DE69304536T2 - Nukleotidische sequentien von genen die für pectate-liasen kodieren und dessen verwendung für den nachweis von bakterien der gattung erwinia - Google Patents

Nukleotidische sequentien von genen die für pectate-liasen kodieren und dessen verwendung für den nachweis von bakterien der gattung erwinia

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Description

  • Die vorliegende Erfindung hat Nukleotidsequzenzen zum Gegenstand, die von Genen stammen, die für Pektat-Lyasen (PL) kodieren und die vorzugsweise als Sonden und Initiatoren (= Startermoleküle) verwendbar sind, und zwar für die Feststellung der Anwesenheit von pektinolytischen Bakterien der Gattung Erwinia bei Wirten, die geeignet sind, von den letzteren infiziert zu werden, oder in jedem Medium, welches für das Überleben dieser Bakterien geeignet ist.
  • Eine 1988 durchgeführte Studie zeigte auf, daß die Schäden aufgrund von Pflanzenkrankheiten sich ohne weiteres auf eine Summe von 60 Milliarden Dollar pro Jahr summierten. Diese Tatsache verdeutlicht die Bedeutung, die der schnellen und spezifischen Feststellung der Anwesenheit von phytopathogenen Agentien zukommt, welche Feststellung unter anderem die Auswahl phytosanitärer Erzeugnisse, ihre Dosierung und den Zeitpunkt ihrer Anwendung bedingt.
  • Vorbeugende Maßnahmen, welche daher eine schnelle, empfindliche und zuverlässige Feststellung der Anwesenheit erfordern, bilden noch in unseren Tagen eines der wirksamsten und billigsten Mittel im Kampf gegen Krankheiten, und zwar sowohl, was die finanzielle Ebene betrifft, als auch bezüglich der Umweltgesichtspunkte, und zwar insbesondere, was diejenigen Bakterien betrifft, gegen die kaum Mittel zur Bekämpfung verfügbar sind, zumal die Verwendung von Antibiotika in den meisten Ländern verboten wurde. Diese vorbeugenden Maßnahmen bestehen im wesentlichen aus der Verwendung von gesunden Pflanzen, Setzlingen oder Samen (im Rahmen einer generalisierenden Verwendung des Begriffs), nachdem man die befallenen Anteile zerstört oder ausgesondert hat, sowie der Sterilisation oder jedem anderen Verfahren zur Desinfektion der Gesamtheit von Materialien, die geeignet sind, mit den Pflanzen und den Samen in Kontakt zu kommen.
  • Die Vorbeugung gegen Krankheitsbilder bakteriellen Ursprungs bei Pflanzen ist allerdings bis zur Gegenwart nicht zufriedenstellend gewesen, und es werden häufig bedeutende Verluste bei ein- und zweikeimblättrigen Pflanzen auf den Anbauflächen, in den Treibhäusern oder während ihrer Lagerung beobachtet.
  • Eine der wichtigsten Ursachen dieses Problems ist die Verwendung von scheinbar gesunden Samen und Setzlingen, die aber in Wirklichkeit Träger von Bakterien sind, welche geeignet sind, Ausgangspunkt der künftigen Entwicklung von Krankheitsbildern bei den aus diesen Samen erhaltenen Pflanzen zu sein. Man spricht daher von Bakterien im Stadium einer versteckten Infektion.
  • Zahlreiche Krankheitsbilder bei Pflanzen sind durch ein solches Stadium einer versteckten Infektion gekennzeichnet. Während dieses Stadiums ist der Grad der Infektion gewöhnlich unterhalb eines solchen, dessen Anwesenheit durch bloßen Augenschein oder auch durch gegenwärtig in der Regel allgemein verfügbare Techniken (Isolierung und mikrobiologische Charakterisierung, Immunologie ...) festgestellt werden könnte (Abwesenheit offenkundiger Sympthome).
  • Als eine andere wichtige Quelle des Befalls von Pflanzen käme außerdem die natürliche oder künstlich geschaffene Umgebung infrage, vorzugsweise Böden und Gewässer.
  • Man muß außerdem zur Kenntnis nehmen, daß die Isolierung und die mikrobiologische Charakterisierung im allgemeinen langwierige und arbeitsaufwendige Techniken darstellen, die mit allzu hohen Kosten verbunden sind, um sie für eine Anwendung in großem Maßstab in Betracht zu ziehen, zumal die immunologischen Methoden nicht immer die erwünschte Spezifizität und Empfindlichkeit zu bieten vermögen.
  • Die pektinolytischen Bakterien der Gattung Erwinia (von jetzt an nur noch als Erwinias bezeichnet) sind verantwortlich für eine große Anzahl jenes Typs von Krankheitsbildern, bei denen der Gewebsuntergang bei einer großen Zahl von Pflanzen, Setzlingen und Samen (im Rahmen einer generalisierenden Verwendung des Begriffs) eines der Sympthome darstellt. Diese Bakterien sind insbesondere fähig, die Kartoffel, den Mais, die Tomate, die Zuckerrübe den Kohl, die Endivie, usw., ebenso wie Zierpflanzen in den Treibhäusern, so wie z.B. reine Zierpflanzen, und in einer allgemeingültigen Art und Weise jede zwischen den europäischen Ländern und Drittländern gehandelte Pflanze zu infizieren.
  • Unter den pektinolytischen Erwinien kann man grundsätzlich erwähnen einerseits die Art Erwinia carotovora, sowie insbesondere Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc), Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), Erwinia carotavora subsp. odorifera (Eco), Erwinia carotovora subsp. wasabiae (Ecw), sowie andererseits die Art Erwinia chrysanthemi (Ech).
  • Diese Bakterien erzeugen mehrere extrazelluläre Enzyme, die fähig sind, die Bestandteile der Zellwand anzugreifen, wie z.B.: Pektinasen, Zellulasen, Hemizellulasen und Proteasen (für eine detaillierte Übersicht siehe den Artikel von A. Kotoujansky, erschienen in den Annu. Rev. Phytopathol. 1987, 25: Seiten 405-430).
  • Von diesen Enzymen sin die Pektat-Lyasen (PL) (auch als Polygalacturonat-Lyasen, Pektat-Transeliminasen, Polygalacturonat-Transeliminasen, Poly(1,4-α-D-galacturonid)- Lyase, und EC 4.2.2.2 bezeichnet) am Mechanismus dieses Gewebsuntergangs bei Pflanzen beteiligt, wenn sie auch nicht die einzigen, für dieses Phänomen verantwortlichen Agentien darstellen und sie zudem auch nicht alle für die Virulenz dieser Bakterien erforderlich wären.
  • Unter Pektat-Lyasen (PL) versteht man jedes Enzym, welches fähig ist, im Zuge einer β-Eliminationsreaktion eine 1,4-glycosidische Bindung zu spalten, die zwischen zwei galacturonischen Resten vorliegt.
  • Diese Pektat-Lyasen (im folgenden Text fortan nur noch als PL bezeichnet) werden hauptsächlich durch die als pel bezeichneten Gene kodiert, wie zum Beispiel pe1Y (Manulis et al., 1988), pe1B (Lei et al., 1987), pe1A (Lei et al., 1988), pe1I (Ito et al., 1988), pe1153 (Trollinger et al., 1989), pe1A, pe1C, pe1E und pe1D (Tamaki et al., 1988), pe1A, pe1D und pe1E (Van Gijsegem, 1989), pe1B (Schoedel und Collmer, 1986), pe1A (Favey et al., 1992) und pe1B (Hinton et al., 1989).
  • Diese Gene selbst sind in Abhängigkeit von ihren Sequenzhomologien in drei Familien eingeteilt worden. Es ist in der Tat ermittelt worden, daß die Familie pe1A, D, E bei Ech vorliegt, die Familie pe1B, C, I, X bei Eca, Ecc und Ech, während die Familie pe1153, Y bei bestimmten Stämmen von Erwinia carotovora vorliegt.
  • Es ist indes ratsam, festzuhalten, daß diese Gene nicht für pektinolytische Erwinias spezifisch sind. Tatsächlich sind auch andere Bakterien, so wie zum Beispiel Yersinia pseudotuberculosis (Yps), Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas sp. in der Lage, Pektat-Lyasen zu erzeugen. Beispielsweise sei die Familie pe1153, Y bei Yps nachgewiesen worden, während ein Abschnitt des Gens pe1153 tatsächlich Eca und Yps gemeinsam sein soll (Trollinger et al., 1989).
  • Die Anwesenheit erhaltener Sequenzen, und zwar auf der Ebene der Nukleotidsequenzen, die den Proteinen dieser PL entsprechen, würde auf dem Auftreten von Kreuzungsreaktionen infolge der Durchführung der Methoden zur Feststellung der Anwesenheit der Erwinias beruhen, da diese Methoden mit einer Hybridisierung unter den Nukleinsäuren oder einer immunologischen Reaktion mit Hilfe von Anti-PL-Antikörpern einhergehen.
  • Es ist hauptsächlich diese Möglichkeit von Kreuzungsreaktionen, welche die Ursache dafür ist, daß irgendeine Methode zur Diagnose von durch diese pektinolytischen Erwinias verursachten Krankheitsbildern, welche unter Vermittlung der mit diesen PL korrespondierenden Nukleotidsequenzen durchgeführt wird, nicht in Betracht gezogen worden ist.
  • Was die Methoden der immunologischen Diagnostizierung dieser Krankheitsbilder betrifft, so weisen sie, abgesehen von den mit den Kreuzungsreaktionen verbundenen Problemen (die zum Auftreten von positiven oder negativen Fehistellen führen), gleichzeitig den Nachteil auf, daß sie keine frühzeitige Diagnose der Krankheitsbilder gestatten, und zwar aufgrund der Tatsache, daß die Anwesenheit dieser PL im untersuchten Medium vom Auftreten der ersten Sympthome dieser Krankheitsbilder begleitet wird.
  • Das Dokument "Plant and Soil, 125, Seiten 285-287, 1990", beschreibt ein DNS-Fragment, welches für eine PL kodiert und welches ausgehend von einem Stamm aus der Untergattung Erwinia carotova carotova (Ecc) isoliert wurde.
  • Genau gesagt ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, für mögliche Anwender zuverlässige Methoden zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit von pektinolytischen Bakterien der Gattung Erwina einer bestimmten Art zur Verfügung zu stellen, und zwar insbesondere, was Bakterien der Art Erwinia chrysanthemi und der Art Erwinia carotovora sowie deren Unterarten und Pathovare betrifft.
  • Um sich einer noch genaueren Formulierung zu bedienen, ist es das Ziel der Erfindung, neue Nukleotidsequenzen zur Verfügung zu stellen, die als Sonden oder Initiatoren (= Startermoleküle) für die Durchführung dieser Methoden verwendbar sind, und zwar insbesondere im Rahmen von Techniken, welche mit einer Hybridisierung unter den Nukleinsäuren (RNS und/oder DNS) einhergehen, gefolgt von einer Vervielfältigung der Anzahl der Kopien der nachzuweisenden Zielsequenzen (oder der zu diesen Zielsequenzen komplementären Sequenzen), beispielsweise entsprechend den Techniken zur genetischen Vervielfältigung, die als PCR (Polymerase Chain Reaction = Polymerase-Kettenreaktion), LCR (Ligase Chain Reaction = Ligase-Kettenreaktion), Qβ-Replikase und 3SR (Self-Sustained Sequence Reaction = Selbsttragende Sequenzreaktion) bezeichnet werden.
  • Außerdem ist die Anwendung dieser vorstehend erwähnten Methoden zur frühzeitigen Diagnostizierung von durch die pektinolytischen Erwinias verursachten Krankheitsbildern ein Ziel der Erfindung, um es mit Hilfe dieser Methoden zu ermöglichen, eine Diagnose des Risikos für ein Auftreten dieser Krankheitsbilder bei den Pflanzen vorzunehmen, oder um die Risiken für einen insbesondere durch Erdreich oder durch Wasser verursachten Befall der Pflanzen abschätzen zu können.
  • Außerdem ist es ein Ziel der Erfindung, möglichen Anwendern Ausstattungen für die Durchführung der vorstehend erwähnten Methoden zur Verfügung zu stellen.
  • Außerdem ist es ein Ziel der Erfindung, die vorstehend erwähnten Nukleotidsequenzen zur Bestimmung des Polymorphismus der für die Pektat-Lyasen kodierenden Gene bei den pektinolytischen Erwinien zu verwenden, um die Arten, Unterarten und Pathovare dieser Bakterien zu identifizieren, aber auch um die geographische Herkunft und die Spezifizität des Wirts der Stämme dieser Arten, Unterarten und Pathovare zu ermitteln, und um Diagnosemethoden für speziell durch diese Arten, Unterarten und Pathovare, entweder separat, oder auch in Verbindung mit anderen verursachten Krankheitsbilder zur Verfügung zu stellen.
  • Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der nachfolgenden Figuren genauer beschrieben werden:
  • - Figur 1: Nukleotidsequenz des Gens pe1153 des Stamms EC153 von Erwinia carotovora;
  • - Figur 2: Nukleotidsequenz des Gens pe1E des Stamms EC16 von Erwinia chrysanthemi;
  • - Figur 3: Karte der Restriktionsstellen, entsprechend den Profilen, die mit Hilfe der Enzyme (a) Sau3A1, (b) HaeII, (c) AluI und (d) HpaII bei Erwinia carotovora erhalten wurden. Die Karte ist lediglich zwischen den beiden Initiatoren (= Startermolekülen) im vervielfältigten Bereich des Gens pe1 wiedergegeben.
