CN101200769A - 利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种分子生物工程技术领域的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法。包括如下步骤：购回的市售药用灵芝菌株，保藏和培养；将培养好的药用灵芝菌丝体经洗涤沉淀，研磨成粉末状；药用灵芝DNA的提取和纯化；药用灵芝特异基因序列的序列测定、PCR产物的电泳检测和限制性内切酶酶切产物的电泳检测；从药用灵芝的菌丝中扩增出的336bp和721bp的特异性条带，通过进一步的序列测定和酶切电泳，发现差异，利用差异进行鉴别；从药用灵芝菌丝中分别扩增出580bp、495bp和836bp的特异性条带，通过电泳检测，发现差异，利用差异进行鉴别，判定检测结果。本发明利用特异基因序列对药用灵芝进行简单、快速、准确的鉴别方法，为进一步研发和使用奠定了基础。

Description

利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物工程技术领域的检测方法，具体地涉及一种利用特异基因序列鉴别对药用灵芝的检测方法。

背景技术

对于药用灵芝的检测，传统的鉴定方法主要是依靠形态学鉴定，主要是灵芝子实体的形、色、气、味、质地等外观性状观察，该方法简便、直接，缺点是主观性强，其准确性完全取决于检验者的经验判断，且难以鉴定加工炮制后的碎片或粉末药材。目前较多的是从生物分类学(基原鉴定)、组织学(显微鉴定)、化学(理化鉴定)角度建立了相对比较客观的检测标准；同时，随着科学技术的发展，细胞学、酶学(同工酶分析)、生物化学(蛋白质分析及效价评价)、血清学(免疫测定)等生物技术亦逐渐应用到灵芝鉴定中来。分子生物学研究发现，中药(不含矿物类)所依赖的生物资源一“物种”的多样性是由于其基因(核苷酸序列)多态性的结果，而基因(核苷酸序列)多态性可在分子水平上检测，它比在形态、组织和化学水平上检测更能代表中药的遗传变异。

以个体间遗传物质内核苷酸序列的变异为基础进行个体的鉴别方法称为分子标记(Molecular Genetic Markers)或分子诊断技术(DNA-Based DiagnosticTechniques)，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种标记-形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有明显的优越性：分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。利用特异基因序列进行鉴别是分子标记的一种新的类型，他是基于PCR和(或)限制性酶切技术的DNA标记，他能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性。基于PCR技术的基本原理是利用鉴别物种已知的DNA序列，通过比对，找出每一个物种特有的DNA序列，设计出一套特异性的PCR引物(19-27bp)，然后用这一引物扩增出该物种的一段特异的DNA序列，凝胶电泳，染色并对条带进行分析。此方法揭示的是特异片段的有和无的信息。基于PCR和限制性酶切技术的DNA标记是利用鉴别物种的特征序列(如与此物种功能相关的基因)，设计出一对特异性的PCR引物(19-27bp)，然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一或两种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并对条带进行分析。此方法揭示的是特异片段的限制性长度变异的信息。

经对现有技术文献的检索发现，苏春丽、唐传红、张劲松、潘迎捷，文章名称：基于β-微管蛋白基因部分序列探讨灵芝属菌株的亲缘关系(菌物学报，2006，25(3)：439~445)，研究者利用β-微管蛋白基因部分序列对灵芝属菌株的亲缘关系进行了探讨，利用特征序列进行物种的鉴别是一种较新的分子标记技术，在药用灵芝的鉴别研究中，利用此特异序列可对树舌亚属、紫芝组和灵芝组之间的菌株进行鉴别。但上述文章涉及的技术不能区分灵芝组内的菌株。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，本发明利用PCR扩增、序列测定和(或)限制性内切酶酶切技术对药用或食用灵芝菌株、原药材，精粉，切片、孢子粉以及破壁孢子粉特异基因序列(真菌免疫调节蛋白基因的编码区和非编码区序列)进行鉴定，以获得药用灵芝特异的序列特征和电泳检测图谱。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明具体包括如下步骤：

(1)购回的市售药用灵芝菌株，保藏和培养；

放在4℃冰箱保藏，每3～5个月更换一次培养基。将斜面菌株放至28℃活化24h，挑取斜面试管菌种的菌丝接至PDA固体培养基平板上，28℃恒温培养7d。用接种铲将1cm²左右的平板菌种接至YPS液体培养基，并捣碎。28℃，120rpm震荡培养。

