JPH03216200A - ライム病スピロヘータ検出のための核酸プローブ - Google Patents
ライム病スピロヘータ検出のための核酸プローブInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はヒトおよび補乳類の疾患を起こすことの近禄種
に属する細菌の検出に関する。特に，ライム病を起こす
細菌を特異的に検出するための核酸グローブおよび組成
物がその使用法と共に提供される。
に属する細菌の検出に関する。特に，ライム病を起こす
細菌を特異的に検出するための核酸グローブおよび組成
物がその使用法と共に提供される。
従来の技術
ライムボレリア病，ライム病、ライム関節炎、バンワー
ス症候群または慢性遊走性紅斑（ＥＣＭ）はイクソデス
（ Ｉｘｏｄｅｓ ）属のダニの咬傷により伝染される
動物から人間へのスピロヘータ性感染の同じものを意味
している呼称である。本疾患は欧州においては、かなυ
前に知られていたが、米国においては１９７５年にコネ
チカットにおいて伝染性関節炎が起こる１では発見され
ていない。
ス症候群または慢性遊走性紅斑（ＥＣＭ）はイクソデス
（ Ｉｘｏｄｅｓ ）属のダニの咬傷により伝染される
動物から人間へのスピロヘータ性感染の同じものを意味
している呼称である。本疾患は欧州においては、かなυ
前に知られていたが、米国においては１９７５年にコネ
チカットにおいて伝染性関節炎が起こる１では発見され
ていない。
１９８２年に推定に基づく病因学的因子がダニから単離
された（ Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２ １ ６ｍ１３１７−１３１９．１９８２）。１９８
４年にスピロヘータがボレリア（ Ｂｏｒｒｅｌｉａ
） 属の一員であることが示され、正式にボレリア プ
ルグドルフエリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆ
ｅｒｉ ）と命名された（Ｊｏｈｎｓｏｎ ら＋ Ｉｎ
ｔ．Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３４：４
９１４９７＝ １９８４）。それ自体はポレびらせん形
細菌のこの節足動物に伴われる属の他の種の進化論的近
線種である。
された（ Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２ １ ６ｍ１３１７−１３１９．１９８２）。１９８
４年にスピロヘータがボレリア（ Ｂｏｒｒｅｌｉａ
） 属の一員であることが示され、正式にボレリア プ
ルグドルフエリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆ
ｅｒｉ ）と命名された（Ｊｏｈｎｓｏｎ ら＋ Ｉｎ
ｔ．Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３４：４
９１４９７＝ １９８４）。それ自体はポレびらせん形
細菌のこの節足動物に伴われる属の他の種の進化論的近
線種である。
ライム病は種々の段階での徴候の多様性により特徴付け
られる重度の慢性ボレリア感染である。
られる重度の慢性ボレリア感染である。
最初のダニ咬傷に続く約３から１４日後，徴候には発熱
，インフルエンザ様病気，およびＥＣＭ皮膚発疹の出現
が含１れるであろう。第２期では（最初の咬傷から週か
ら月単位後に起こる），さらなる皮膚の症状進行，関節
炎，神経系の病気，および心臓の病状などが含まれる。
，インフルエンザ様病気，およびＥＣＭ皮膚発疹の出現
が含１れるであろう。第２期では（最初の咬傷から週か
ら月単位後に起こる），さらなる皮膚の症状進行，関節
炎，神経系の病気，および心臓の病状などが含まれる。
第５期はよ９重度の関節炎および神経系の病気により特
徴付けられる。
徴付けられる。
ライム病の診断は一般に分別的であり，かつ宿主抗体応
答に依存している。診断法としてのこれらの細菌の単離
および培養は技術的または経済的に容易だとは考えられ
ない。分別的診断は年の時節（ダニの季節），地方特有
の領域中の住所、ダニ咬傷の歴史の再収集＋ ＥＣＭ発
疹にたよっている。この診断スキームは各々，疾病の慢
性性、旅行者の感染．ダニの信じられないほどの小ささ
、すべての患者がＥ Ｃ Ｍ発疹を経験するわけではな
いことなどに悩まされる。抗体応答に基づく診断は抗−
Ｂ．プルグドルフエリ（ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ）
抗体の産生に向かっての感染個体の匍清転換を必要とす
る。抗体法には多くの診断的問題が作用するが．ライム
診断は以下の理由によシ失敗している： −少数のスピロヘータおよび抗原的に穏やかな外膜の組
合せにより弱い宿主の免疫応答を得る。
答に依存している。診断法としてのこれらの細菌の単離
および培養は技術的または経済的に容易だとは考えられ
ない。分別的診断は年の時節（ダニの季節），地方特有
の領域中の住所、ダニ咬傷の歴史の再収集＋ ＥＣＭ発
疹にたよっている。この診断スキームは各々，疾病の慢
性性、旅行者の感染．ダニの信じられないほどの小ささ
、すべての患者がＥ Ｃ Ｍ発疹を経験するわけではな
いことなどに悩まされる。抗体応答に基づく診断は抗−
Ｂ．プルグドルフエリ（ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ）
抗体の産生に向かっての感染個体の匍清転換を必要とす
る。抗体法には多くの診断的問題が作用するが．ライム
診断は以下の理由によシ失敗している： −少数のスピロヘータおよび抗原的に穏やかな外膜の組
合せにより弱い宿主の免疫応答を得る。
−穐清転換（ ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ）には
感染後いくらかの時間がかかる。スピロヘータ柚が高い
