CN110643726A - 软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用 - Google Patents

软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用。该方法具有快速、精准，灵敏的特点，有效提高了检测Dickeya chrysanthemi引起半夏软腐病的便捷性、及时性和准确度。引物序列为：上游引物BXTF:5`CATCAGGGTTTCCCC 3`，见SEQ ID NO.1；下游引物BXTR：5`GTCTGGGGATCTGCC 3`，见SEQ ID NO.2。本发明采用巢式PCR(Nested PCR)对Dickeya chrysanthemi进行分子检测，检测操作简单、准确性好、灵敏度较高，国内外对该方法均未有报道。

Description

软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法 及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用。
背景技术
半夏(Pinellia ternata)，为天南星目、天南星科、半夏属药用植物，为我国大宗常用药材，主要药用部位为其块茎，其燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结。用于痰多咳喘，痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛，呕吐反胃，胸脘痞闷，梅核气；生用外治痈肿痰核，是多种中成药的原料药。广泛分布于中国长江流域以及东北、华北等地区，在西藏也有分布，生长于海拔2500米以下。随着中医药事业的发展，半夏用量逐年增加，种植面积逐年扩大，但是由Dickeya chrysanthemi(GenBank登录号为MK181574)引起的软腐病目前在各大半夏产区大面积流行，该致病菌可以通过种苗、水和土壤进行传播，一旦染病，整株一周内彻底腐烂死亡，对半夏的产量和品质影响极大，同时严重阻碍了农户的种植积极性。申请人在湖北天门半夏基地调查发现，该菌导致的软腐病发病率高达70％(文献链接https://doi.org/10.1094/PDIS-03-19-0505-PDN)，目前由于该病害对半夏产业造成的影响巨大，同时缺乏中药材植物保护专业人才的指导，在半夏各大产区存在乱施滥用各类化学药剂的情况，不但未能有效防治病害，而且增加了致病菌的抗药性，加剧了环境污染，十分不符合绿色药材发展理念，同时严重威胁半夏产业的进一步发展和壮大。传统病原菌的鉴定必须在植株被致病菌侵染表现出症状后才可以开展，需要病原菌分离、纯化培养、科赫氏法则验证、形态学观察、生理生化检测等去鉴定，顺利的话完成整个过程需要大约20-30天，但是一旦产生其他杂菌污染培养基，就会影响鉴别速度，需要更长的时间，同时长时间的鉴定耽误防治时机，不利于防治的时效性。传统鉴定存在鉴定不准、耗时、费力的缺点，完全满足不了植保工作精准、快速防控的要求。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用，该方法具有快速、精准，灵敏的特点，有效提高了检测Dickeya chrysanthemi引起半夏软腐病的便捷性、及时性和准确度。
本发明是这样实现的，软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物，所述引物序列为：
上游引物BXTF:5`CATCAGGGTTTCCCC 3`，见SEQ ID NO.1；
下游引物BXTR：5`GTCTGGGGATCTGCC 3`，见SEQ ID NO.2。
软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法，包括以下步骤：
步骤1：提取软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的基因组DNA；
步骤2：以步骤1中得到的DNA为模板，利用通用引物27F/1492R进行第一轮PCR扩增；
步骤3：以第一轮扩增产物为模板，利用权利要求1所述的检测引物进行第二轮PCR扩增；
步骤4：第二轮扩增产物进行电泳检测，如果出现348bp的DNA条带，则确定所测样品中存在致病菌Dickeya chrysanthemi。
进一步，步骤2中第一轮PCR和步骤3中第二轮PCR扩增体系为：1μL模板，2×TaqMaster Mix 12.5μL，10μM的上、下游引物各1μL，双蒸水9.5μL。
进一步，步骤2中第一轮PCR的扩增反应程序为预变性94℃3分钟，94℃30秒，54℃30秒，72℃1分30秒，35个循环，最后在72℃延伸10分钟，16℃保存。
进一步，步骤3中第二轮PCR的扩增反应程序为预变性94℃3分钟，接着94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，30个循环，最后在72℃延伸3分钟，16℃保存。
进一步，步骤3中将第一轮扩增产物稀释50倍作为第二轮扩增的模板。
软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法，包括以下步骤：以软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的检测引物进行PCR扩增；PCR反应体系总体积为25μL，模板1μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的上下游引物BXTF/BXTR各1μL，双蒸水9.5μL；扩增反应程序为：预变性94℃5分钟，接着94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，30个循环，最后在72℃延伸3分钟。