  • Die vorliegende Erfindung hat ein Verfahren zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit von pektinolytischen Bakterien einer bestimmten Art der Gattung Erwinia zum Gegenstand, insbesondere von Bakterien der Art Erwinia chrysanthemi und der Art Erwinia carotovora in jedem Medium, das solche Bakterien enthalten kann, vorzugsweise im Erdreich oder in Wasser oder bei einem Wirt, der dafür geeignet ist, Träger solcher Bakterien zu sein, vorzugsweise bei Pflanzen, Setzlingen und Samen, welches Verfahren umfasst die Schritte des Suchens nach DNS- oder RNS-Fragmenten, die für die jeweils betreffende Art spezifisch sind und die für eine Pektat-Lyase (PL) codieren, und des Durchführens einer molekularen Hybridisierung mit mindestens einer spezifischen Sonde, welcher Hybridisierung eine Vervielfältigung der Anzahl der Kopien der oben erwähnten DNS-Fragmente mit Hilfe spezifischer Initiatoren (Startermoleküle) vorausgegangen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Nukleotidsequzenzen, die in ihrer Gesamtheit oder zum Teil den Genen entsprechen, die im Inneren des Genoms der pektinolytischen Erwinien für die PL kodieren, wobei diese Nukleotidsequenzen als Sonden und Initiatoren (= Startermoleküle) für die Durchführung des vorstehend erwähnten Verfahrens der Erfindung verwendbar sind.
  • Die Erfindung hat in dieser Hinsicht insbesondere die Verwendung von Nukleotidsequzenzen zum vorstehend erwähnten Zweck zum Gegenstand, welche Nukleotidsequenzen in ihrer Gesamtheit oder zum Teil den offenen Stadien der Informationsübertragung der Gene entsprechen, die bei Erwinia carotovora und Erwinia chrysanthemi (vorzugsweise dem im Rahmen der Figur 1 wiedergegebenen Gen pe1153 des Stamms EC153 von Eca, dem im vorstehend erwähnten Artikel von Favey et al. beschriebenen Gen pe1A des Stamms 3937 von Ech oder dem im Rahmen der Figur 2 wiedergegebenen Gen pele des Stamms EC16 von Ech) für die PL kodieren.
  • Unter Nukleotidsequzenzen, die in ihrer Gesamtheit oder zum Teil den Genen entsprechen, die im Inneren des Genoms der pektinolytischen Bakterien der Gattung Erwinia für die PL kodieren, versteht man insbesondere:
  • - entweder solche Sequenzen, die der Gesamtheit oder einem Teil eines der Stränge der DNS der für die PL kodierenden Gene, oder der Gesamtheit oder einem Teil der Sequenzen der von diesen Genen stammenden Boten-RNS (= engl.: messenger-RNS; im folgenden Text von hier an als "B-RNS" bezeichnet) identisch entsprechen,
  • - oder solche Sequenzen, die geeignet sind, sich mit der Gesamtheit oder einem Teil der vorstehend erwähnten B-RNS oder mit einem der Stränge der vorstehend erwähnten DNS zu hybridisieren. Anschaulich ausgedrückt, sind die Bedingungen der vorstehend erwähnten Hybridisierung in einer solchen Art und Weise ausreichend zwingend vorzugeben, daß die erhaltene Hybridisierungsstufe zwei aufeinanderfolgende Waschstufen von ungefähr 15 Minuten Dauer bei einer Temperatur von 65 ºC , jeweils in einer Lösung des Typs "3 x SSS" (0,5 M NaCl; 0,05 M Natriumcitrat) übersteht; mit Vorteil enthalten diese Sequenzen mindestens ungefähr 40 % Nukleotide, die mit denen der vorstehend erwähnten DNS und B-RNS identisch sind.
  • Die Erfindung hat insbesondere jede Nukleotidsequenz zum Gegenstand, welche die nachfolgende Nukleotidsequenz A ganz oder teilweise enthält:
  • 5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3'
  • oder welche die dazu komplementäre Sequenz oder eine von der Sequenz A, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleitete Sequenz enthält, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 1231 und 1254 der in Figur 1 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder welche die zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementäre Sequenz enthält.
  • Die Erfindung hat außerdem jede Nukleotidsequenz zum Gegenstand, welche die nachfolgende Nukleotidsequenz B ganz oder teilweise enthält, welche ausgewählt ist aus der Gesamtheit oder einem Teil von:
  • * den nachfolgenden Nukleotidketten:
  • oder deren komplementären Sequenzen,
  • * oder einer von der Sequenz B, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleiteten Sequenz, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 1642 und 1665 der in Figur 1 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder welche die zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementäre Sequenz enthält.
  • Die Erfindung bezieht sich außerdem auf jede Nukleotidsequenz, welche die nachfolgende Nukleotidsequenz C ganz oder teilweise enthält, welche ausgewählt ist aus der Gesamtheit oder einem Teil von:
  • * den nachfolgenden Nukleotidketten:
  • (die Punkte stellen jeweils Nukleotide dar, die mit denen in der ersten Zeile identisch sind) oder deren komplementären Sequenzen,
  • * oder einer von der Sequenz C, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleiteten Sequenz, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 295 und 317 der in Figur 2 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder welche die zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementäre Sequenz enthält.
  • Die Erfindung bezieht sich außerdem auf jede Nukleotidsequenz, welche die nachfolgende Nukleotidsequenz D ganz oder teilweise enthält, welche ausgewählt ist aus der Gesamtheit oder einem Teil von:
  • * den nachfolgenden Nukleotidketten:
  • oder deren komplementären Sequenzen,
  • * oder einer von der Sequenz D, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleiteten Sequenz, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 672 und 701 der in Figur 2 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder welche die zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementäre Sequenz enthält.
  • Anschaulich ausgedrückt, versteht man außerdem sowohl im vorausgehenden Textabschnitt als auch im folgenden Text unter einer abgeleiteten Sequenz jede Sequenz, die Nukleotide, wie zum Beispiel Uracil, Inosin, 7-Deaza-2-desoxyguanosintriphosphat (CDGTP), usw. enthält, so daß der Ausdruck entweder einer modifizierten DNS oder einer modifizierten RNS entspricht.
  • Mit Vorteil können die vorstehend erwähnten Nukleotidsequenzen markiert sein, vorzugsweise mittels einer radioaktiven oder enzymatischen Methode, mittels einer fluoreszierenden Zusammensetzung, durch Bindung an ein antigenes Molekül (das zur Erkennung durch die Antikörper geeignet ist), oder an ein ganz anderes Molekül, das geeignet ist, direkt oder indirekt mit Hilfe von Reagenzien nachgewiesen zu werden, wobei diese besagte Bindung möglicherweise durch die Vermittlung eines Bindungarmes bewirkt werden kann, vorzugsweise durch die Vermittlung einer Nukleotidseqzuenz, die aus ungefähr 5 bis 100 Nukleotiden besteht und die an der jeweils äußersten Position 3' oder 5' dieser Sequenzen angeordnet ist.
  • Als Anschauungsbeispiele für direkt oder indirekt nachweisbare Moleküle, die mit den vorstehend erwähnten Nukleotidsequenzen verknüpft werden können, kann man Acetylaminofluoren, Biotin (mit Hilfe von Avidin oder Streptavidin nachweisbar) oder außerdem noch Digoxigenin anführen.
  • Die vorstehend erwähnten Nukleotidsequenzen können paarweise verwendet werden, um diejenigen Komponenten zu erzeugen, die im nachfolgenden Text als Initiatorpaare bezeichnet werden, wobei diese besagten Initiatorpaare bei den pektinolytischen Erwinien die Vervielfältigung (oder ferner auch noch als Multiplikation bezeichnet) der Anzahl der Kopien der Gesamtheit oder eines Teilabschnitts der für eine PL kodierenden Gene oder der Kopien der entsprechenden RNS und ihrer abgewandelten Nukleotide durch inverse Transkription ermöglichen, was vorzugsweise mittels der PCR- Technik, wie nachstehend erläutert werden wird, oder auch mittels jeder anderen, möglichen Technik erfolgt, die mit einer Hybridisierung zwischen den Nukleotidsequenzen verbunden ist und die es zudem erlaubt, auch eine geringe Anzahl an ursprünglich vorhandenen Nukleotidsequenzen durch Multiplikation der Anzahl der Kopien derselben oder der Derivate derselben (oder deren jeweils komplementäre Sequenzen) nachzuweisen, wobei die Initiatoren erforderlichenfalls markiert werden, vorzugsweise im Wege der vorstehend bezeichneten Art und Weise.
  • Mit Vorteil bestehen die Initiatoren gemäß der Erfindung aus ungefähr 5 bis 100 Nukleotiden und bevorzugt aus 15 bis 30 Nukleotiden, wobei sie außerdem geeignet sind, sich mit einem Bereich der bei den pektinolytischen Erwinien für eine PL kodierenden Gene zu hybridisieren, welcher besagte Bereich entsprechend den Initiatoren im Inneren eines und desselben Paares jeweils in einer Art und Weise unterschieden wird, daß er entweder die Vervielfältigung der gesamten Gene oder von Fragmenten dieser Gene ermöglicht, wobei diese besagten Fragmente aus ungefähr 150 bis 700 Nukleotiden und vorzugsweise aus ungefähr 400 bis 500 Nukleotiden bestehen.
  • Die Erfindung hat insbesondere auch Initiatorpaare (Startermolekülpaare) für die genetische Vervielfältigung speziell der Erwinia carotovora (Ec) zum Gegenstand, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß der eine der Initiatoren dieser Paare aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz A oder eine davon abgeleitete Sequenz, wie vorstehend definiert, ganz oder teilweise enthalten, während dagegen der andere Initiator aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz B oder eine davon abgeleitete Sequenz, wie vorstehend definiert, ganz oder teilweise enthalten.
  • Die Erfindung hat außerdem insbesondere auch Initiatorpaare (Startermolekülpaare) für die genetische Vervielfältigung speziell von (Ech) zum Gegenstand, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß der eine der Initiatoren dieser Paare aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz C oder eine davon abgeleitete Sequenz, wie vorstehend definiert, ganz oder teilweise enthalten, während dagegen der andere Initiator aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz D oder eine davon abgeleitete Sequenz, wie vorstehend definiert, ganz oder teilweise enthalten.
  • Vorzugsweise enthalten die Initiatoren gemäß der Erfindung die letzten drei, und besonders bevorzugt die letzten fünf Nukleotide, die sich an den äußersten Positionen 3' der vorstehend beschriebenen Sequenzen (A, B, C und D) befinden.
  • Die vorstehend beschriebenen Nukleotidsequenzen können außerdem, gegebenenfalls in der vorzugsweise vorstehend beschriebenen Art und Weise markiert, als Sonden verwendet werden, wobei diese Sonden geeignet sind, sich mit entweder der Gesamtheit oder einem Abschnitt der Gene oder der entsprechenden RNS oder mit davon durch inverse Transkription abgeleiteten Nukleotiden, die bei den pektinolytischen Erwinien für eine PL kodieren, zu hybridisieren.
  • Mit Vorteil bestehen die Sonden der Erfindung aus etwa 10 bis etwa 500 Nukleotiden.
  • Im Rahmen der Verwendung der vorstehend beschriebenen Sequenzen als Sonden zur Identifizierung und Feststellung der Anwesenheit von Erwinia carotorova enthalten die Sequenzen besonders bevorzugt mindestens etwa 10 Nukleotide aus der Sequenz, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 1613 und 1707 der in Figur 1 dargestellten Sequenz befinden, oder mindestens 10 Nukleotide, welche eine Übereinstimmung von mindestens 40 % mit der oben erwähnten Sequenz aufweisen, oder aber die ganze Sequenz ist noch zum Verbleib im Zustand der Hybridisierung mit den besagten, vorstehend definierten Sequenzen prädestiniert, vorzugsweise unter den oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen.
  • Anschaulich gesagt, stellen die Sequenzen A und B, oder jede, so wie vorstehend beschrieben, von diesen abgeleitete Sequenz, besonders vorteilhafte Sonden für die Feststellung der Anwesenheit von Erwinia carotovora, und insbesondere von Ecc, Eca, Eco und Ecw, oder auch jeder Art, Unterart oder eines jeden Pathovar dar, und zwar sowohl hinsichtlich der tatsächlich bekannten, als auch betreffend der nachträglich durch Modifikation der bekannten Taxonomie davon abgeleiteten Varianten.
  • Im Rahmen der Verwendung der vorstehend beschriebenen Sequenzen als Sonden zur Identifizierung und Feststellung der Anwesenheit von Erwinia chrysanthemi enthalten die Sequenzen besonders bevorzugt mindestens etwa 10 Nukleotide:
  • - aus der in Figur 2 wiedergegebenen Sequenz, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 295 und 701 des Gens peie des Stamms EC16 von Ech befinden,
  • - oder aus der Sequenz, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 130 und 970 des Gens pe1A des Stamms 3937 von Ech befinden, wie beschrieben im vorstehend erwähnten Artikel von Favey et al., oder mindestens 10 Nukleotide, welche eine Übereinstimmung von mindestens 40 % mit der oben erwähnten Sequenz aufweisen, oder aber die ganze Sequenz ist noch zum Verbleib im Zustand der Hybridisierung mit den besagten, vorstehend definierten Sequenzen prädestiniert, vorzugsweise unter den oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen.
  • Anschaulich gesagt stellen die Sequenzen C und D, oder jede, so wie vorstehend beschrieben, von diesen abgeleitete Sequenz, besonders vorteilhafte Sonden für die Feststellung der Anwesenheit von Ech oder auch jeder Art, Unterart oder eines jeden Pathovar dar, und zwar sowohl hinsichtlich der tatsächlich bekannten, als auch betreffend der nachträglich durch Modifikation der bekannten Taxonomie davon abgeleiteten Varianten.