間（最初のダニ咬傷から一週間以内）、患者は発熱およ
びＥ Ｃ Ｍ ｋ示しているが抗体を証明するのは失敗
するであろう。
感染後いくらかの時間がかかる。スピロヘータ柚が高い
間（最初のダニ咬傷から一週間以内）、患者は発熱およ
びＥ Ｃ Ｍ ｋ示しているが抗体を証明するのは失敗
するであろう。
抗体応答は一時的である。第２期または第６期の間（循
環する細菌が最も少ない時），抗体力価は非常に低いで
あろう。
環する細菌が最も少ない時），抗体力価は非常に低いで
あろう。
細胞媒介免疫性は循環抗体信号を減じるであろう。即ち
、古典的宿主ＩｇＧおよびＩｇＭ応答は遮蔽された抗原
のため減少しているがまたは存在しない。
、古典的宿主ＩｇＧおよびＩｇＭ応答は遮蔽された抗原
のため減少しているがまたは存在しない。
試料を標的抗原としてたよっている。この方法の主たる
問題点は，他の細菌の免疫性試験の免疫応答と交差反応
性があることである。
問題点は，他の細菌の免疫性試験の免疫応答と交差反応
性があることである。
との交差反応である。
本発明が解決しようとする問題点
付随する問題を避けるため非免疫学に基づいた検定法全
提供し、ライム病および関連する病的状Ｍｋ起こすこと
ができるダニー媒介性スビロヘタに特異的な核酸グロー
ブを提供するのが本発明の１つの様相である。
提供し、ライム病および関連する病的状Ｍｋ起こすこと
ができるダニー媒介性スビロヘタに特異的な核酸グロー
ブを提供するのが本発明の１つの様相である。
カルチャー コレク７ヨン株番号３５２１０）の株型に
特に特異的なプロープおよび検定法を提供するのが本発
明の他の様相である。
特に特異的なプロープおよび検定法を提供するのが本発
明の他の様相である。
通常の仮定条件下グローブへ近づきやすくすることがで
きる標的領域ヘハイブリダイズできる核酸ブローブｋ提
供するのが本発明のさらに別の様相である。
きる標的領域ヘハイブリダイズできる核酸ブローブｋ提
供するのが本発明のさらに別の様相である。
Ｋｏｈｎｅ ら（バイオフィジカル ジャーナル８：
１１０４−１１１ＥＬ １９６８）はｒ Ｒ Ｎ Ａ
配列へのグローブを調製するための１つの方法を議論た
，実際，スピロヘータ細菌を検出するだめの他のグロー
ブを作製するのに必要な教示は提供されていない。
１１０４−１１１ＥＬ １９６８）はｒ Ｒ Ｎ Ａ
配列へのグローブを調製するための１つの方法を議論た
，実際，スピロヘータ細菌を検出するだめの他のグロー
ブを作製するのに必要な教示は提供されていない。
ＰａｃｅおよびＣａｍｐｂｅｌｌ （ジャーナル オブ
バクテリオロジ−ＩＣ１７：５４３−５４７．１９７１
）は異なった細菌種からのリポソームリボ核酸の相同性
およびそのような相同性のレベルを定量化するだめのハ
イブリダイゼーション法ヲ議論している。同様にＳｏｇ
ｉｎ ， ＳｏｇｉｎおよびＷＯｅＳｅ（シャーナル
オブ モレキュラー エボリューション１：１７３−１
８４．１９７２）は系統発生論的関係の評価のため、異
なったリポソームＲＮＡ分子の一次構造を使用する理論
的および実際的面について議論している。Ｆｏｘ ＋Ｐ
ｅｃｈｍａｎおよびＷｏｅｓｅ （インターナショナル
ジャーナル オブ システマチック バクテリオロジ−
２７：４４−５７．１９７７）は原核動物分類学の方
法としての１６８リポソームＲＮＡの比較目録作りにつ
いて議論している。しかしながら、これらの文献はライ
ムスピロヘータに関するＫｏ ｈｎｅ の教示の欠点
を解消するのに失敗しており，特に，ライム病またはそ
の病因学的作因で検定に有用なライムスピロヘータ特異
的プローフを提供していない。リポソームは生命の主た
る構造および触媒要素である細胞タンパク質へ遺伝的情
報を翻訳する唯一の既知の方法として働いているので、
すべての生物体に対して深い重要性をもっている。この
重要性の明らかな現われはすべての細胞がリポソームを
持っていることが観察されることである。
バクテリオロジ−ＩＣ１７：５４３−５４７．１９７１
）は異なった細菌種からのリポソームリボ核酸の相同性
およびそのような相同性のレベルを定量化するだめのハ
イブリダイゼーション法ヲ議論している。同様にＳｏｇ
ｉｎ ， ＳｏｇｉｎおよびＷＯｅＳｅ（シャーナル
オブ モレキュラー エボリューション１：１７３−１
８４．１９７２）は系統発生論的関係の評価のため、異
なったリポソームＲＮＡ分子の一次構造を使用する理論
的および実際的面について議論している。Ｆｏｘ ＋Ｐ
ｅｃｈｍａｎおよびＷｏｅｓｅ （インターナショナル
ジャーナル オブ システマチック バクテリオロジ−
２７：４４−５７．１９７７）は原核動物分類学の方
法としての１６８リポソームＲＮＡの比較目録作りにつ
いて議論している。しかしながら、これらの文献はライ
ムスピロヘータに関するＫｏ ｈｎｅ の教示の欠点
を解消するのに失敗しており，特に，ライム病またはそ
の病因学的作因で検定に有用なライムスピロヘータ特異
的プローフを提供していない。リポソームは生命の主た
る構造および触媒要素である細胞タンパク質へ遺伝的情
報を翻訳する唯一の既知の方法として働いているので、
すべての生物体に対して深い重要性をもっている。この
重要性の明らかな現われはすべての細胞がリポソームを
持っていることが観察されることである。
リボノームは６つの異なったＲＮＡ分子（少くとも大腸
菌においてはつを含んでおり，それは５８ ．１ ６８
および２３８ ｒＲＮＡと称される。
菌においてはつを含んでおり，それは５８ ．１ ６８
および２３８ ｒＲＮＡと称される。
これらの名前は歴史的にはそれらの沈降速度により決定
されたＲＮＡ分子の大きさに関連している。
されたＲＮＡ分子の大きさに関連している。
しかしながら，実際上はリポソームＲＮＡ分子の大きさ
は生物体間で本質的に変化している。それでもなお、細
菌中の対応ＲＮＡ分子に対しての遺伝的名前として５Ｓ