(2)将培养好的药用灵芝菌丝体经洗涤沉淀，研磨成粉末状；

将培养好的菌丝体10,000g离心10min，去上清，加入PBS缓冲液洗涤沉淀三次，用液氮将洗涤好的菌丝体研磨成粉末状。

(3)药用灵芝DNA的提取和纯化；

(4)药用灵芝特异基因序列的序列测定、PCR产物的电泳检测和限制性内切酶酶切产物的电泳检测；

(5)从药用灵芝的菌丝中扩增出的336bp和721bp的特异性条带，通过进一步的序列测定和酶切电泳，发现差异，利用差异进行鉴别；

(6)从药用灵芝菌丝中可分别扩增出580bp、495bp和836bp的特异性条带，通过电泳检测，发现差异，利用差异进行鉴别，判定检测结果。

根据所使用特异引物的不同分三个层面进行结果判定：①选用特异引物(FIP A和FIP B)从所选药用灵芝菌丝中均能扩增出大约336bp的特异性条带，通过序列比对，发现差异，利用序列差异进行初步鉴别，判定检测结果；②选用特异引物(FIPGLUF和FIPGLUR、FIPGSIF和FIPGSIR、FIPGTSF和FIPGTSR)可分别从药用灵芝的不同种中扩增出大小不同的特异性条带(580bp、495bp、836bp)，通过电泳检测，发现差异，利用电泳条带大小和有无进行鉴别，判定检测结果；③选用特异引物(FIPGF和FIPGF)从所选药用灵芝菌丝中均能扩增出大约721bp的特异性条带，通过限制性内切酶酶切产物的电泳检测，发现电泳条带的差异，利用条带差异进行鉴别，判定检测结果。

所述的药用灵芝，包括：赤灵芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)、松杉灵芝(G.tsuage)。

步骤(3)中所述的药用灵芝DNA的提取和纯化，采用高盐低pH提取法提取基因组DNA，包括(并不限于)以下步骤：

①经液氮研磨的样品(大约1g)放入65℃预热的提取缓冲液，放入65℃水浴保温30min，不时缓慢振摇，室温下10,000×g离心10min；

②在上清液中加入2/3体积的KAc高盐溶液，混匀后置于0℃保持30min以沉淀蛋白质；

③在4℃下10,000×g离心10min，弃蛋白质沉淀。上清液加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)抽提，在6,000×g离心10min，取出水相转入另一离心管，

如果中间层仍有白色沉淀，则再用氯仿/异戊醇(24/1)抽提一次；

④在上清液中加入2/3体积的预冷异丙醇，混匀后置于-20℃静置30min，以沉淀核酸，可以重复一次，用70％乙醇清洗沉淀，在空气中干燥50min，将DNA沉淀溶解在合适体积的TE缓冲液中，分装存放于-20℃或4℃冰箱中保存。

步骤(3)中药用灵芝DNA的检测，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱法进行检测，包括以下步骤：

①取10μl DNA溶液，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶电泳成像系统分析结果及摄取图像。

②吸光值的测定：提取的DNA经50倍稀释后，于紫外可见分光光度计上测定其浓度和纯度。

所述步骤(4)药用灵芝特异基因序列的序列测定、PCR产物的电泳检测和限制性内切酶酶切产物的电泳检测，是通过以下三部分内容来实现的：

第一部分：药用灵芝特异基因序列的测定，包括以下步骤：

所述的药用灵芝特异基因的序列测定，包括以下步骤：

①引物的设计

上游引物：FIP A：5’-ATGTCCGACACTGCCTTGATCTTCAGG-3’，

下游引物：FIP B：5’-CTAGTTCCACTGGGCGATGATGAAGTC-3’；

②PCR扩增

PCR扩增的总反应体系如下，总体积25μl，单位(μl)：

Tag^ExDNA polymerase(TaKaRa)   0.25

10×PCR Buffer                2.5

dNTP Mix(2.5mM)               2.0

MgCl₂(25mM)                   1.5

DNA                           0.5

FIP A(10μM)                  0.5

FIP B(10μM)                  0.5

PCR-Grade Water               17.25

总体积                        25

PCR程序：95℃变性5min，(95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec)共进行35个循环，72℃延伸10min。反应结束后取5μL产物电泳检测。

③PCR扩增片段的回收、连接

使用胶回收试剂盒回收片段(按胶回收试剂盒的步骤操作)。

采用T-A系统将DNA片段与pMD 18-T载体连接，反应体系如下，总体积10μl，单位(μl)：

pMD18-TVector DNA    1

回收片断             1

连接溶液I            5

无菌水               3

总体积               10

反应条件：16℃，30min以上。连接好的片段可用于转化。

④PCR扩增片段的转化

感受态细胞的制备：在工作平板上挑取DH5α单菌落接种到20~30mL无抗生素的LB培养基中，在240~260rpm摇床中37℃摇菌至OD₆₀₀＝0.5(约6~8h)；取出菌液与0.1M CaCl₂同时置于冰浴中15~30min；在灭菌的超净台上取1.5mL菌液于1.5mL-EP管中，4℃5000~8000rpm离心5min收集菌体；用移液器吸去上清，并用500μL冰冷的0.1M CaCl₂重悬菌体；离心后用移液器尽可能吸去上清，用200μL冰冷的0.1M CaCl₂重悬菌体，置冰浴过夜备用。