  • Das Verfahren zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit von pektinolytischen Erwinien gemäß der Erfindung umfasst vorzugsweise die folgenden Stufen:
  • - die Behandlung einer aus dem Erdreich, aus dem Wasser oder einem Wirt entnommenen Probe, vorzugsweise bei Pflanzen oder Samen, in einer Art und Weise, daß das Genom dieser Erwinias für die Sonden und/oder Initiatoren der Erfindung und, im Bedarfsfall, für jede DNS- oder RNS- Polymerase zugänglich wird, was eine Replikation der beiden Stränge der genomen DNS oder entsprechend analog der RNS erlaubt, und welche Behandlung vorzugsweise durch Erhitzen, Maceration, (in einem Lösungsmittel, wie z.B. Wasser), Zermahlen oder Ultraschalleinwirkung durchgeführt wird, und zwar vorzugsweise in der Anwesenheit eines Detergens' (wie zum Beispiel von Laurylsulfat, oder von Natriumdodecylsulfat oder auch von "Triton X 100" (= hinterlegte Marke)), ferner in der Anwesenheit eines Antioxidans, außerdem von Chelatbildnern, einer alkalischen Komponente und/oder von Zusammensetzungen, welche Inhibitoren entfernen, so wie zum Beispiel die Polyphenole (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), oder auch die Polysaccharide (beispielsweise cetyltrimethylammoniumbromid);
  • - die Vervielfältigung der Anzahl der Kopien der für die PL kodierenden Gene oder der Fragmente dieser Gene, die möglicherweise dafür infrage kommen, in dieser Probe anwesend zu sein, mit Hilfe der Initiatorpaare (oder der von diesen abgeleiteten oder zu diesen komplementären Sequenzen), die so wie vorstehend definiert sind,
  • - das Feststellen der möglichen Anwesenheit von infolge der vorhergehenden Stufe vervielfältigten Fragmente, welche von der Anwesenheit von für die PL kodierenden Genen und somit der Anwesenheit von pektinolytischen Erwinien in der untersuchten Probe zeugen.
  • Die Stufe der genetischen Vervielfältigung kann in vitro oder in vivo realisiert werden, und zwar mit Hilfe jeder Methode, welche die klassischen Techniken der enzymatischen Vervielfältigung von DNS oder RNS verwendet, so wie zum Beispiel die als LCR (Ligase Chain Reaction = Ligasekettenreaktion) bezeichnete Technik, die vorzugsweise in der Zeitschrift P.N.A.S., U.S.A., 88, Seiten 189-193 (1991) beschrieben wird, oder die als "Qβ-Replicase" bezeichnete Technik, die in der Zeitschrift "Biotechnology" (Vol. 6, Oktober 1988) beschrieben wird, oder mit Vorteil die als PCR (Polymerase Chain Reaction = Polymerasekettenreaktion) bezeichnete Technik, so wie sie vorzugsweise in den europäischen Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern entsprechend EP-A 0 200 362, EP-A 0 201 184, EP-A 0 229 701 und EP-A 0 258 017 beschrieben wird, oder außerdem noch die als "3SR" bezeichnete Technik, die von Fahy et al. in der Publikation PCR Meth. Appl. 1, Seiten 25-33 (1991) beschrieben wird, oder die von diesen letztgenannten Methoden abgeleiteten Techniken, oder auch jede andere Methode, die die in vitro-Vervielfältigung von Nukleotidsequenzen ermöglicht.
  • Anschaulich gesagt, enthält der Schritt der Vervielfältigung der Gene oder der Fragmente dieser Gene vorzugsweise die folgenden Stufen:
  • - eine Vorstufe der Denaturierung des DNS-Doppelstranges zum DNS-Einzelstrang, durch Erwärmen im Temperaturbereich zwischen etwa 80 ºC und etwa 110 ºC, vorzugsweise bei 100 ºC, vorzugsweise in einem Puffer, der aus Tris-HCl (10 mM pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01 % Gelatine, DNS- Polymerase-Kofaktoren, vorzugsweise Mg²&spplus;-Ionen und K&spplus;-Ionen, den 4 Desoxynukleotiden, aus welchen sich die DNS (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) zusammensetzt, und den so wie vorstehend definierten Initiatorpaaren besteht; wobei diese Stufe während eines Zeitraums von etwa 2 Minuten bis etwa 7 Minuten, vorzugsweise während eines Zeitraumes von 5 Minuten durchgeführt werden kann,
  • - die eigentliche Vervielfältigung durch Zugabe von beispielsweise thermoresistenter DNS-Polymerase zum in der vorstehenden Stufe erhaltenen Medium, und
  • - das Erwärmen auf eine Temperatur von ca. 94 ºC, was der Stufe der eigentlichen Denaturierung entspricht; wobei diese Stufe während eines Zeitraums von etwa 10 Sekunden bis etwa 2 Minuten durchgeführt werden kann,
  • - dann das Erwärmen auf den Temperaturbereich von ca. 60 ºC bis ca. 76 ºC, was der Stufe der Hybridisierung der Initiatorpaare mit den für die PL kodierenden Genen oder den Fragmenten dieser Gene entspricht, welche möglicherweise in der untersuchten, biologischen Probe anwesend sind; wobei diese Stufe während eines Zeitraums von etwa 10 Sekunden bis etwa 3 Minuten durchgeführt werden kann,
  • - und schließlich das Erwärmen auf den Temperaturbereich von ca. 50 ºC bis ca. 76 ºC, was der Stufe der Verlängerung der in der vorhergehenden Stufe gegenseitig hybridisierten Initiatorpaare entspricht, um somit Nukleotidsequenzen herzustellen, die gänzlich oder teilweise komplementär zu den genomen Sequenzen der pektinolytischen Erwinia-Bakterien sind, wobei die letztgenannten Sequenzen durch die Nukleotide begrenzt werden, die sich mit den oben erwähnten Initiatoren hybridisierten; wobei diese Stufe während eines Zeitraums von etwa 10 Sekunden bis etwa 3 Minuten durchgeführt werden kann,
  • - die etwa 20- bis etwa 50-fache, vorzugsweise 25- bis 35-fache Wiederholung der vorhergehenden Vervielfältigungs stufe;
  • - im Bedarfsfall die Wiederverwendung eines aliquoten Anteils des am Ende der vorhergehenden Vervielfältigungsstufe erhaltenen Mediums, um eine neue Vervielfältigung gemäß der vorstehend beschriebenen Methode zu realisieren.
  • Hierzu sollte man wissen, daß sämtliche im Rahmen der vorstehend ausgeführten Methoden definierten Zeitabschnitte in Abhängigkeit von der jeweils verwendeten Apparatur (d.h., je nachdem, ob beispielsweise ein Regelgerät oder ein Temperaturregler verwendet wird) abgewandelt werden können.
  • Es wird somit deutlich, daß die im Rahmen des Schrittes der Vervielfältigung der Anzahl der Kopien durch Multiplikation eines Fragments der RNS auf der Basis der vorstehend beschriebenen Methode verwendeten 4 Desoxynukleotide dUTP, dCTP, dGTP und dATP sind.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung kann die Empfindlichkeit des Nachweises gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren in nachfolgend beschriebener Weise verbessert werden, und zwar mittels einer Vervielfältigung des Typs der in "PCR - A Practical Approach", herausgegeben von M.J. McPherson, P.Quirke, G.R. Taylor , Seite 42, (1991), Oxford University Press beschriebenen "nested PCR" (= "nested Polymerase Chain Reaction") unter Verwendung interner Initiatoren innerhalb des im vorausgegangenen Schritt vervielfältigten Fragmentes, was zu einer Vervielfältigung der Anzahl der Kopien eines DNS- oder RNS-Fragmentes führt, welches kürzer ist als jenes Fragment, dessen Kopienanzahl ursprünglich vervielfältigt worden ist.
  • Der Nachweis der vorstehend erwähnten Gene oder Genfragmente kann durchgeführt werden, indem das Reaktionsmedium, in dem die Vervielfältigung durchgeführt worden ist, ganz oder teilweise der Gelelektrophorese unterworfen wird. Die visuell erkennbare Abbildung einer bedeutenden Anhäufung von (mehr oder weniger von anderen unterscheidbaren) Sequenzen auf einem bestimmten Punkt des Gels, entsprechend der Anzahl der Kopien der somit vervielfältigten Gene oder eines Teilabschnitts derselben ist mit der Anwesenheit der vorstehend erwähnten Gene in der untersuchten Probe korrelierbar.
  • Mit Vorteil ist die vervielfältigte Anzahl der Kopien der vorstehend erwähnten Gene oder eines Teilabschnitts derselben für einen Nachweis mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Sonden geeignet, und zwar vorzugsweise gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren.
  • Für den Fall einer Verwendung von Sonden kann der Nachweis der vervielfältigten Genfragmente entweder mit Hilfe einer einzigen Sonde (einfache Hybridisierung), vorzugsweise unter Verwendung von markierten Initiatoren oder Nukleotiden, oder mit Hilfe von zwei Sonden (doppelte Hybridisierung) durchgeführt werden.
  • Anschaulich gesagt, wird das auf einer doppelten Hybridisierung beruhende Verfahren gemäß der Erfindung mit Vorteil in der folgenden Art und Weise durchgeführt:
  • - nachdem das Genom in den Bakterien innerhalb der Probe zugänglich gemacht worden ist, geht man entsprechend der Vervielfältigungsstufe gemäß der vorstehend beschriebenen Technik vor, und setzt das Verfahren anschließend mit den folgenden Schritten fort:
  • - es erfolgt die Fixierung einer als "Falle" dienenden Nukleotidsequenz auf einem festen Träger (so wie zum Beispiel auf einer Membran oder auch einem beschichteten Träger für die Mikrotitration, so wie zum Beispiel auf einem von denjenigen, welche gewöhnlich im Rahmen der als ELISA bezeichneten Technik verwendet werden, wobei an diesen Trägern Nukleinsäuren fixiert sein können oder auch nicht), welche besagte Nukleotidsequenz unter den vorstehend beschriebenen Sonden gemäß der Erfindung ausgewählt worden ist und mit welcher sich die vorstehend erwähnten Gene oder die Fragmente derselben hybridisieren können, und zwar vorzugsweise unter den vorstehend erwähnten Bedingungen, wobei diese besagte Fixierung entsprechend den gewöhnlichen Techniken durchgeführt wird, vorzugsweise so wie von Maniatis et al. 1982 beschrieben,
  • - es erfolgt das Spülen des festen Trägers;
  • - die Absättigung der freien, reaktiven Positionen des Trägers;
  • - die Behandlung der als "Fallen" dienenden und somit fixierten Sequenzen in einem Brutapparat mit dem von der in der vorstehend beschriebenen Art und Weise vorbehandelten, biologischen Probe stammenden, genetisch vervielfältigten DNS (oder RNS) unter Bedingungen, welche die Hybridisierung der vorstehend erwähnten DNS (oder der RNS) mit den besagten, als "Fallen" dienenden Sequenzen erlauben, und zwar vorzugsweise unter den vorstehend definierten Hybridisierungsbedingungen;
  • - das Spülen des festen Trägers, und zwar vorzugsweise mit Hilfe von "6 x SSC" bei einer Temperatur von 65 ºC (oder alternativ "3 x SSC" bei einer Temperatur von 65 ºC, oder alternativ "0,1 x SSC", falls erforderlich, bei einer Temperatur von 68ºC), während eines Zeitraumes von 15 Minuten, sowie eine anschließende, zweimalige Wiederholung dieses Vorgehens;
  • - die Behandlung der vorstehend erwähnten DNS- oder RNS-Sequenzen, die in der vorausgegangenen Stufe mit den als "Fallen" dienenden Sequenzen hybridisiert worden sind, in einem Brutapparat mit einer oder mehreren Sonde(n) entsprechend der Erfindung, wobei diese Sonden in einer solchen Art und Weise ausgewählt werden, so daß sie nicht zu den vorstehend erwähnten, als "Fallen" dienenden Sequenzen komplementär sein sollten, unter Bedingungen, welche die Hybridisierung der vorstehend erwähnten, vervielfältigten DNS (oder der RNS) mit den besagten Sonden erlauben, und zwar vorzugsweise unter den vorstehend definierten Hybridisierungsbedingungen;
  • - das Spülen des festen Trägers, und zwar vorzugsweise unter den vorstehend erwähnten Bedingungen;
  • - die Feststellung der Anwesenheit von im Zuge der Hybridisierung mit den vervielfältigten Nukleotidsequenzen im Anschluß an die vorhergehende Stufe möglicherweise in fixiertem Zustand auf dem festen Träger verbliebenen Sonden, was somit von der Anwesenheit der vorstehend erwähnten, genomischen DNS (oder RNS) innerhalb der biologischen Probe zeugen würde, wobei diese besagte Feststellung der Anwesenheit entweder auf direktem Wege durchgeführt wird, indem die besagten Sonden im Wege einer radioaktiven Methode oder mittels einer fluoreszierenden Zusammensetzung markiert werden, oder alternativ auf indirektem Wege unter Vermittlung von reaktiven Agentien, welche selbst in der Lage sind, diese Sonden zu erkennen; für den Fall, daß die besagten Sonden mit Antigenen oder mit Molekülen markiert sind, welche geeignet sind, von Antikörpern oder reaktiven Agentien erkannt zu werden, so erfolgt diese Feststellung vorzugsweise mit Hilfe von Antikörpern oder mittels anderer, vorstehend beschriebener, reaktiver Agentien.
  • Vorzugsweise kann die Spezifizität der beiden im Rahmen des Nachweises mit Hilfe des Verfahrens der doppelten Hybridisierung verwendeten Sonden veränderbar sein. Beispielsweise kann man eine spezielle Sonde einer bestimmten Art verwenden, die anschaulich gesagt als "Fallensonde" dient, und zwar insbesondere von der Art Erwinia carotovora oder der Art Erwinia chrysanthemi. Die zweite, im Rahmen des vorstehend beschriebenen Verfahrens der doppelten Hybridisierung verwendete Sonde könnte unter speziellen Sonden der Unterarten oder der Pathvare der vorstehend erwähnten Stämme ausgewählt werden.
  • Es wird darauf hingewiesen, daß man im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch andere, in fester oder flüssiger Phase durchzuführende Methoden, was etwa den Nachweis oder die quantitative Bestimmung betrifft, ohne weiteres in Betracht ziehen kann.
