DE69026995T2 - Nukleinsäuresonden zum Nachweis von Lyme-Krankheit verursachenden Spirocheten - Google Patents
Nukleinsäuresonden zum Nachweis von Lyme-Krankheit verursachenden SpirochetenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis von Bakterien, die zur Art Borrelia burgdorferi gehören, und damit verwandten Arten von durch Zecken übertragenen Spirochäten, die beim Menschen und bei Tieren Krankheiten verursachen können. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Nucleinsäuresonden und Zusammensetzungen sowie Verfahren für ihre Verwendung zum spezifischen Nachweis von Bakterien bereit, die die Lyme- Krankheit verursachen.
- Lyme-Borreliose, Lyme- Krankheit, Lyme-Arthritis, das Bannwarth-Syndrom oder Erythema chronicum migrans (ECM) sind Synonyme für eine zoonotische Spirochäten-Infektion, die durch den Biß der zur Gattung Ixodes gehörenden Zecken übertragen wird. Obwohl die Krankheit in Europa bereits seit einiger Zeit bekannt war, wurde sie in den Vereinigten Staaten erst 1975 entdeckt, als in Connecticut eine Arthritis-Epidemie auftrat. 1982 wurde aus einer Zecke ein mutmaßlicher Krankheitserreger isoliert (Burgdorfer et al., Science 216 (1982), 1317-1319). 1984 zeigte es sich, daß die Spirochäte zur Gattung Borrelia gehört. Sie wurde offiziell als Borrelia burgdorferi bezeichnet (Johnson et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 34 (1984), 496-497). Sie ist mit Borrelia hermsii, Borrelia turicatae, Borrelia anserina und anderen Vertretern der mit Arthropoden assoziierten Gattung spiralförmiger Bakterien evolutionär verwandt.
- Die Lyme-Krankheit ist eine schwere chronische Borreliose-Infektion, die in verschiedenen Stadien durch vielfältige Symptome gekennzeichnet ist. Ungefähr 3 bis 14 Tage nach dem ursprünglichen Zeckenbiß können Symptome auftreten, die Fieber, eine grippeähnliche Erkrankung und das Auftreten des ECM-Hautausschlags umfassen. Im zweiten Stadium, das Wochen bis Monate nach dem ursprünglichen Zeckenbiß auftritt, kann die Haut noch weiter in Mitleidenschaft gezogen werden und es können Arthritis, Beschwerden des Nervensystems und krankhafte Herzveränderungen auftreten. Das dritte Stadium ist durch noch schwerere Arthritis und Komplikationen des Nervensystems gekennzeichnet.
- Die Diagnose der Lyme-Krankheit wird im allgemeinen entweder mittels einer Differentialdiagnose oder in Abhängigkeit von der Antikörper-Reaktion des Wirtes gestellt. Die Isolierung und Züchtung dieser Bakterien als diagnostisches Verfahren läßt sich technisch und ökonomisch nicht durchführen. Bei einer Differentialdiagnose zieht man in Betracht, ob es sich um die entsprechende Jahreszeit (Zeckenzeit) handelt, ob der Wohnort in einem endemischen Gebiet liegt, ob sich der Patient an einen Zeckenbiß erinnern kann und ob ein ECM- Ausschlag auftritt. Die Diagnosestellung wird dadurch erschwert, daß die Krankheit chronisch ist, Reisende infiziert werden, die Zecken unglaublich klein sind bzw. nicht alle Patienten den ECM-Ausschlag zeigen. Die auf Antikörper-Reaktion basierende Diagnose erfordert die Serokonversion infizierter Patienten, damit Antikörper gegen B. burgdorferi produziert werden. Obwohl die Verfahrensweise unter Verwendung von Antikörpern bei vielen diagnostischen Problemen erfolgreich ist, versagt sie aus folgenden Gründen bei der Diagnose der Lyme-Krankheit:
- - Die Kombination einer geringen Anzahl von Spirochäten mit einer nur in geringem Maße antigen wirkenden äußeren Membran führt zu einer schwachen Immunreaktion des Wirts.
- - Nach Infektion erfordert die Serokonversion eine gewisse Zeitdauer. Während des Höhepunktes der Spirochätämie, d.h. in den Wochen nach dem primären Zeckenbiß, weist ein Patient, der Fieber und ECM hat, möglicherweise keine Antikörper auf.
- - Die Antikörper-Reaktion ist kurzzeitig. Während des zweiten oder dritten Stadiums, wenn im Kreislauf am wenigsten Bakterien vorhanden sind, können die Antikörper-Titer sehr niedrig sein.
- - Die zellvermittelte Immunität kann das im Kreislauf befindliche Antikörper-Signal verringern, d.h. die klassische IgG- und IgM-Reaktion des Wirtes nimmt aufgrund maskierter Antigene ab oder fehlt.
- - Für die meisten Antikörper-Tests werden vollständige Borrelia burgdorferi-Präparate als Zielantigene benötigt. Das Hauptproblem bei dieser Verfahrensweise stellt die Kreuzreaktivität dar, wobei Immunreaktionen auf andere Bakterien erfolgen. Besonders erwähnenswert ist die Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen Treponema pallidum (Syphilis).
- Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Testsystemen, die nicht auf Immunreaktionen basieren, wodurch damit im Zusammenhang stehende Probleme vermieden werden, und die Bereitstellung von Nucleinsäuresonden, die spezifisch sind für durch Zecken übertragene Spirochäten, die die Lyme-Krankheit und damit zusammenhängende Erkrankungen verursachen.
- Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Sonden und Tests, die insbesondere spezifisch sind für den Typstamm der Art, Borrelia burgdorferi B31, American Type Culture Collection-Nr. 35210.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Nucleinsäure-Sonden, die mit Zielbereichen hybridisieren können, welche unter normalen Testbedingungen für Sonden zugänglich gemacht werden können.
- Obwohl Kohne et al. (Biophysical Journal 8 (1968), 1104-1118) ein Verfahren zur Herstellung von Sonden für rRNA-Sequenzen diskutieren, geben sie nicht die Lehre an, die für die Herstellung von Borrelia burgdorferi-spezifischen Sonden oder beliebigen anderen Sonden zum Nachweis von Spirochäten- Bakterien notwendig ist.
- EP-A-0272009 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäure- Sonden, die zu der kleinen rRNA eines nichtviralen Ziel-Organismus komplementär sind und deren spezifische Identifizierung gestatten. Die erfindungsgemäßen Sonden werden in dieser Patentveröffentlichung jedoch nicht offenbart. Der Artikel von Goebel und Chuba, J. Clin. Biochem. 25 (9) (1987), Seite 573, beschreibt, wie in einer Probe B. burgdorferi unter Verwendung von Oligonucleotid-Sonden identifiziert werden konnte, die auf spezifische rRNA-Sequenzen gerichtet waren. Die Veröffentlichung offenbart jedoch nicht, welche Sequenzen in einem solchen Test verwendet werden können.
