣ
およびそれに相補的な５'-ＧＴＣ）は、置換されたスト
ランドの５'および３'末端に存在し、それぞれ
およびそれに相補的な５'-ＧＴＣ）は、置換されたスト
ランドの５'および３'末端に存在し、それぞれ
【化２】 で表わす。
【００１８】ＳＤＡのための増幅プライマーをデザイン
するためのパラメーターについてはほとんど知られてい
ない。一般的に、ＧＣ含有率が比較的低く、かつ配列変
異性がより小さい標的配列が望ましい。しかしながら、
ＳＤＡによって増幅されるその様な領域が２つ（それぞ
れの増幅プライマーにハイブリダイゼ−ションするため
に）互いに十分接近した位置に存在しなくてはならな
い。一般型のＳＤＡは、ＰＣＲよりより短い標的、通
常、約１００ヌクレオチドより小さい標的を必要とす
る。しかしながら、これらの基準を満たすことができた
としても、ＳＤＡ用にデザインした増幅およびバンパー
プライマーの有効性は予想しがたい。標的配列に正確に
マッチするようにデザインされた増幅プライマーが、理
由は分からないが、それを増幅できない場合があるが、
それに対して、標的配列の同じ領域から誘導したミスマ
ッチを含む増幅プライマーがすべての変異株を有効に増
幅する場合もある。この事は、いくぶんかは、増幅プラ
イマーに含まれるその他の配列の不確定効果（例えば、
制限エンドヌクレアーゼ認識サイト、およびエンドヌク
レアーゼが結合するためのスペーサーとなる隣接配列）
によるかもしれない。加えて、バンパープライマーも、
それらは標的配列に直接関係するわけではなく、増幅の
過程にも直接的には関係しないにもかかわらず、時とし
て、増幅に重大な影響を与える。また、増幅プライマー
とバンパープライマーとの組み合わせも重要であること
も分かっている。即ち、バンパープライマー／増幅プラ
イマーの組み合わせによって、有効な増幅が可能になる
場合もあるが、同じバンパープライマーが非常に近似し
ているが異なる増幅プライマーと組み合わせて用いられ
た場合に、増幅が阻害されることもある。それ故、マイ
コバクテリウムの種の中で変異性がほとんどまたは全く
無い配列を同定することが第一の段階であるが、ＳＤＡ
での使用に適した増幅プライマーを確実にデザインする
には充分ではない。現在のところ、ＳＤＡプライマーを
デザインする過程は、標的配列としてはっきりとした見
込みのある２つの領域（ＧＣ低含有率、小さい配列変異
性、互いの近接性）を同定すること、一連の関連または
重複するプライマーをデザインすること、およびＳＤＡ
で組み合わせの異なるプライマーを試験して増幅が持続
されるか否かを決定すること、による。
するためのパラメーターについてはほとんど知られてい
ない。一般的に、ＧＣ含有率が比較的低く、かつ配列変
異性がより小さい標的配列が望ましい。しかしながら、
ＳＤＡによって増幅されるその様な領域が２つ（それぞ
れの増幅プライマーにハイブリダイゼ−ションするため
に）互いに十分接近した位置に存在しなくてはならな
い。一般型のＳＤＡは、ＰＣＲよりより短い標的、通
常、約１００ヌクレオチドより小さい標的を必要とす
る。しかしながら、これらの基準を満たすことができた
としても、ＳＤＡ用にデザインした増幅およびバンパー
プライマーの有効性は予想しがたい。標的配列に正確に
マッチするようにデザインされた増幅プライマーが、理
由は分からないが、それを増幅できない場合があるが、
それに対して、標的配列の同じ領域から誘導したミスマ
ッチを含む増幅プライマーがすべての変異株を有効に増
幅する場合もある。この事は、いくぶんかは、増幅プラ
イマーに含まれるその他の配列の不確定効果（例えば、
制限エンドヌクレアーゼ認識サイト、およびエンドヌク
レアーゼが結合するためのスペーサーとなる隣接配列）
によるかもしれない。加えて、バンパープライマーも、
それらは標的配列に直接関係するわけではなく、増幅の
過程にも直接的には関係しないにもかかわらず、時とし
て、増幅に重大な影響を与える。また、増幅プライマー
とバンパープライマーとの組み合わせも重要であること
も分かっている。即ち、バンパープライマー／増幅プラ
イマーの組み合わせによって、有効な増幅が可能になる
場合もあるが、同じバンパープライマーが非常に近似し
ているが異なる増幅プライマーと組み合わせて用いられ
た場合に、増幅が阻害されることもある。それ故、マイ
コバクテリウムの種の中で変異性がほとんどまたは全く
無い配列を同定することが第一の段階であるが、ＳＤＡ
での使用に適した増幅プライマーを確実にデザインする
には充分ではない。現在のところ、ＳＤＡプライマーを
デザインする過程は、標的配列としてはっきりとした見
込みのある２つの領域（ＧＣ低含有率、小さい配列変異
性、互いの近接性）を同定すること、一連の関連または
重複するプライマーをデザインすること、およびＳＤＡ
で組み合わせの異なるプライマーを試験して増幅が持続
されるか否かを決定すること、による。
【００１９】核酸は、ハイブリダイズするために完全な
相補性を必要としないので、ここで述べるプローブおよ
びプライマー配列は、マイコバクテリウム カンサシイ
に特異的なプローブおよびプライマーとしての有用性が
失われないようにある程度修飾されても良い。この技術
分野で知られているように、相補的および部分的に相補
的な核酸配列のハイブリダイゼーションは、厳密性を増
すあるいは減ずるようにハイブリダイゼーションの条件
を調節する（即ち、ハイブリダイゼーションの温度また
は緩衝液の塩含有量を調節する）ことによって可能にな
る。ここに示す配列をそのように部分的に修飾し、かつ
マイコバクテリウム カンサシイ特異性を維持するよう
にハイブリダイゼーション条件を任意に調節するのに必
要なのは日常的な実験のみであり、当業者によく知られ
ている。
相補性を必要としないので、ここで述べるプローブおよ
びプライマー配列は、マイコバクテリウム カンサシイ
に特異的なプローブおよびプライマーとしての有用性が
失われないようにある程度修飾されても良い。この技術
分野で知られているように、相補的および部分的に相補
的な核酸配列のハイブリダイゼーションは、厳密性を増
すあるいは減ずるようにハイブリダイゼーションの条件
を調節する（即ち、ハイブリダイゼーションの温度また
は緩衝液の塩含有量を調節する）ことによって可能にな
る。ここに示す配列をそのように部分的に修飾し、かつ
マイコバクテリウム カンサシイ特異性を維持するよう
にハイブリダイゼーション条件を任意に調節するのに必
要なのは日常的な実験のみであり、当業者によく知られ
ている。
【００２０】本発明のプライマーを用いて生成された増
幅生成物は、その大きさの特徴、例えばエチジウンブロ
ミドで染色されたポリアクリルアミドまたはアガロース
ゲル上で検出され得る。代わりに、サンプル中のマイコ
バクテリウム カンサシイ核酸または特異的に増幅され
たマイコバクテリウム カンサシイ標的配列を、本発明
の増幅プライマーまたはそれらの標的結合配列にハイブ
リダイズさせることによって検出しても良い。ハイブリ
ダイゼーションによって検出するためには、オリゴヌク
レオチドに検出可能な標識を付加するのが一般的であ
る。検出可能な標識とは、プローブの標的核酸へのハイ
ブリダイゼーションを示すものとして直接的または間接
的に検出することの出来る部分である。標識を直接検出
するために、プローブをラジオアイソトープで標識して
オートラジオグラフで検出しても良く、または蛍光部分
で標識してこの技術分野で既知なように蛍光で検出して
も良い。別の方法として、プローブを検出可能にするた
めに薬品の追加を必要とする標識を付加することによっ
て、プローブを間接的に検出しても良い。間接的に検出
可能な標識とは、例えば、化学発光試薬、目に見える反
応生成物を生成する酵素、および標識された特異的な結
合相手（例えば、抗体または抗原／ハプテン）と結合す
ることによって検出されるであろうリガンド（例えば、
ハプテン、抗体または抗原）を含む。とくに有効な標識
には、（標識したアビジンまたはストレプトアビジンと
結合することによって検出可能になる）ビオチン、およ
び（酵素基質を添加することによって色のついた反応生
成物を生成して検出可能になる）西洋ワサビのペルオキ
シダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素が
含まれる。その様な標識をオリゴヌクレオチドに付け加
える、またはその様な標識をオリゴヌクレオチド内に含
ませるための方法はこの技術分野で熟知されており、任
意のこれらの方法は本発明での使用に適している。
幅生成物は、その大きさの特徴、例えばエチジウンブロ