  • Diese Methoden werden vor allem in einem Artikel von Bloch, 1991, beschrieben, der die PCR-Technik im allgemeinen sowie darüberhinaus eine Methode für die quantitative Bestimmung durch "gemeinsame Vervielfältigung" ("co-amplification") behandelt, welche für die quantitative Bestimmung der in einer untersuchten, biologischen Probe anwesenden pektinolytischen Erwinien verwendet werden kann, oder in einem Artikel von Barany, (1991), der die LCR- und die PCR- Methode behandelt, oder außerdem noch in einem Artikel von Gilliland et al., (1990), der eine kompetitive PCR-Methode für die quantitative Bestimmung von B-RNS behandelt und welche ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung anwendbar ist.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren, so wie vorstehend beschrieben, welches Verfahren die Identifizierung und die Feststellung der Anwesenheit von Bakterien der Art Erwinia carotovora und insbesondere einer der Unterarten Ecc, Eca, Eco und Ecw, oder einer jeglichen Art, Unterart oder Pathovar erlaubt, und zwar sowohl hinsichtlich der tatsächlich bekannten, als auch betreffend der nachträglich durch Modifikation der bekannten Taxonomie davon abgeleiteten Varianten, wobei das besagte Verfahren durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:
  • - die verwendeten Inititatorpaare bestehen aus einer Nukleotidsequenz A oder einer davon abgeleiteten Sequenz sowie einer Nukleotidsequenz B oder einer davon abgeleiteten Sequenz, so wie vorstehend definiert;
  • - die als "Fallen" dienenden Sequenzen und die Sonden werden unter den Sequenzen ausgewählt, die mindestens 10 Nukleotide aus der Sequenz enthalten, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 1231 und 1665 der in Figur 1 dargestellten Sequenz befinden.
  • Mit Vorteil werden die Stufen der eigentlichen Denaturierung, der Hybridisierung und der Elongation im Rahmen des vorstehend erwähnten Verfahrens bei einer Temperatur von 94 ºC während eines Zeitraumes von 1 Minute, bzw. bei einer Temperatur von 65 ºC während eines Zeitraumes von 1 Minute, bzw. bei einer Temperatur von 72 ºC während eines Zeitraumes von 1 Minute und 30 Sekunden durchgeführt.
  • Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren, so wie vorstehend beschrieben, welches Verfahren die Identifizierung und die Feststellung der Anwesenheit von Bakterien der Art Ech oder einer jeglichen Art, Unterart oder eines jeden Pathovars erlaubt, und zwar sowohl hinsichtlich der tatsächlich bekannten, als auch betreffend der nachträglich durch Modifikation der bekannten Taxonomie davon abgeleiteten Varianten, wobei das besagte Verfahren durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:
  • - die verwendeten Inititatorpaare bestehen aus einer Nukleotidsequenz C oder einer davon abgeleiteten Sequenz sowie einer Nukleotidsequenz D oder einer davon abgeleiteten Sequenz, so wie vorstehend definiert;
  • - die als "Fallen" dienenden Sequenzen und die Sonden werden unter den Sequenzen ausgewählt, die mindestens 10 Nukleotide aus der Sequenz enthalten, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 295 und 701 der in Figur 2 dargestellten Sequenz befinden.
  • Mit Vorteil wird im Rahmen des vorstehend erwähnten Verfahrens die Stufe der eigentlichen Denaturierung bei einer Temperatur von 94 ºC während eines Zeitraumes von 1 Minute durchgeführt und die Stufen der Hybridisierung und der Elongation werden zu einer einzigen Stufe bei einer Temperatur von 72 ºC während eines Zeitraumes von 2 Minuten zusammengefasst.
  • Außerdem ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Anwendung der vorstehend erwähnten Verfahren zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit von Bakterien im Rahmen der Durchführung einer Diagnosemethode für das mögliche Auftreten (im folgenden Text auch als Methode für eine frühzeitige Diagnose bezeichnet) von durch pektinolytische Erwinien verursachten Krankheitsbildern, insbesondere von durch Bakterien der Art Erwinia carotovora und der Art Erwinia chrysanthemi bei einem so wie vorstehend definierten Wirt verursachten Krankheitsbildern, welcher besagte Wirt dafür geeignet ist, ein scheinbar gesunder Träger solcher Bakterien zu sein und sich somit im Stadium einer versteckten Infektion zu befinden.
  • Das Ergebnis der vorstehend erwähnten Diagnosemethode erlaubt es, das Risiko abzuschätzen, welches bei einem bestimmten Wirt, welcher Wirt geeignet ist, Träger pektinolytischer Erwinien, insbesondere von Ec und Ech zu sein, im Hinblick auf die Entwicklung und, gegebenenfalls, die Übertragung eines Krankheitsbildes vorliegt, welches durch diese besagten Bakterien verursacht wird.
  • Die Erfindung betrifft auch die Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren zur Vorbeugung gegen pektinolytische Erwinien in jedem Medium, das solche enthalten könnte, vorzugsweise im Erdreich und in Wasser, und dient somit als Indikator möglicher Quellen des Befalls mit besagten Bakterien.
  • Unter den im Rahmen der vorstehend erwähnten Diagnose- und Nachweismethoden fassbaren pektinolytischen Erwinien muß man sowohl sämtliche natürlichen Stämme dieser Bakterien verstehen, als auch diejenigen Bakterienstämme und andere Organismen, welche modifiziert wurden, vorzugsweise mit Hilfe gentechnischer Methoden.
  • Als Krankheitsbilder, welche ein Stadium der versteckten Infektion aufweisen und für eine Vorbeugung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, kann man insbesondere anführen:
  • - sämtliche als Fäulniskrankheiten bezeichnete generische Krankheitsgattungen (sowohl trockene als auch feuchte Fäulnis), welche sich örtlich begrenzt und/oder systemisch entwickeln, und zwar sowohl betreffend die gesamte Pflanze oder deren Organe, auf der Anbaufläche oder in konserviertem Zustand oder noch während des Überlebens der Pflanze. Als anschauliche Beispiele kann man erwähnen die Fäulnis der Kartoffel (bei der Pflanze oder der Wurzelknolle), der Sommerendivien oder von Endivienkeimlingen oder auch von gelagerten Endivien, die Fäulnis der "Sankt-Pauls- Pflanze" (frz.: Saintpaulia), oder auch die Fäulnis jeglicher Sorte von Salaten, deren pflanzliche Organe (sie werden im nachfolgenden Text als in eine 4º-Skala eingeteilte Erzeugnisse bezeichnet) möglicherweise selbst verursachten oder auf ihre Umgebung zurückgehenden Veränderungen unterworfen sind (wie zum Beispiel einer veränderten Atmosphäre, Spülungen, Desinfektionsvorgängen, etc.);
  • - die unterschiedlichen, als systemische Fäulniskrankheiten bezeichneten Krankheiten, so wie zum Beispiel der "Schwarzfuß" (frz.: jambe noire) oder die Wachstumsmangelkrankheit der Kartoffel;
  • - die Ringfäule, welche sich durch eine ungewöhnliche Haltung der Pflanzen auszeichnet, und welche allgemein nach einer Verstopfung der pflanzlichen Kappillargefäße beobachtet wird, insbesondere infolge des Unterbindens der Zirkulation von einem oder zwei der Pflanzensäfte (tritt vorzugsweise bei der Kartoffel und der Nelke auf).
  • Die Erfindung hat außerdem Ausstattungen zur Durchführung eines Verfahrens oder einer Diagnosemethode gemäß der Erfindung zum Gegenstand, wobei diese besagten Ausstattungen mindestens eine Nukleotidsequenz enthalten, welche aus den vorstehend definierten ausgewählt wird, und welche der Gesamtheit oder einem Teilabschnitt der Gene entspricht, die im Inneren des Genoms der pektinolytischen Erwinien für Pektat-Lyasen kodieren.
  • Die Erfindung hat insbesondere Ausstattungen zum Gegenstand, welche folgendes umfassen:
  • - mindestens ein Initiatorpaar, wobei der eine der Initiatoren ganz oder teilweise aus der Sequenz A oder einer von dieser letzteren abgeleiteten Sequenz besteht, während der andere Initiator ganz oder teilweise aus der Sequenz B oder einer von dieser letzteren abgeleiteten Sequenz besteht, oder auch einer zu diesen Sequenzen komplementären Sequenz, so wie vorstehend beschrieben, wobei dieses Initiatorpaar die genetische Vervielfältigung der Nukleotidsequenzen von Bakterien der Art Erwinia carotovora, vorzugsweise von Eca, Eco, Ecc und Ecw erlaubt;
  • - eine (oder mehrere) Sonde(n), welche geeignet ist/(sind), sich mit der Gesamtheit oder einem Teilabschnitt der Fragmente von vervielfältigten Genen mit Hilfe der vorstehend erwähnten Initiatorpaare zu hybridisieren, und zwar insbesondere Sonden, welche mindestens 10 Nukleotide aus der Sequenz enthalten, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 1231 und 1665 der in Figur 1 dargestellten Sequenz befinden.
  • Die Erfindung bezieht sich außerdem auf Ausstattungen, welche folgendes umfassen:
  • - ein Initiatorpaar, wobei der eine der Initiatoren ganz oder teilweise aus der Sequenz C oder einer von dieser letzteren abgeleiteten Sequenz besteht, während der andere Initiator ganz oder teilweise aus der Sequenz D oder einer von dieser letzteren abgeleiteten Sequenz besteht, oder auch aus einer zu diesen Sequenzen komplementären Sequenz, so wie vorstehend beschrieben, wobei dieses Initiatorpaar die genetische Vervielfältigung der Nukleotidsequenzen von Bakterien der Art Erwinia chrysanthemi erlaubt;
  • - eine (oder mehrere) Sonde(n), welche geeignet ist/(sind), sich mit der Gesamtheit oder einem Teilabschnitt der Fragmente von vervielfältigten Genen mit Hilfe der vorstehend erwähnten Initiatorpaare zu hybridisieren, und insbesondere Sonden, welche mindestens 10 Nukleotide aus der Sequenz enthalten, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 295 und 701 der in Figur 2 dargestellten Sequenz befinden.
  • Die Ausstattungen gemäß der Erfindung können außerdem noch folgendes umfassen:
  • - eine thermoresistente DNS- oder RNS-Polymerase,
  • - ein Reaktionsmedium, das vorzugsweise aus Tris-HCl (10 mM pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01 % Gelatine, DNS-Polymerase-Kofaktoren, vorzugsweise Mg²&spplus;-Ionen und K&spplus;- Ionen, den 4 Desoxynukleotiden, aus welchen sich die DNS (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) oder die RNS (dCTP, dUTP, dGTP, dTTP) zusammensetzt.
  • Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von Nukleotidsequenzen, die gänzlich oder teilweise den Genen entsprechen, die im Inneren des Genoms pektinolytischer Bakterien der Gattung Erwinia, und insbesondere von Erwinia carotovora und von Erwinia chrysanthemi, für Pektat-Lyasen kodieren, im Rahmen der Durchführung eines Verfahrens zur Identifizierung von Unterarten, und/oder von Stämmen oder von Pathovaren der Arten oder der Unterarten verschiedener Bakterien der Gattung Erwinia.
  • Die Erfindung hat außerdem die Verwendung von Nukleotidsequenzen wie vorstehend definiert zum Gegenstand, welche Nukleotidsequenzen gänzlich oder teilweise den Genen entsprechen, die im Inneren des Genoms pektinolytischer Bakterien der Gattung Erwinia für Pektat-Lyasen kodieren, und zwar zur Durchführung einer Methode zum Nachweis des Polymorphismus der vervielfältigten Fragmente, welche Fragmente beispielsweise zum Nachweis des Polymorphismus der Größe der Restriktionsfragmente herangezogen werden können, die von den vorstehend erwähnten, vervielfältigten Genen stammen, wobei diese besagten Fragmente kennzeichnend sind für jegliche Art oder jegliche Unterart oder jeden Pathovar von irgendeiner bestimmten Art pektinolytischer Bakterien der Gattung Erwinia.
  • Mit Vorteil wird der Nachweis der vervielfältigten Fragmente im Zuge einer Hybridisierung mit Sonden durchgeführt, welche Sonden, in Abhängigkeit von der betreffenden Art, der Unterart oder dem Pathovar der pektinolytischen Erwinien, eine mehr oder weniger breite Spezifizität aufweisen. Dieser Nachweis kann zum Beispiel gemäß der Methode RFLP (Restriction Fragment Length Polymerisation) durchgeführt werden, oder auch alternativ mit Hilfe eines entsprechenden Nachweises in fester Phase (durch einfache oder doppelte Hybridisation, wie vorstehend beschrieben), so wie dies beispielsweise von Erlich, Gibbs und Kazajian (Herausgeber), (1989) in der Publikation "Current Communications in Molecular Biology": Polymerase Chain Reaction, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., USA, beschrieben wurde.
  • Anschaulich gesagt, betrifft die Erfindung insbesondere die bei im Zuge der Restriktion mit Hilfe der Enzyme Sau3A1 und HaeII sowie den weiteren, im Rahmen der Figur 3 wiedergegebenen Enzymen bei Erwinia carotovora erhaltenen Restriktionsfragmente.
  • Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die zum Nachweis des beobachteten Polymorphismus mit Hilfe der Enzyme Sau3A1 und HaeII im Rahmen des Falls der Eca-Bakterien verwendbaren Sonden.
  • Die Erfindung hat außerdem ein Verfahren zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit eines Stammes einer Art oder Unterart oder eines bestimmten Pathovars von pektinolytischen Bakterien der Gattung Erwinia bei einem Wirt zum Gegenstand, insbesondere bei Pflanzen und Samen, welches Verfahren realisiert wird, indem man das vorstehend beschriebene Verfahren zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit durchführt und wobei das besagte Verfahren zusätzlich noch eine Stufe zum Nachweis des vorstehend erwähnten Stammes umfasst.
