CN100507546C - 评价培养基分离回收微生物类群能力的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)，根据DGGE电泳图谱及谱带相似性系数(Cs)分析，综合评价不同培养基或培养条件回收分离微生物类群能力。本发明可以直观的筛选出能更好的分离回收样品中的微生物类群的培养基，与传统的用形态和生理生化特征鉴定的方法相比，具有快速、简便、准确、重复性高等优点，该检测方法还可以用于快速分析环境微生物种群多样性和群落动态的变化。
Description
[所属技术领域]
本发明涉及一种利用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DENATURINGGRADIENT GEL ELECTROPHORESIS其缩写为PCR-DGGE)评价不同培养基或培养条件回收分离微生物类群能力的快速检测方法。
[背景技术]
自然环境中微生物资源极为丰富，然而到目前为止，可以人工培养的微生物极为有限，不到总量的1％。由于培养条件和培养方法的不足，许多在环境中占优势的菌至今为止还未在实验室里被分离出来，或分离出来的根本不是环境中的优势菌。因此评价不同培养基和培养条件回收分离微生物类群的能力极为重要。
在评价培养基回收分离微生物类群能力的效果时，分离到的微生物类群是否与环境样品中的微生物类群一致是一个核心问题。以往对于不同培养基和培养条件回收分离微生物类群能力的评价方法是建立在传统的平板菌落计数和形态观察技术上的。但因为微生物菌落形态比较简单，有些比较相似，仅凭显微镜无法判断准确，容易产生误判，故单凭形态学分析进行菌落计数是不准确的。而依据生理生化特征对培养的微生物进行分类鉴定，由于工作量大，耗时，也几乎是不可能的。因此传统的评价培养基分离回收微生物类群能力的方法存在很大的弊端。
[发明内容]
本发明的目的在于通过利用PCR-DGGE技术对不同培养基或培养条件分离回收微生物类群能力进行快速检测。
本发明的快速检测方法包括以下步骤：
(1)选择用于实验的样品；
(2)分离和纯化样品中的微生物：将样品制备成10-1～10-5不同的稀释度，分别在不同培养基上涂平板，适温下或不同条件下培养；
(3)提取和纯化样品中所有微生物的基因组DNA：称取10.0g样品，放入盛有10粒无菌玻璃珠(直径3mm～5mm)的三角瓶中，加15mL提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA-Na2，200mmol/L NaCl，1％ PVP，2％ CTAB，pH8.0)；在180r/min，37℃条件下振荡30min，然后加入2mL20％ SDS继续振荡10min；65℃水浴1h后6000r/min离心15min，收集上清液，加入0.5倍体积PEG-NaCl溶液(其中含30％ PEG和1.6mol/L NaCl)，混匀后室温下静置2h，10000r/min离心20min，沉淀用2mL TE重新悬浮；加4mol/L NaAC(pH5.4)至终浓度0.3mol/L，用酚/氯仿/异戊醇溶液(25:24:1)抽提一次，加入0.6倍体积异丙醇沉淀2h，12000r/min离心20min，沉淀干燥后，用200μl TE溶解，再用Wizard@DNA clean-up system(Promega)纯化后，置于-20℃保存，待用；
(4)提取不同培养基和培养条件下的平板回收菌总DNA：分别用10ml无菌水洗涤平板，收集菌体，然后提取菌体总DNA；
(5)所有样品的16SrDNA V3区进行PCR扩增：取10倍缓冲液5μl，dNTP(10mM)1μl，F341-357(GC)(10μM)1μl，R534-518(10μM)1μl，Taq(5U/μl)0.4μl，模板DNA2μl，补足ddH2O至50μl；反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 2min，10个循环；94℃ 30S，60～55℃ 30s(-0.5℃/循环)，72℃ 2min，10个循环；94℃ 30S，55℃ 30s，72℃ 2min，15个循环；72℃ 7min；扩增产物采用1.5％琼脂糖分析检验；
(6)将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶(DGGE)电泳：PCR产物浓缩后，采用D-Code突变检测系统对样品进行DGGE分析；所用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，变性梯度为35％～60％(100％的变性剂为7mol/L尿素，40％甲酰胺)，180V，60℃恒温，0.5×TAE中电泳4.0h，GoldView染料染色30min，UVI成像系统拍照；用UVIBand分析软件帮助确定样品电泳条带的多少和条带的亮度峰值；
(7)DGGE谱带相似性系数(Cs)分析：用Sorenson配对比较不同样品的DGGE指纹图谱的相似性；Cs＝2j/(a+b)，其中a、b表示两个比较对象中的DNA条带数目，j表示a和b中相同的条带数量；