- Die Beschreibung des Standes der Technik umfaßt WO-A-90 15157 als Dokument nach Artikel 54 (3) des Europäischen Patentübereinkommens. Das Patent offenbart die partielle Sequenz der Sonden/Primer 1637 und 1643. In diesem Patent werden jedoch nicht die erfindungsgemäßen Sonden 1616,1617, 1618, 1619,1620,1621 oder 1622 offenbart.
- Pace und Campbell (Journal of Bacteriology 107 (1971), 543-547) diskutieren die Homologie ribosomaler Ribonucleinsäuren aus verschiedenen Bakterienarten und ein Hybridisierungsverfahren zur quantitativen Bestimmung des Ausmaßes dieser Homologie. In ähnlicher Weise diskutieren Sogin, Sogin und Woese (Journal of Molecular Evolution 1 (1972), 173-184) theoretische und praktische Aspekte der Verwendung von primären strukturellen Merkmalen verschiedener ribosomaler RNA-Moleküle zur Beurteilung phylogenetischer Verwandtschaften. Fox, Pechman und Woese (International Journal of Systematic Bacteriology 27 (1977), 44-57) diskutieren die vergleichende katalogische Erfassung von ribosomalen 16S-RNAs als Weg zur Systematisierung von Prokaryonten. Diese Literaturstellen können jedoch die mangelnde Lehre von Kohne in bezug auf Lyme-Spirochäten nicht wettmachen und stellen insbesondere keine Lyme-Spirochäten-spezifischen Sonden bereit, die sich in Tests zum Nachweis der Lyme-Krankheit oder ihres Erregers Borrelia burgdorferi und verwandter Organismen verwenden lassen.
- Ribosomen besitzen für alle Organismen große Bedeutung, da sie die einzig bekannten Mittel zur Übersetzung der genetischen Information in Zellproteine, die wichtigsten strukturellen und katalytischen Elemente des Lebens, sind. Diese Bedeutung wird bei der Erkenntnis klar, daß alle Zellen Ribosomen besitzen.
- Ribosomen enthalten drei verschiedene RNA-Moleküle, die zumindest bei Escherichia coli als 5S-, 16S- und 23S-rRNAs bezeichnet werden. Aus historischer Sicht hängen diese Namen mit der durch die Sedimentationsgeschwindigkeit ermittelten Größe der RNA-Moleküle zusammen. Tatsächlich unterscheidet sich die Größe der ribosomalen RNA- Moleküle jedoch erheblich von Organismus zu Organismus. Trotzdem werden 5S-, 16S- und 23S-rRNA im allgemeinen als Oberbegriffe für homologe RNA- Moleküle in beliebigen Bakterien verwendet und diese Konvention wird in der vorliegenden Erfindung beachtet. Gemäß einer in der vorliegenden Erfindung zusätzlich beachteten Konvention werden Sequenzpositionen in Analogie zu der 16S-rRNA-Sequenz von Escherichia coli numeriert (Brosius et al., PNAS (USA) 75 (1978), 4801-4805).
- Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Sonde(n)" bezieht sich auf synthetische oder biologisch erzeugte Nucleinsäuren (DNA oder RNA), die durch Entwurf oder Auswahl spezifische Nucleotidsequenzen enthalten, welche ihnen unter definierten, vorher bestimmten Stringenzbedingungen die spezifische (d.h. bevorzugte, vgl. nächsten Absatz) Hybridisierung mit Ziel- Nucleinsäure-Sequenzen ermöglichen. Neben ihren Hybridisierungseigenschaften können die Sonden bestimmte Bestandteile enthalten, die für ihr richtiges oder optimales Funktionieren unter bestimmten Testbedingungen relevant sind. Die Sonden können beispielsweise so modifiziert werden, daß ihre Widerstandsfähigkeit gegen einen Nuclease-Abbau verbessert wird (z.B. durch Anbindung einer "Cap"-Struktur an den Enden), daß sie Nachweis- Liganden tragen (z.B. Fluorescein, ³²P, Biotin, usw.) oder ihr Einfangen an einem festen Träger (z.B. Polydesoxyadenosin-"Schwänze" - vgl. Figur 2) erleichtert wird. Durch diese Modifikationen wird die eigentliche Funktion der Sonden unterstützt, die in ihrer Fähigkeit besteht, daß sie sich in einem Hybridisierungstest zur Unterscheidung zwischen Ziel-Organismen und Organismen, die keine Ziele darstellen, verwenden lassen.
- Üblicherweise versteht man unter Hybridisierung das Verfahren, bei dem man unter vorher ermittelten Reaktionsbedingungen zwei teilweise oder vollständig komplementäre einzelsträngige Nucleinsäuren in antiparalleler Weise (eine Nucleinsäure besitzt eine 5'-3'-Orientierung, die andere eine 3'-5'- Orientierung) zusammenkommen läßt, wobei sich nach klaren Regeln, die festlegen, welche Nucleinsäure-Basen sich miteinander paaren, eine doppelsträngige Nucleinsäure mit spezifischen und stabilen Wasserstoff- Bindungen bildet. Eine hohe Sonden-Spezifität hängt von der statistisch geringen Wahrscheinlichkeit des zufälligen Vorkommens von nur einmal vorhandenen Sequenzen ab, wobei diese Wahrscheinlichkeit vom Multiplikationsprodukt der Wahrscheinlichkeiten des Vorkommens der einzelnen Basen der Sequenz bestimmt wird. Der Fachmann versteht diese Prinzipien sehr gut.
- Die Stringenz spezifischer Hybridisierungsbedingungen ist sowohl durch die Basenzusammensetzung des doppelsträngigen Sonden/Ziel-Moleküls als auch den Umfang und die Geometrie von Basenfehlpaarungen zwischen den beiden Nucleinsäuren definiert.
- Die Stringenz kann auch durch Reaktionsparameter wie Konzentration und Typ der in der Hybridisierungslösung vorhandenen Ionen-Arten, Art und Konzentration der vorhandenen Denaturierungsmittel und/oder Temperatur der Hybridisierung gesteuert werden. Mit zunehmender Stringenz der Hybridisierungsbedingungen sind im allgemeinen längere Sonden bevorzugt, wenn stabile Hybride gebildet werden sollen. Folglich bestimmt die Stringenz der Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfinden soll (z.B. auf der Basis des durchzuführenden Tests), bestimmte Merkmale der bevorzugten Sonden, die eingesetzt werden sollen. Diese Beziehungen sind gut erforscht und können durch den Fachmann ohne weiteres beeinflußt werden.