  • Diese Stufe zur Identifizierung der vorstehend erwähnten Stämme einer Art oder Unterart oder eines bestimmten Pathovars kann eine ergänzende Stufe im Rahmen der vorstehend erwähnten Verfahren zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit darstellen. Die vorstehend erwähnten Verfahren gliedern sich somit in zwei Zeitabschnitte; nämlich erstens den Nachweis der möglichen Anwesenheit von pektinolytischen Erwinien, gefolgt von zweitens dem Nachweis, bzw. der Unterscheidung der fraglichen Art, der fraglichen Unterart oder dem fraglichen Pathovar.
  • Diese Stufe des Nachweises der besagten Stämme kann außerdem im Rahmen der vorstehend erwähnten Verfahren die Stufe des Nachweises der Erwinien ersetzen, und zwar in der Art und Weise, daß die möglicherweise in dem biologischen Medium anwesende, fragliche Art oder die fragliche Unterart direkt nachgewiesen werden soll.
  • Der Nachweis der Stämme der Art, Unterart oder des Pathovars wird vorzugsweise in der nachfolgenden Art und Weise durchgeführt:
  • - das Versetzen der für eine PL kodierenden Gene von pektinolytischen Erwinien oder der Fragmente derselben Gene, welche möglicherweise in der untersuchten Probe anwesend sein könnten, und deren Anzahl an Kopien gegebenenfalls vervielfältigt worden ist, mit einem (oder mehreren) Restriktionsenzym(en), welche(s) geeignet ist/ (sind), die besagten Gene oder die Fragmente derselben an einer (oder mehreren), für eine Art, eine Unterart oder einen bestimmten Pathovar der Bakterien der Gattung Erwinia spezifischen Stelle(n) zu zertrennen, gefolgt von einem anschließenden Vergleich der Größe der in der vorhergehenden Strufe erhaltenen Restriktionsfragmente mit entsprechenden, für eine vorstehend erwähnte bestimmte Art oder eine Unterart kennzeichnenden Referenzfragmenten, so wie zum Beispiel mit den vorstehend beschriebenen Referenzfragmenten, vorzugsweise mit Hilfe der Technik der Gelelektrophorese;
  • oder alternativ der Nachweis der polymorphen Restriktionsstellen mit Hilfe von für die fragliche Art, die Unterart oder den Pathovar spezifischen Sonden, vorzugsweise entsprechend der auf Seite 200 des Buches von Ehrlich mit dem Titel "PCR Technology", (1989), Stockton Press, beschriebenen Methode;
  • oder auch stattdessen durch einen Vergleich der Schmelztemperatur der Domänen der erhaltenen Fragmente mit der entsprechenden Temperatur der Referenzfragmente; diese Technik kann mit Vorteil mit Hilfe der Gelelektrophorese in einem Medium, welches denaturiert sein kann oder auch nicht, durchgeführt werden, wobei das besagte Medium außerdem homogen sein kann oder auch einen kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Gradienten (der beispielsweise in Gestalt der Konzentration von Harnstoff oder Formamid, usw. eingestellt werden kann), oder einen Temperaturgradienten aufweisen kann, vorzugsweise entsprechend den Techniken, die in der Publikation "Current Communication in Molecular Biology; Polymerase Chain Reaction", herausgegeben von H.A. Erlich, R. Gibbs und H.H. Kazazian, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), beschrieben werden.
  • Der Nachweis kann außerdem mit Hilfe der besagten Initiatoren in den mittels der vorstehend erwähnten Restriktionsenzyme nachgewiesenen, polymorphen Teilabschnitten durchgeführt werden.
  • Der Nachweis der Stämme der Art, Unterart oder des Pathovars von pektinolytischen Bakterien der Gattung Erwinia wird vorzugsweise entsprechend der LCR-Technik, oder entsprechend einer von der letzteren Technik abgeleiteten (oder aufgrund dieser Technik naheliegenden) Technik durchgeführt, wie vorstehend beschrieben, und zwar vorzugsweise in der nachfolgenden Art und Weise:
  • - das Versetzen der für eine PL kodierenden Gene oder der Fragmente derselben, wobei die Anzahl der Kopien gegebenenfalls zum Zeitpunkt der Durchführung einer Diagnosemethode gemäß der Erfindung, so wie vorstehend beschrieben, vervielfältigt worden ist, mit einem (oder mehreren) Oligonukleotidsequenzpaar(en), wobei jede dieser Sequenzen aus ungefähr 10 bis ungefähr 30 Nukleotiden besteht und welche Sequenzen geeignet sind, sich wechselseitig mit einem (oder mehreren) Nukleotid(en) zu hybridisieren, welche(s) in den für Pektat-Lyasen kodierenden Genen oder Fragmenten dieser Gene angeordnet ist/(sind), und welche(s) letztgenannte(n) Nukleotid(e) charakteristisch für eine fragliche Art oder eine fragliche Unterart oder einen fraglichen Pathovar von Bakterien der Gattung Erwinia ist/(sind), und welche Sequenzen insbesondere geeignet sind, sich wechselseitig mit den für die Restriktionsstellen der zur Bestimmung dieses Stammes (oder der Art, der Unterart oder des Pathovars) verwendeten Enzyme kennzeichnenden Sequenzen zu hybridisieren, und zwar unter Bedingungen, welche die Hybridisierung dieser Gene oder der Fragmente der Gene mit dem/(den) besagten Sequenzpaar(en) ermöglichen, vorzugsweise unter den vorstehend definierten Hybridisierungsbedingungen;
  • - Zugabe einer, beispielsweise thermisch beständigen Ligase, so daß diese(s) Sequenzpaar(e) eine (oder mehrere), Sequenz(en) hervorbringen könnte, welche Sequenzen einheitlich aus jeder der zwei Sequenzen dieser Paare und des (oder der) dazu komplementären, vorstehend erwähnten, für den fraglichen Stamm von Erwinia-Bakterien kennzeichnenden Nukleotids/(Nukleotide) aufgebaut ist/(sind), so daß infolge der Wirkung dieser Ligase die beiden Sequenzen des (oder der) Paares/(Paare) mit den vorstehend erwähnten Genen oder mit den Fragmenten derselben hybridisiert werden;
  • - Vervielfältigung der Anzahl der Kopien dieser einheitlichen Sequenzen durch Verknüpfung mit Hilfe einer Ligase, und zwar im Rahmen der hierfür erforderlichen Stufen der eigentlichen Denaturierung, der Hybridisierung und des Zusammenfügens (frz.: aboutage), und zwar vorzugsweise gemäß den vorstehend beschriebenen Techniken;
  • - Nachweis dieser einheitlichen Sequenzen, wobei dieser Nachweis mit Vorteil mit Hilfe der Technik der Elektrophorese durchgeführt wird, oder vorzugsweise mit Hilfe von spezifischen Sonden, die entweder markiert sein können oder auch nicht (einfache Hybridisierung), oder welche besagten Sonden in der vorstehend beschriebenen Art und Weise von markierten, reaktiven Agentien erkannt werden können (beipielsweise im Falle der doppelten Hybridisierung).
  • Unter Nukleotiden, die kennzeichnend für eine Art oder eine Unterart oder einen Pathovar von Bakterien der Gattung Erwinia sind, versteht man jedes Nukleotid, welches in einer bestimmten Position eines für eine Pektat-Lyase kodierenden Gens dieser Art oder Unterart oder dieses Pathovars von Erwinia von denjenigen Nukleotiden verschieden ist, die sich in ein- und demselben Gen bei den jeweils anderen Arten oder Unterarten oder Pathovaren von Erwinia in der selben Position befinden. Diese Nukleotide weisen zudem die Eigenschaft auf, die Fähigkeit eines Restriktionsenzyms zu beeinflussen, das Zielfragment abzutrennen oder die untersuchte Probe zu vervielfältigen.
  • Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Nukleotidsequenzpaare für die Durchführung der vorstehend erwähnten Methode zur Feststellung der Anwesenheit von Arten, Unterarten oder Pathovaren der Bakterien der Gattung Erwinia, so wie sie vorstehend beschrieben wurden, wobei diese Sequenzen vorzugsweise unter denjenigen ausgewählt werden, welche die Positionen Sau3A1 und HaeII derjenigen Gene abgrenzen, die bei diesen Arten oder Unterarten oder Pathovaren von Bakterien der Gattung Erwinia für eine Pektat- Lyase kodieren.
  • Die Erfindung hat außerdem Ausstattungen zur Durchführung der vorstehend erwähnten Methoden zur Diagnose von Krankheitsbildern zum Gegenstand, welche Krankheitsbilder speziell durch eine bestimmte Art, Unterart oder einen Pathovar von Bakterien der Gattung Erwinia verursacht werden, wobei diese besagten Ausstattungen, abgesehen von der Gesamtheit oder einem Teil der Bestandteile der vorstehend beschriebenen Ausstattungen, zusätzliche noch folgendes umfassen:
  • - eine (oder mehrere), markierte oder nicht markierte, oligonukleotidische Sonde(n), welche auf einem festen Träger fixiert ist/(sind) und welche Sonde(n) für einen kennzeichnenden Nukleotidabschnitt einer bestimmten Art, Unterart oder eines bestimmten Pathovars von Bakterien der Gattung Erwinia spezifisch ist/(sind);
  • - gegebenenfalls, ein- oder mehrere Restriktionsenzym(e), und vorzugsweise Restriktionsfragmente, wobei auf die vorstehend im Text Beschriebenen verwiesen wird;
  • - und/oder eine Ligase und ein (oder mehrere) Oligonukleotidsequenzenpaar(e), so, wie es/(sie) vorstehend beschrieben wurde/(n), welche(s) geeignet ist/(sind), sich wechselseitig mit einem (oder mehreren) Nukleotid(en) zu hybridisieren, welche(s) in den für Pektat-Lyasen kodierenden Genen oder Fragmenten dieser Gene angeordnet ist/(sind), und welche(s) Oligonukleotidsequenzpaar(e) charakteristisch für eine Art oder eine Unterart oder einen Pathovar von Bakterien der Gattung Erwinia ist/(sind).
  • Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung der vorstehend definierten Nukleotidsequenzen zur Durchführung eines Nachweisverfahrens bei einem Wirt oder in einem Medium, wie vorstehend definiert, so wie zum Beispiel bei allen Mikroorganismen oder jeder Zelle, zum Beispiel bei Einzellern, in deren Genome die vorstehend beschriebenen Nukleotidsequenzen in einer vorübergehenden oder endgültigen Art und Weise eingeführt worden sind, welches Nachweisverfahren gegebenenfalls mit dem Ziel einer Diagnose durchgeführt wird. Vorzugsweise wird dieses Verfahren wiederum entsprechend einem der vorstehend beschriebenen Verfahren zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit durchgeführt.
  • Anschaulich gesagt, die Erfindung hat auch die Verwendung der vorstehend definierten Nukleotidsequenzen zum Gegenstand, welche besagten Nukleotidsequenzen gänzlich oder zum Teil den Genen entsprechen, die bei den pektinolytischen Erwinien für eine Pektat-Lyase kodieren, und zwar zum Beispiel als Markierungselemente für Zellen, wie zum Beispiel für Einzeller, oder für mit Hilfe gentechnischer Methoden veränderte Mikroorganismen, indem diese besagten Nukleotidsequenzen in ihr Genom eingeführt werden, oder auch für zelluläre Wirte, welche durch solche Mikroorganismen infiziert (oder umgewandelt) worden sind, wobei solche besagten Markierungselemente vorzugsweise der Verfolgung des Entwicklungsganges dieser Zellen, Mikroorganismen und zellulären Wirte in einer bestimmten Umgebung dienen.
  • Die Erfindung bezieht sich außerdem auf jedes Verfahren zur Herstellung der vorstehend erwähnten Nukleotidsequenzen.
  • Was die Herstellung der Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung betrifft, so kann diese entweder mit Hilfe eines chemischen Verfahrens, oder mittels anderer Verfahren durchgeführt werden, so wie zum Beispiel mittels der Vervielfältigung durch LCR oder PCR oder auch durch jede andere Methode für die genetische Vervielfältigung.
  • Eine geeignete Herstellungsanleitung für Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung (welche Sequenzen maximal etwa 200 Nukleotide oder Basenpaare (BP) umfassen, da es sich ja um zweikettige Nukleotidsequenzen handelt) im Zuge eines chemischen Verfahrens umfasst die folgenden Stufen:
  • - die Synthese von DNS, und zwar zum Beispiel mittels der automatisierten β-Cyanethyl-Phosphoramidit- Methode, die in Bioorganic Chemistry 4; Seiten 274-325, (1986) beschrieben ist;
  • - die Klonierung der somit in einem geeigneten, vorzugsweise plasmidischen Vektor erhaltenen DNS und die Wiedergewinnung der DNS, und zwar entweder durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde, oder durch Elektrophorese, im allgemeinen nach einer Restriktion und gefolgt von einer Elution der Fragmente.
  • Eine geeignete Herstellungsanleitung für Nukleotidsequenzen mit einer Länge von mehr als ungefähr 200 Nukleotiden, - oder Basenpaaren (BP), (da es sich ja um zweikettige Nukleotidsequenzen handelt) im Zuge eines chemischen Verfahrens umfasst die folgenden Stufen:
  • - die Aufbaustufe, zum Beispiel durch Heranführen (oder Verknüpfung mit Hilfe einer Ligase) von auf chemischem Wege synthetisierten Oligonukleotiden, an deren äußersten Positionen angemessene Restriktionsstellen vorgesehen sind, gemäß dem in Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80; Seiten 7461-7465, 1983 beschriebenen Prinzip;
  • - die Klonierung der somit in einem geeigneten, vorzugsweise plasmidischen Vektor erhaltenen DNS und die Wiedergewinnung der besagten DNS, und zwar entweder durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde, oder durch Elektrophorese, im allgemeinen nach einer Restriktion und gefolgt von einer Elution der Fragmente.
  • Die Herstellung der Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung kann außerdem auch auf biologischem Wege durchgeführt werden, vorzugsweise nach Transformation und Klonierung der zellulären Wirte, die geeignet erscheinen, um diese Nukleotidsequenzen zu enthalten und die Multiplikation der letztgenannten zu ermöglichen.