(8)评价方法：根据DGGE电泳图谱及谱带相似性系数(Cs)分析，综合评价不同培养基或培养条件回收分离微生物类群能力；DGGE电泳图谱中一般每个条带可以看作是一个微生物类群，条带的强度可以反映这个类群的数量的多寡，电泳条带越多，谱带相似性系数(Cs)越高，说明该种培养基或培养条件回收分离样品中的微生物类群的能力较好；
利用本发明的快速检测方法，可以直观的筛选出能更好的分离回收样品中的微生物类群的培养基，与传统的用形态和生理生化特征鉴定的方法相比，具有快速、简便、准确、重复性高等优点，是传统技术不可比拟的，为开发新的培养基和培养技术提供了一种分子水平的评价方法，此外该检测方法还可以用于快速分析环境微生物种群多样性和群落动态的变化。
[附图说明]
番茄土壤样品在4种不同培养基(营养肉汤，YG，土壤浸汁液，根系分泌物)和不同培养条件下的DGGE指纹图谱比较。其中L1-L4为：营养肉汤，YG，土壤浸汁液，根系分泌物等4种培养基在28℃培养2天的DGGE图谱；L6-L9为：营养肉汤，YG，土壤浸汁液，根系分泌物等4种培养基在20℃培养12天后的DGGE图谱。L5为番茄根际土壤的DGGE图谱。从DGGE电泳结果可以看出，不同样品的电泳图谱有很大的区别：4种培养基在28℃培养12天的DGGE指纹图谱比较接近，回收到的细菌菌群较相似；而在20℃培养的DGGE指纹图谱中各样品的条带数均多，于28℃培养的样品所分离到的类群较多，更接近于根际土壤中的细菌类群。
[具体实施方式]
实施例1：
一种评价培养基分离回收微生物类群能力的快速检测试剂盒：包括10倍缓冲液，dNTP(10mM)，F341-357(GC)(10μM)，R534-518(10μM)，Taq(5U/μl)及ddH2O。
该检测试剂盒用于评价不同培养基分离回收微生物类群能力的方法：
(1)选择用于实验的环境样品：土壤采自广东省农科院大丰试验基地，在番茄结果期，按五点取样法选取番茄植株，将其根系连同土壤挖出，自然风干，研磨过1mm筛；
(2)分离和纯化环境样品中的细菌：采用营养肉汤，YG(酵母葡萄糖琼脂培养基)、根系分泌物、土壤浸渍液4种培养基；将土样充分振荡，制备10-1～10-5不同稀释度的样品，分别在4种培养基上涂平板，置于两种不同温度下培养；28℃培养2天，20℃培养12天；
(3)提取和纯化环境样品中所有微生物的基因组DNA：称取10.0g土样，放入盛有10粒无菌玻璃珠(直径3mm～5mm)的三角瓶中，加15mL提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA-Na2，200mmol/L NaCl，1％ PVP，2％ CTAB，pH8.0)。在180r/min，37℃条件下振荡30min，然后加入2mL 20％ SDS继续振荡10min；65℃水浴1h后6000r/min离心15min，收集上清液，加入0.5倍体积PEG-NaCl溶液(其中含30％ PEG和1.6mol/L NaCl)，混匀后室温下静置2h，10000r/min离心20min，沉淀用2mL TE重新悬浮；加4mol/L NaAC(pH5.4)至终浓度0.3mol/L，用酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提一次，加0.6倍体积异丙醇沉淀2h，12000r/min离心20min，沉淀干燥后，用200μlTE溶解，再用Wizard@DNA clean-up system(Promega)纯化后，置于-20℃保存，待用；
(4)提取平板回收菌总DNA：分别用10ml无菌水洗涤平板，收集菌体；采用CTAB法提取菌体总DNA；
(5)所有样品的16SrDNA V3区PCR扩增：反应体系为10倍缓冲液5μl，dNTP(10mM)1μl，引物F341-357(GC)(10μM)和R534-518(10μM)各1μl，Taq(5U/μl)0.4μl，模板DNA 2μl，补足ddH2O至50μl；反应程序为94℃5min预变性；94℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 2min，10个循环；94℃ 30S，60～55℃ 30s(-0.5℃/循环)，72℃ 2min，10个循环；94℃ 30S，55℃ 30s，72℃ 2min，15个循环；72℃ 7min；扩增产物采用1.5％琼脂糖分析检验；
(6)将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶(DGGE)电泳：PCR产物浓缩后，采用D-Code突变检测系统对样品进行DGGE分析；所用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，变性梯度为35％～60％(100％的变性剂为7mol/L尿素，40％甲酰胺)，180V，60℃恒温，0.5×TAE中电泳4.0h，GoldView染料染色30min，UVI成像系统拍照；用UVIBand分析软件帮助确定样品电泳条带的多少和条带的亮度峰值；