如上述的软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物在软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测中的应用。
如上所述的软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法在软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1)本发明引物和方法检测灵敏度极高，可以检测到10fg/μL的半夏软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi基因组DNA，较常规PCR检测方法灵敏度提高1000倍，即使在潜伏期或者感染极其轻微的情况下也能准确检测出Dickeya chrysanthemi；
2)本发明方法针对半夏软腐病菌基因组DNA可以扩增出348bp的单一条带，特异性强，受外源基因组DNA干扰小，精准度高；
3)本发明还有耗时短、操作简单的特点，不需要复杂的检测场所和实验室，完成整个检测程序约3个小时，常规病原菌鉴定方法至少需要20天；
4)本发明的技术方案适用于半夏引种检疫、脱毒种子种苗质量检测，以及半夏抗Dickeya chrysanthemi引起的软腐病抗性鉴定早期无症状植株检测。
附图说明
图1是特异引物BXTF/BXTR针对Dickeya chrysanthemi基因组DNA的特异性检测；
图2是特异引物BXTF/BXTR的常规PCR检测Dickeya chrysanthemi基因组DNA；
图3是特异引物BXTF/BXTR的Nested PCR检测Dickeya chrysanthemi基因组DNA；
图4是特异引物BXTF/BXTR在Nested PCR条件下检测田间半夏软腐病。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用，具体如下各实施例所示。
实施例1半夏软腐病致病菌特异性PCR检测方法的建立
1、半夏软腐病致病基因组DNA的提取
半夏软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi为湖北省农业科学院中药材研究所植保研究室保存。在含有NA平板上培养一周后，用细菌DNA提取试剂盒提取致病菌总基因组DNA。
2、特异分子检测引物的设计
对得到的病菌总基因组DNA进行PCR扩增测序，根据半夏软腐病致病菌Dickeyachrysanthemi与同属Dickeya billingiae、Dickeya psidii、Dickeya amylovora、Dickeyatracheiphila、Dickeya rhapontici、Dickeya mallotivora、Dickeya pyrifoliae、Dickeya quercina、Dickeya lupinicola、Dickeya carotovora等细菌16S rDNA(核糖体RNA)区域碱基组成差异而设计特异性引物，引物序列为：
上游引物BXTF:5`CATCAGGGTTTCCCC 3`，见SEQ ID NO.1；
下游引物BXTR：5`GTCTGGGGATCTGCC 3`，见SEQ ID NO.2。
3、半夏软腐病致病菌快速分子检测方法的建立
1)利用细菌DNA提取试剂盒提取半夏软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi基因组DNA，然后于-20℃保存；
2)以提取的致病菌DNA为模板利用通用引物进行第一轮PCR扩增。
通用引物27F/1492R的序列为：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，见SEQ ID NO.3；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，见SEQ ID NO.4。
反应体系总体积为25μL，反应组分为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的上下游引物27F/1492R各1μL，DNA 1μL，双蒸水9.5μL。
扩增反应程序为：预变性94℃3分钟，94℃30秒，54℃30秒，72℃1分30秒，35个循环，最后在72℃延伸10分钟，16℃保存。
3)将第一轮扩增产物稀释50倍，取1μL作为模板，进行第二轮扩增。
上游引物BXTF:5`CATCAGGGTTTCCCC 3`；
下游引物BXTR：5`GTCTGGGGATCTGCC 3`。
反应体系总体积为25μL，将第一轮扩增产物稀释50倍，取1μL作为模板，反应组分为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的上下游引物BXTF/BXTR各1μL，双蒸水9.5μL。
扩增反应程序为：预变性94℃3分钟，接着94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，30个循环，最后在72℃延伸3分钟，16℃保存。
4)扩增产物电泳检测。
取7μL扩增产物，采用1％(质量/体积)琼脂糖凝胶，100ml琼脂糖胶加入100μL(体积比)的Goldview I型核酸染色剂，在电压120V下电泳20分钟，于凝胶成像系统下拍照检测，如果存在348bp的DNA特异性条带，则确定所检测样品中存在Dickeya chrysanthemi。
实施例2针对Dickeya chrysanthemi基因组DNA的特异性检测