  • Ein anderes Herstellungsverfahren umfasst die Vervielfältigung der Anzahl der Kopien dieser bestimmten Nukleotidsequenz mit Hilfe geeigneter Initiatoren, so wie sie vorstehend beschrieben werden, wobei dieses besagte Verfahren vorzugsweise gemäß der PCR-Technik mittels der bei den pektinolytischen Erwinien für eine Pektat-Lyase kodierenden Gene oder den Fragmenten derselben durchgeführt wird.
  • Die Erfindung wird im Rahmen der folgenden Beispiele für die Durchführung der Methoden zum Nachweis der pektinolytischen Bakterien der Gattung Erwinia mit Hilfe der PCR-Technik noch weitergehender im Einzelnen ausgeführt.
    • A.) Materialien und Methoden: Bakterienstämme:
  • es sind Stämme der Unterarten von Erwinia carotovora und der Art Erwinia chrysanthemi, ebenso wie auch anderer Mikroorganismen verwendet worden (siehe hierzu im Einzelnen die Tabellen 1 und 2).
    • Isolierung des DNS-Erbmaterials:
  • Die Bakterien werden während des Zeitraumes von 1 Nacht bei einer Temperatur von 30 ºC in einem Luria-Medium ("Medium L") (Miller, 1972) kultiviert. Es werden jeweils zwei Milliliter dieser Kulturen zum Zweck einer Extraktion der DNS mit Hilfe der modifizierten Methode von Klotz und Zimm (1972) zentrifugiert: Bei letzterer werden die Reaktanden um einen Faktor 10 reduziert.
    • Analyse der Sequenzen:
  • es sind die folgenden veröffentlichten Ergebnisse verwendet worden: pe1Y (Manulis et al., 1988), pe1B (Lei et al., 1987), pe1A (Lei et al., 1988), pe1I (Ito et al., 1988), pe1153 (Trollinger et al., 1989), pe1A, pe1C, pe1E und pe1D (Tamaki et al., 1988), pe1A, pe1D und pe1E (Van Gijsegem, 1989), pe1B (Schoedel und Collmer, 1986), pe1A (Favey et al., 1992) und pe1B (Hinton et al., 1989).
  • Die Nukleotidsequenzen der Gene des Typs pel sind, zu Paaren eingeteilt, im Rahmen des offenen Stadiums der Informationsübertragung (frz.: "lecture ouverte",; ORF) untersucht worden, wobei ein speziell für die Sequenzanalyse vorgesehenes Programmpaket des Typs "GCG" (= Genetic Computer Croup, Universität von Wisconsin, USA) verwendet wurde.
  • Insbesondere sind die erhalten gebliebenen Sequenzabschnitte der verschiedenen Stämme der Unterarten von Erwinia carotovora und der Art Erwinia chrysanthemi sowie die davon unterschiedlichen anderer Arten untersucht worden.
  • Die Inititatoren sind mit Hilfe der folgenden Kriterien ausgewählt worden:
  • - die besagten Initiatoren sollten ausreichend entfernt liegen, um die Vervielfältigung derjenigen Fragmente zu ermöglichen, welche die Träger des Polymorphismus darstellen;
  • - die besagten Initiatoren sollten aber auch nicht zu entfernt liegen, um eine rasche Vervielfältigung des nachzuweisenden Fragments zu ermöglichen;
  • - die letzten 3 (und, falls möglich, die letzten 5) Nukleotide an der äußersten Position 3' der Initiatoren sollten unveränderlich und daher strikt komplementär zu dem besagten Teilabschnitt sein, welcher dem zu vervielfältigenden Fragment entspricht;
  • - die im Rahmen der vorliegenden Erfindung aufgefundenen Initiatoren liegen ungefähr 400 bis 500 Nukleotide von den zu vervielfältigenden Fragmenten entfernt.
  • Unter den aufgefundenen Initiatoren stellen die vorstehend erwähnten Initiatoren A, B, C und D die besonders bevorzugten Initiatoren dar.
  • Für den Fall der Bakterien der Art Ec sind die folgenden zwei Oligonukleotide (= "24-Mere"; d.h., Sequenzen, die aus 24 Nukleotiden bestehen), welche ungefähr 400 Basenpaare voneinander entfernt sind, als Initiatoren für die PCR- Technik ausgewählt worden:
  • 5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3' (Initiator A) und
  • 5'-CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-3' (Initiator B).
  • Für den Fall der Bakterien der Art Ech sind die folgenden zwei Reihen von Oligonukleotiden (= das eine ist ein "23-Mer"; d.h., eine Sequenz, die aus 23 Nukleotiden besteht, und das andere ist ein "30-Mer"; d.h., eine Sequenz, die aus 30 Nukleotiden besteht), welche Oligonukleotide ungefähr 400 Basenpaare voneinander entfernt sind, als Initiatoren für die PCR-Technik ausgewählt worden:
  • 5'-GATCAGAAAGCCCGCAGCCAGAT-3' (Initiator C),
  • 5'-CTGTGGCCGATCAGGATGGTTTTGTCGTGC-3' (Initiator D).
  • Es erfolgte gegenüber den Hinterlegungsbanken, der Genbank und der EMBL eine Bestätigung der theoretischen Bestimmung der besagten Initiatoren mit dem Ergebnis einer (vollständigen oder teilweisen) Homologie, im Rahmen derer bis zu fünf voneinander abweichende Nukleotide (= engl.: mismatch) zulässig sind.
  • Vervielfältigung der DNS: das stufenweise Vorgehen im Rahmen der verwendeten PCR-Technik ist von demjenigen abgeleitet, welches die Firma Perkin-Elmer Cetus Corporation empfiehlt. Die Reaktion wird unter Verwendung eines Volumens von 50 µl mit 50 µl Mineralöl (von der Firma Sigma kommerziell erhältlich) durchgeführt.
  • Was die Bakterien der Art Ec angeht, so wird die Mischung dann 25 Durchgängen einer Brutbehandlung unter den folgenden Bedingungen unterworfen: 1 Minute bei einer Temperatur von 94 ºC, 1 Minute bei einer Temperatur von 65 ºC, 1 Minute und 30 Sekunden bei einer Temperatur von 72 ºC (unter Verwendung der folgenden Apparatur: Pharmacia LKB Gene ATAQ Controller DFAT 70-01-101).
  • Bei den Bakterien der Art Ech werden die 25 Durchgänge in der folgenden Art und Weise durchgeführt:
  • 1 Minute bei einer Temperatur von 94 ºC, 2 Minuten bei einer Temperatur von 72 ºC. Eine erste Untersuchung der mit Hilfe der PCR-Technik erhaltenen Reaktionsprodukte wird mit Hilfe der Elektrophorese auf Agarose-Minigel (1% (p/v)) durchgeführt.
    • Untersuchung der Restriktions fragmente:
  • Die Reaktionsprodukte des PCR-Schrittes werden mit Ethanol ausgefällt und über einen 20 pl-Filter des Typs TE (= Tris-EDTA) (Maniatis, 1982) gefiltert. Die im Fall der Bakterien der Art EC verwendeten Restriktionsenzyme sind AluI, HaeII, SauA1, HpaII, Taq1, HaeIII und Hha1, alle hergestellt von der Firma Boehringer. Der der eigentlichen Restriktion entsprechende Schritt wird unter Verwendung eines Volumens von 15 µl zusammen mit 5 µl der DNS bei einer Temperatur von 37 ºC während eines Zeitraumes von 1 oder 2 Stunden durchgeführt. Im Fall der Bakterien der Art Ech sind die Enzyme die folgenden: SauI3A1, AluI und HpaII. Das gesamte Volumen wird dann in einem Puffer des Typs TBE (Tris- Borat-EDTA), (Maniatis, 1982), unter einer Spannung von 250 V eine Stunde lang einem Elektrophoreseschritt auf 6-prozentigem Acrylamidgel unterworfen (Mutterlauge: 28 % Acrylamid, Appligène, 2 /% bis, hergestellt von Biorad). Das Gel wird mit Ethidiumbromid (2 mg/l) angefärbt und anschließend gespült. Ein µg des "Markierungsstoffes V" (hergestellt von Boehringer) und ein Referenzfragment in Form eines 1000 Basenpaare aufweisenden DNS-Fragmentes (1kb (BRL)) werden als Markierungselemente für die Größe der Fragmente verwendet.
    • B.) Ergebnisse: PCR-Versuch:
  • Die Initiatoren A und B wurden jeweils in einem ersten Zeitabschnitt im Hinblick auf ihre Spezifizität unter veränderten Temperaturbedingungen gegenüber 6 Bakterienstämmen experimentell untersucht.
  • Die besten Bedingungen, die für die Vervielfältigung ermittelt wurden (mit einer Apparatur der Firma Pharmacia), sind die folgenden: 1 Minute bei einer Temperatur von 94 ºC, 1 Minute bei einer Temperatur von 65 ºC, 1 Minute und 30 Sekunden bei einer Temperatur von 72 ºC (25 Durchgänge). Es wurde eine Zusammenstellung von Mikroorganismen im Hinblick auf ihre Spezifizität entsprechend dieses besagten Vorgehens im Rahmen der PCR-Technik untersucht (siehe hierzu nachfolgend Tabelle 1). Im Rahmen dieser Zusammenstellung wiesen sämtliche Stämme der Unterarten Eca, Ecc, Eco und Ecw ein vervielfältigtes Fragment mit 434 Basenpaaren auf. Es ist keiner der Stämme der Unterart Ecb (Erwinia carotovora subsp. betavascularum), der Art Ech oder ein irgendwelchen anderen Arten von Bakterien der Gattung Erwinia zuzurechnender Stamm, so wie zum Beispiel etwa herbicola oder etwa auch rhapontici nachgewiesen worden. Die anderen untersuchten Mikroorganismen ergaben kein positives Signal. Diese Initiatoren gestatten somit den spezifischen Nachweis von vier der bekannten Unterarten der pektinolytischen Erwinien von der Art Erwinia carotovora, und zwar vorzugsweise auf der Kartoffelpflanze.
  • Die besten Bedingungen, die für die Vervielfältigung der Initiatoren C und D ermittelt wurden (mit einer Apparatur der Firma Pharmacia), sind die folgenden: 1 Minute bei einer Temperatur von 94 ºC und 2 Minuten bei einer Temperatur von 72 ºC.
  • Mit Hilfe der Initiatoren C und D werden die Stämme der Art Ech spezifisch nachgewiesen, und somit können die krankheitsbildenden Erwinien auf der Kartoffelpflanze im Rahmen einer möglichen Unterscheidung zwischen den Arten chrysanthemi und carotovora nachgewiesen werden. Aufgrund der physiologischen und geographischen Unterschiede zwischen diesen beiden Arten sowie ihrer unterschiedlichen pathogenen Virulenz können diese PCR-Prüfungen eine wichtige Rolle spielen, vorzugsweise im Zuge einer Zertifizierung von infektionsfreien Samen und Stecklingen.
  • Gleichwohl gestattet es dieser an Erwinia carotovora durchgeführte Versuch nicht, die für die Kartoffelpflanze auf ihren Anbauflächen pathogensten dieser Stämme (hauptsächlich Eca) von den anderen Stämmen zu unterscheiden, welche, unter anderem, für die während der Lagerung auftretenden Krankheiten verantwortlich sind (wie zum Beipiel Ecc). Aus diesem Grunde wird im folgenden noch eine zusätzliche RFLP- Studie anhand der vervielfältigten Teilabschnitte der besagten Sequenzen unternommen, um einen möglicherweise mit der pathogenen Virulenz, der Taxonomie oder der geographischen Region der Isolierung der jeweiligen Stämme korrelierten Polymorphismus der besagten Sequenzen aufzuklären.
    • RFLP-Untersuchung:
  • Die 434 Basenpaare aufweisenden, vervielfältigten Fragmente aus der Zusammenstellung der Ec-Stämme sind einem Restriktionsschritt unter Verwendung mehrerer Enzyme unterworfen worden: von diesen Enzymen weisen TaqI und HaeIII keinen Polymorphismus auf und werden somit im Rahmen einer Zusammenstellung verschiedener Stämme untersucht. Hha1 weist auf einer für die Ec-Stämme repräsentativen Skala von 30 Stämmen mehr als 15 Profile auf. AluI, HaeIII, Sau3A1 und HpaII weisen von der Gesamtheit der Zusammenstellung (ungefähr 100 Stämme) drei von 5 unterschiedlichen Profilen auf (siehe Figur 3). In der Tabelle 1 ist ein Überblick über die weltweit erzielten Ergebnisse wiedergegeben. Das Enzym Sau3A1 erlaubt die Identifizierung der an der Kartoffelpflanze isolierten Eca-Stämme (siehe Profil IV in Figur 3), welche die verantwortlichen Agentien für die typische "Schwarzfuß"-Krankheit (= frz.: "jambe noire") dieser Pflanze sind. Außerdem weisen zwei an der Tomatenpflanze isolierte Eca-Stämme das Profil IV auf, aber diese Stämme sind ebenfalls verantwortlich für die Sympthome der "Schwarzfuß"- Krankheit, welche sowohl bei der Tomaten-, als auch bei der Kartoffelpflanze auftritt, von welchen Pflanzen sie auch übertragen wird (Samson et al., 1989). Es könnte sich hierbei um für Kartoffelpflanzen spezifische Eca-Stämme handeln, welche zufällig auf Tomatenpflanzen gefunden wurden, es sei denn, es existiert tatsächlich überhaupt kein Unterschied im Hinblick auf die pathogene Virulenz der Eca-Bakterien gegenüber diesen beiden, in taxonomischer Hinsicht ja eng verwandten Gemüsearten.