ミドで染色されたポリアクリルアミドまたはアガロース
ゲル上で検出され得る。代わりに、サンプル中のマイコ
バクテリウム カンサシイ核酸または特異的に増幅され
たマイコバクテリウム カンサシイ標的配列を、本発明
の増幅プライマーまたはそれらの標的結合配列にハイブ
リダイズさせることによって検出しても良い。ハイブリ
ダイゼーションによって検出するためには、オリゴヌク
レオチドに検出可能な標識を付加するのが一般的であ
る。検出可能な標識とは、プローブの標的核酸へのハイ
ブリダイゼーションを示すものとして直接的または間接
的に検出することの出来る部分である。標識を直接検出
するために、プローブをラジオアイソトープで標識して
オートラジオグラフで検出しても良く、または蛍光部分
で標識してこの技術分野で既知なように蛍光で検出して
も良い。別の方法として、プローブを検出可能にするた
めに薬品の追加を必要とする標識を付加することによっ
て、プローブを間接的に検出しても良い。間接的に検出
可能な標識とは、例えば、化学発光試薬、目に見える反
応生成物を生成する酵素、および標識された特異的な結
合相手（例えば、抗体または抗原／ハプテン）と結合す
ることによって検出されるであろうリガンド（例えば、
ハプテン、抗体または抗原）を含む。とくに有効な標識
には、（標識したアビジンまたはストレプトアビジンと
結合することによって検出可能になる）ビオチン、およ
び（酵素基質を添加することによって色のついた反応生
成物を生成して検出可能になる）西洋ワサビのペルオキ
シダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素が
含まれる。その様な標識をオリゴヌクレオチドに付け加
える、またはその様な標識をオリゴヌクレオチド内に含
ませるための方法はこの技術分野で熟知されており、任
意のこれらの方法は本発明での使用に適している。
【００２１】増幅された標的配列を検出するためには、
増幅反応に用いるプライマーを標識し、検出プローブと
して用いることもできる。なぜならば、プライマーは増
幅生成物中に取り込まれるからである。別の方法とし
て、増幅プライマーとは異なる少なくとも一つの標識し
たプローブを、ハイブリダイゼーションによって増幅さ
れた標的配列を検出するためのプローブとして用いても
良い。このプローブは、増幅プライマーの間にある標的
内の配列、即ち内部プローブ、とハイブリダイズする、
ように選択されなければならない。別の方法として、プ
ライマーまたは内部プローブのいずれかを標識し、Ｗａ
ｌｋｅｒら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、上記）
に記載された方法にしたがって、増幅生成物を検出する
ためにポリメラーゼによって伸長しても良い。
増幅反応に用いるプライマーを標識し、検出プローブと
して用いることもできる。なぜならば、プライマーは増
幅生成物中に取り込まれるからである。別の方法とし
て、増幅プライマーとは異なる少なくとも一つの標識し
たプローブを、ハイブリダイゼーションによって増幅さ
れた標的配列を検出するためのプローブとして用いても
良い。このプローブは、増幅プライマーの間にある標的
内の配列、即ち内部プローブ、とハイブリダイズする、
ように選択されなければならない。別の方法として、プ
ライマーまたは内部プローブのいずれかを標識し、Ｗａ
ｌｋｅｒら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、上記）
に記載された方法にしたがって、増幅生成物を検出する
ためにポリメラーゼによって伸長しても良い。
【００２２】便宜上、マイコバクテリウム カンサシイ
の種特異的検出および同定のための増幅プライマーは、
検出を行うための他の成分および試薬をさらに含むキッ
トの形でパックされても良い。例として、その様なキッ
トは、本発明の少くとも一対の増幅プライマーを含む。
ハイブリダイゼーションによる検出のために、６ＸＳＳ
Ｃ（０．９Ｍ−塩化ナトリウム、０．０９Ｍ−クエン酸
ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１Ｍ−ＥＤＴＡ ｐＨ
８．０、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ´ｓ溶液（０．１％
ｗ／ｖ ＦＩＣＯＬＬ ＴＹＰＥ ４００、０．１％
ｗ／ｖ ポリビニルピロリドン、０．１％ ｗ／ｖ ウ
シ血清アルブミン）、および１００μｇ／ｍｌの剪断変
性されたサケ精子ＤＮＡ、またはプローブハイブリダイ
ゼーションに有用であることが知られているその他の試
薬、といったようなハイブリダイゼーション溶液も含ま
れても良い。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、上記、を参照の
事。代わりに、既知の核酸増幅法の一つでの使用に適し
た薬剤が、マイコバクテリウム カンサシイ特異的増幅
プライマーと共に含まれても良い。キットの成分は、一
つの容器に一緒にパックされ、典型的には、本発明の方
法のある特定の実施態様を実行するための指示書を含
む。さらに、例えば、検出用プローブとして用いるのに
適した標識を付した第二プローブ、および標識の検出を
行うための薬剤または手段、のような随意の成分をキッ
トの中に含んでも良い。
の種特異的検出および同定のための増幅プライマーは、
検出を行うための他の成分および試薬をさらに含むキッ
トの形でパックされても良い。例として、その様なキッ
トは、本発明の少くとも一対の増幅プライマーを含む。
ハイブリダイゼーションによる検出のために、６ＸＳＳ
Ｃ（０．９Ｍ−塩化ナトリウム、０．０９Ｍ−クエン酸
ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１Ｍ−ＥＤＴＡ ｐＨ
８．０、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ´ｓ溶液（０．１％
ｗ／ｖ ＦＩＣＯＬＬ ＴＹＰＥ ４００、０．１％
ｗ／ｖ ポリビニルピロリドン、０．１％ ｗ／ｖ ウ
シ血清アルブミン）、および１００μｇ／ｍｌの剪断変
性されたサケ精子ＤＮＡ、またはプローブハイブリダイ
ゼーションに有用であることが知られているその他の試
薬、といったようなハイブリダイゼーション溶液も含ま
れても良い。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、上記、を参照の
事。代わりに、既知の核酸増幅法の一つでの使用に適し
た薬剤が、マイコバクテリウム カンサシイ特異的増幅
プライマーと共に含まれても良い。キットの成分は、一
つの容器に一緒にパックされ、典型的には、本発明の方
法のある特定の実施態様を実行するための指示書を含
む。さらに、例えば、検出用プローブとして用いるのに
適した標識を付した第二プローブ、および標識の検出を
行うための薬剤または手段、のような随意の成分をキッ
トの中に含んでも良い。
【００２３】
【実施例】一つの種の分離菌の中での標的配列の不均一
性が種特異的増幅プライマーをデザインすることを妨
げ、かつ標的の種特異的増幅を妨げる場合もあるため、
最初に、マイコバクテリウム カンサシイの株の間での
ｐ６１２３配列の不均一性の程度を測定する必要があっ
た。ｐ６１２３は、前実験では、ハイブリダイゼーショ
ンプローブとしてのみ種特異性を示した。ハイブリダイ
ゼーションによる検出、例えばサザンブロットでは、増
幅プライマーとしては許容出来ない高いレベル（７０％
程度）の配列のミスマッチがあっても許容される。ｐ６
１２３配列を、類似株であるがマイコバクテリウム カ
ンサシイの異なる株（ｐ６２３２）から誘導された変異
株の配列と並べて比較することによって、さらに３種の
マイコバクテリウム カンサシイ分離株（ＴＭＣ１２０
１、ＬＣＤＣ７２４および１３６３８）の類似配列のサ
ブフラグメントを増幅するＰＣＲプライマーをデザイン
した。配列番号：１（ＭＹ−１）は、ｐ６１２３の配列
のヌクレオチド５０３−４８４に相当するアンチセンス
プライマーである。ヌクレオチド５０−６９に相当する
２つのセンスプライマーを合成した。第一のプライマー
（配列番号：２、ＭＹ２ａ）は５８の位置がアデニンで
あり、これに対して、第二のプライマー（配列番号：
３、ＭＹ２ｇ）は５８の位置がグアニンである。配列番
号：１、配列番号：２および配列番号：３は、製造者に
よって選ばれたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