．１６Ｓおよび２３８ ｒＲＮＡが一般に使用されてお
り、この慣習はここにおいても引きつがれるであろう。
は生物体間で本質的に変化している。それでもなお、細
菌中の対応ＲＮＡ分子に対しての遺伝的名前として５Ｓ
．１６Ｓおよび２３８ ｒＲＮＡが一般に使用されてお
り、この慣習はここにおいても引きつがれるであろう。
ここで使用されている別の慣習では大腸菌１６８ ｒ
ＲＮＡ配列の配列位置番号（Ｂｒｏｓｉｕｓ ら＋ Ｐ
ＮＡＳ（ＬＴＳＡ）７５：４８０１−４８０５．１９７
８）と同じ番号が選定されている。
ＲＮＡ配列の配列位置番号（Ｂｒｏｓｉｕｓ ら＋ Ｐ
ＮＡＳ（ＬＴＳＡ）７５：４８０１−４８０５．１９７
８）と同じ番号が選定されている。
ここで使用されるグローブとは合成的１たは生物学的に
作製された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で，計画的にぼ
たは選択により，前もって決定されている限定されたス
トリンジエンシ一下，標的核酸配列へ特異的に（郎ち、
優先的に、次節を参照されたい）それ？・イブリダイズ
させる特異的ヌクレオチド配列を含んでいる。そのノ・
イブリダイゼーション性に加え，グローブはまた特足の
検定条件下それらの適性な１たは至適なｂｔ４Ｑ発揮に
関係するある棟の構成物を含んでいてもよい。例えば，
そのヌクレアーゼ分解への抵抗性を改良するため（例え
ば末端キャップ形成），検出リガンドを運搬するため（
例えばフルオレセイン，６２Ｐ，ビオチンその他）また
は固形支持体上へのその捕捉を容易にするため（例えば
ポリデオキ／デノンン゛尾′゛−一一図２参照〕プロー
プが改変されていてもよい。そのような改変はハイブリ
ダイゼーソヨ／検定において標的および非標的生物体間
を有効に識別するその能力でるる基本的プロブ機能の仕
上げである。
作製された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で，計画的にぼ
たは選択により，前もって決定されている限定されたス
トリンジエンシ一下，標的核酸配列へ特異的に（郎ち、
優先的に、次節を参照されたい）それ？・イブリダイズ
させる特異的ヌクレオチド配列を含んでいる。そのノ・
イブリダイゼーション性に加え，グローブはまた特足の
検定条件下それらの適性な１たは至適なｂｔ４Ｑ発揮に
関係するある棟の構成物を含んでいてもよい。例えば，
そのヌクレアーゼ分解への抵抗性を改良するため（例え
ば末端キャップ形成），検出リガンドを運搬するため（
例えばフルオレセイン，６２Ｐ，ビオチンその他）また
は固形支持体上へのその捕捉を容易にするため（例えば
ポリデオキ／デノンン゛尾′゛−一一図２参照〕プロー
プが改変されていてもよい。そのような改変はハイブリ
ダイゼーソヨ／検定において標的および非標的生物体間
を有効に識別するその能力でるる基本的プロブ機能の仕
上げである。
ハイブリダイゼーンヨンとは伝統的には前もって決定さ
れている条件下，２つの部分的１たは完全に相補的な核
酸鎖が逆平行様式（１つは５′から６′へ，他のものは
６′から５′へ配回して）で一緒になり，特異的および
安定な水累結合で二本鎖核酸を形成する過程と理解され
ており，どの核酸塩基が互いに対になるかに関する明白
な法則に従っている。グローブの高い特異性は、その個
々の確率の倍数生成物により指令されるごとく，無作為
に存在している特別の配列の低い統計的確率に頼ってい
る。これらの概念は当業者にはよく理解されている。
れている条件下，２つの部分的１たは完全に相補的な核
酸鎖が逆平行様式（１つは５′から６′へ，他のものは
６′から５′へ配回して）で一緒になり，特異的および
安定な水累結合で二本鎖核酸を形成する過程と理解され
ており，どの核酸塩基が互いに対になるかに関する明白
な法則に従っている。グローブの高い特異性は、その個
々の確率の倍数生成物により指令されるごとく，無作為
に存在している特別の配列の低い統計的確率に頼ってい
る。これらの概念は当業者にはよく理解されている。
ハイブリダイゼーション条件の特定の組のストリンジェ
ン７−は２つの核酸間の誤対合水準および幾何構造によ
るのみならず．グローブ／標的二連体の塩基組成によっ
ても限定される。
ン７−は２つの核酸間の誤対合水準および幾何構造によ
るのみならず．グローブ／標的二連体の塩基組成によっ
ても限定される。
ストリンジェンシ−は，ノ１イブリダイセーション溶液
中に存在するイオン性化学種の濃度および型、存在する
変性剤の型および濃度、および／壕たぱハイブリダイゼ
ーションの温度のごとき反応バラメーターによっても支
配されるであろう。
中に存在するイオン性化学種の濃度および型、存在する
変性剤の型および濃度、および／壕たぱハイブリダイゼ
ーションの温度のごとき反応バラメーターによっても支
配されるであろう。
般に，ノ・イブリダイゼーション条件がよりストリンジ
ェントになると，もし安定なノ・イブリノドが形成され
るならより長いグローブが好適である。
ェントになると，もし安定なノ・イブリノドが形成され
るならより長いグローブが好適である。
当然の結果として，ノ・イブリダイゼーションが行われ
る条件のストリンジエイ７−は（例えば、果施される検
定の型に基づいて），用いられる好適なグローブのある
種の特性を指図するであろう。
る条件のストリンジエイ７−は（例えば、果施される検
定の型に基づいて），用いられる好適なグローブのある
種の特性を指図するであろう。
そのような関係は当業者にはよく理解されており，容易
に処理できる。
に処理できる。
一般的事柄としては，グローブに依存して、約０．９モ
ルの塩溶液中約６５゜Ｃ−６５゜Ｃのス｝ ＩＪンジェ
ント条件と理解されている。
ルの塩溶液中約６５゜Ｃ−６５゜Ｃのス｝ ＩＪンジェ
ント条件と理解されている。
問題を解決するための手段
発明の要約
不発明の種々の原理および態様に従うと、特足の条件下