  • Eine Ausnahme stellt der in Argentinien auf der Kartoffelpflanze isolierte Stamm 89.19 dar, welcher nicht das Profil IV aufweist. Dieser Stamm zeigt vielmehr das Profil II, so wie auch die beiden vom Regelfall abweichenden Eca- Stämme 1H und 40H, die aus Gewässern in Spanien isoliert wurden. Diese Stämme weisen gemeinsame, kennzeichnende Merkmale auf, so wie zum Beispiel die Möglichkeit, bei 37 ºC zu wachsen (was die Eca-Stämme üblicherweise sonst nicht tun) und führen auch nicht zu den typischen Sympthomen der "Schwarzfuß"-Krankheit, wie sie von den entsprechenden Kartoffelpflanzen übertragen werden. Diese Stämme scheinen sich daher in die Unterart atroseptica offensichtlich nicht einzufügen.
  • Im Rahmen dieses PCR-Versuchs führte die Restriktion mit dem Enzym Sau3A1 zu den homogensten Ergebnissen im Hinblick auf die Identifizierung des typischen Verursachers der "Schwarzfuß"-Krankheit. Vom Standpunkt der Diagnostik aus betrachtet, könnte die einzige Verwendung des PCR- Versuchs darin bestehen, eine zuverlässige Abschätzung der zu erwartenden Risiken zu ermöglichen, denen eine gegebene Anbaufläche oder ein bestimmtes Lager ausgesetzt ist. Die durch die Verwendung des Enzyms Sau3A1 und somit den durch dieses Enzym nachgewiesenen Polymorphismus erhaltenen Informationen erlauben es, die typischen Verursacher der "Schwarzfuß"-Krankheit zu identifizieren.
  • Die Profile, die mit Hilfe der Enzyme Sau3A1, HpaII und AluI bei denjenigen Genen erhalten wurden, die bei Ech für eine Pektat-Lyase kodieren, erlauben es, die Stämme der Unterart Ech in Abhängigkeit von dem Wirt zu unterscheiden, von dem sie stammen, und insbesondere erlauben diese Profile es weiterhin auch, die Pathovare zu unterscheiden, so wie zum Beispiel zeae und dianthicola.
  • Was Ech angeht, so ist außerdem festzuhalten, daß es eine Beziehung zwischen dem erhaltenen Profiltyp und der Herkunftspflanze sowie insbesondere auch dem Pathovar gibt. Zum Beispiel gestattet es das Enzym Sau3A1, speziell die für Nelken, Mais, die "Sankt-Pauls-Pflanze" (frz.: Saintpaulia), die Dieffenbachia oder den Philodendron spezifischen Stämme zu identifizieren, während das Enzym AluI die Identifizierung der für Mais spezifischen Stämme erlaubt.
  • Wir wir im vorausgehenden Textabschnitt gesehen haben, sind die Initiatoren A und B einerseits, sowie entsprechend die Initiatoren C und D andererseits jeweils für die Ec-Bakterien, bzw. für die Ech-Bakterien spezifisch. Es ist außerdem zweckmäßig festzuhalten, daß diese Initiatoren in keinem einzigen, im folgenden aufgezählten Fall die Vervielfältigung der Nukleotidsequenzen ermöglichen, nämlich bei Erwinia herbicola, Erwinia rhapontici, Franckia, Pseudomonas sp., Xanthomonas campestris, Agrobacterium tumefaciens, Clavibacter sp. (früher als Corynebacterium bezeichnet), bei den atmosphärischen Stickstoff fixierenden Organismen, den Pilzen und den saprophytischen Hefepilzen der Kartoffelpflanze, und bei Yersinla sp., obwohl einzelne dieser Organismen durchaus Pektat-Lyasen erzeugen. Tabelle 1: Herkunftsorte und Restriktionsstellen der Ec- Stämme, die im Rahmen der PCR-RFLP-Studie verwendet wurden:
  • (*: Stämme, die ursprünglich anhand von Phänotypischen Kriterien als zur Unterart atroseptica gehörend bestimmt wurden, müssen tatsächlich als zu der Unterart carotovora gehörend eingeordnet werden) Tabelle 2: Herkunftsorte der im Rahmen der PCR-RFLP-Studie verwendeten Ech-Stämme:
    • LITERATURHINWEISE
  • - Barany, 1991, Biochemistry, Vol 30, Nr. 11, Seite 2735;
  • - Bloch, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, Seiten 189-193;
  • - Favey et al., 1992, Journal of General Microbiology, Vol 138, Seiten 499-508;
  • - Gilliland et al., 1990, PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, herausgegeben von Innis, Gelfand, Sninsky, White, Academic Press, Inc.;
  • - Hinton et al., 1989, Molecular Microbiology, Vol 3, Seiten 1785-1795;
  • - Ito et al., 1988, Agric. Biol. Chem., Vol 52, Seiten 479-487;
  • - Klotz and Zimm, 1972, J. Mol. Biol., Vol 72, Seiten 779-800;
  • - Lei et al., 1987, Journal of Bacteriology, Vol 169, Seiten 4379-4383;
  • - Lei et al., 1988, Gene, Vol 62, Seiten 159-164;
  • - Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., USA, Seiten 545 ff.;
  • - Manulis, 1988, Journal of Bacteriology, Vol 170, Seiten 1825-1830;
  • - Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., USA, Seiten 466 ff.;
  • - Samson et al., 1989, Biochemical and serological diversity of Erwinia chrysanthemi, in: Proc. 7th. Int. Conf. Plant Path. Pact., Budapest, Ungarn, Seiten 895-900;
  • - Schoedel und Collmer, 1986, Journal of Bacteriology, Vol 167, Seiten 117-123;
  • - Trollinger et al., 1989, Molecular Plant Microbe Interactions, Vol 2, Seiten 17-25;
  • - Van Gijsegem, 1989, Molecular Microbiology, Vol 3, Seiten 1415-1424.

Claims (28)

1. Ein Verfahren zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit von pektinolytischen Bakterien einer bestimmten Art der Gattung Erwinia, insbesondere der Art Erwinia chrysanthemi und der Art Erwinia carotovora im Erdreich oder in Wasser oder bei einem Wirt, der dafür geeignet ist, Träger solcher Bakterien zu sein, vorzugsweise bei Pflanzen und Samen, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
das Suchen nach DNS- oder RNS-Fragmenten, die für die jeweils betreffende Art, die Unterart oder den Pathovar spezifisch sind und die für eine Pektat-Lyase (PL) codieren, und
das Durchführen einer molekularen Hybridisierung mit mindestens einer spezifischen Sonde, welcher Hybridisierung eine Vervielfältigung der Anzahl der Kopien der oben erwähnten DNS-Fragmente mit Hilfe spezifischer Initiatoren (Startermoleküle) vorausgegangen ist.
2. Eine Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie die nachfolgende Nukleotidsequenz A ganz oder teilweise enthält:
5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3'
oder die dazu komplementäre Sequenz oder eine von der Sequenz A, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleitete Sequenz enthält, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 1231 und 1254 der in Figur 1 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder die zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementäre Sequenz.
3. Eine Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie die nachfolgende Nukleotidsequenz B ganz oder teilweise enthält, welche ausgewählt ist aus der Gesamtheit oder einem Teil von:
* den nachfolgenden Nukleotidketten:
oder deren komplementären Sequenzen,
* oder einer von der Sequenz B, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleiteten Sequenz, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 1642 und 1665 der in Figur 1 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder die zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementäre Sequenz.
4. Eine Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie die nachfolgende Nukleotidsequenz C ganz oder teilweise enthält, welche ausgewählt ist aus der Gesamtheit oder einem Teil von:
* den nachfolgenden Nukleotidketten:
(die Punkte stellen jeweils Nukleotide dar, die mit denen in der ersten Zeile identisch sind) oder deren komplementären Sequenzen,
* oder einer von der Sequenz C, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleiteten Sequenz, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 295 und 317 der in Figur 2 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder die zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementäre Sequenz.
5. Eine Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie die nachfolgende Nukleotidsequenz D ganz oder teilweise enthält, welche ausgewählt ist aus der Gesamtheit oder einem Teil von:
* den nachfolgenden Nukleotidketten:
oder deren komplementären Sequenzen,
* oder einer von der Sequenz D, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleiteten Sequenz, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 672 und 701 der in Figur 2 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder die zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementäre Sequenz.
6. Initiatorpaare (Startermolekülpaare) für die genetische Vervielfältigung, dadurch gekennzeichnet, daß der eine der Initiatoren dieser Paare aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz A oder eine davon abgeleitete Sequenz gemäß Anspruch 2 ganz oder teilweise enthalten, während dagegen der andere Initiator aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz B oder eine davon abgeleitete Sequenz gemäß Anspruch 3 ganz oder teilweise enthalten.
7. Initiatorpaare für die genetische Vervielfältigung, dadurch gekennzeichnet, daß der eine der Initiatoren dieser Paare aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz C oder eine davon abgeleitete Sequenz gemäß Anspruch 4 ganz oder teilweise enthalten, während dagegen der andere Initiator aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz D oder eine davon abgeleitete Sequenz gemäß Anspruch 5 ganz oder teilweise enthalten.
8. Nukleotidische Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 10 Nukleotide aus der Sequenz enthält, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 1231 und 1665 der in Figur 1 dargestellten Sequenz befinden, oder mindestens 10 Nukleotide enthält, welche eine Übereinstimmung von mindestens 40 % mit der oben erwähnten Sequenz aufweisen.
9. Nukleotidische Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 10 Nukleotide aus der Sequenz enthält, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 295 und 701 der in Figur 2 dargestellten Sequenz befinden, oder mindestens 10 Nukleotide enthält, welche eine Übereinstimmung von mindestens 40 % mit der oben erwähnten Sequenz aufweisen.
10. Nukleotidsequenzen gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie markiert sind, vorzugsweise im Wege einer radioaktiven oder enzymatischen Methode, mittels einer fluoreszierenden Zusammensetzung, durch Bindung an ein antigenes Molekül (das zur Erkennung durch die Antikörper geeignet ist), oder an ein ganz anderes Molekül, das geeignet ist, direkt oder indirekt mit Hilfe von Reagenzien nachgewiesen zu werden, wobei diese besagte Bindung durch die Vermittlung eines Bindungarmes bewirkt werden kann, vorzugsweise durch die Vermittlung einer Nukleotidseqzuenz, die aus ungefähr 5 bis 100 Nukleotiden besteht und die an den äußersten Positionen 3' oder 5' dieser Sequenzen angeordnet ist.
11. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit von Erwinia carotovora im Erdreich oder in Wasser oder bei einem Wirt, vorzugsweise bei Pflanzen und Samen, welches Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
- die Behandlung einer aus dem Erdreich, aus dem Wasser oder dem besagten Wirt entnommenen Probe in einer Weise, daß das Genom von Erwinia carotovora für die im Anspruch 6 definierten Initiatoren und, im Bedarfsfall, für jede DNS- oder RNS-Polymerase zugänglich wird, was eine Replikation der beiden Stränge der genomen DNS oder entsprechend analog der RNS erlaubt, und welche Behandlung vorzugsweise durch Erhitzen, Maceration, (in einem Lösungsmittel wie z.B. Wasser), Zermahlen oder Ultraschalleinwirkung durchgeführt wird,
- die Vervielfältigung der Anzahl der Kopien der Fragmente der für die PL kodierenden Gene, die möglicherweise in dieser Probe anwesend sind, mit Hilfe der Initiatorpaare, die vorstehend definiert sind,
- das Feststellen der möglichen Anwesenheit der für die PL kodierenden Gene und somit der Anwesenheit von Erwinia carotovora in der untersuchten Probe mit Hilfe einer Sonde gemäß Anspruch 8, welche im Bedarfsfall markiert ist, und zwar vorzugsweise in der im Anspruch 10 angezeigten Weise.
12. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Identifizierung und zur Feststellung der Anwesenheit von Erwinia chrysanthemi im Erdreich oder in Wasser oder bei einem Wirt, vorzugsweise bei Pflanzen und Samen, welches Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
- die Behandlung einer aus dem Erdreich, aus dem Wasser oder dem besagten Wirt entnommenen Probe in einer Weise, daß das Genom von Erwinia chrysanthemi für die im Anspruch 7 definierten Initiatoren und, im Bedarfsfall für jede DNS- oder RNS-Polymerase zugänglich wird, was eine Replikation der beiden Stränge der genomen DNS oder entsprechend analog der RNS erlaubt, und welche Behandlung vorzugsweise durch Erhitzen, Maceration, (in einem Lösungsmittel wie z.B. Wasser), Zermahlen oder Ultraschalleinwirkung durchgeführt wird,
- die Vervielfältigung der Anzahl der Kopien der Fragmente der für die PL kodierenden Gene, die möglicherweise in dieser Probe anwesend sind, mit Hilfe der Initiatorpaare, die vorstehend definiert sind,
- die Feststellung der möglichen Anwesenheit der für die PL kodierenden Gene und somit der Anwesenheit von Erwinia chrysanthemi in der untersuchten Probe mit Hilfe einer Sonde gemäß Anspruch 9, welche im Bedarfsfall markiert ist, und zwar vorzugsweise in der im Anspruch 10 angezeigten Weise.