３８０Ｂ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで、すべて合成さ
れた。オリゴヌクレオチドは水酸化アンモニウムを用い
５０℃に１６時間保つことによって保護をはずし、次い
で、製造者によって選択されたＯＰＣ精製（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。
性が種特異的増幅プライマーをデザインすることを妨
げ、かつ標的の種特異的増幅を妨げる場合もあるため、
最初に、マイコバクテリウム カンサシイの株の間での
ｐ６１２３配列の不均一性の程度を測定する必要があっ
た。ｐ６１２３は、前実験では、ハイブリダイゼーショ
ンプローブとしてのみ種特異性を示した。ハイブリダイ
ゼーションによる検出、例えばサザンブロットでは、増
幅プライマーとしては許容出来ない高いレベル（７０％
程度）の配列のミスマッチがあっても許容される。ｐ６
１２３配列を、類似株であるがマイコバクテリウム カ
ンサシイの異なる株（ｐ６２３２）から誘導された変異
株の配列と並べて比較することによって、さらに３種の
マイコバクテリウム カンサシイ分離株（ＴＭＣ１２０
１、ＬＣＤＣ７２４および１３６３８）の類似配列のサ
ブフラグメントを増幅するＰＣＲプライマーをデザイン
した。配列番号：１（ＭＹ−１）は、ｐ６１２３の配列
のヌクレオチド５０３−４８４に相当するアンチセンス
プライマーである。ヌクレオチド５０−６９に相当する
２つのセンスプライマーを合成した。第一のプライマー
（配列番号：２、ＭＹ２ａ）は５８の位置がアデニンで
あり、これに対して、第二のプライマー（配列番号：
３、ＭＹ２ｇ）は５８の位置がグアニンである。配列番
号：１、配列番号：２および配列番号：３は、製造者に
よって選ばれたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
３８０Ｂ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで、すべて合成さ
れた。オリゴヌクレオチドは水酸化アンモニウムを用い
５０℃に１６時間保つことによって保護をはずし、次い
で、製造者によって選択されたＯＰＣ精製（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。
【００２４】ＰＣＲ増幅は、１０ｍＭ−トリス塩酸 ｐ
Ｈ８．３、５０ｍＭ−ＫＣｌ、１．５ｍＭ−ＭｇＣｌ
2 、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、２００μＭ−ｄ
ＡＴＰ，２００μＭ−ｄＣＴＰ、２００μＭ−ｄＧＴ
Ｐ、２００μＭ−ＴＴＰ、１．０μＭのそれぞれのプラ
イマー（センスおよびアンチセンス）、および１０6 か
ら１０4 モルの標的ＤＮＡを含む１００μｌの反応液中
で行われた。反応液は、鉱物油で覆い、５分間９５℃に
加熱した。ＡＭＰＬＩＴＡＱポリメラーゼ（Ｐｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）をそれぞれの反応液に
（２．５ Ｕｎｉｔｓ／１００μｌ）加え、熱サイクル
を開始させた。熱サイクルのプロトコール、全３０サイ
クルは次の通りであった：９４℃に１分３０秒、５５℃
に２分、７２℃に３分。これに続いて、７分間７２℃に
インキュベーションした。次いで、サンプルは４℃で保
存した。
Ｈ８．３、５０ｍＭ−ＫＣｌ、１．５ｍＭ−ＭｇＣｌ
2 、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、２００μＭ−ｄ
ＡＴＰ，２００μＭ−ｄＣＴＰ、２００μＭ−ｄＧＴ
Ｐ、２００μＭ−ＴＴＰ、１．０μＭのそれぞれのプラ
イマー（センスおよびアンチセンス）、および１０6 か
ら１０4 モルの標的ＤＮＡを含む１００μｌの反応液中
で行われた。反応液は、鉱物油で覆い、５分間９５℃に
加熱した。ＡＭＰＬＩＴＡＱポリメラーゼ（Ｐｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）をそれぞれの反応液に
（２．５ Ｕｎｉｔｓ／１００μｌ）加え、熱サイクル
を開始させた。熱サイクルのプロトコール、全３０サイ
クルは次の通りであった：９４℃に１分３０秒、５５℃
に２分、７２℃に３分。これに続いて、７分間７２℃に
インキュベーションした。次いで、サンプルは４℃で保
存した。
【００２５】４５４塩基対からなる生成物が、配列番
号：１および配列番号：２を用いてマイコバクテリウム
カンサシイＴＭＣ１２０１、ＬＣＤＣ７２４および１
３６３８から増幅された。また、配列番号：１および配
列番号：３を用いると、４５４塩基対からなる生成物
が、ＬＣＤＣ７２４および１３６３８からは増幅された
が、ＴＭＣ１２０１からは増幅されなかった。増幅生成
物はＳｍａＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）で消化し
たｐＵＣ１８プラスミド内へサブクローン化し、それぞ
れの株からえた二つの独立したクローンは、製造者の選
択によって、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
３７３ＡシークエンサーおよびＰｒｉｓｍＤｙｅ ｔｅ
ｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を
用いて配列決定した。多量の配列変異が株の間で見つか
った。マイコバクテリウム カンサシイ１３６３８（配
列番号：１５）から増幅された配列は、ｐ６２３２の配
列とは同一であったが、ｐ６１２３からの配列とは異な
っていた。ＴＭＣ１２０１（配列番号：１３）およびＬ
ＣＤＣ７２４（配列番号：１４）から得られた配列はｐ
６１２３およびｐ６２３２から得られた配列の両方と異
なっていた。様々なマイコバクテリウム カンサシイ分
離株（ｐ６１２３、ｐ６２３２、ＴＭＣ１２０１、ＬＣ
ＤＣ７２４および１３６３８−図２）の配列を直線に並
べて比較することによって、５つの分離株のすべてを増
幅できる可能性を有する数種の増幅プライマーおよびブ
ンパープライマーをデザインした。これらは、標的配列
のＧＣ含有率、２つの増幅プライマー結合サイトの近
さ、および配列変異性を基に選択した。
号：１および配列番号：２を用いてマイコバクテリウム
カンサシイＴＭＣ１２０１、ＬＣＤＣ７２４および１
３６３８から増幅された。また、配列番号：１および配
列番号：３を用いると、４５４塩基対からなる生成物
が、ＬＣＤＣ７２４および１３６３８からは増幅された
が、ＴＭＣ１２０１からは増幅されなかった。増幅生成
物はＳｍａＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）で消化し
たｐＵＣ１８プラスミド内へサブクローン化し、それぞ
れの株からえた二つの独立したクローンは、製造者の選
択によって、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
３７３ＡシークエンサーおよびＰｒｉｓｍＤｙｅ ｔｅ
ｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を
用いて配列決定した。多量の配列変異が株の間で見つか
った。マイコバクテリウム カンサシイ１３６３８（配
列番号：１５）から増幅された配列は、ｐ６２３２の配
列とは同一であったが、ｐ６１２３からの配列とは異な
っていた。ＴＭＣ１２０１（配列番号：１３）およびＬ
ＣＤＣ７２４（配列番号：１４）から得られた配列はｐ
６１２３およびｐ６２３２から得られた配列の両方と異
なっていた。様々なマイコバクテリウム カンサシイ分
離株（ｐ６１２３、ｐ６２３２、ＴＭＣ１２０１、ＬＣ
ＤＣ７２４および１３６３８−図２）の配列を直線に並
べて比較することによって、５つの分離株のすべてを増
幅できる可能性を有する数種の増幅プライマーおよびブ
ンパープライマーをデザインした。これらは、標的配列
のＧＣ含有率、２つの増幅プライマー結合サイトの近
さ、および配列変異性を基に選択した。
【００２６】ストランド置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉ
ｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
（ＳＤＡ）反応は、一般的には、ウラシルＤＮＡグリコ
シラーゼ（ＵＤＧ）を用いて生成したアンプリコンを不
活性化（汚染除去）するために、ＴＴＰの代わりにｄＵ