、ボレリア（ ＢｏｒｒｅＬｉａ）スピロヘータのリポ
ソームＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）’？たはｒ Ｒ Ｎ Ａ
遺伝子（ｒＤＮＡ） にハイブリダイズするが，同一
条件下、試験試料中に存在するかもしれない他の細菌の
ｒＲＮＡまたぱｒＤＮＡにはハイプリダイズしないデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ Ｒ，ＮＡ
）からなる核歌グローブおよびグローブセットが提供さ
れる。それ故，本発明のプロプは，ライム病またはヒト
患者または獣医学検体からの穐液尿，脳脊髄液、皮膚バ
イオプシ、唾液，関節滑液１たは他の組織または液体試
料などの臨床試料中のライム病病因学的因子の特異的検
出に価値のある核酸ハイプリダイゼーション検定の開発
のための基礎を提供する。本プロープは１た，伝染性速
度１たは地方病の範囲を評価するためのライム病のダニ
ベクター（イクソデス（ Ｉｘｏｄｅｓ）属）を試験す
るための基礎も提供する。
、ボレリア（ ＢｏｒｒｅＬｉａ）スピロヘータのリポ
ソームＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）’？たはｒ Ｒ Ｎ Ａ
遺伝子（ｒＤＮＡ） にハイブリダイズするが，同一
条件下、試験試料中に存在するかもしれない他の細菌の
ｒＲＮＡまたぱｒＤＮＡにはハイプリダイズしないデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ Ｒ，ＮＡ
）からなる核歌グローブおよびグローブセットが提供さ
れる。それ故，本発明のプロプは，ライム病またはヒト
患者または獣医学検体からの穐液尿，脳脊髄液、皮膚バ
イオプシ、唾液，関節滑液１たは他の組織または液体試
料などの臨床試料中のライム病病因学的因子の特異的検
出に価値のある核酸ハイプリダイゼーション検定の開発
のための基礎を提供する。本プロープは１た，伝染性速
度１たは地方病の範囲を評価するためのライム病のダニ
ベクター（イクソデス（ Ｉｘｏｄｅｓ）属）を試験す
るための基礎も提供する。
我々の経験において、核酸ハイブリダイゼ＝／ヨンに基
づく検定は試験試料中の細菌の検出のための現在利用可
能な大部分の微生物学または免疫学的方法に関する実施
能力を増大させることが発見されてきており、一般的に
は以下のことが挙げられる； ａ）感度の増加；即ち，与えられた試料中の前記細菌を
より頻繁に検出する能力， ｂ）安価な試薬の作用および労力の減少による検定費用
の可能囲としての著しい減少；Ｃ）標的細菌の生化学的
に例外的な株または劇的に異なった外膜タンパク質を持
つ細菌でさえも正確に同定： ｄ）細菌の存在およびその結果の病因学的因子の定量化
の可能性のだめの直接検定； ｅ）宿主免役応答予定と独立した検定一一より早い検出
が可能である； ｆ〕直接的試験は抗生物質管理体制の効力のモニタリン
グを可能にする； ｇ）皮膚のごとき抗体力価が通常低い組織の試料中の前
記病因学的因子検出の可能性。
づく検定は試験試料中の細菌の検出のための現在利用可
能な大部分の微生物学または免疫学的方法に関する実施
能力を増大させることが発見されてきており、一般的に
は以下のことが挙げられる； ａ）感度の増加；即ち，与えられた試料中の前記細菌を
より頻繁に検出する能力， ｂ）安価な試薬の作用および労力の減少による検定費用
の可能囲としての著しい減少；Ｃ）標的細菌の生化学的
に例外的な株または劇的に異なった外膜タンパク質を持
つ細菌でさえも正確に同定： ｄ）細菌の存在およびその結果の病因学的因子の定量化
の可能性のだめの直接検定； ｅ）宿主免役応答予定と独立した検定一一より早い検出
が可能である； ｆ〕直接的試験は抗生物質管理体制の効力のモニタリン
グを可能にする； ｇ）皮膚のごとき抗体力価が通常低い組織の試料中の前
記病因学的因子検出の可能性。
本発明のグローブｋｒＲＮＡに対して向けることにより
招かれる他の利点に、検出されたｒＲＮＡが細胞質量の
かなりの成分を構成しているという事実が含まれる。細
胞リポソーム含量は変化する当り２０，０００までのリ
ポソームを，それ故ｒＲＮＡの各々の２ ０， ０ ０
０コピーを含んでいるであろう（リポソーム中に１：
１：１の化学量論で存在する）。対照的に．遺伝子１た
はそのＲＮＡ転写体のごとき他の可能な細胞標的分子は
，それらがより低い存在割合で存在しているのでより理
想的ではない。他の予期されなかった利点はｒ Ｒ Ｎ
Ａ （およびそれらを特定している遺伝子〕は同時代
の生物体の側万伝達を受けにくいようであることである
。それ故−ｒＲＮＡ一次構造は，同時代の生物体間の側
方伝達を受け易いであろう例えばプラスミド運搬性遺伝
子またはその生成物の場合であるごとき遺伝子一特異性
標的よりもむしろ生物体一特異性分子標的を提供する。
招かれる他の利点に、検出されたｒＲＮＡが細胞質量の
かなりの成分を構成しているという事実が含まれる。細
胞リポソーム含量は変化する当り２０，０００までのリ
ポソームを，それ故ｒＲＮＡの各々の２ ０， ０ ０
０コピーを含んでいるであろう（リポソーム中に１：
１：１の化学量論で存在する）。対照的に．遺伝子１た
はそのＲＮＡ転写体のごとき他の可能な細胞標的分子は
，それらがより低い存在割合で存在しているのでより理
想的ではない。他の予期されなかった利点はｒ Ｒ Ｎ
Ａ （およびそれらを特定している遺伝子〕は同時代
の生物体の側万伝達を受けにくいようであることである
。それ故−ｒＲＮＡ一次構造は，同時代の生物体間の側
方伝達を受け易いであろう例えばプラスミド運搬性遺伝
子またはその生成物の場合であるごとき遺伝子一特異性
標的よりもむしろ生物体一特異性分子標的を提供する。
の近縁種の検出に関して異常な包含性および排外性特性
を持つ本発明のプロープのごときプローフを発生させる
ことができるという発見は予言できずまた予期されなか