- Je nach Sondenlänge versteht der Fachmann im allgemeinen unter stringenten Bedingungen etwa 35ºC - 65ºC in einer etwa 0,9 molaren Salzlösung.
- In der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Nucleinsäurefragment bereitgestellt, das unter vorher bestimmten Stringenzbedingungen mit ribosomaler RNA (rRNA) oder rDNA-Genen (rDNA) von Borrelia burgdorferi hybridisieren kann. Das Fragment ist zu mindestens 90% einer Sequenz komplementär, die zehn beliebige aufeinanderfolgende Nucleotide innerhalb der Nucleotidsequenzen einer der folgenden Sonden umfaßt: Sonde 1616, Sonde 1617, Sonde 1618, Sonde 1619, Sonde 1620, Sonde 1621 oder Sonde 1622. Die Sequenzen dieser Sonden sind nachstehend definiert.
- In der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Nucleinsäurefragment bereitgestellt, das unter vorher bestimmten Stringenzbedingungen mit ribosomaler RNA (rRNA) oder rDNA-Genen (rDNA) von Borrelia burgdorferi hybridisieren kann. Das Fragment ist zu mindestens 90% einer Sequenz komplementär, die zehn beliebige aufeinanderfolgende Nucleotide innerhalb der Sonden 1616, 1617, 1618, 1619, 1620, 1621 oder 1622 umfaßt.
- Nucleinsäuresequenzen gemäß der ersten oder der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Sonden 1616, 1617, 1618, 1619, 1620, 1621 oder 1622 oder eine ihrer komplementären Sequenzen umfassen. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch einen Sondensatz, der mindestens zwei Nucleinsäurefragmente gemäß der ersten oder der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung oder eine dazu komplementäre Nucleinsäuresequenz umfaßt. Der Sondensatz kann auch ein erstes, bereits früher beschriebenes Nucleinsäurefragment und eine zweite Nucleinsäure umfassen, die die Sonde/der Primer 1643 oder die Sonde/der Primer 1637 ist, die die nachstehend definierte Nucleotidsequenz haben.
- In einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis des Erregers der Lyme-Krankheit oder Borreliose in einer Probe bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Schritte:
- (a) Inkontaktbringen der Probe mit mindestens einem Nucleinsäurefragment gemäß der ersten oder zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung oder einer dazu komplementären Nucleinsäuresequenz unter Bedingungen, die die Hybridisierung des Fragments mit rRNA oder rDNA von einer die Lyme-Krankheit verursachenden Borrelia-Art erlaubt, sofern diese in der Probe vorhanden ist, wobei Hybrid-Nucleinsäurekomplexe gebildet werden; und
- (b) Nachweis der Hybrid-Nucleinsäurekomplexe als Anzeichen für die Gegenwart einer Borrelia-Art.
- In einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis des Erregers der Lyme-Krankheit oder Borreliose in einer Probe bereitgestellt, das die Schritte umfaßt:
- (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Nucleinsäurefragment, das die Sonde/den Primer 1637 oder die Sonde/den Primer 1643 umfaßt, unter Bedingungen, die die Hybridisierung des Fragments mit rRNA oder rDNA von einer die Lyme-Krankheit verursachenden Borrelia-Art erlaubt, sofern diese in der Probe vorhanden ist, wobei Hybrid- Nucleinsäurekomplexe gebildet werden; und
- (b) Nachweis der Hybrid-Nucleinsäurekomplexe durch zusätzliches Inkontaktbringen der Probe mit einem zweiten Nucleinsäurefragment, das die Sonden 1616, 1617, 1618, 1619, 1620, 1621 oder 1622 oder eine ihrer komplementären Sequenzen umfaßt, und
- (c) Amplifikation der 16S-rRNA-Gensequenz der Borrelia-Art, sofern diese vorhanden ist, durch die Polymerase-Kettenreaktion.
- Die erfindungsgemäßen Sonden bieten daher die Basis zur Entwicklung eines nützlichen Nucleinsäure-Hybridisierungstests zum spezifischen Nachweis der Lyme-Krankheit oder ihres Erregers in klinischen Blut-, Urin-, Zerebrospinalflüssigkeits-, Hautbiopsie-, Speichel- oder Synovialflüssigkeits- Proben oder in Proben anderer Gewebe oder Flüssigkeiten von Mensch oder Tier. Die Sonden bieten auch die Basis zum Testen der Krankheitsüberträger der Lyme-Krankheit - Zecken der Gattung Ixodes - zur Beurteilung von Infektionsraten oder des endemischen Bereichs.
- Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben aus eigener Erfahrung festgestellt, daß gegenüber anderen derzeit verfügbaren mikrobiologischen oder immunologischen Verfahren zum Nachweis von Bakterien in Testproben auf Nucleinsäure-Hybridisierungen basierende Testsysteme bessere Möglichkeiten zur Erzielung guter Resultate bieten, zu denen im allgemeinen gehören:
- a) erhöhte Empfindlichkeit, d.h. die Fähigkeit zum häufigeren Nachweis der Bakterien in einer bestimmten Probe;
- b) potentiell deutlich niedrigere Testkosten aufgrund der Verwendung preisgünstiger Reagenzien und eines geringeren Arbeitsaufwandes;
- c) genaue Identifizierung selbst von biochemisch ungewöhnlichen Stämmen der Ziel-Bakterien oder von Bakterien, bei denen die Proteine der äußeren Membran extrem verschieden sind;
- d) direktes Testen auf die Gegenwart des Bakteriums und die sich daraus ergebende Möglichkeit zur quantitativen Bestimmung der Krankheitserreger;
- e) der Test ist nicht vom Eintreten der Immunreaktionen des Wirtes abhängig - ein viel früherer Nachweis ist möglich;
- f) das direkte Testen ermöglicht die Kontrolle der Wirksamkeit einer Antibiotika-Verabreichung;
- g) die Möglichkeit des Nachweises des Krankheitserregers in Gewebeproben, bei denen die Antikörper-Titer normalerweise sehr niedrig sind, z.B. in Hautproben.