利用细菌DNA提取试剂盒提取Dickeya chrysanthemi、Dickeya amylovora、Dickeya tracheiphila、Dickeya rhapontici、Dickeya mallotivora、Dickeyalupinicola、Dickeya carotovora、多黏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、慢芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、肠杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、白绢菌、镰刀菌、丝核菌、茎点霉、灰霉等及半夏植株基因组DNA，设置清水为阴性对照，取以上各病原菌DNA 1μL作为模板，进行PCR。
反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的上下游引物BXTF/BXTR各1μL，双蒸水9.5μL。扩增反应程序为：预变性94℃5分钟，接着94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，30个循环，最后在72℃延伸3分钟。
取7μL扩增产物，采用1％(质量/体积)琼脂糖凝胶，100mL琼脂糖胶加入100μL(质量体积比)的Goldview I型核酸染色剂，在电压120V下电泳20分钟，于凝胶成像系统下拍照检测。
结果如图1所示，泳道1为DL2000Marker；泳道2为清水空白对照，为阴性对照；泳道3为Dickeya chrysanthemi基因组DNA，阳性对照；泳道4-25分别为Dickeya amylovora、Dickeya tracheiphila、Dickeya rhapontici、Dickeya mallotivora、Dickeyalupinicola、Dickeya carotovora、多黏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、慢芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、肠杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、白绢菌、镰刀菌、丝核菌、茎点霉、灰霉等及半夏植株基因组DNA。
结果说明，利用本发明引物BXTF/BXTR针对半夏软腐病菌基因组DNA可以扩增出348bp的单一条带，不会检测出Dickeya amylovora、Dickeya tracheiphila、Dickeyarhapontici、Dickeya mallotivora、Dickeya lupinicola、Dickeya carotovora、多黏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、慢芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、肠杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、白绢菌、镰刀菌、丝核菌、茎点霉、灰霉等及半夏植株基因组DNA，特异性强，受外源基因组DNA干扰小，精准度高。
实施例3常规PCR检测Dickeya chrysanthemi基因组DNA
将Dickeya chrysanthemi基因组DNA依次稀释为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL合计9个浓度梯度，然后进行PCR。
PCR反应体系总体积为25μL，反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的上下游引物BXTF/BXTR各1μL，双蒸水9.5μL。扩增反应程序为：预变性94℃5分钟，接着94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，30个循环，最后在72℃延伸3分钟。
取7μL扩增产物，采用1％(质量/体积)琼脂糖凝胶，100mL琼脂糖胶加入100μL(质量体积比)的Goldview I型核酸染色剂，在电压120V下电泳20分钟，于凝胶成像系统下拍照检测。
结果如图2所示，其中泳道1为DL2000Marker；泳道2为清水空白对照；泳道3-11分别为Dickeya chrysanthemi基因组DNA依次为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL。
结果说明，利用常规pcr技术进行检测时，本发明引物BXTF/BXTR可以检测到100pg/μL的Dickeya chrysanthemi基因组DNA，检出限低于100pg/μL时已经不能很好的进行检测。
实施例4Nested PCR检测Dickeya chrysanthemi基因组DNA
将Dickeya chrysanthemi基因组DNA依次稀释为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL合计12个浓度梯度，然后利用引物27F/1492R进行第一轮PCR，扩增反应程序为：预变性94℃3分钟，94℃30秒，54℃30秒，72℃1分30秒，35个循环，最后在72℃延伸10分钟，16℃保存，取上述PCR产物稀释50倍取1μL为模板，引物为BXTF/BXTR，进行第二轮PCR，反应体系为：2×TaqMaster Mix 12.5μL，10μM的上下游引物BXTF/BXTR各1μL，双蒸水9.5μL。扩增反应程序为：预变性94℃5分钟，接着94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，30个循环，最后在72℃延伸3分钟。
取7μL扩增产物，采用1％(质量/体积)琼脂糖凝胶，100mL琼脂糖胶加入100μL(质量体积比)的Goldview I型核酸染色剂，在电压120V下电泳20分钟，于凝胶成像系统下拍照检测。