ＴＰを用いて、前述の方法（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、上記）で行った。反応は、
６ｍＭ−ＭｇＣｌ2 、それぞれ２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＣ
ＴＰおよびα−チオ−ｄＡＴＰ（２'-デオキシアデノシ
ン５'-Ｏ-(１−チオトリホスフェート）、５ｍＭ−ｄＵ
ＴＰ、１００μｇ／ｍｌのアセチル化ウシ血清アルブミ
ン、１ｎｇ／μｌのヒト胎盤ＤＮＡ、４２．５ｍＭ−Ｋ
ｉＰＯ４ ｐＨ７．６、０．５μＭのプライマーＳ１お
よびＳ２、０．０５μＭのプライマーＢ１およびＢ２、
３ｕｎｉｔｓ／μｌのＨｉｎｃＩＩ、０．１ｕｎｉｔｓ
／μｌのｅｘｏ- クレノーＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉ
ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）およ
び様々な量の標的ＤＮＡを含む、５０μｌ容量内で行わ
れた。また、反応液は１５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）を含む。ＨｉｎｃＩＩ、ｅｘｏ- ク
レノーおよびＭｇＣｌ2 を加える前に、反応液を９５℃
に２分間加熱して標的ＤＮＡを変性させ、次いで４１℃
に２分間保ってプライマーをアニールした。酵素および
ＭｇＣｌ2 を加えた後に、増幅させるために反応液を４
１℃で２時間インキュベーションした。増幅は、９５℃
で２分間加熱することによって終止させた。増幅生成物
は、32Ｐで標識したプライマー（配列番号：１２）のハ
イブリダイゼーションおよび伸長によって検出し、次い
で、前述の方法（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓＲｅｓ．，上記）に従って、変性させてポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行った。
ｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
（ＳＤＡ）反応は、一般的には、ウラシルＤＮＡグリコ
シラーゼ（ＵＤＧ）を用いて生成したアンプリコンを不
活性化（汚染除去）するために、ＴＴＰの代わりにｄＵ
ＴＰを用いて、前述の方法（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、上記）で行った。反応は、
６ｍＭ−ＭｇＣｌ2 、それぞれ２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＣ
ＴＰおよびα−チオ−ｄＡＴＰ（２'-デオキシアデノシ
ン５'-Ｏ-(１−チオトリホスフェート）、５ｍＭ−ｄＵ
ＴＰ、１００μｇ／ｍｌのアセチル化ウシ血清アルブミ
ン、１ｎｇ／μｌのヒト胎盤ＤＮＡ、４２．５ｍＭ−Ｋ
ｉＰＯ４ ｐＨ７．６、０．５μＭのプライマーＳ１お
よびＳ２、０．０５μＭのプライマーＢ１およびＢ２、
３ｕｎｉｔｓ／μｌのＨｉｎｃＩＩ、０．１ｕｎｉｔｓ
／μｌのｅｘｏ- クレノーＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉ
ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）およ
び様々な量の標的ＤＮＡを含む、５０μｌ容量内で行わ
れた。また、反応液は１５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）を含む。ＨｉｎｃＩＩ、ｅｘｏ- ク
レノーおよびＭｇＣｌ2 を加える前に、反応液を９５℃
に２分間加熱して標的ＤＮＡを変性させ、次いで４１℃
に２分間保ってプライマーをアニールした。酵素および
ＭｇＣｌ2 を加えた後に、増幅させるために反応液を４
１℃で２時間インキュベーションした。増幅は、９５℃
で２分間加熱することによって終止させた。増幅生成物
は、32Ｐで標識したプライマー（配列番号：１２）のハ
イブリダイゼーションおよび伸長によって検出し、次い
で、前述の方法（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓＲｅｓ．，上記）に従って、変性させてポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行った。
【００２７】配列番号：４および配列番号：５（ＭＹｓ
１およびＭＹｓ１．１）は、ＳＤＡのＳ１増幅プライマ
ーとしてデザインされた。配列番号：６および配列番
号：７（ＭＹｓ２およびＭＹｓ２．１）は、ＳＤＡのＳ
２増幅プライマーとしてデザインされた。それらは、標
的配列にハイブリダイズする標的結合領域および制限エ
ンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩの認識サイトを含む。配
列番号：８および配列番号：９（ＭＹｂ１およびＭＹｂ
１．１）は、Ｂ１外部プライマーである。配列番号：１
０および配列番号：１１（ＭＹｂ２およびＭＹｂ２．
１）は、Ｂ２外部プライマーである。Ｂ１およびＢ２プ
ライマーは、標的結合配列からなり、Ｓ１およびＳ２の
上流で標的とハイブリダイズする（図２）。Ｂ１および
Ｂ２プライマーの伸長物は、ＳＤＡ標的生成の第一サイ
クルで、Ｓ１およびＳ２プライマーの伸長生成物を置換
するために提供される。配列番号：１２（ＭＹｄ１）
は、プライマー伸長分析によって増幅生成物を特異的に
検出するために用いられる検出プローブである。配列番
号：４−１２のオリゴヌクレオチドは、Ｓｙｎｔｈｅｔ
ｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
によって合成され、ゲル精製された。
１およびＭＹｓ１．１）は、ＳＤＡのＳ１増幅プライマ
ーとしてデザインされた。配列番号：６および配列番
号：７（ＭＹｓ２およびＭＹｓ２．１）は、ＳＤＡのＳ
２増幅プライマーとしてデザインされた。それらは、標
的配列にハイブリダイズする標的結合領域および制限エ
ンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩの認識サイトを含む。配
列番号：８および配列番号：９（ＭＹｂ１およびＭＹｂ
１．１）は、Ｂ１外部プライマーである。配列番号：１
０および配列番号：１１（ＭＹｂ２およびＭＹｂ２．
１）は、Ｂ２外部プライマーである。Ｂ１およびＢ２プ
ライマーは、標的結合配列からなり、Ｓ１およびＳ２の
上流で標的とハイブリダイズする（図２）。Ｂ１および
Ｂ２プライマーの伸長物は、ＳＤＡ標的生成の第一サイ
クルで、Ｓ１およびＳ２プライマーの伸長生成物を置換
するために提供される。配列番号：１２（ＭＹｄ１）
は、プライマー伸長分析によって増幅生成物を特異的に
検出するために用いられる検出プローブである。配列番
号：４−１２のオリゴヌクレオチドは、Ｓｙｎｔｈｅｔ
ｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
によって合成され、ゲル精製された。
【００２８】さらに、ＴＭＣ１２０１、ＬＣＤＣ７２４
および１３６３８株から得られた配列情報は、ＬＣＤＣ
７２４と配列番号：４（ＭＹｓ１）のプライマーの間に
は３' 位にミスマッチが存在した。また、幾つかのミス
マッチが、ＬＣＤＣ７２４およびＴＭＣ１２０１と配列
番号：８（ＭＹｂ１）との間にも存在したが、ｐ６１２
３、ｐ６２３２または１３６３８とはミスマッチが無か
った。それ故、配列番号：９（ＭＹｂ１．１）Ｂ１プラ
イマーは、ＬＣＤＣ７２４およびＴＭＣ１２０１と完璧
にマッチするように、デザインし、合成した。配列番
号：５および配列番号：６の標的領域は、配列決定を行
った株のすべてで同一であった。しかしながら、検出プ
ローブ（配列番号：１２）の標的結合領域でミスマッチ
が見つかった。検出プローブは低厳密性条件下でポリメ
ラーゼによって伸長される１６マーであるので、これら
のミスマッチは増幅生成物の検出に影響を与えないであ
ろう。
および１３６３８株から得られた配列情報は、ＬＣＤＣ
７２４と配列番号：４（ＭＹｓ１）のプライマーの間に
は３' 位にミスマッチが存在した。また、幾つかのミス
マッチが、ＬＣＤＣ７２４およびＴＭＣ１２０１と配列
番号：８（ＭＹｂ１）との間にも存在したが、ｐ６１２
３、ｐ６２３２または１３６３８とはミスマッチが無か
った。それ故、配列番号：９（ＭＹｂ１．１）Ｂ１プラ
イマーは、ＬＣＤＣ７２４およびＴＭＣ１２０１と完璧
にマッチするように、デザインし、合成した。配列番