- Es ist entdeckt worden, daß zu den weiteren Vorteile, die sich dadurch ergeben, daß die erfindungsgemäßen Sonden gegen rRNA gerichtet sind, die Tatsache gehört, daß die nachgewiesenen rRNAs einen signifikanten Bestandteil der Zellmasse bilden. Obwohl die Schätzungen des zellulären Ribosomengehalts unterschiedlich sind, können aktiv wachsende Borrelia burgdorferi-Bakterien mehr als 20 000 Ribosomen pro Zelle und daher 20 000 Kopien jeder der rRNAs (in Ribosomen in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1:1 vorhanden) enthalten. Im Gegensatz dazu sind andere potentielle zelluläre Zielmoleküle, wie z.B. Gene oder RNA-Transkripte davon, weniger ideal, da sie in geringerer Zahl vorkommen. Ein weiterer unerwarteter Vorteil besteht darin, daß die rRNAs (und die Gene, die sie codieren) offensichtlich keine laterale Übertragung zwischen gleichzeitig vorkommenden Organismen erfahren. Die rRNA- Primärstruktur bietet daher eher ein organismusspezifisches molekulares Ziel als ein genspezifisches Ziel, wie es z.B. bei einem auf einem Plasmid vorhandenen Gen oder Produkt davon, das eine laterale Übertragung zwischen gleichzeitig vorhandenen Organismen erfährt, wahrscheinlich der Fall wäre.
- Die Entdeckung, daß Sonden erzeugt werden können, die die außerordentliche Eigenschaft der erfindungsgemäßen Sonden besitzen, einen Nachweis des Erregers der Lyme-Krankheit, Borrelia burgdorferi, und dessen engen Verwandten durch eine Zuordnung zu diesen Bakterien oder einen Ausschluß davon zu ermöglichen, konnte nicht vorausgesagt werden und war unerwartet.
- Die Prinzipien und Aspekte der vorliegenden Erfindung lassen sich durch Bezugnahme auf die Tabelle besser verstehen, wobei:
- die Fähigkeit der bevorzugten Sonden veranschaulicht, bei repräsentativen Stichproben von aus den Vereinigten Staaten und Europa stammenden Borrelia burgdorferi-Stämmen, die sowohl klinische Isolate als auch Isolate aus Zecken umfassen, in einem Dot-Blot-Hybridisierungstest eine Zuordnung zu der Art oder einen Ausschluß davon zu ermöglichen,
- sowie durch Bezugnahme auf die Figur, die eine schematische Darstellung eines doppelten Testsystems zum Einfangen und Nachweis der Sonden zeigt.
- Der erste bei der Entwicklung der erfindungsgemäßen Sonden unternommene Schritt umfaßte die Identifizierung der Bereiche der 16S-rRNA, die als potentielle Zielorte für Lyme-Spirochäten-spezifische Nucleinsäuresonden dienen könnten. Praktisch ist es schwierig, a priori vorauszusagen, welche nicht zu Borrelia gehörenden Organismen in einer beliebigen Testprobe vorhanden sein könnten. Es ist besonders wichtig, daß Proben, die tatsächlich die Syphilis verursachende Spirochäte Treponema pallidum enthalten, durch die Sondenkombinationen nicht versehentlich Lyme-positiv getestet werden.
- Wegen der großen Anzahl solcher möglicherweise nicht zu den Lyme-Erregern gehörenden Bakterien ist der Nachweis des Ausschlußpotentials für eine bestimmte Sondensequenz nicht nur unvorhersagbar, sondern auch extrem schwierig und mühsam. Damit man nicht wissen muß, welche der nicht zu Borrelia gehörenden Bakterien in allen Testproben vorhanden sein könnten, wurde ein strengeres Kriterium gewählt.
- Dies erforderte die Kenntnis der phylogenetischen Verwandtschaften der Spirochäten untereinander sowie zwischen Spirochäten und anderen Bakteriengruppen.
- Insbesondere wurde eine jedoch bislang nicht bewiesene Arbeitshypothese übernommen, daß sich das Ausschlußkriterium dadurch erfüllen ließe, daß, falls eine bestimmte Zielregion in rRNA von Borrelia burgdorferi identifiziert werden könnte, die sich vom homologen Bereich in der rRNA von typischen, Borrelia burgdorferi evolutionär nahestehenden Verwandten ausreichend unterscheidet, man eine Sonde für eine solche Sequenz verwenden könnte, um mit Hilfe eines Hybridisierungstestes zwischen Borrelia burgdorferi und verwandten Arten zu unterscheiden. Auf der Basis phylogenetischer Beobachtungen wurde dann geschlußfolgert, daß von rRNA-Sequenzen von Organismen, die entfernter verwandt sind, vorausgesagt werden kann, daß sie sich in einem bestimmten Sequenzbereich von den vorstehend erwähnten, Borrelia burgdorferi evolutionär nahestehenden Verwandten unterscheiden, selbst wenn ihre tatsächliche Identität nicht notwendigerweise bekannt ist. A priori kann jedoch nicht vorausgesagt werden, ob solche Bereiche überhaupt existieren und falls doch, wo sich solche Bereiche innerhalb der rRNA befinden.
- Durch die Bestimmung der 16S-rRNA-Sequenz vom Borrelia burgdorferi- Typstamm mit Hilfe von Standard-Laborverfahren und anschließenden Vergleich mit den 16S-rRNA-Sequenzen anderer Spirochäten sowie den Sequenzen anderer im Blut lebender, infektiöser Organismen wird die Suche nach lohnenden Zielsequenzen innerhalb der 16S-rRNA erheblich eingegrenzt. Zum endgültigen Entwurf von Sonden trug auch eine zusätzliche Auswertung von 1 6S-rRNA-Sequenzen von durch Zecken übertragenen Bakteriengattungen bei, wie z.B. Rickettsia und Ehrlichia, die signifikante Erkrankungs- und Sterblichkeitsraten beim Menschen verursachen können.
- Die Sonden können mit Hilfe eines beliebigen geeigneten chemischen oder biologischen Verfahrens synthetisiert werden. Insbesondere können DNA- Sonden chemisch mit Hilfe eines automatisierten Phosphoramid-Verfahrens unter Verwendung von Cyanethyl-Phosphoramiden synthetisiert werden (Beaucage und Carruthers, Tetrahedron Letters 24 (1981), 245). RNA-Sonden können durch Transkription der entsprechenden DNA-Sequenzen hergestellt werden.