DGGE谱带相似性系数(Cs)：用Sorenson配对比较相似性系数(Cs)比较不同样品DGGE指纹图谱的相似性；Cs＝2j/(a+b)，其中a、b表示两个比较对象中的DNA条带数目，j表示a和b中相同的条带数量。结果(见表1)显示：番茄根际样品与在28℃培养的营养肉汤、YG、土壤浸渍液、根系分泌物培养基相似指数较低，Cs值分别为0.21、0.10、0.20、0.11，与在20℃培养的4种培养基相似指数分别为0.34、0.43、0.36、0.44。可见在20℃培养下根系分泌物和YG培养基能更多的分离出番茄根际的细菌类群，优于其它的培养基和培养条件。
表1 不同样品的Cs值
Table 1 Cs values of different samples
L1-L4：营养肉汤，YG，土壤浸汁液，根系分泌物；28℃培养。
L6-L9：营养肉汤，YG，土壤浸汁液，根系分泌物；20℃培养。
L5：根际土壤
将DGGE电泳图谱及谱带相似性系数(Cs)综合起来分析评价4种不同培养基回收分离微生物类群能力的大小：YG培养基在较低的培养温度20℃下进行较长时间的培养，比营养肉汤培养基产生更多、更具代表性的细菌；而以根系分泌物为基础的培养基从番茄根际回收到的细菌菌群最多。
Claims (2)
1.一种评价培养基分离回收微生物类群能力的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)选择用于实验的样品；
(2)分离和纯化环境样品中的微生物：将样品制备成10-1～10-5不同的稀释度，分别在不同培养基上涂平板，适温下或不同条件下培养；
(3)提取和纯化环境样品中所有微生物的基因组DNA：称取10.0g样品，放入盛有10粒直径3mm～5mm无菌玻璃珠的三角瓶中，加15mL提取缓冲液，其中含100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA-Na2，200mmol/L NaCl，1％PVP，2％CTAB，pH8.0；在180r/min，37℃条件下振荡30min，然后加入2mL20％SDS继续振荡10min；65℃水浴1h后6000r/min离心15min，收集上清液，加入0.5倍体积PEG-NaCl溶液，其中含30％PEG和1.6mol/L NaCl，混匀后室温下静置2h，10000r/min离心20min，沉淀用2mL TE重新悬浮；加4mol/LpH5.4的NaAC至终浓度0.3mol/L，用酚/氯仿/异戊醇体积比为25:4:1的溶液抽提一次，加入0.6倍体积异丙醇沉淀2h，12000r/min离心20min，沉淀干燥后，用200μl TE溶解，再用Promega公司的
DNA clean-up system纯化后，置于-20℃保存，待用；
(4)提取不同培养基和培养条件下的平板回收菌总DNA：分别用10ml无菌水洗涤平板，收集菌体；然后提取菌体总DNA；
(5)所有样品的16SrDNA V3区进行PCR扩增：取10倍缓冲液5μl，10mMdNTP1μl，10μM带GC夹板的F341-3571μl，10μM R534-5181μl，5U/μlTaq 0.4μl，模板DNA 2μl，补足ddH2O至50μl；反应程序为94℃ 5min预变性；94℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 2min，10个循环；94℃ 30S，60～55℃ 30s，-0.5℃/循环，72℃ 2min，10个循环；94℃30S，55℃30s，72℃ 2min，15个循环；72℃ 7min；扩增产物采用1.5％琼脂糖分析检验；
(6)将PCR扩增产物进行DGGE电泳：聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，变性梯度为35％～60％，100％的变性剂为7mol/L尿素，40％甲酰胺，180V，60℃恒温，0.5×TAE中电泳4.0h，GoldView染料染色30min，UVI成像系统拍照；用UVIBand分析软件帮助确定样品电泳条带的多少和条带的亮度峰值；
(7)DGGE谱带相似性系数Cs分析：用Sorenson配对比较不同样品的DGGE指纹图谱的相似性；Cs＝2j/(a+b)，其中a、b表示两个比较对象中的DNA条带数目，j表示a和b中相同的条带数量。
2.权利要求1所述的检测方法，可用于快速评价不同培养基对各种环境中微生物类群的回收分离能力。
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| PCR-DGGE法用于活性污泥系统中微生物群落结构变化的解析. 刘新春等.生态学报，第25卷第4期. 2005 |
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