った。
を持つ本発明のプロープのごときプローフを発生させる
ことができるという発見は予言できずまた予期されなか
った。
表および図の簡単な説明
本発明の原理および特色は表を参照することによりさら
に理解されるであろう。
に理解されるであろう。
表的試料（臨床およびダニ両方の単離物を含む〕に対す
る好適なブロープのドットブロットハイプリダイゼーシ
ョン検定における包含性および排外性挙動を例示してお
シ：図を参照すると二重グローブ捕捉／検出アッセイ（
ｄｕａｌ ｐｒｏｂｅ ｃａｐｔｕｒｅ／ｄｅｔｅｃｔ
ｏｒ ａｓｓａｙ ） の模式的表現が示されている
。
る好適なブロープのドットブロットハイプリダイゼーシ
ョン検定における包含性および排外性挙動を例示してお
シ：図を参照すると二重グローブ捕捉／検出アッセイ（
ｄｕａｌ ｐｒｏｂｅ ｃａｐｔｕｒｅ／ｄｅｔｅｃｔ
ｏｒ ａｓｓａｙ ） の模式的表現が示されている
。
発明の詳細な説明および最良の形態
本元明のグローブの開発にとられた最初のエゼはライム
スピロヘータ特異性核酸グローブの標α部位として働く
ことができる可能性がある１６５ｒ Ｒ Ｎ Ａ領域の
同定を含んでいる。実際的には、前もってどの非−ボレ
リア（ Ｂａｒｒｅｌ ｉａ ）生物力試験試料に存在
するであろうかを予測するのはほ難である。特に重要で
あるのはブロープ組合せ力実際には梅ほスピロヘータ．
トレポネーマ パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌ
ｌｉｄｕｍ ）を含んでいえ試料をライムー陽性と間違
って検出しないことてある。
スピロヘータ特異性核酸グローブの標α部位として働く
ことができる可能性がある１６５ｒ Ｒ Ｎ Ａ領域の
同定を含んでいる。実際的には、前もってどの非−ボレ
リア（ Ｂａｒｒｅｌ ｉａ ）生物力試験試料に存在
するであろうかを予測するのはほ難である。特に重要で
あるのはブロープ組合せ力実際には梅ほスピロヘータ．
トレポネーマ パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌ
ｌｉｄｕｍ ）を含んでいえ試料をライムー陽性と間違
って検出しないことてある。
任意の与えられたグローブ配列ＫＷ外性を示すそのよう
な潜在的非ライム因子細菌は多数であるため，予測でき
ないだけでなく非常に困難で面伊であろう。グローブを
用いて最終的にスクリーニングされるであろうすべての
試験試料中にどの非ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌ ｉａ ）
細菌が存在するであろうかを知る必要性を除去するため
により厳しい基準が適用された。
な潜在的非ライム因子細菌は多数であるため，予測でき
ないだけでなく非常に困難で面伊であろう。グローブを
用いて最終的にスクリーニングされるであろうすべての
試験試料中にどの非ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌ ｉａ ）
細菌が存在するであろうかを知る必要性を除去するため
により厳しい基準が適用された。
このことはスピロヘータ間およびスピロヘータおよび他
の細菌の群間の系統発生論的知識を必然的に伴う。
の細菌の群間の系統発生論的知識を必然的に伴う。
的関係種のｒＲＮＡ中の相同的領域から十分に異定でき
るとし、次にハイプリダイゼーショ／にような配列への
プロープが使用できることが決定されることにより．排
他的基準が満足できるという，影響を及ぼしてはいるが
以前には証明されていない仮説が適用された。系統発生
論的観察に基づくと，よシ遠縁の生物のｒＲＮＡ配列（
その実際の同一性は知る必要はないが〕は．前記のボレ
リアフルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉ ）の間近の進化論的関係種よ９も配列の
特定の領域が予言的に異っているべきだと次に外挿され
る。
るとし、次にハイプリダイゼーショ／にような配列への
プロープが使用できることが決定されることにより．排
他的基準が満足できるという，影響を及ぼしてはいるが
以前には証明されていない仮説が適用された。系統発生
論的観察に基づくと，よシ遠縁の生物のｒＲＮＡ配列（
その実際の同一性は知る必要はないが〕は．前記のボレ
リアフルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉ ）の間近の進化論的関係種よ９も配列の
特定の領域が予言的に異っているべきだと次に外挿され
る。
しかしながら、前もってそのような領域が存在するか１
たけもし存在してもｒＲＮＡ内のどこにそのような領域
が位置するであろうかなどは予測できない。
たけもし存在してもｒＲＮＡ内のどこにそのような領域
が位置するであろうかなどは予測できない。
決定（標準的実．験室法による）および続いての他のス
ピロヘータ１６８ ｒＲＮＡの配列およヒ他のｆｍ液
感染生物からの配列の比収にょり１６ＳｒＲＮＡ内のｌ
ｌｔｎｍのある標的配列の探究全がなりしぼることがで
きる。ヒトに病的状態１たは死亡を起こすことができる
リケッチアおよびエールリヒア属のごときダニ媒介性細
菌属からの１６８ ｒＲＮＡ配列のさらなる評価もま
た最終的プロープ設計に寄与した。
ピロヘータ１６８ ｒＲＮＡの配列およヒ他のｆｍ液
感染生物からの配列の比収にょり１６ＳｒＲＮＡ内のｌ
ｌｔｎｍのある標的配列の探究全がなりしぼることがで
きる。ヒトに病的状態１たは死亡を起こすことができる
リケッチアおよびエールリヒア属のごときダニ媒介性細
菌属からの１６８ ｒＲＮＡ配列のさらなる評価もま
た最終的プロープ設計に寄与した。
プローブの物質的説明
クローフ選択戦略により試料中のライム スヒロヘータ
の同定に有用な多数のグローブが得られた。以下の好通