- Die Strategie zur Auswahl von Sonden erbrachte eine Anzahl von Sonden, die sich zur Identifizierung von Lyme-Spirochäten in Proben eignen. In der vorliegenden Erfindung sind die folgenden bevorzugten Oligonucleotid-Sonden offenbart: SONDE
- Diese Sonden sind auffolgende Bereiche innerhalb der 16S-rRNA gerichtet, wobei die Positionen der Zielbereiche in Analogie zur 16S-rRNA von Escherichia coli (Brosius et al., PNAS (USA) 75 (1978), 4801-4805) numeriert und die Zielsequenzen wie folgt bezeichnet sind:
- Zielbereich 63-106 der SONDE 1616:
- Zielbereich 178-194 der SONDE 1617:
- Zielbereich 416-450 der SONDE 1618:
- SONDE 1619: Zielbereich 453-481
- SONDE 1620: Zielbereich 829-866
- SONDE 1621: Zielbereich 1122-1156
- SONDE 1622: Zielbereich 1414-1475
- Die Identifizierung der Sonden-Zielbereiche ist einer der wichtigsten Aspekte der vorliegenden Erfindung. Sie ermöglichte die Identifizierung der bevorzugten Sonden. Jeder Sonden-Zielbereich enthält einen Kern von wichtigen Nucleotiden, die zur Erzeugung von Basenfehlpaarungen mit potentiell kreuzreagierenden, nicht zu Borrelia gehörenden Organismen entscheidend sind. Der wiederholte Sonden-Entwurf durch Verkürzen der Enden oder durch eine geringfügige Verschiebung der Sonde auf eine Seite des Sonden-Zielbereichs wird nicht als neuer Entwurf der Sonde angesehen, sondern nur als Äquivalent zu den in der vorliegenden Erfindung bezeichneten Sonden.
- Zwei zusätzliche Oligonucleotide, die in der vorliegenden Erfindung diskutiert werden, umfassen:
- SONDE/PRIMER 1643:
- SONDE/PRIMER 1637:
- Die Sonde/der Primer 1643 ist so entworfen, daß sie/er an das 5'-Ende des zur 16S-rRNA von Borrelia komplementären 16S-rDNA-Genstranges hybridisiert und aus folgender Sequenz besteht:
- ZIELSEQUENZ DER SONDE/DES PRIMERS 1643:
- Die Sonde/der Primer 1637 ist so entworfen, daß sie/er an den gegenläufigen Strang des vorstehend beschriebenen Ziel-Moleküls, d.h. an das 3'-Ende der 16S-rRNA hybridisiert:
- ZIELSEQUENZ DER SONDE/DES PRIMERS 1637:
- Die Oligonucleotide 1643 und 1637 sind zur Verwendung in Testsystemen entworfen, bei denen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion fast das gesamte 16S-rRNA-Gen (rDNA) von Borrelia burgdorferi und verwandten Arten amplifiziert wird. Sie sind in dem gemeinsam von Lane et al. übertragenen, gleichfalls anhängigen US-Patent Nr. 359,158 mit dem Titel "Universal Eubacteria Nucleic Acid Probes and Methods", das der EP-A-0 431 148 entspricht, detaillierter erläutert. In Beispiel 6 werden sie zur spezifischen Amplifikation und den Nachweis von Borellia verwendet.
- Eine Dot-Blot-Analyse umfaßt entsprechend wohlbekannten Verfahren die Immobilisierung einer Nucleinsäure oder einer Nucleinsäure-Population auf einem Filter, wie z.B. einer Nitrocellulose-, Nylon- oder einer anderen daraus abgeleiteten Membran, die besonders für diesen Zweck leicht im Handel erhältlich ist. DNA oder RNA lassen sich auf einem solchen Filter leicht immobilisieren und können anschließend unter Hybridisierungsbedingungen großer Bandbreite (d.h. Stringenzen) mit interessierenden Nucleotidsequenzen oder Sonden untersucht oder auf Hybridisierung hin getestet werden. Unter stringenten Bedingungen zeigen Sonden, deren Nucleotidsequenzen eine größere Komplementarität zur Zielsequenz aufweisen, einen höheren Hybridisierungsgrad als Sonden, die weniger komplementär sind.
- Die Sonden 1616, 1617, 1618, 1619, 1620, 1621 und 1622 wurden in einem Dot-Blot- Versuchsaufbau getestet. 100 ng RNA, die mittels Phenolextraktion und Cäsiumtrifluoracetat-Gradientenzentrifugation aufgereinigt worden war, wurden denaturiert und auf eine Nylonmembran aufgetüpfelt. Durch die Anlagerung eines ³²Phosphor-Restes an das 5'-Ende der Oligonucleotide wurden die Sonden mit Isotopen markiert. Die Hybridisierung der Sonden erfolgte bei den in Tabelle 1 angegebenen Temperaturen in Gegenwart von 1,08 M Natriumchlorid, 60 mM Natriumphosphat und 6 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH-Wert 7,4. Nichthybridisierte Sonden wurden durch Waschen bei einer Salzkonzentration entfernt, die ein Drittel der Salzkonzentration unter Hybridisierungsbedingungen betrug. Die Filter wurden auf Röntgenfilme gelegt. Die Intensität der Hybridisierungssignale wurde nach dreistündigem Auflegen der Filter auf die Filme ausgewertet. In der Tabelle bedeutet "+" ein starkes Hybridisierungssignal, "+-" ein schwaches Hybridisierungssignal und "-", daß kein Hybridisierungssignal vorhanden ist. Die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse der Dot-Blot-Analyse deuten darauf hin, daß die Borrelia burgdorferi-Stämme untereinander heterogen und mit anderen Borrelia-Arten eng verwandt sind.
- Bei vielen praktischen Anwendungen der Sonden setzt man ein Sondenpaar ein, das, wie in Figur 1 gezeigt, in einem aus einer "Einfang"-Sonde und einer "Nachweis"-Sonde bestehenden "Sandwich"-Hybridisierungssystem verwendet wird. Idealerweise ist die Einfang-Sondel 2 ein Polynucleotid mit zwei Funktionen, das durch Anlagerung eines homopolymeren Poly(A)-Anhanges an das 3'-Ende einer Sonde mit hoher Zielspezifität hergestellt wird. Der Anhang hybridisiert seinerseits mit einem komplementären Homopolymen 1 an einer festen Oberfläche¹&sup0;, wie z.B. in Form von Glasperlen, einer Filterscheibe oder magnetischen Teilchen. Eine Hybridisierung der Einfang- Sonde 12 mit ihrem Zielmolekül¹&sup5;, in diesem Fall 16S-rRNA von Lyme- Spirochäten, führt zur Komplexbildung zwischen dem Zielmolekül¹&sup5; und dem festen Träger¹&sup0; Die Nachweis-Sonde¹³, die vorteilhafterweise auch etwas spezifisch ist, ist Teil des bevorzugten Nachweis-Systems, das darauf beruht, daß durch Radioaktivität, Fluoreszenz, Chemolumineszenz, Farbe, usw. (Nachweis- Einheit¹&sup4;) das Vorliegen des vollständigen Hybridisierungskomplexes angezeigt wird.