号：５および配列番号：６の標的領域は、配列決定を行
った株のすべてで同一であった。しかしながら、検出プ
ローブ（配列番号：１２）の標的結合領域でミスマッチ
が見つかった。検出プローブは低厳密性条件下でポリメ
ラーゼによって伸長される１６マーであるので、これら
のミスマッチは増幅生成物の検出に影響を与えないであ
ろう。
【００２９】ＳＤＡプライマーの第一のセット（配列番
号：４、配列番号：６、配列番号：８、および配列番
号：１０）は、ｐ６１２３およびｐ６２３２の配列のみ
を基礎にしてデザインされており、その他の株の配列情
報はその時点では得られてなかった。このプライマーの
セットは、さらに、試験したマイコバクテリウム カン
サシイの３つの分離株（ＬＣＤＣ７２４、１３６３８お
よびＴＭＣ１２０１）を検出したが、マイコバクテリウ
ム ガスツリ、ヒト結核菌またはトリ結核菌とは全く交
差反応しなかった。しかしながら、増幅の程度（増幅因
子）は、分離した株によって異なっていた。増幅は、Ｌ
ＣＤＣ７２４では大きく減少したが、多分、配列番号：
４のプライマーの３' のミスマッチによると思われる
（以下を参照の事）。
号：４、配列番号：６、配列番号：８、および配列番
号：１０）は、ｐ６１２３およびｐ６２３２の配列のみ
を基礎にしてデザインされており、その他の株の配列情
報はその時点では得られてなかった。このプライマーの
セットは、さらに、試験したマイコバクテリウム カン
サシイの３つの分離株（ＬＣＤＣ７２４、１３６３８お
よびＴＭＣ１２０１）を検出したが、マイコバクテリウ
ム ガスツリ、ヒト結核菌またはトリ結核菌とは全く交
差反応しなかった。しかしながら、増幅の程度（増幅因
子）は、分離した株によって異なっていた。増幅は、Ｌ
ＣＤＣ７２４では大きく減少したが、多分、配列番号：
４のプライマーの３' のミスマッチによると思われる
（以下を参照の事）。
【００３０】より堅実な増幅因子を与えるＳＤＡのため
の増幅プライマーを分離することを試み、マイコバクテ
リウム カンサシイの５株のすべての配列を基にして、
新規のＳ１およびＳ２ＳＤＡプライマーをデザインし
た。これらは、配列番号：５および配列番号：７（ＭＹ
ｓ１．１およびＭＹｓ２．１）であった。また、新規の
Ｂ２プライマー、配列番号：１１（ＭＹｂ２．１）もデ
ザインされ、合成された。配列番号：１１は、５' ヌク
レオチドがＧの代わりにＡであることを除いて配列番
号：１０（ＭＹｂ２）と同一であり、ｐ６１２３配列と
完璧にマッチするが、ｐ６２３２、ＴＭＣ１２０１，Ｌ
ＣＤＣ７２４および１３６３８とは異なる。次いで、プ
ライマーの組み合わせを変えて試験し、どの組み合わせ
がＴＭＣ１２０１，ＬＣＤＣ７２４および１３６３８に
厳密な増幅因子を与えるかを決定した。試験した４種類
の増幅プライマーの組み合わせは以下の通りである。
の増幅プライマーを分離することを試み、マイコバクテ
リウム カンサシイの５株のすべての配列を基にして、
新規のＳ１およびＳ２ＳＤＡプライマーをデザインし
た。これらは、配列番号：５および配列番号：７（ＭＹ
ｓ１．１およびＭＹｓ２．１）であった。また、新規の
Ｂ２プライマー、配列番号：１１（ＭＹｂ２．１）もデ
ザインされ、合成された。配列番号：１１は、５' ヌク
レオチドがＧの代わりにＡであることを除いて配列番
号：１０（ＭＹｂ２）と同一であり、ｐ６１２３配列と
完璧にマッチするが、ｐ６２３２、ＴＭＣ１２０１，Ｌ
ＣＤＣ７２４および１３６３８とは異なる。次いで、プ
ライマーの組み合わせを変えて試験し、どの組み合わせ
がＴＭＣ１２０１，ＬＣＤＣ７２４および１３６３８に
厳密な増幅因子を与えるかを決定した。試験した４種類
の増幅プライマーの組み合わせは以下の通りである。
【００３１】Ａ） 配列番号：４、および配列番号：６ Ｂ） 配列番号：４、および配列番号：７ Ｃ） 配列番号：５、および配列番号：６ Ｄ） 配列番号：５、および配列番号：７ セットＡおよびセットＣは、３種の分離菌すべてに、容
易に検出できるレベルの増幅された標的配列を生成し
た。セットＤはＴＭＣ１２０１および１３６３８を増幅
するが、ＬＣＤＣ７２４ではほとんど増幅されなかっ
た。セットＢはＬＣＤＣ７２４では検出できる増幅生成
物を生成しなかったが、ＴＭＣ１２０１および１３６３
８では良く増幅した。これらの結果は、バンパープライ
マーを任意に組み合わせを用いても同様であったが、配
列番号：１１は以下で議論するように例外であった。配
列番号：５、配列番号：６、配列番号：８および配列番
号：１０は、最も厳密な増幅因子を持つ最良の結果を示
した。
易に検出できるレベルの増幅された標的配列を生成し
た。セットＤはＴＭＣ１２０１および１３６３８を増幅
するが、ＬＣＤＣ７２４ではほとんど増幅されなかっ
た。セットＢはＬＣＤＣ７２４では検出できる増幅生成
物を生成しなかったが、ＴＭＣ１２０１および１３６３
８では良く増幅した。これらの結果は、バンパープライ
マーを任意に組み合わせを用いても同様であったが、配
列番号：１１は以下で議論するように例外であった。配
列番号：５、配列番号：６、配列番号：８および配列番
号：１０は、最も厳密な増幅因子を持つ最良の結果を示
した。
【００３２】これらの結果は、ＳＤＡプライマー間の予
期せぬ相互作用を示している。配列番号：４は、ＬＣＤ
Ｃ７２４とは３' 末端にミスマッチを含んでいる。一般
的に、プライマーの３' 末端はポリメラーゼがプライマ
ーを効果的に伸長するためにハイブリダイズしなくては
ならないと信じられてきた。この事は、配列番号：４と
配列番号：７と組み合わした場合に、増幅が起こらない
ことと一致する。しかしながら、配列番号：４の増幅プ
ライマーを配列番号：６と組み合わせた場合、３' がミ
スマッチしているにもかかわらず、予想に反して、３種
の分離菌のすべてで効率よく増幅する。配列番号：７お
よび配列番号：６は両方共、標的配列に完壁にマッチし
ており、同じ対になる増幅プライマーと組み合わせた場
合、増幅にほとんど影響を与えないと予想される。バン
パープライマーの選択もまた増殖に予想外の効果を与え
る。配列番号：１０は５' 末端にミスマッチを含む。配
列番号：１１はミスマッチを訂正し完璧にマッチしたバ
ンパープライマーを作り出すようにデザインされた。し
かしながら、増幅が改善されたというよりはむしろ、予
想に反して、配列番号：１１はほとんど検出できないレ
ベルにまで増幅を押さえた。反対に、５' ミスマッチを
含むバンパープライマーは、正常に機能して正常なレベ
ルの増幅を示した。
期せぬ相互作用を示している。配列番号：４は、ＬＣＤ
Ｃ７２４とは３' 末端にミスマッチを含んでいる。一般
的に、プライマーの３' 末端はポリメラーゼがプライマ
ーを効果的に伸長するためにハイブリダイズしなくては
ならないと信じられてきた。この事は、配列番号：４と
配列番号：７と組み合わした場合に、増幅が起こらない
ことと一致する。しかしながら、配列番号：４の増幅プ
ライマーを配列番号：６と組み合わせた場合、３' がミ
スマッチしているにもかかわらず、予想に反して、３種
の分離菌のすべてで効率よく増幅する。配列番号：７お
よび配列番号：６は両方共、標的配列に完壁にマッチし
ており、同じ対になる増幅プライマーと組み合わせた場
合、増幅にほとんど影響を与えないと予想される。バン
パープライマーの選択もまた増殖に予想外の効果を与え
る。配列番号：１０は５' 末端にミスマッチを含む。配
列番号：１１はミスマッチを訂正し完璧にマッチしたバ
ンパープライマーを作り出すようにデザインされた。し
かしながら、増幅が改善されたというよりはむしろ、予
想に反して、配列番号：１１はほとんど検出できないレ
ベルにまで増幅を押さえた。反対に、５' ミスマッチを
含むバンパープライマーは、正常に機能して正常なレベ
ルの増幅を示した。
【００３３】プライマーのミスマッチの影響を補うため
に、型にはまらないＳＤＡプライマーセットを組み立て
た。ＳＤＡは、それまでは、２つの増幅プライマーと２
つのバンパープライマーのみで行われてきたが、これら
の型にはまらないプライマーのセットは、変化しやすい
配列により効率的にハイブリダイズ出来る可能性を持つ
増幅プライマーおよびバンパープライマーをさらに含ん
でいる。例えば、配列番号：４、配列番号：５、および
配列番号：６（３つの増幅プライマー）を配列番号：
８、配列番号：１０、および配列番号：１１（３つのバ
ンパープライマー）と共に用いるＳＤＡは、増幅レベル
はわずか減ずるが種特異的増幅を提供し、分離菌間での
増幅因子の違いを本質的になくす長所を有する。配列番
号：１１は従来のプライマーの組み合わせで用いた場合