转化：采用常规的分子生物学方法进行转化。将10μl连接片段与100μl感受态细胞混合；放置冰上，30min；42℃水浴放置90sec；放置冰上1-2min；加入800μlLB培养液，在摇床(37℃，200rpm)中培养1h；取100μl溶液均匀涂在LB平板上(含Amp，X-gal，IPTG)；培养箱(37℃)中培养过夜。

⑤阳性菌落的鉴定

取白色菌落用菌落PCR法或转化质粒的酶切鉴定阳性菌落。

⑥序列测定。

第二部分：药用灵芝赤灵芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)和松杉灵芝(G.tsuage)特有基因序列PCR扩增产物的电泳检测。

所述的赤灵芝(G.lucidum)特有基因序列的PCR扩增产物的电泳检测，包括以下步骤：

①引物的设计(primer design)

FIPGLUF：5’-GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3’

FIPGLUR：5’-CGCTATGCCATACCCGGAGTTG-3’

②PCR扩增(PCR amplification)

PCR扩增的总反应体系如下，总体积25μl，单位(μl)：

Tag^ExDNA polymerase(TaKaRa)  0.25

10×PCR Buffer               2.5

dNTP Mix(2.5mM)              2.0

MgCl₂(25mM)                  1.5

DNA                          0.5

FIPGLUF(10μM)               0.5

FIPGLUR(10μM)               0.5

PCR-Grade Water              17.25

总体积                       25

PCR程序：95℃变性5min，(95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec)共进行35个循环，72℃延伸10min。反应结束后取5μL产物电泳检测。

③电泳检测(electrophoresis detection)

取PCR产物10μl，在1×TAE电泳缓冲液下经1％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统观察电泳条带和拍照。

所述的紫芝(G.sinense)特有基因序列的PCR扩增产物的电泳检测，包括以下步骤：

①引物的设计(primer design)

FIPGSIF：5’-GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3’

FIPGSIR：5’-ACCCCAACAGGTTCGTCGACAACG-3’

②PCR扩增(PCR amplification)

PCR扩增的总反应体系如下，总体积25μl，单位(μl)：

Tag^ExDNA polymerase(TaKaRa)0.25

10×PCR Buffer             2.5

dNTP Mix(2.5mM)            2.0

MgCl₂(25mM)                1.5

DNA                        0.5

FIPGSIF(10μM)             0.5

FIPGSIR(10μM)             0.5

PCR-Grade Water            17.25

总体积                     25

PCR程序：95 ℃变性5min，(95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec)共进行35个循环，72℃延伸10min。反应结束后取5μL产物电泳检测。

③电泳检测(electrophoresis detection)

取PCR产物10μl，在1×TAE电泳缓冲液下经1％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统观察电泳条带和拍照。

所述的松杉灵芝(G.tsuage)特有基因序列的PCR扩增产物的电泳检测，包括以下步骤：

①引物的设计(primer design)

FIPGTSF：5’-TACGAGGGTTTCACGCCGAGGTTC-3’

FIPGTSR：5’-AAACTCGGCCGCGATAGAGAAGCA-3’

②PCR扩增(PCR amplification)

PCR扩增的总反应体系如下，总体积25μl，单位(μl)：

Tag^Ex DNA polymerase(TaKaRa)   0.25

10×PCR Buffer                 2.5

dNTP Mix(2.5mM)                2.0

MgCl₂(25mM)                    1.5

DNA                            0.5

FIPGTSF(10μM)                 0.5

FIPGTSR(10μM)                 0.5

PCR-Grade Water                17.25

总体积                         25

PCR程序：95℃变性5min，(95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec)共进行35个循环，72℃延伸10min。反应结束后取5μL产物电泳检测。

③电泳检测(electrophoresis detection)

取PCR产物10μl，在1×TAE电泳缓冲液下经1％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统观察电泳条带和拍照。

第三部分：药用灵芝特异基因序列的PCR扩增产物的限制性内切酶酶切的电泳检测；包括以下步骤：

①引物设计(primer design)

FIPGF：5’-CTGTGGCTTGCAGGGCCTCGCAC-3’

FIPGR：5’-CTTGTCTCATAATCATGCCCGTG-3’

②PCR扩增(PCR amplification)