- Zum spezifischen Nachweis, z.B. des amerikanischen Erregers der Lyme- Krankheit, Borrelia burgdorferi, dient im bevorzugten Testsystem eine Kombination aus Einfang-Sonde 1617 und einer der Nachweis-Sonden 1616, 1618, 1619, 1620, 1621 oder 1622 als das am meisten bevorzugte Sondenpaar. Tests beispielsweise mit der Sonde 1620 als Einfang-Sonde sind zwar bei fast allen Borrelia burgdorferi-Stämmen positiv, unter bestimmten Hybridisierungsbedingungen werden jedoch auch zwei andere durch amerikanische Zecken übertragene Erreger von Tierkrankheiten, Borrelia hermsii und Borrelia turicatae, nachgewiesen.
- Blut wird vorzugsweise so behandelt, daß man den gesamten Gehalt an Nucleinsäuren erhält, wie z. B. mittels Ultraschallbehandlung, Verwirbelung mit Glasperlen, einer durch ein Detergens bewirkten Lyse unter Verwendung eines Mittels wie SDS oder einer chemischen Behandlung. In einer anderen Ausführungsform können die Bakterienzellen beispielsweise mit Hilfe des Isolator-Systems von DuPont und anschließender Zellyse teilweise aufgereinigt werden. Die Sonde 1620, an die ein aus Adenosinresten bestehender Polymerbereich angelagert ist, und die Sonde 1621, die eine ³²Phosphor- Markierung umfaßt, werden dann idealerweise mit der Probe in einem chaotropen Puffer, wie Guanidiniumisothiocyanat, vereinigt. Vorteilhafterweise werden auch mit Oligo-Thymidin derivatisierte Magnetpartikel zugegeben. Es bildet sich ein Hybridisierungskomplex, der eine Magnetperle, die Sonde 1620, die 16S-Ziel-rRNA von Borrelia burgdorferi oder einer seiner nahestehenden Verwandten und die Sonde 1621 umfaßt. Ein außerhalb des Reaktionsröhrchens nahe dem Boden vorhandener Magnet führt zur Adhäsion des das magnetische Teilchen enthaltenden Hybridisierungskomplexes an der Innenseite des Röhrchens, wodurch die Entfernung nicht umgesetzter Bestandteile, wie z.B. Probenmatrize, nichtgebundene Sonde, usw., ermöglicht wird. Zur signifikanten Verminderung unspezifischer Hintergrundsignale wird der Perlen-Sonden- Zielmolekül-Komplex vorteilhafterweise erneut in Lösung gebracht und denaturiert (ausführlicher im EP-A-0 265 244 entsprechenden Collins-US- Patent Nr. 922,155 beschrieben). Schließlich umfaßt der Nachweis in diesem Beispiel das Auftüpfeln der Perlen auf eine Membran und eine Analyse mittels Autoradiographie.
- Man arbeitet idealerweise nach den in Beispiel 3 dargelegten Verfahren, wobei man allerdings anstelle der Blutprobe eine Urinprobe, Hautprobe, Synovialflüssigkeit vom Menschen, eine Biopsieprobe bzw. andere Gewebe- oder Flüssigkeitsproben verwendet. Bei andersartigen Proben müssen zur Anpassung und weiteren Behandlung offensichtliche und geringfügige Änderungen vorgenommen werden, um dabei in angemessener und geeigneter Weise die Ziel-Nucleinsäure zu präsentieren.
- Man arbeitet idealerweise nach den in Beispiel 3 dargelegten Verfahren, wobei allerdings die getestete Probe eine Probe von Hund, Katze, Rind, Pferd oder einem anderen Tier ist. Bei einer solche Probe kann es sich um den in den Beispielen 3 oder 4 beschriebenen Probentyp handeln.
- Die Behandlung der Proben ist so geplant, daß DNA erhalten wird, wie z.B. mit Hilfe der in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren. Die Sonde/der Primer 1643 und die Sonde/der Primer 1637 werden zusammen mit der klinischen Probe in einer Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. Das erhaltene Material kann dann vorteilhafterweise in einer "Sandwich"-Hybridisierung (Beispiel 2) mit einer der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Sonden getestet werden. Idealerweise kann die Polymerase-Kettenreaktion selbst hochspezifisch gemacht werden, indem die Sonde 1643 beispielsweise zusammen mit Sonde 1620 verwendet wird (vgl. Figur 1). Der Nachweis kann anschließend durch Verwendung einer der Sonden 1616, 1617, 1618 oder 1619 erfolgen oder durch Einbau von Nucleotidtriphosphaten in etwa 850 Basenpaar lange Polynucleotide bestimmt werden.
- Zur Ermittlung des Infektionspotentials von Zecken in einem bestimmten Gebiet, von dem bekannt ist, daß es endemisch ist, wurden Zecken, die durch Etherbehandlung oder Einfrieren unbeweglich gemacht worden waren, auf Nitrocellulose oder einer Nylonmembran zerdrückt. Auf dem gleichen Filter konnten gleichzeitig viele auf diese Weise hergestellte Zeckenproben weiterbehandelt werden. Jede einzelne Zeckenprobe sollte dabei etwa 1 cm von einer anderen Probe entfernt sein. Wie von den Herstellern empfohlen, sollten die Filter danach in einer basischen Lösung denaturiert und anschließend neutralisiert werden. Mit den Zeckenproben wurde die Sonde 1622 oder in einer anderen Ausführungsform eine der anderen in der vorliegenden Erfindung offenbarten Sonden hybridisiert, die mit ³²-Phosphor mit hoher spezifischer Aktivität markiert worden war. Nach Entfernung der nichthybridisierten Sonde durch Waschen wurden die Filter 1 bis 10 Tage auf einen Röntgenfilm gelegt. Dunkle Flecken auf dem Film zeigen Zecken, die Lyme-Spirochäten enthalten.
- Ein Hybridisierungstest in Flüssigkeit ist vorteilhaft insofern, als er größere Empfindlichkeit aufweist und man mehr als einen Test an der gleichen Probe durchführen kann. Deshalb ist er gegenüber den in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren bevorzugt. In diesem Beispiel wurden einzelne Zecken, z.B. Zecken, die von menschlicher Haut entfernt worden waren, in einem chaotropen Puffer homogenisiert. Eine Fraktion dieses Homogenats wurde in einem Hybridisierungstest analysiert, der zu dem in Beispiel 2 beschriebenen "Sandwich"-Verfahren analog war.
- Eine Anzahl von Zecken, die an einer Stelle gesammelt worden waren, wurde vereinigt, in einem chaotropen Puffer homogenisiert und wie in den Beispielen 7 oder 8 beschrieben getestet. Ein positives Signal zeigt, daß in diesem Gebiet Spirochäten vorkommen, erlaubt aber keine quantitative Beurteilung der Häufigkeit des Vorkommens.