にはほとんどの増幅を押さえる（上述）ので、この事は
予想外であった。配列番号：１１の厳格な抑制効果は、
３つの増幅プライマーおよび３つのバンパープライマー
を用いた場合に、打ち負かされると思われる。配列番
号：５および配列番号：６（２つの増幅プライマー）を
配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０
（３つのバンパープライマー）と共に用いるＳＤＡは、
Ｂ１プライマーとして配列番号：８のみを用いても増幅
されない株を増幅させ、また、様々な分離菌間の増幅因
子の一貫性を改良した。
に、型にはまらないＳＤＡプライマーセットを組み立て
た。ＳＤＡは、それまでは、２つの増幅プライマーと２
つのバンパープライマーのみで行われてきたが、これら
の型にはまらないプライマーのセットは、変化しやすい
配列により効率的にハイブリダイズ出来る可能性を持つ
増幅プライマーおよびバンパープライマーをさらに含ん
でいる。例えば、配列番号：４、配列番号：５、および
配列番号：６（３つの増幅プライマー）を配列番号：
８、配列番号：１０、および配列番号：１１（３つのバ
ンパープライマー）と共に用いるＳＤＡは、増幅レベル
はわずか減ずるが種特異的増幅を提供し、分離菌間での
増幅因子の違いを本質的になくす長所を有する。配列番
号：１１は従来のプライマーの組み合わせで用いた場合
にはほとんどの増幅を押さえる（上述）ので、この事は
予想外であった。配列番号：１１の厳格な抑制効果は、
３つの増幅プライマーおよび３つのバンパープライマー
を用いた場合に、打ち負かされると思われる。配列番
号：５および配列番号：６（２つの増幅プライマー）を
配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０
（３つのバンパープライマー）と共に用いるＳＤＡは、
Ｂ１プライマーとして配列番号：８のみを用いても増幅
されない株を増幅させ、また、様々な分離菌間の増幅因
子の一貫性を改良した。
【００３４】さらに、プライマーを用いて種特異的増幅
を示すために、マイコバクテリウムカンサシイの７４分
離菌から得られたＤＮＡについて、配列番号：５、配列
番号：６、配列番号：８、配列番号：９、および配列番
号：１０を用いてＳＤＡによって試験した。これらは、
オーストラリアからの１７種の分離菌（１４は医療現場
より、３つは環境より）、ソロモン諸島からの２種の医
療現場よりの分離菌、日本からの１１種の医療現場より
の分離菌、英国からの５種の分離菌（１つは医療現場よ
り、４つは呼吸より）、米国からの１１種の医療現場よ
りの分離菌、南アフリカからの４種の医療現場よりの分
離菌、スイスからの１１種の分離菌（９種は尿より、１
つは医療現場より、１つは痰より）、ベルギーからの４
種の分離菌（３種は医療現場より、１つは尿より）、を
含んでいる。５種類の研究室で得られた株（ＬＣＤＣ７
１１、ＬＣＤＣ７１４、ＬＣＤＣ７１５、ＬＣＤＣ７２
５、およびＤ−３１）を、ＴＭＣ１２０１、１３６３
８、およびＬＣＤＣ７２４に加えて、試験した。特異的
増幅生成物は、これらのＤＮＡサンプルのすべてで、32
Ｐで標識したプライマー（配列番号：１２）のハイブリ
ダイゼーションおよびポリメラーゼ伸長によって検出し
た。このＳＤＡシステムは、試験したその他のマイコバ
クテリウムのいずれとも交差反応しなかった、即ち、
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ，Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａ
ｅ、Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕ
ｍ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ
ｌａｒｅ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｎ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ、
Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、
Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉまたはＭ．ｘｅｎｏｐｉでは検出可
能な増幅生成物は生成されなかった。さらに、このセッ
トのプライマーは、マイコバクテリウムに近い関係にあ
るＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓまたはＲｈ
ｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｃｏｃｈｒｏｕｓとも、交
差反応しない。
を示すために、マイコバクテリウムカンサシイの７４分
離菌から得られたＤＮＡについて、配列番号：５、配列
番号：６、配列番号：８、配列番号：９、および配列番
号：１０を用いてＳＤＡによって試験した。これらは、
オーストラリアからの１７種の分離菌（１４は医療現場
より、３つは環境より）、ソロモン諸島からの２種の医
療現場よりの分離菌、日本からの１１種の医療現場より
の分離菌、英国からの５種の分離菌（１つは医療現場よ
り、４つは呼吸より）、米国からの１１種の医療現場よ
りの分離菌、南アフリカからの４種の医療現場よりの分
離菌、スイスからの１１種の分離菌（９種は尿より、１
つは医療現場より、１つは痰より）、ベルギーからの４
種の分離菌（３種は医療現場より、１つは尿より）、を
含んでいる。５種類の研究室で得られた株（ＬＣＤＣ７
１１、ＬＣＤＣ７１４、ＬＣＤＣ７１５、ＬＣＤＣ７２
５、およびＤ−３１）を、ＴＭＣ１２０１、１３６３
８、およびＬＣＤＣ７２４に加えて、試験した。特異的
増幅生成物は、これらのＤＮＡサンプルのすべてで、32
Ｐで標識したプライマー（配列番号：１２）のハイブリ
ダイゼーションおよびポリメラーゼ伸長によって検出し
た。このＳＤＡシステムは、試験したその他のマイコバ
クテリウムのいずれとも交差反応しなかった、即ち、
Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ，Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａ
ｅ、Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕ
ｍ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ
ｌａｒｅ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｎ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ、
Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、
Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉまたはＭ．ｘｅｎｏｐｉでは検出可
能な増幅生成物は生成されなかった。さらに、このセッ
トのプライマーは、マイコバクテリウムに近い関係にあ
るＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓまたはＲｈ
ｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｃｏｃｈｒｏｕｓとも、交
差反応しない。
【００３５】上述の実施例は、本発明の態様を説明する
ためのものであり、特許請求の範囲によって定められた
本発明を制限するためのものではない。
ためのものであり、特許請求の範囲によって定められた
本発明を制限するためのものではない。
【００３６】
【００３７】配列番号：１ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (A) 生物名: Mycobacterium kansasii (xi) 配列: SEQ ID NO:1: TGAAACGTGT TTTGCCAGCG 20
【００３８】配列番号：２ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (A) 生物名: Mycobacterium kansasii (xi) 配列: SEQ ID NO:2: ACCAGCGGAT CGTCACGGTG 20