PCR扩增的总反应体系如下，总体积25μl，单位(μl)：

Tag^Ex DNA polymerase(TaKaRa)  0.25

10×PCR Buffer               2.5

dNTP Mix(2.5mM)              2.0

MgCl₂(25mM)                  1.5

DNA                          0.5

FIPGF(10μM)                 0.5

FIPGR(10μM)                 0.5

PCR-Grade Water              17.25

总体积                       25

PCR程序：95℃变性5min，(95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec)共进行35个循环，72℃延伸10min。反应结束后取5μL产物电泳检测。

③电泳检测(electrophoresis detection)

取PCR产物10μl，在1×TAE电泳缓冲液下经1％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统观察电泳条带和拍照。

④PCR产物的回收(recovering PCR products)

使用胶回收试剂盒回收片段(按胶回收试剂盒的步骤操作)。

⑤酶切(enzyme cleaving)

在1.5mL-EP管中加入下列试剂，总体积25μl，单位(μl)：

胶回收片断              5

10×buffer              5

100×BSA                1

酶(Acc III or           1

Ava II)

ddH₂O                   8

总体积                  20

混匀后在37℃(Ava II)或60℃(Acc III)酶切过夜。取酶切产物10μl，在1×TAE电泳缓冲液下经1％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统观察电泳条带和拍照。

步骤(5)中所述的从所选药用灵芝菌丝中均能扩增出大约336bp的特异性条带，是指：以提取的灵芝菌丝DNA为模板，使用上游引物FIP A和下游引物FIR B，进行标准程序的PCR扩增，从药用灵芝(包括赤灵芝G.lucidum、紫芝G.sinense和松杉灵芝G.tsugae)菌丝中均能扩增出大约336bp的特异性条带。

步骤(5)中所述的通过序列比对，发现差异，利用序列差异进行初步鉴别，是指：在克隆出赤灵芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)和松杉灵芝(G.tsugae)336bp特异基因序列基础上，通过测序后进行序列比对，发现赤灵芝(G.lucidum)和松杉灵芝(G.tsugae)这336bp特异基因序列没有差异，而两者与紫芝(G.sinense)的336bp特异序列有差异，利用这些差异可以进行赤灵芝(G.lucidum)、松杉灵芝(G.tsugae)和紫芝(G.sinense)的鉴别。

步骤(5)中所述的利用电泳条带大小和有无差异进行鉴别，是指：通过步骤(3)DNA的提取和纯化的实施，应在电泳图上显示提取的DNA样品没有降解；通过步骤(4)的实施从电泳图谱上能观察到从所选三种药用灵芝中均能扩增出大小不同的特异性条带，通过观察电泳图谱上扩增条带的大小和有无来进行鉴别；引物FIPGLUF和FIPGLUR是用来扩增赤灵芝(G.lucidum)的特异引物，可扩增得到大约580bp的的特异性条带；引物FIPGTSF和FIPGTSR是用来扩增松杉灵芝(G.tsugae)的特异引物，可扩增得到大约836bp的特异性条带。引物FIPGSIF和FIPGSIR是用来扩增紫芝(G.sinense)的特异引物，可扩增得到大约495bp的特异性条带。

步骤(5)中所述的利用条带差异进行鉴别，是指：将从所选药用灵芝菌丝中扩增出的大约721bp的特异性条带分别用限制性内切酶Acc III(T*CCGGA)进行酶切，从赤灵芝(G.lucidum)和松杉灵芝(G.tsugae)种来的721bp的特异性条带，酶切产物电泳时显示出大约442bp和270bp两个条带，从紫芝(G.sinense)种来的721bp的特异性条带，酶切产物电泳时显示出大约721bp的一个条带；同时将扩增得到的这个721bp的特异性条带分别用限制性内切酶AvaII(G*GWCC)进行酶切，从紫芝(G.sinense)种来的721bp的特异性条带，酶切产物电泳时显示出大约402 bp，48bp和262bp的三个条带(由48bp条带太小，不宜被看清，故主要通过判断402bp和262bp两个条带的有无来进行鉴定)。从赤灵芝(G.lucidum)和松杉灵芝(G.tsugae)种来的721bp的特异性条带，酶切产物电泳时显示出大约721bp一个条带。

本发明利用特异基因序列对三种灵芝——赤灵芝(Ganoderma lucidum)、紫芝(Ganaderma sinensis)和松杉灵芝(Ganoderma tsuage)进行鉴别，能够有效地确定药用灵芝的分类地位，对药用灵芝产品原料药的来源鉴定提供了简单、快速、准确的鉴别方法，为灵芝药用产品的研发和临床应用使用剂量的确定奠定了基础，为中药加快现代化的步伐。

本发明所涉及的菌种来源于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其简称和保藏编号、保藏单位名称具体如下：