- Die Haut ist eine der Stellen, an denen man Spirochäten insbesondere im ersten Stadium der Lyme-Krankheit optisch gut darstellen kann. Eine Sonde, wie z.B. die Sonde 1622, wurde mit Rhodamin oder Huorescein markiert. Eine auf einem Objektträger befindliche Hautbiopsie-Probe wurde mit der fluoreszierenden Sonde unter Bedingungen hybridisiert, die eine Hybridisierung fördern. Dann wurde die nichthybridisierte Sonde durch Waschen entfernt. Durch Beobachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop wurde die Fluoreszenz der typisch spiralförmigen Bakterien sichtbar. TABELLE Test von Lyme-spezifischen Sonden durch Hybridisierung mit rRNA oder donierter rDNA (HYBRIDISIERUNG: "+" = stark; "+-" = schwach [alles über Hintergrundniveau]; "-" = keine Hybridisierung) SONDEN Sonden-Nummer: Ungefähre Position auf 16S-rRNA Oligomergröße: Hybridisierungstemperatur: ATCC-Nr. oder ARTNAME (RNAs) STAMM Typ DEUTSCH TSCHECHISCH I. pacificus Maus veerybird Mensch CRTdogontick Charlietick Zecke Escherichia coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis A Brucella abortus Francisella tularensis Bacillus subtilis Clostridium perfringens Peptostreptococcus productus Staphylococcus aureus Bifidobacterium dentium Borellia burgdorferi (B31) Borellia hermsii Borellia turicatae Leptoonema biflexa illini Leptospira interrogans pomona Leptospira biflexa Spirochaeta aurantia Treponema bryantii Treponema denticola Treponema hyodysenteriae Treponema innocens Treponema pectinovorum Treponema succinifaciens Bacteroides fragilis RNA aus nonormalem Stuhl Weizenkeim-RNA RNA einer menschlichen Zellinie Candida albicans Cryptococcus neoformans Im Phagen Lambda donierte DNAs: clonierte rDNA Treponema pallidum clonierte rDNA Rickettsia prowazekii clonierte rDNA Ehrlichia risticii TABELLE (FORTSETZUNG) Test von Lyme-spezifischen Sonden durch Hybridisierung mit rRNA oder donierter rDNA (HYBRIDISIERUNG: "+" = stark; "+-" = schwach [alles über Hintergrundniveau]; "-" = keine Hybridisierung) SONDEN Sonden-Nummer: Ungefähre Position auf 16S-rRNA Oligomergröße: Hybridisierungstemperatur: ATCC-Nr. oder ARTNAME (RNAs) STAMM Typ DEUTSCH TSCHECHISCH I. pacificus Maus veerybird Mensch CRTdogontick Charlietick Zecke Escherichia coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis A Brucella abortus Francisella tularensis Bacillus subtilis Clostridium perfringens Peptostreptococcus productus Staphylococcus aureus Bifidobacterium dentium Borellia burgdorferi (B31) Borellia hermsii Borellia turicatae Leptoonema biflexa illini Leptospira interrogans pomona Leptospira biflexa Spirochaeta aurantia Treponema bryantii Treponema denticola Treponema hyodysenteriae Treponema innocens Treponema pectinovorum Treponema succinifaciens Bacteroides fragilis RNA aus nonormalem Stuhl Weizenkeim-RNA RNA einer menschlichen Zellinie Candida albicans Cryptococcus neoformans Im Phagen Lambda donierte DNAs: clonierte rDNA Treponema pallidum clonierte rDNA Rickettsia prowazekii clonierte rDNA Ehrlichia risticii
- SEQ. ID-Nr.: 1
- SEQUENZLÄNGE: 29 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA oder RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: In der Beschreibung als Sonde 1616 bezeichnet
- EIGENSCHAFTEN: Sonde zum selektiven Nachweis von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- GCCACTGAAT GTATTGCTAC ATCCCGTTG
- SEQ, ID-Nr.: 2
- SEQUENZLÄNGE: 29 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA oder RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: In der Beschreibung als Sonde 1617 bezeichnet
- EIGENSCHAFTEN: Sonde zum selektiven Nachweis von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- CATCAATTAA CAAATTAACT GACCTTATT
- SEQ. ID-Nr.: 3
- SEQUENZLÄNGE: 35 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRANGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA oder RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: In der Beschreibung als Sonde 1618 bezeichnet
- EIGENSCHAFTEN: Sonde zum selektiven Nachweis von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- CCTCATTTAT AAAAGAATTT TACAATCTTT CGACC
- SEQ. ID-Nr.: 4
- SEQUENZLÄNGE. 29 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRANGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA oder RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: In der Beschreibung als Sonde 1619 bezeichnet
- EIGENSCHAFTEN: Sonde zum selektiven Nachweis von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- CATCACTTTG TCATTTCCTA CAAAGCTTA
- SEQ, ID-Nr.: 5
- SEQUENZLÄNGE: 32 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRANGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA oder RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: In der Beschreibung als Sonde 1620 bezeichnet
- EIGENSCHAFTEN: Sonde zum selektiven Nachweis von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- GTTAGCTTCG GTACTAACTT TTAGTTAACA CC
- SEQ, ID-Nr.: 6
- SEQUENZLÄNGE: 36 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA oder RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: In der Beschreibung als Sonde 1621 bezeichnet
- EIGENSCHAFTEN: Sonde zum selektiven Nachweis von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- TTATCTGAG TCCCCACCAT TACATGCTGG TAACAG
- SEQ, ID-Nr.: 7
- SEQUENZLÄNGE: 64 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA oder RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: In der Beschreibung als Sonde 1622 bezeichnet
- EIGENSCHAFTEN: Sonde zum selektiven Nachweis von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- CATACCTTAA ATACCTTCCT CCCTTACGGG TTAGAATAAT AGCTTCGGGT ATCCTCAACT CGGG
- SEQ, ID-Nr.: 8
- SEQUENZLÄNGE: 30 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: Zielsequenz für Sonde 1616
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: Nucleotid-Bereich 63-106 der 16S-rRNA von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- CAAACGGGAU GUAGCAAUAC AUUCAGUGGC
- SEQ, ID-Nr.: 9
- SEQUENZLÄNGE: 29 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRANGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: Zielsequenz für Sonde 1617
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: Nucleotid-Bereich 178-194 der 16S-rRNA von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- AAUAAGGUCA GUUAAUUUGU UAAUUGAUG