なオリゴヌクレオチドグローブについて説明する： グローブ１６１ ６： ５’−ＧＣＣＡＣＴＧＡＡＴＧ
ＴＡＴＴＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＧＴＴＧ−３’ プＯ− プ１６１７：５’−ＣＡＴＣＡＡＴＴＡＡＣＡ
ＡＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＡＴＴ−３’ グｏ− プ１６１８：５”ＣＣＴＣＡＴＴＴＡＴＡＡＡ
ＡＧＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＴＴＣＧ ＡＣＣ−３’ グローブ１ ６１９：５′一ＣＡＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣ
ＡＴＴＴＣＣＴＡＣＡＡＡＧＣＴＴＡ−３’ ７−０− プ１ ６２０： ５′−ＧＴＴＡＧＣＴＴＣ
ＧＧＴＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＡＧＴＴＡＡＣＡＣＣ −６′ グｏ− プ１ ６２１ ： ５’−ＣＴＴＡＴＣＴＧＡ
ＧＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＡ ＡＣＡＧ−３’ プｏ − フ１ ６ ２ ２ ： ５’一ＣＡＴＡＣＣ
ＴＴＡＡＡＴＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＴＡＣＧＧＧＴ
ＴＡＧＡＡＴＡＡＴＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＡＴＣＣＴＣ
ＡＡＣＴＣＧＧＧ−３’ これらのグローブは下記の犬腸菌１６８ ｒＲＮＡ（
Ｂｒｏｓｉｕｓ ら− ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）７５
：４８０１−４８０５− １９７８）の類似の標的位置
番号をつけられ，標的配列と称される１６ｓ ｒＲＮ
Ａ内の領域を標的としている。
の同定に有用な多数のグローブが得られた。以下の好通
なオリゴヌクレオチドグローブについて説明する： グローブ１６１ ６： ５’−ＧＣＣＡＣＴＧＡＡＴＧ
ＴＡＴＴＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＧＴＴＧ−３’ プＯ− プ１６１７：５’−ＣＡＴＣＡＡＴＴＡＡＣＡ
ＡＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＡＴＴ−３’ グｏ− プ１６１８：５”ＣＣＴＣＡＴＴＴＡＴＡＡＡ
ＡＧＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＴＴＣＧ ＡＣＣ−３’ グローブ１ ６１９：５′一ＣＡＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣ
ＡＴＴＴＣＣＴＡＣＡＡＡＧＣＴＴＡ−３’ ７−０− プ１ ６２０： ５′−ＧＴＴＡＧＣＴＴＣ
ＧＧＴＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＡＧＴＴＡＡＣＡＣＣ −６′ グｏ− プ１ ６２１ ： ５’−ＣＴＴＡＴＣＴＧＡ
ＧＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＡ ＡＣＡＧ−３’ プｏ − フ１ ６ ２ ２ ： ５’一ＣＡＴＡＣＣ
ＴＴＡＡＡＴＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＴＡＣＧＧＧＴ
ＴＡＧＡＡＴＡＡＴＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＡＴＣＣＴＣ
ＡＡＣＴＣＧＧＧ−３’ これらのグローブは下記の犬腸菌１６８ ｒＲＮＡ（
Ｂｒｏｓｉｕｓ ら− ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）７５
：４８０１−４８０５− １９７８）の類似の標的位置
番号をつけられ，標的配列と称される１６ｓ ｒＲＮ
Ａ内の領域を標的としている。
グローブ１６１６標的領域６３−１０６：５’−ＣＡＡ
ＡＣＧＧＧＡＵＧＵＡＧＣＡＡＵＡＣＡＵＵＣＡＧＵＧ
ＧＣ−３’ グローブ１６１７標的領域１７８−１９４：５’−ＡＡ
ＵＡＡＧＧＵＣＡＧＵＵＡＡＵＵＵＧＵＵＡＡＵＵＧＡ
ＵＧ−３’ プロープ１６１８標的領域４１６−４５０：５’−ＧＧ
ＵＣＧＡＡＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＡＵＵＣＵＵＵＵＡＵ
ＡＡＡＵＧＡＧＧ−３’ グローブ１６１９標的領域４５３−４８１：５’−ＵＡ
ＡＧＣＵＵＵＧＵＡＧＧＡＡＡＵＧＡＣＡＡＡＧＵＧＡ
ＵＧ−３’ プロープ１６２０標的領域８２９−８６６：５’ 一Ｇ
ＧＵＧＵＵＡＡＣＵＡＡＡＡＧＵＵＡＧＵＡＣＣＧＡＡ
ＧＣＵＡＡＣ−３．’ プロープ１６２１欅的領域１１２２−１１５６：５’−
ＣＵＧＵＵＡＣＣＡＧＣＡＵＧＵＡＡＵＧＧＵＧＧＧＧ
ＡＣＵＣＡＧＡＵＡＡＧ−３’ プロープ１６２２標的領域１４１４−１４７５：５’−
ＣＣＣＧＡＧＵＵＧＡＧＧＡＵＡＣＣＣＧＡＡＧＣＵＡ
ＵＵＡＵＵＣＵＡＡＣＣＣＧＵＡＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧ
ＧＵＡＵＵＵＡＡＧＧＵＡＵＧ−３．’グローブ標的領
域の同定は本発明のかぎとなる局面の１つであり，好適
なグローブの同定を可能にする。ブロープ標的領域の各
々は潜在的に交差反応性の非−ポレリア（ ＥＩＯｒｒ
ｅｌ ｉａ ）生物との不適当な組合せを作るために決
定的なかぎとなるヌクレオチドの基本的な中心部を含ん
でいる。末端を短くしたり，プロープ標的の一万へプロ
ープをわずかにシフトさせることによるグローブの再設