所述的赤灵芝(Ganoderma lucidum)来源于中国普通微生物保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Cente英文缩写CGMCC)，编号：AS 5.65；保藏单位：广东省微生物研究所菌种保藏中心(MicrobiologicalCulture and Collection center of Guangdong Institute of Microbiology)保藏编号：GIM 5.9；

所述的紫芝(Ganaderma sinensis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China英文缩写ACCC)编号：51332；

所述的松杉灵芝(Ganoderma tsuage)来源于中国普通微生物保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center英文缩写CGMCC)菌种编号：5.0542。

具体实施方式

以下结合实验室具体的试验数据对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

利用特异基因序列进行药用灵芝菌种的鉴定。

1.菌丝体的培养(culture the mycelia)

灵芝(G.lucidum)菌种，来源于广东省微生物研究所菌种保藏中心MCCGM(GIM 5.11，GIM 5.250，GIM 5.251，GIM 5.257，GIM 5.259)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)(50088)、华中食用菌栽培研究所(南韩灵芝)、上海农科院食用菌研究所(红灵芝)、黑龙江科学院应用微生物研究所(韩国灵芝)、四川省农科院土壤肥料所(灵芝)、山东农业大学(泰山灵芝)。购回的菌株的培养、保藏具体操作步骤同本发明步骤(1)的具体内容。

2.菌丝体的准备(preparation the mycelia)

菌丝体的准备的具体操作步骤同本发明步骤(2)的具体内容。

3.菌丝体基因组DNA提取(extraction the DNA ofmycelia)

选取高盐低pH提取法提取基因组DNA，具体操作步骤同本发明步骤(3)的具体内容。

4.DNA的检测(detection of DNA)

采用琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱法进行检测，具体操作步骤同本发明步骤(4)的具体内容。

5.引物设计(primer design)

根据我们的实施方案设计五对引物，引物FIP A和FIP B对、引物FIPGLUF和FIPGLUR对、引物FIPGTSF和FIPGTSR对、引物FIPGSIF和FIPGSIR对、引物FIPGF和FIPGR对。引物序列同本发明步骤(5)、(6)的具体内容。

6.PCR扩增(PCR amplification)

反应程序：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃，延伸40sec进行35个循环，最后在72℃延伸10min。

7.PCR产物的电泳检测(electrophoresis detection)

PCR产物在1×TAE电泳缓冲液下经1％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统拍照。

使用引物FIP A和FIP B对可扩增出赤灵芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)和松杉灵芝(G.tsugae)三个药用灵芝的特异基因序列，在电泳图上可见大约336bp的特异性条带；使用引物FIPGLUF和FIPGLUR对可扩增出赤灵芝(G.lucidum)特有的基因序列，在电泳图上可见大约580bp的特异性条带；使用引物FIPGTSF和FIPGTSR对可扩增出松杉灵芝(G.tsugae)特有的基因序列，在电泳图上可见大约836bp的特异性条带；使用引物FIPGSIF和FIPGSIR对可扩增出紫芝(G.sinense)特有的基因序列，在电泳图上可见大约495bp的特异性条带；使用引物FIPGF和FIPGR对可扩增出赤灵芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)和松杉灵芝(G.tsugae)三个药用灵芝的特异基因序列，在电泳图上可见大约721bp的特异性条带。

在电泳图谱上可根据三对引物的扩增结果进行鉴定。引物FIPGLUF和FIPGLUR对只能将属于赤灵芝(G.lucidum)种的基因序列进行扩增，在电泳图上可见大约580bp的特异性条带；而不能将非赤灵芝(G.lucidum)的种进行扩增；引物FIPGTSF和FIPGTSR对只能将属于松杉灵芝(G.tsugae)种的基因序列进行扩增，在电泳图上可见大约836bp的特异性条带；而不能将非松杉灵芝(G.tsugae)种的基因序列进行扩增；引物FIPGSIF和FIPGSIR对只能将属于紫芝(G.sinense)种的基因序列进行扩增，在电泳图上可见大约495bp的特异性条带；而不能将非紫芝(G.sinense)种的基因序列进行扩增。

8.序列测定(sequence determination)

将从赤灵芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)和松杉灵芝(G.tsugae)三个药用灵芝种中扩增到的大约336bp的的特异性条带，胶回收、连接和克隆后进行序列测定。可根据测定出的序列与实施方案中测定的序列是否相同进行鉴别。

9.酶切产物的电泳检测(Electrophoresis of enzyme cleaving)