【００３９】配列番号：３ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (A) 生物名: Mycobacterium kansasii (xi) 配列: SEQ ID NO:3: ACCAGCGGGT CGTCACGGTG 20
【００４０】配列番号：４ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: misc_feature (B) 存在位置: 19..24 (D) その他の情報: /function= "HincII 制限酵素部位" (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: misc_binding (B) 存在位置: 25..37 (D) その他の情報: /function= "標的配列にハイブリダ
イズする" /standard_name= "標的結合配列" (xi) 配列: SEQ ID NO:4: TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACCAGCAC CTCGGCG 37
イズする" /standard_name= "標的結合配列" (xi) 配列: SEQ ID NO:4: TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACCAGCAC CTCGGCG 37
【００４１】配列番号：５ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: misc_feature (B) 存在位置: 19..24 (D) その他の情報: /function= "HincII 制限酵素部位" (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: misc_binding (B) 存在位置: 26..38 (D) その他の情報: /function= "標的配列にハイブリダ
イズする" /standard_name= "標的結合配列" (xi) 配列: SEQ ID NO:5: TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACAGAACA GCACCTCG 38
イズする" /standard_name= "標的結合配列" (xi) 配列: SEQ ID NO:5: TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACAGAACA GCACCTCG 38
【００４２】配列番号：６ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: misc_feature (B) 存在位置: 19..24 (D) その他の情報: /function= "HincII 制限酵素部位" (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: misc_binding (B) 存在位置: 25..37 (D) その他の情報: /function= "標的配列にハイブリダ
イズする" /standard_name= "標的結合配列" (xi) 配列: SEQ ID NO:6: TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACCGATTC CTGGTGG 37
イズする" /standard_name= "標的結合配列" (xi) 配列: SEQ ID NO:6: TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACCGATTC CTGGTGG 37
【００４３】配列番号：７ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: misc_feature (B) 存在位置: 19..24 (D) その他の情報: /function= "HincII 制限酵素部位" (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: misc_binding (B) 存在位置: 25..37 (D) その他の情報: /function= "標的配列にハイブリダ
イズする" /standard_name= "標的結合配列" (xi) 配列: SEQ ID NO:7: TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACAGCGTT CTGCGAC 37
イズする" /standard_name= "標的結合配列" (xi) 配列: SEQ ID NO:7: TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACAGCGTT CTGCGAC 37
【００４４】配列番号：８ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 11 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO:8: CCGGCCAACA G 11
【００４５】配列番号：９ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO:9: ACGGTGCTGC GGC 13
【００４６】配列番号：１０ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 12 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO:10: GTCGGTGTGG CA 12
【００４７】配列番号：１１ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 12 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO:11: ATCGGTGTGG CA 12
【００４８】配列番号：１２ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 16 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO:12: AACTCGACGG CCTCGG 16
【００４９】配列番号：１３ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 200 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (A) 生物名: Mycobacterium kansasii (xi) 配列: SEQ ID NO:13: ACCAGCGGAT CGTCACGGTG CTGCGGCCAG ACGACGGTAC GGCCGGCCAG CAGCGCCACG 60 GTGGGGTACC CGTCGAACAG CACCTCGGCG AACTCGACCG CCTCGGGCGC CCACCAGGAA 120 TCGTCGTCGC AGAACGCGAC AAACGGTGTG TCGCAGTATG CCACACCGAT GTTGCGAGCC 180 ACCGCGCCCT GGTTGCGGGT 200
【００５０】配列番号：１４ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 200 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (A) 生物名: Mycobacterium kansasii (xi) 配列: SEQ ID NO:14: ACCAGCGGGT CGTCACGGTG CTGCGGCCAG ACGACGGTTC GGCCTGCCAG TAGCGCCACG 60 GTGGGATACG CGTCGAACAG CACCTCGGCA AACTCGACGG CCCCGGGCGC CCACCAGGAA 120 TCGTCGTCGC AGAACGCGAC AAAAGGTGTG CTGCATTGTG CCACACCGAT ATTGCGGGCT 180 ACGGCGCCTT GGTTGCGGGT 200