- SEQ ID-Nr.: 10
- SEQUENZLÄNGE: 35 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: Zielsequenz für Sonde 1618
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: Nucleotid-Bereich 416-450 der 16S-rRNA von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- GGUCGAAAGA UUGUAAAAUU CUUUUAUAAA UGAGG
- SEQ. ID-Nr.: 11
- SEQUENZLÄNGE: 29 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRANGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: Zielsequenz für Sonde 1619
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: Nucleotid-Bereich 453-481 der 16S-rRNA von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- UAAGCUUUGU AGGAAAUGAC AAAGUGUAG
- SEQ. ID-Nr.: 12
- SEQUENZLÄNGE: 32 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: Zielsequenz für Sonde 1620
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: Nucleotid-Bereich 829-866 der 16S-rRNA von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- GGUGUUAACU AAAAGUUAGU ACCGAAGCUA AC
- SEQ. ID-Nr.: 13
- SEQUENZLÄNGE: 36 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: Zielsequenz für Sonde 1621
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: Nucleotid-Bereich 1122-1156 der 16S-rRNA von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- CUGUUACCAG CAUGUAAUGG UGGGGACUCA GAUAAG
- SEQ. ID-Nr.: 14
- SEQUENZLÄNGE: 61 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRANGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: Zielsequenz für Sonde 1622
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: Nucleotid-Bereich 1414-1475 der 16S-rRNA von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- CCCGAGUUGA GGAUACCCGA AGCUAUUAUU CUAACCCGUA
- AGGGAGGAAG GUAUUUAAGG U
- SEQ. ID-Nr.: 15
- SEQUENZLÄNGE: 37 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRANGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA oder RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: In der Beschreibung als Sonde/Primer 1643 charakterisiert
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: Sonde/Primer zum Nachweis von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- CCGAATTCGT CGACAACAGA GTTTGATCCT GGCTTAG
- SEQ, ID-Nr.: 16
- SEQUENZLÄNGE: 33 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA oder RNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: In der Beschreibung als Sonde/Primer 1637 charakterisiert
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: Sonde/Primer zum Nachweis von Borrelia burgdorferi
- SEQUENZ:
- CCCGGGATCC AAGCTTAAGG AGGTGATCCA GCC
- SEQ. ID-Nr.: 17
- SEQUENZLÄNGE: 20 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: Zielsequenz für die Sonde/den Primer 1643
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: 16S-rDNA-Strang, der zum 5'-Ende der 16S-rRNA von Borrelia burgdorferi komplementär ist
- SEQUENZ:
- CTAAGCCAGG ATCAAACTCT
- SEQ.ID-Nr.: 18
- SEQUENZLÄNGE: 17 Basen
- SEQUENZTYP: Nucleotidsequenz
- ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
- TOPOLOGIE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Synthetisch oder biologisch erzeugte DNA
- HYPOTHETISCH: Nein
- SENSE- ODER ANTI-SENSE-STRANG: Sense-Strang
- KENNZEICHEN: Zielsequenz für die Sonde/den Primer 1637
- URSPRUNGSORGANISMUS: Borrelia burgdorferi
- EIGENSCHAFTEN: 16S-rDNA-Strang, der zum 3'-Ende der 16S-rRNA von Borrelia burgdorferi komplementär ist
- SEQUENZ:
- GGCTGGATCA CCTCCTT
Claims (7)
1. Nucleinsäurefragment, das unter vorherbestimmten
Stringenzbedingungen mit rRNA oder rDNA-Genen (rDNA) von
Borrelia burgdorferi hybridisieren kann, wobei das
Fragment zu mindestens 90 % einer Sequenz komplementär ist,
umfassend 10 beliebige aufeinanderfolgende Nucleotide
innerhalb einer Sonde mit einer der folgenden
Nucleotidsequenzen:
Sonde
2. Nucleinsäurefragment, das unter vorherbestimmten
Stringenzbedingungen mit rRNA oder rDNA-Genen (rDNA) von
Borrelia burgdorferi hybridisieren kann, wobei das
Fragment zu mindestens 90 % einer Sequenz homolog ist,
umfassend 10 beliebige aufeinanderfolgende Nualeotide
innerhalb der Sonden 1616, 1617, 1618, 1619, 1620, 1621
oder 1622, wobei die Sonden wie in Anspruch 1 definiert
sind.
3. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2, umfassend
die Sonden 1616, 1617, 1618, 1619, 1620, 1621 oder 1622
oder eine ihrer komplementären Sequenzen.
4. Sondensatz, umfassend mindestens zwei
Nucleinsäurefragmente nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
5. Sondensatz, umfassend eine erste Nucleinsäure, die ein
Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3
ist, und eine zweite Nucleinsäure, die Sonde/Primer 1643
oder Sonde/Primer 1637 mit den folgenden
Nucleotidsequenzen ist
Sonde/Primer
6. Verfahren zum Nachweis des ätiologischen Wirkstoffes der
Lyme-Krankheit oder Borreliose in einer Probe, das die
Schritte umfaßt:
(a) Inkontaktbringen der Probe mit mindestens einem
Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis
3 unter Bedingungen, die die Hybridisierung des
Fragments mit rRNA oder rDNA von einer die Lyme-
Krankheit verursachenden Borrelia-Art erlauben,
sofern diese in der Probe anwesend ist, wobei Hybrid-
Nucleinsäurekomplexe gebildet werden; und
(b) Nachweis der Hybrid-Nucleinsäurekomplexe als
Anzeichen für die Gegenwart einer Borrelia-Art.
7. Verfahren zum Nachweis des ätiologischen Wirkstoffes der
Lyme-Krankheit oder Borreliose in einer Probe, das die
Schritte umfaßt:
(a)
Inkontaktbringen der Probe mit einem
Nucleinsäurefragment, das die Sonde/den Primer 1637 oder die
Sonde/den Primer 1643 umfaßt, wobei die Sonde/die
Primer wie in Anspruch 5 definiert sind, unter
Bedingungen, die die Hybridisierung des Fragments mit
rRNA oder rDNA von einer die Lyme-Krankheit
verursachenden Borrelia-Art erlauben, sofern diese in der
Probe anwesend ist, wobei
Hybrid-Nucleinsäurekomplexe gebildet werden;
(b) Nachweis der Hybrid-Nucleinsäurekomplexe durch
zusätzliches Inkontaktbringen der Probe mit einem die
Sonden 1616, 1617, 1618, 1619, 1620, 1621 oder 1622
oder eine ihrer komplementären Sequenzen umfassenden
zweiten Nucleinsäurefragment; und
(c) Amplifikation der 16S rRNA-Gensequenz der Borrelia-
Art, sofern diese anwesend ist, durch die
Polymerasekettenreaktion.
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