将从赤灵芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)和松杉灵芝(G.tsugae)三个药用灵芝种中扩增到的大约721bp的特异性条带分别用限制性内切酶AccIII(T*CCGGA)进行酶切，从赤灵芝(G.lucidum)和松杉灵芝(G.tsugae)种来721bp特异序列，酶切产物电泳时显示出大约442bp和270bp两个条带，而从紫芝(G.sinense)种来的721bp特异序列，酶切产物电泳时显示出大约721bp的一个条带；或将扩增到的这个721bp的特异性条带分别用限制性内切酶Ava II(G*GWCC)进行酶切，从紫芝(G.sinense)种来的721bp特异序列，酶切产物电泳时显示出大约402bp，48bp和262bp的三个条带。由48bp条带太小，不宜被看清，故主要通过判断402bp和262bp两个条带的有无来进行鉴定。从赤灵芝(G.lucidum)和松杉灵芝(G.tsugae)种来的721bp特异序列，酶切产物电泳时显示出大约721bp一个条带。根据酶切条带的大小进行鉴别。

实施例2

利用特异基因序列进行赤灵芝(G.lucidum)子实体(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)的鉴定

1.基因组DNA提取

选取高盐低pH提取法提取基因组DNA，具体操作步骤同本发明步骤(3)的具体内容。

2.DNA的检测

采用琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱法进行检测，具体操作步骤同本发明步骤(4)的具体内容。

3.引物设计

根据我们的实施方案设计五对引物，引物FIP A和FIP B对、引物FIPGLUF和FIPGLUR对、引物FIPGTSF和FIPGTSR对、引物FIPGSIF和FIPGSIR对、引物FIPGF和FIPGR对。引物序列同本发明步骤(5)、(6)的具体内容。。

4.PCR反应

反应程序：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃，延伸40sec进行35个循环，最后在72℃延伸10min。

5.PCR产物的电泳检测

PCR产物在1×TAE电泳缓冲液下经1％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统拍照。

使用引物FIP A和FIP B对可扩增出以赤灵芝(G.lucidum)子实体(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)来源的材料的特异基因序列，在电泳图上可见大约336bp的特异性条带；使用引物FIPGLUF和FIPGLUR对可扩增出赤灵芝(G.lucidum)来源的子实体(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)材料的特有基因序列，在电泳图上可见大约580bp的特异性条带；使用引物FIPGTSF和FIPGTSR对和引物FIPGSIF和FIPGSIR对均不能扩增出以赤灵芝来源的(G.lucidum)子实体(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)材料的特有基因序列，在电泳图谱上没有特异性条带出现；使用引物FIPGF和FIPGR对可扩增出以赤灵芝(G.lucidum)来源的子实体(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)材料的特异基因序列，在电泳图谱上可见大约721bp的特异性条带。在电泳图谱上可根据这五对引物的扩增结果进行判定。

6.序列测定

将从以赤灵芝(G.lucidum)来源的子实体(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)材料的中扩增到的大约336bp的特异性条带，胶回收、连接和克隆后进行序列测定。可根据测定出的序列与实施方案中测定的赤灵芝(G.lucidum)序列是否相同进行鉴别。

7.酶切产物的电泳检测

将从赤灵芝(G.lucidum)来源的子实体(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)中扩增得到的大约721bp的特异性条带用限制性内切酶Acc III(T*CCGGA)进行酶切，酶切产物电泳时显示出大约442bp和270bp两个条带，或将扩增到的这个721bp的特异性条带使用限制性内切酶Ava H(G*GWCC)进行酶切，酶切产物电泳时显示出大约721bp一个条带。根据酶切条带的大小进行鉴别。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)一种编码赤灵芝(G.lucidum)免疫调节蛋白基因的核酸，其特征在于具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1078bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

<110>上海交通大学

<120>利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1078

<212>DNA

<213>赤灵芝(G.lucidum)