計はグローブの新規再設計とは考えられないであろうし
．ここに設計されたグローブと均等物と考えられる。
ＡＣＧＧＧＡＵＧＵＡＧＣＡＡＵＡＣＡＵＵＣＡＧＵＧ
ＧＣ−３’ グローブ１６１７標的領域１７８−１９４：５’−ＡＡ
ＵＡＡＧＧＵＣＡＧＵＵＡＡＵＵＵＧＵＵＡＡＵＵＧＡ
ＵＧ−３’ プロープ１６１８標的領域４１６−４５０：５’−ＧＧ
ＵＣＧＡＡＡＧＡＵＵＧＵＡＡＡＡＵＵＣＵＵＵＵＡＵ
ＡＡＡＵＧＡＧＧ−３’ グローブ１６１９標的領域４５３−４８１：５’−ＵＡ
ＡＧＣＵＵＵＧＵＡＧＧＡＡＡＵＧＡＣＡＡＡＧＵＧＡ
ＵＧ−３’ プロープ１６２０標的領域８２９−８６６：５’ 一Ｇ
ＧＵＧＵＵＡＡＣＵＡＡＡＡＧＵＵＡＧＵＡＣＣＧＡＡ
ＧＣＵＡＡＣ−３．’ プロープ１６２１欅的領域１１２２−１１５６：５’−
ＣＵＧＵＵＡＣＣＡＧＣＡＵＧＵＡＡＵＧＧＵＧＧＧＧ
ＡＣＵＣＡＧＡＵＡＡＧ−３’ プロープ１６２２標的領域１４１４−１４７５：５’−
ＣＣＣＧＡＧＵＵＧＡＧＧＡＵＡＣＣＣＧＡＡＧＣＵＡ
ＵＵＡＵＵＣＵＡＡＣＣＣＧＵＡＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧ
ＧＵＡＵＵＵＡＡＧＧＵＡＵＧ−３．’グローブ標的領
域の同定は本発明のかぎとなる局面の１つであり，好適
なグローブの同定を可能にする。ブロープ標的領域の各
々は潜在的に交差反応性の非−ポレリア（ ＥＩＯｒｒ
ｅｌ ｉａ ）生物との不適当な組合せを作るために決
定的なかぎとなるヌクレオチドの基本的な中心部を含ん
でいる。末端を短くしたり，プロープ標的の一万へプロ
ープをわずかにシフトさせることによるグローブの再設
計はグローブの新規再設計とは考えられないであろうし
．ここに設計されたグローブと均等物と考えられる。
２つのさらなるオリゴヌクレオチドが本発明で議論され
ている： グローブ／プライマ−１６４３： ５’− ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧ
ＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧ−５’グローフ７プ
ライマ−１６３７： ５′一ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧ
ＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’ グローブ／グライマ−１６４６はその５′末端が下記の
配列： グローブ／グライマ−１６４６標的： ５’−ＣＴＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＴＣＴ−３
．’から構成されるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ） １
６８ｒ Ｒ Ｎ Ａ と相補的な１６８ ｒＤＮ
Ａ 遺伝子鎖にハイブリダイズできるように設計されて
いる。
ている： グローブ／プライマ−１６４３： ５’− ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧ
ＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧ−５’グローフ７プ
ライマ−１６３７： ５′一ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧ
ＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’ グローブ／グライマ−１６４６はその５′末端が下記の
配列： グローブ／グライマ−１６４６標的： ５’−ＣＴＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＴＣＴ−３
．’から構成されるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ） １
６８ｒ Ｒ Ｎ Ａ と相補的な１６８ ｒＤＮ
Ａ 遺伝子鎖にハイブリダイズできるように設計されて
いる。
グローブ／プライマ−１６６７は前の標的の反対のＤＮ
Ａ鎖の１６８ ｒＲＮＡ３’末端ヘハイプリダイズす
るように設計されている： グローブ／プライマ−１６６７標的： ５′−ＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴ−３’オリ
ゴヌクレオチド１６４３および１６６７は，ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉ ）および関連徨のほとんどの全１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ） ポリメラーゼチェーン
反応による増幅を使用する検定において使用するために
設計された。これらはＬａｎｅらによる”普遍的真正細
菌核酸グローブおよびその方法”と題した共通に譲渡さ
れた係争中のＵＳＳＮ３５９．１５８によシ完全に議論
されており、ポレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ） 一％異
的増幅および検出に関して実施例８で使用されている。
Ａ鎖の１６８ ｒＲＮＡ３’末端ヘハイプリダイズす
るように設計されている： グローブ／プライマ−１６６７標的： ５′−ＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴ−３’オリ
ゴヌクレオチド１６４３および１６６７は，ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉ ）および関連徨のほとんどの全１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ） ポリメラーゼチェーン
反応による増幅を使用する検定において使用するために