【００５１】配列番号：１５ (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 200 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (A) 生物名: Mycobacterium kansasii (xi) 配列: SEQ ID NO:15: ACCAGCGGGT CGTCACGGTG TTGCGGCCAC ACGACGGTAC GGCCGGCCAA CAGGGCCACG 60 GTGGGATACG CGTCGAACAG CACCTCGGCG AACTCGACGG CCTCGGGTGC CCACCAGGAA 120 TCGTCGTCGC AGAACGCGAC AAACGGTGTG CCGCATACTG CCACACCGAT GTTGCGGGCC 180 ACCGCGCCCT CGTTGCGGGT 200
【図１】ストランド置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐ
ｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＤ
Ａ）の標的生成スキーム（Ａ）、およびＳＤＡによる標
的配列の外部増幅の反応段階（Ｂ）を示する図である。
ｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＤ
Ａ）の標的生成スキーム（Ａ）、およびＳＤＡによる標
的配列の外部増幅の反応段階（Ｂ）を示する図である。
【図２】５種類のマイコバクテリウム カンサシイ株の
うちｐ６１２３のヌクレオチド配列を示す図であり、増
幅プライマーがハイブリダイズするサイトを示してい
る。
うちｐ６１２３のヌクレオチド配列を示す図であり、増
幅プライマーがハイブリダイズするサイトを示してい
る。
フロントページの続き (56)参考文献 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣ ＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，31 （1993） Ｐ．2769−2772
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号：５からなる第一の増幅プライ
マーおよび配列番号：６からなる第二の増幅プライマ
ー、または配列番号：５のヌクレオチド２６−３８から
なる第一の増幅プライマーおよび配列番号：６のヌクレ
オチド２５−３７からなる第二の増幅プライマーを含
む、マイコバクテリウム カンサシイ標的核酸の種特異
的増幅のためのプライマーのセット。 - 【請求項２】 配列番号：４のヌクレオチド２５−３７
からなる第一の増幅プライマーおよび配列番号：６のヌ
クレオチド２５−３７からなる第二の増幅プライマー、
または配列番号：４からなる第一の増幅プライマーおよ
び配列番号：６からなる第二の増幅プライマーを含む、
マイコバクテリウム カンサシイ標的核酸の種特異的増
幅のためのプライマーセット。 - 【請求項３】 さらに、配列番号：５からなる第三の増
幅プライマーを含む、請求項２のプライマーセット。 - 【請求項４】 ａ） 標的配列が存在する場合、配列番
号：５のヌクレオチド２６−３８からなる第一の増幅プ
ライマーおよび配列番号：６のヌクレオチド２５−３７
からなる第二の増幅プライマーを標的配列にハイブリダ
イズし、； ｂ） ハイブリダイズした第一および第二の増幅プライ
マーをポリメラーゼで伸長して伸長生成物を作成し、さ
らに伸長生成物を置換することによって、標的配列を増
幅し、そして； ｃ） 増幅した標的配列を検出する：ことからなる、二
本鎖のマイコバクテリウム カンサシイ核酸標的配列の
種特異的検出方法。 - 【請求項５】 ａ） 標的配列が存在する場合、配列番
号：５のヌクレオチド２６−３８からなる第一の標的結
合配列を含む第一の増幅プライマーおよび配列番号：６
のヌクレオチド２５−３７からなる第二の標的結合配列
を含む第二の増幅プライマーであって、さらに第一およ
び第二の標的結合配列の５' 側に制限エンドヌクレアー
ゼ認識サイトを含む第一および第二の増幅プライマー
を、標的配列にハイブリダイズし； ｂ） ハイブリダイズした第一および第二の増幅プライ
マーを伸長して第一および第二の伸長生成物を生成さ
せ、さらに第一および第二の伸長生成物を置換すること
により標的配列を含む標的フラグメントを作成し； ｃ） 標的フラグメント内の制限エンドヌクレアーゼ認
識サイトにニックを入れ、エキソヌクレアーゼ欠損ポリ
メラーゼを用いてニックから伸長させ、さらに標的配列
のコピーを置換することによって、標的配列を増幅し；
そして ｄ） 増幅した標的配列を検出する：ことからなる、二
本鎖のマイコバクテリウム カンサシイ核酸標的配列の
種特異的検出方法。 - 【請求項６】 第一の増幅プライマーが配列番号：５か
らなり、第二の増幅プライマーが配列番号：６からな
る、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 ａ） 標的配列が存在する場合、配列番
号：４のヌクレオチド２５−３７からなる第一の増幅プ
ライマーおよび配列番号：６のヌクレオチド２５−３７
からなる第二の増幅プライマーを、標的配列にハイブリ
ダイズし； ｂ） ハイブリダイズした第一および第二の増幅プライ
マーをポリメラーゼを用いて伸長して伸長生成物を作成
し、さらに伸長生成物を置換することによって、標的配
列を増幅し；そして ｃ）増幅した標的配列を検出する：ことからなる、二本
鎖からなるマイコバクテリウム カンサシイ核酸標的配
列の種特異的検出方法。 - 【請求項８】 ａ） 標的配列が存在する場合、配列番
号：４のヌクレオチド２５−３７からなる第一の標的結
合配列を含む第一の増幅プライマーおよび配列番号：６
のヌクレオチド２５−３７からなる第二の標的結合配列
を含む第二の増幅プライマーであって、さらに第一およ
び第二の標的結合配列の５' 側に制限エンドヌクレアー
ゼ認識サイトを含む第一および第二の増幅プライマー
を、標的配列にハイブリダイズし； ｂ） ハイブリダイズした第一および第二の増幅プライ
マーを伸長して第一および第二の伸長生成物を生成さ
せ、さらに第一および第二の伸長生成物を置換すること
により標的配列を含む標的フラグメントを作成し； ｃ） 標的フラグメント内の制限エンドヌクレアーゼ認
識サイトにニックを入れ、エキソヌクレアーゼ欠損ポリ
メラーゼを用いてニックから伸長させ、さらに標的配列
のコピーを置換することによって、標的配列を増幅し；
そして ｄ） 増幅した標的配列を検出する：ことからなる、二
本鎖のマイコバクテリウム カンサシイ核酸標的配列の
種特異的検出方法。 - 【請求項９】 第一の増幅プライマーが配列番号：４か
らなり、第二の増幅プライマーが配列番号：６からな
る、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 さらに、配列番号：５からなる第三の
増幅プライマーのハイブリダイゼーションを含む、請求
項９記載の方法。
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| US308892 | 1994-09-19 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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-
1994
- 1994-09-19 US US08/308,892 patent/US5500341A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-08-03 CA CA002155387A patent/CA2155387C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-08-09 DE DE69514883T patent/DE69514883T2/de not_active Expired - Fee Related
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Non-Patent Citations (1)
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| ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，３１ （１９９３） Ｐ．２７６９−２７７２ |
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