<400>1

cgtatgcacc ctggtttaca tcatcgtgaa acggcgctcc ggttgccgta taaaaggacg  60

gcaaaggcgg ccagtggact tcagcacctg ctcttgtacc cacttctagt aagtcgcata 120

ccacctctcc tgacagcgac aggttcactg actagttcat agtccacagc tctttgccta 180

caatcaaggt ttgccgacac cctctttgag ccctccccct tcaataaccc cctaacttct 240

gccccgcagc atcatgtccg acactgcctt gatcttcagg ctcgcctggg acgtgaagaa 300

gctctcgttc gactacaccc cgaactgggg ccgcggcaac cccaacaact tcatcgacac 360

tgtcaccttc ccgaaagtct tgaccgacaa ggcgtacacg taccgcgtcg ccgtctccgg 420

acggaacctc ggcgtgaaac cctcgtacgc ggtcgagagc gacggctcgc agaaggtcaa 480

cttcctcgag tacaactccg ggtatggcat agcggacacg aacacgatcc aggtgttcgt 540

tgtcgacccc gacaccaaca acgacttcat catcgcccag tggaactagg aggaggcagt 600

gactgacccc tggcggtcta atctgcgggc cactgtgggg gaggggcatc gcccatcagc 660

ttccttgtct cataatcatg cccgtgtagc aattgtaaat cgaccttgtt gtaacatgca 720

tccagctttt gtggtgtgcc gtcttatgtt tggttgaatg cgtcagccta tcaaagctag 780

cttagggcta ggtgggtcgc cgtcggccgc gttcaagcct tcgggcgctc gtgtctttag 840

tcagctaaca actcaaatac ttacttttgt aagagttact ataaacccga ttaaaatctg 900

tttgttatct gatgattccg atctaatgaa aggctacccc ttccgagtca ctaatgggta 960

ctttgagaca acgagcggac cgtcttggta tgagaataag cttcaagtta cgactggcac1020

atatctacag cggataagac gattcgcatc acactatgga acattccgtc tgatcgat  1078

(2)一种编码紫芝(G. sinense)免疫调节蛋白基因的核酸，其特征在于具有SEQID NO.2所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1072bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

<110>上海交通大学

<120>利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>2

<211>1072

<212>DNA

<213>紫芝(G.sinense)

<400>1

accgccatcc ataaccaacg tctcaacccc gagatggacg tcatctggag gtaacgacca  60

aggcggtctt ccggcaactg tggtctcgaa gacgtgaggc gtttacaagg ttggacatct 120

cggggcaatt ctgccaaact cgcaaggaga atgtaccgtc ctatcacttg cagtggtcag 180

caggggttgc atccaggtcc acctgcggtg caactcggtt ccctgtggct tgcagggcct 240

cgcacgtcgt atgcaccctg gtttacatca tcgtgaaacg gcgctccggt tgccgtataa 300

aaggacggca aaggcggcca gtggacttca gcacctgctc ttgtacccac ttctagtaag 360

tcgcatacca cctctcctga cagcgacagg ttcactgact agttcacagt ccacagctct 420

ttgccttaca atcaaggttt gccgacaccc tctttgagcc ctcccccttc aataaccccc 480

taacttctgc cccgcagcat catgtccgac actgccttga tcttcaggct ggcctgggac 540

gtgaaaaagc tatcgttcga ctacaccccg acctggggcc gtggcaaccc cagcaggttc 600

gtcgacaacg tcaccttccc gcaggtcctg gccgacaagg cgtacacgta ccgcgttgtt 660

gtgtctggtc gggaccttgg cgtgcgcccc tcgtacgcgg tggggagtga tggctcgcag 720

aaggtcaact tcctcgagta taaccagggc tacggcatcg cggacacgaa caccatccag 780

gtattcgtta tcgaccccga caccggcgca gacttcatca tcgcccagtg gaactaggag 840

gaggcagtga ctgacccctg gcggtctaat ctgcgggcca ctgtggggga ggggcatcgc 900

ccatcagctt ccttgtctca taatcatgcc cgtgtaacaa ttgtaaatcg accttgttgt 960

accatgcatc cagcttttgt ggtgtaccgt cttatgtttg gttgaatgcg tcagcctatc1020

aaagctagct tagggctagg tgggtcgccg tcggccgcgt tcaagccttc gg        1072

(3)一种编码松杉灵芝(G.tsugae)免疫调节蛋白基因的核酸，其特征在于具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.3的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1015bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.3

<110>上海交通大学

<120>利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>3

<211>1015

<212>DNA

<213>松杉灵芝(G.tsugae)

<400>1

atcgccatcc ataaccaacg tctcaacccc cgagatggac gtcatctgga ggtaacgacc  60

aaggcggtct tccggcaact gtggtctcga agacgtgagg cgtttacaag gttggacatc 120

tcggggcaat tctgccaaac tcgcaaggag aatgtaccgc cctatcacct ccagtggtca 180

gcaggggttg cattcaggtc cacctgcggt gcagttcggt tccctgtggc ttgcagggcc 240

tcgcacgtcg tatgcaccct ggtttacatc atcgtgaaac gacgctccgg ttgtcgtata 300

aaaggacggc aaaggcggcc agtgaacttc agcacctgct cttgtaccca ctcctagtaa 360

gtcgcatacc acctaccacc tcaccctgaa agcgacgagt ttactgacta gttcatagtc 420

acagctcttt gacttacaat caaggtttgc cgacaccctc tttgagcgct cccccttcaa 480

taacccccta acctctgccg cgcagcatca tgtccgacac cgctctgatc ttcaggctcg 540

cctgggacgt gaagaagctc tcgttcgact acaccccgaa ctggggccgc ggcaacccca 600

acaacttcat cgacactgtc accttcccga aagtcttgac cgacaaggcg tacacgtacc 660

gcgtcgccgt ctccggacgg aacctcggcg tgaaaccctc gtacgcggtc gagagcgacg 720

gctcgcagaa ggtcaacttc ctcgagtaca actccgggta tggcatagcg gacacgaaca 780

cgatccaggt gttcgttgtc gaccccgaca ccaacaacga cttcatcatc gcccagtgga 840

actaggagga ggcagtgact gacccctggc ggtctaatct gcgggccact gtgggggagg 900

ggcatcgccc atcagcttcc ttgtctcata atcatgcccg tggcggatgc gtacaatctc 960

agcacgtagt gcatcatcct tggggacata aactcggccg cgatagagaa gcagg     1015

Claims (6)