结果如图3所示，其中泳道1为DL2000Marker；泳道2为清水空白对照；泳道3-11分别为Dickeya chrysanthemi基因组DNA依次为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL。
结果表明，本发明检测灵敏度极高，可以检测到10fg/μL的Dickeya chrysanthemi基因组DNA，较常规PCR检测方法灵敏度提高1000倍，即使在潜伏期或者感染极其轻微的情况下也能准确检测出Dickeya chrysanthemi。
实施例5特异引物检测田间半夏软腐病致病菌
2019年8月在湖北省天门市半夏GAP种植基地随机采集有明显软腐病症状的半夏植株3株，病区田土壤样品3份，无菌组培苗3份。同时设置无菌水作为对照。然后按照2-11的顺序为样品进行编号，提取样品DNA。参照实施例4中的步骤进行Nested PCR检测。
结果如图4所示，其中泳道1为DL2000Marker；泳道2为清水空白对照；泳道3-5分别为软腐病植株，6-8为染病田块土样，9-11健康无病组培半夏。
结果表明，采集具有明显软腐病症状的3株半夏植株均检测出条带，3份土壤有2份检测出，而健康无明显软腐病症状3株半夏植株则未检测出，说明本发明方法在实际的应用中切实可行。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院中药材研究所
<120> 软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物、检测方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(BXTF)
<400> 1
catcagggtt tcccc 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(BXTR)
<400> 2
gtctggggat ctgcc 15
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(27F)
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(1492R)
<400> 4
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

1.软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物，其特征在于，所述引物序列为：
上游引物BXTF:5`CATCAGGGTTTCCCC 3`，见SEQ ID NO.1；
下游引物BXTR：5`GTCTGGGGATCTGCC 3`，见SEQ ID NO.2。
2.软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的基因组DNA；
步骤2：以步骤1中得到的DNA为模板，利用通用引物27F/1492R进行第一轮PCR扩增；
步骤3：以第一轮扩增产物为模板，利用权利要求1所述的检测引物进行第二轮PCR扩增；
步骤4：第二轮扩增产物进行电泳检测，如果出现348bp的DNA条带，则确定所测样品中存在致病菌Dickeya chrysanthemi。
3.根据权利要求2所述的软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法，其特征在于，步骤2中第一轮PCR和步骤3中第二轮PCR扩增体系为：1μL模板，2×Taq Master Mix12.5μL，10μM的上、下游引物各1μL，双蒸水9.5μL。
4.根据权利要求2所述的软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法，其特征在于：步骤2中第一轮PCR的扩增反应程序为预变性94℃3分钟，94℃30秒，54℃30秒，72℃1分30秒，35个循环，最后在72℃延伸10分钟，16℃保存。
5.根据权利要求2所述的软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法，其特征在于：步骤3中第二轮PCR的扩增反应程序为预变性94℃3分钟，接着94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，30个循环，最后在72℃延伸3分钟，16℃保存。
6.根据权利要求2所述的软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法，其特征在于：步骤3中将第一轮扩增产物稀释50倍作为第二轮扩增的模板。
7.软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的检测引物进行PCR扩增；PCR反应体系总体积为25μL，模板1μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的上下游引物BXTF/BXTR各1μL，双蒸水9.5μL；扩增反应程序为：预变性94℃5分钟，接着94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，30个循环，最后在72℃延伸3分钟。
8.如权利要求1所述的软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测引物在软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测中的应用。
9.如权利要求2-7任一所述的软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测方法在软腐病致病菌Dickeya chrysanthemi的检测中的应用。
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