13. Ein Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Vervielfältigung der Anzahl der für die Pektat-Lyasen kodierenden Gene die folgenden Stufen umfasst:
- eine Vorstufe der Denaturierung des DNS-Doppelstranges zum DNS-Einzelstrang, durch Erwärmen im Temperaturbereich zwischen etwa 80 ºC und etwa 110 ºC, vorzugsweise bei 100 ºC, vorzugsweise in einem Puffer, der aus Tris-HCl (10 mM pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01 % Gelatine, DNS-(oder RNS)-Polymerase-Kofaktoren, insbesondere Mg²&spplus;-Ionen und K&spplus;- Ionen, den 4-Desoxynukleotiden, aus welchen sich die DNS (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) oder die RNS (dCTP, dUTP, dGTP, dTTP) zusammensetzt, und den in den Ansprüchen 6 und 7 definierten Initiatorpaaren besteht,
- die eigentliche Vervielfältigung durch Zugabe von beispielsweise thermoresistenter DNS-Polymerase zum in der vorstehenden Stufe erhaltenen Medium, und
- das Erwärmen auf ca. 94 ºC, was der Stufe der eigentlichen Denaturierung entspricht,
- dann das Erwärmen auf den Bereich von ca. 60 ºC bis ca. 76ºC, was der Stufe der Hybridisierung der Initiatorpaare mit den für die PL kodierenden Genen oder den Fragmenten dieser Gene entspricht, welche möglicherweise in der untersuchten, biologischen Probe anwesend sind,
- und schließlich das Erwärmen auf den Bereich von ca. 50 ºC bis ca. 76 ºC, was der Stufe der Verlängerung der in der vorhergehenden Stufe gegenseitig hybridisierten Initiatorpaare entspricht, um somit Nukleotidsequenzen herzustellen, die gänzlich oder teilweise komplementär zu den genomen Sequenzen der pektinolytischen Erwinia-Bakterien sind, wobei die letztgenannten Sequenzen durch die Nukleotide begrenzt werden, die sich mit den oben erwähnten Initiatoren hybridisierten,
- die etwa 20- bis etwa 50-fache, vorzugsweise 25- bis 35-fache Wiederholung der vorhergehenden Vervielfältigungsstufe;
- im Bedarfsfall die Wiederverwendung eines aliquoten Anteils des am Ende der vorhergehenden Vervielfältigungsstufe erhaltenen Mediums, um eine neue Vervielfältigung gemäß der vorstehend beschriebenen Methode zu realisieren.
14. Anwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Durchführung einer Diagnosemethode für das mögliche Auftreten von Krankheiten, die durch die Bakterien der Art Erwinia carotovora und insbesondere durch eine der Unterarten Ecc, Eca, Eco und Ecw, durch die Bakterien der Art Erwinia chrysanthemi, oder durch jegliche Art, Unterart oder Pathovar verursacht werden, und zwar sowohl durch die tatsächlich bekannten, als auch durch die später durch Modifikation der bekannten Taxonomie davon abgeleiteten.
15. Ausstattung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes umfasst:
- mindestens ein Initiatorpaar gemäß Anspruch 6, und/oder
- mindestens ein Initiatorpaar gemäß Anspruch 7,
- eine (oder mehrere) Sonde(n) gemäß Anspruch 8,
und/oder eine (oder mehrere) Sonde(n) gemäß Anspruch 9, welche besagten Sonden geeignet sind, sich gänzlich oder teilweise mit den Fragmenten der mit Hilfe der Initiatorpaare gemäß den Ansprüchen 6 oder 7 vervielfältigten Gene zu hybridisieren.
16. Ausstattung gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem folgendes umfasst:
- eine thermoresistente DNS- oder RNS-Polymerase, - ein Reaktionsmedium, das vorzugsweise aus Tris-HCl (10 mM pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01 % Gelatine, DNS-Polymerase-Kofaktoren, vorzugsweise Mg²&spplus;-Ionen und K&spplus;- Ionen, den 4-Desoxynukleotiden, aus welchen sich die DNS (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) oder die RNS (dCTP, dUTP, dGTP, dTTP) zusammensetzt, besteht, und/oder,
- ein oder mehrere Restriktionsenzym(e), und, im Bedarfsfall, Restriktionsfragmente, die einen charakteristischen Bezug zu den Unterarten der Erwinia carotovora und/oder der Erwinia chr ysan thema aufweisen, im Fall der Unterarten der Erwinia carotovora vorzugsweise die in Figur 3 dargestellten Restriktions fragmente, und/oder
- eine Ligase und ein (oder mehrere) Oligonukleotidsequenzenpaare, welche(s) geeignet sind/(ist), sich wechselseitig mit einem (oder mehreren) Nukleotid(en) zu hybridisieren, welche(s) in den für Pektat-Lyasen kodierenden Genen oder Fragmenten dieser Gene angeordnet ist/(sind), und welche(s) oligonukleotidsequenzpaar(e) charakteristisch für eine Art oder Unterart oder Pathovar von Bakterien der Gattung Erwinia ist/(sind), und/oder,
- eine (oder mehrere) Oligonukleotidsonde(n), welche für einen Nukleotidabschnitt spezifisch ist/(sind), der charakteristisch für eine Art oder Unterart oder Pathovar von Bakterien der Gattung Erwinia ist/(sind).
17. Verwendung von Nukleotidsequenzen, die gänzlich oder teilweise den Genen entsprechen, die im Inneren des Genoms pektinolytischer Bakterien der Gattung Erwinia, und insbesondere von Erwinia carotovora und von Erwinia chrysanthemi, für Pektat-Lyasen kodieren, zur Durchführung eines Verfahrens zur Identifizierung von Unterarten, und/oder von Stämmen oder von Pathovaren der Arten oder der Unterarten verschiedener Bakterien der Gattung Erwinia.
18. Ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleotidsequenz, welche ganz oder teilweise die folgende Nukleotidsequenz A enthält:
5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3'
oder der dazu komplementären Sequenz oder einer von der Sequenz A, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleiteten Sequenz, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 1231 und 1254 der in Figur 1 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder der zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementären Sequenz, welches besagte Verfahren entweder auf biologischem Wege durchgeführt wird, vorzugsweise nach Transformation und Klonierung der zellulären Wirte, die geeignet erscheinen, um diese Nukleotidsequenz zu enthalten, oder durch Vervielfältigung der Anzahl der Kopien dieser Nukleotidsequenz, vorzugsweise gemäß der PCR-Technik, und zwar entweder auf chemischem Wege, vorzugsweise mittels der automatisierten β-Cyanethyl-Phosphoramidit-Methode, die in Bioorganic Chemistry 4; Seiten 274-325, 1986 beschrieben ist, oder mittels der Aufbaumethode, zum Beispiel durch Heranführen (oder Verknüpfung mit Hilfe einer Ligase) von auf chemischem Wege synthetisierten Oligonukleotiden, an deren äußersten Positionen angemessene Restriktionsstellen vorgesehen sind, gemäß dem in Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80; Seiten 7461-7465, 1983 beschriebenen Prinzip; wobei diesen Methoden die Klonierung der somit in einem geeigneten, vorzugsweise plasmidischen Vektor erhaltenen DNS und die Wiedergewinnung der DNS, entweder mittels einer geeigneten Sonde, oder durch Elektrophorese, im allgemeinen nach einer Restriktion und gefolgt von einer Elution der Fragmente folgt.
19. Ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleotidsequenz, welche die nachfolgende Nukleotidsequenz B ganz oder teilweise enthält, welche ausgewählt ist aus der Gesamtheit oder einem Teil von:
* den nachfolgenden Nukleotidketten:
oder deren komplementären Sequenzen,
* oder einer von der Sequenz B, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleiteten Sequenz, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 1642 und 1665 der in Figur 1 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder der zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementären Sequenz, welches Verfahren gemäß den in Anspruch 18 beschriebenen Methoden durchgeführt wird.
20. Ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleotidsequenz, welche die nachfolgende Nukleotidsequenz C ganz oder teilweise enthält, welche ausgewählt ist aus der Gesamtheit oder einem Teil von:
* den nachfolgenden Nukleotidketten:
(die Punkte stellen jeweils Nukleotide dar, die mit denen in der ersten Zeile identisch sind) oder deren komplementären Sequenzen,
* oder einer von der Sequenz C, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleiteten Sequenz, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 295 und 317 der in Figur 2 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder der zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementären Sequenz, welches Verfahren gemäß den in Anspruch 18 beschriebenen Methoden durchgeführt wird.
21. Ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleotidsequenz, welche die nachfolgende Nukleotidsequenz D ganz oder teilweise enthält, welche ausgewählt ist aus der Gesamtheit oder einem Teil von:
* den nachfolgenden Nukleotidketten:
oder deren komplementären Sequenzen,
* oder einer von der Sequenz D, vorzugsweise durch Unterdrücken und/oder Austausch und/oder Hinzufügen von Nukleotiden abgeleiteten Sequenz, und welche Sequenz geeignet ist, sich mit dem Fragment, welches durch die Positionen 672 und 701 der in Figur 2 dargestellten Sequenz begrenzt wird, zu hybridisieren, oder der zu dieser abgeleiteten Sequenz komplementären Sequenz, welches Verfahren gemäß den in Anspruch 18 beschriebenen Methoden durchgeführt wird.
22. Ein Verfahren zur Herstellung von Initiatorpaaren für die genetische Vervielfältigung, in welchem Verfahren der eine der Initiatoren dieses Paares aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz A oder gemäß Anspruch 18 eine davon abgeleitete Sequenz ganz oder teilweise enthalten, während dagegen der andere Initiator aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz B gemäß Anspruch 19 oder eine davon abgeleitete Sequenz ganz oder teilweise enthalten, und wobei das besagte Verfahren gemäß den in Anspruch 18 beschriebenen Methoden durchgeführt wird.
23. Ein Verfahren zur Herstellung von Initiatorpaaren für die genetische Vervielfältigung, in welchem Verfahren der eine der Initiatoren dieses Paares aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz C gemäß Anspruch 20 oder eine davon abgeleitete Sequenz ganz oder teilweise enthalten, während dagegen der andere Initiator aus den Sequenzen ausgewählt wird, welche die Nukleotidsequenz D gemäß Anspruch 21 oder eine davon abgeleitete Sequenz ganz oder teilweise enthalten, und wobei das besagte Verfahren gemäß den in Anspruch 18 beschriebenen Methoden durchgeführt wird.
24. Verfahren zur Herstellung einer nukleotidischen Sonde, welche mindestens 10 Nukleotide aus der Sequenz enthält, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 1231 und 1665 der in Figur 1 dargestellten Sequenz befinden, oder mindestens 10 Nukleotide enthält, welche eine Übereinstimmung von mindestens 40 % mit der oben erwähnten Sequenz aufweisen, und welches Verfahren gemäß den in Anspruch 18 beschriebenen Methoden durchgeführt wird.
25. Verfahren zur Herstellung einer nukleotidischen Sonde, welche mindestens 10 Nukleotide aus der Sequenz enthält, welche durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich an den Positionen 295 und 701 der in Figur 2 dargestellten Sequenz befinden, oder mindestens 10 Nukleotide enthält, welche eine Übereinstimmung von mindestens 40 % mit der oben erwähnten Sequenz aufweisen, und welches Verfahren gemäß den in Anspruch 18 beschriebenen Methoden durchgeführt wird.
26. Verfahren zur Herstellung von Nukleotidsequenzen, so wie sie in einem der Ansprüche 18 bis 25 definiert sind, welche Sequenzen markiert sind, und zwar vorzugsweise im Wege einer radioaktiven oder enzymatischen Methode, mittels einer fluoreszierenden Zusammensetzung, durch Bindung an ein antigenes Molekül (das zur Erkennung durch die Antikörper geeignet ist), oder an ein ganz anderes Molekül, das geeignet ist, direkt oder indirekt mit Hilfe von Reagenzien nachgewiesen zu werden, wobei diese besagte Bindung durch die Vermittlung eines Bindungarmes bewirkt werden kann, vorzugsweise durch die Vermittlung einer Nukleotidseqzuenz, die aus ungefähr 5 bis 100 Nukleotiden besteht und die an den äußersten Positionen 3' oder 5' dieser Sequenzen angeordnet ist, und welches Verfahren gemäß den in Anspruch 18 beschriebenen Methoden durchgeführt wird.
27. Verfahren zur Herstellung einer Ausstattung für die Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, welches besagte Verfahren eine Stufe zum Zusammenstellen des folgenden umfasst:
- mindestens ein Initiatorpaar, so wie in Anspruch 22 definiert, und/oder
- mindestens ein Initiatorpaar, so wie in Anspruch 23 definiert,
- eine (oder mehrere) Sonde(n), so wie in Anspruch 24 definiert, und/oder eine (oder mehrere) Sonde(n), die im Anspruch 25 definiert sind, welche besagten Sonden geeignet sind, sich gänzlich oder teilweise mit den Fragmenten der mit Hilfe der Initiatorpaare, so wie in den Ansprüchen 22 und 23 entsprechend definiert, vervielfältigten Gene zu hybridisieren.
28. Verfahren zur Herstellung einer Ausstattung gemäß Anspruch 27, welches besagte Verfahren außerdem eine Stufe zum Zusammenstellen des folgenden umfasst:
- eine thermoresistente DNS- oder RNS-Polymerase,
- ein Reaktionsmedium, das vorzugsweise aus Tris-HCl (10 mM pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01 % Gelatine, DNS-Polymerase-Kofaktoren, vorzugsweise Mg²&spplus;-Ionen und K&spplus;- Ionen, den 4-Desoxynukleotiden, aus welchen sich die DNS (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) oder die RNS (dCTP, dUTP, dGTP, dTTP) zusammensetzt, besteht, und/oder,
- ein oder mehrere Restriktionsenzym(e), und, im Bedarfsfall, die Restriktionsfragmente, die einen charakteristischen Bezug zu den Unterarten der Erwinia carotovora und/oder der Erwinia chrysanthema aufweisen, im Fall der Unterarten der Erwinia carotovora vorzugsweise die in Figur 3 dargestellten Restriktionsfragmente, und/oder
- eine Ligase und ein (oder mehrere) Oligonukleotidsequenzenpaare, welche(s) geeignet sind/(ist), sich wechselseitig mit einem (oder mehreren) Nukleotid(en) zu hybridisieren, welche(s) in den für Pektat-Lyasen kodierenden Genen oder Fragmenten dieser Gene angeordnet ist/(sind), und welche(s) Oligonukleotidsequenzpaar(e) charakteristisch für eine Art oder Unterart oder Pathovar von Bakterien der Gattung Erwinia ist/(sind), und/oder,
- eine (oder mehrere) Oligonukleotidsonde(n), welche für einen Nukleotidabschnitt spezifisch ist/(sind), der charakteristisch für eine Art oder Unterart oder Pathovar von Bakterien der Gattung Erwinia ist/(sind).
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