1.一种利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)购回的市售药用灵芝菌株，保藏和培养；

(2)将培养好的药用灵芝菌丝体经洗涤沉淀，研磨成粉末状；

(3)药用灵芝DNA的提取和纯化；

(4)药用灵芝特异基因序列的序列测定、PCR产物的电泳检测和限制性内切酶酶切产物的电泳检测；

(5)从药用灵芝的菌丝中扩增出的336bp和721bp的特异性条带，通过进一步的序列测定和酶切电泳，发现差异，利用差异进行鉴别；

(6)从药用灵芝菌丝中分别扩增出580bp、495bp和836bp的特异性条带，通过电泳检测，发现差异，利用差异进行鉴别，判定检测结果。

2.根据权利要求1所述的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征是，步骤(3)中所述的药用灵芝DNA的提取和纯化，采用高盐低pH提取法提取基因组DNA，包括以下步骤：

①经液氮研磨的样品放入65℃预热的提取缓冲液，放入65℃水浴保温30min，不时缓慢振摇，室温下10,000×g离心10min；

②在上清液中加入2/3体积的KAc高盐溶液，混匀后置于0℃保持30min以沉淀蛋白质；

③在4℃下10,000×g离心10min，弃蛋白质沉淀，上清液加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，在6,000×g离心10min，取出水相转入另一离心管，

如果中间层仍有白色沉淀，则再用氯仿/异戊醇抽提一次；

④在上清液中加入2/3体积的预冷异丙醇，混匀后置于-20℃静置30min，以沉淀核酸，可以重复一次，用70％乙醇清洗沉淀，在空气中干燥50min，将DNA沉淀溶解在合适体积的TE缓冲液中，分装存放于-20℃或4℃冰箱中保存。

3.根据权利要求1所述的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征是，步骤(5)中所述的从所选药用灵芝的菌丝中扩增出的336bp和721bp的特异性条带，设计了两对引物序列：

第1对：FIP A：5’-ATGTCCGACACTGCCTTGATCTTCAGG-3’和FIP B：5’-CTAGTTCCACTGGGCGATGATGAAGTC-3’；

第2对：FIPGF：5’-CTGTGGCTTGCAGGGCCTCGCAC-3’和FIPGR：5’-CTTGTCTCATAATCATGCCCGTG-3’。

4.根据权利要求1所述的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征是，步骤(5)中所述的从所选的药用灵芝菌丝中均能扩增出的336bp和721bp的特异性条带，是指：以提取的药用灵芝菌丝DNA为模板，使用引物FIP A和FIP B，进行标准程序的PCR扩增，从药用灵芝来源的赤灵芝、紫芝和松杉灵芝菌丝中均能扩增出336bp大小的特异性条带；使用引物FIPGF和FIPGR，进行标准程序的PCR扩增，从赤灵芝、紫芝和松杉灵芝中也均能扩增出721bp大小的特异性条带。

5.根据权利要求1所述的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征是，步骤(6)中所述的从药用灵芝菌丝中分别扩增出580bp、495bp和836bp的特异性条带，设计了三对引物序列：

第1对：FIPGLUF：5’-GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3’和FIPGLUR：5’-CGCTATGCCATACCCGGAGTTG-3’；

第2对：FIPGSIF：5’-GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3’和FIPGSIR：5’-ACCCCAACAGGTTCGTCGACAACG-3’；

第3对：FIPGTSF：5’-TACGAGGGTTTCACGCCGAGGTTC-3’和FIPGTSR：5’-AAACTCGGCCGCGATAGAGAAGCA-3’。

6.根据权利要求1所述的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征是，步骤(6)中所述的从药用灵芝菌丝中分别扩增出580bp、495bp和836bp的特异性条带，是指：以提取的药用灵芝菌丝DNA为模板，使用引物FIPGLUF和FIPGLUR只能从赤灵芝中扩增得到580bp大小的特异性条带；使用引物FIPGSIF和FIPGSIR只能从紫芝中扩增出495bp大小的特异性条带；使用引物FIPGTSF和FIPGTSR只能从松杉灵芝中扩增出836bp大小的特异性条带。