設計された。これらはＬａｎｅらによる”普遍的真正細
菌核酸グローブおよびその方法”と題した共通に譲渡さ
れた係争中のＵＳＳＮ３５９．１５８によシ完全に議論
されており、ポレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ） 一％異
的増幅および検出に関して実施例８で使用されている。
実施例
実施例１： ブロープ ハイプリダイゼーション挙動の
ドットープロット分析 よく知られた方法に従ったドットープロット分析には，
特にこの目的のだめのニトロセルロース，ナイロンまた
は他の誘導化膜のごときフィルター（容易に市販品とし
て得ることができる〕上への核酸または核酸の集団の固
定化が含まれている。ＤＮＡまたはＲＮＡの両方ともそ
のようなフィルター上に容易に固定化でき，続いて、種
々の条件下（即ちストリンジェンシー）ヌクレオチド配
列または問題とするグローブとのハイプリダイゼーショ
ンを証明または試験できる。ストリンジェンシー条件下
，標的に対しより大きな相補性を持つヌクレオチド配列
からなるグローブはより少ない相補性を含むグローブよ
シ高い水準のハイブリダイゼーションヲ示スであろう。
ドットープロット分析 よく知られた方法に従ったドットープロット分析には，
特にこの目的のだめのニトロセルロース，ナイロンまた
は他の誘導化膜のごときフィルター（容易に市販品とし
て得ることができる〕上への核酸または核酸の集団の固
定化が含まれている。ＤＮＡまたはＲＮＡの両方ともそ
のようなフィルター上に容易に固定化でき，続いて、種
々の条件下（即ちストリンジェンシー）ヌクレオチド配
列または問題とするグローブとのハイプリダイゼーショ
ンを証明または試験できる。ストリンジェンシー条件下
，標的に対しより大きな相補性を持つヌクレオチド配列
からなるグローブはより少ない相補性を含むグローブよ
シ高い水準のハイブリダイゼーションヲ示スであろう。
プローブ１６１６− １６１７．１６１８．１６１９−
１６２０− １６２１および１６２２がドットープロッ
ト処方により試験された。フェノール抽出およびトリフ
ルオロ酢酸セリウム勾配を通した遠心分離により精製さ
れた１００ナノグラムのＲＮＡ全変性し，ナイロン膜上
にスポットした。グロ一フはオリゴヌクレオチドの５′
末端への６２−リン部分の付加により同位元累で標識さ
れた。グローフのハイブリダイゼーションは１、０８Ｍ
塩化ナトリウム，６０ｍＭ リン酸ナトリウムおよび６
ｍＭエチレンジアミン四酢酸−ｐＨ７．Ｃの存在下，表
１に示された温度で起こった。ハイブリダイズしなかっ
たグローブはハイプリダイゼ〜ション条件の６分の１の
塩濃度で洗浄して除去された。フィルターｔＸ一線フィ
ルムに暴露し、ハイブリダイゼーション信号の強度は暴
蕗６時間後に評価した。
１６２０− １６２１および１６２２がドットープロッ
ト処方により試験された。フェノール抽出およびトリフ
ルオロ酢酸セリウム勾配を通した遠心分離により精製さ
れた１００ナノグラムのＲＮＡ全変性し，ナイロン膜上
にスポットした。グロ一フはオリゴヌクレオチドの５′
末端への６２−リン部分の付加により同位元累で標識さ
れた。グローフのハイブリダイゼーションは１、０８Ｍ
塩化ナトリウム，６０ｍＭ リン酸ナトリウムおよび６
ｍＭエチレンジアミン四酢酸−ｐＨ７．Ｃの存在下，表
１に示された温度で起こった。ハイブリダイズしなかっ
たグローブはハイプリダイゼ〜ション条件の６分の１の
塩濃度で洗浄して除去された。フィルターｔＸ一線フィ
ルムに暴露し、ハイブリダイゼーション信号の強度は暴
蕗６時間後に評価した。
表において− Ｎ ＋Ｉ１は強いハイブリダイゼーショ
ンを表わし，”＋−”はわずかな信号を表わし，および
”一“はハイプリダイゼーションの信号がなかったこと
を示している。
ンを表わし，”＋−”はわずかな信号を表わし，および
”一“はハイプリダイゼーションの信号がなかったこと
を示している。
表１に示されたドットプロットの結果はボレリア プル
グドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉ）株間の不均質性および他のボレリア（ Ｂｏｒｒ
ｅｌｉａ）種への近い関係を示している。
グドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉ）株間の不均質性および他のボレリア（ Ｂｏｒｒ
ｅｌｉａ）種への近い関係を示している。
実施例２： ニ重ブロープ ハイプリダイゼーション実
際の実施においては，これらのグローブの多くの応用例
において，図２に示したごとき”捕捉”グローブおよび
１検出”ブロープの６サンドインチ″ハイプリダイゼー
ションスキームにより，対のブロープが同時に使用され
るであろう。捕捉グローブ１２は理想的には高い標的特
異性を持つプロープに同種重合体の３′−ボリＡの尾を
付けることにより製造される二機能性ポリヌクレオチド
であろう。尾は次にガラスビーズ．フィルター円盤また
は磁気粒子のごとき固体表面 上の相補宜１ ビロヘータ１６Ｓ ｒＲＮＡ）へのハイブリダイゼあ
ろう。検出グローブ （都合がよいのはある程度の特異
性のあるもの〕は、放射活性、螢光，化学発光、色その
他に基づく好適な検出スキームの一部であり（検出部
），それは全ハイプリダイゼ−ション複合体の存在を報
告するであろう。
際の実施においては，これらのグローブの多くの応用例
において，図２に示したごとき”捕捉”グローブおよび
１検出”ブロープの６サンドインチ″ハイプリダイゼー
ションスキームにより，対のブロープが同時に使用され
るであろう。捕捉グローブ１２は理想的には高い標的特
異性を持つプロープに同種重合体の３′−ボリＡの尾を
付けることにより製造される二機能性ポリヌクレオチド
であろう。尾は次にガラスビーズ．フィルター円盤また
は磁気粒子のごとき固体表面 上の相補宜１ ビロヘータ１６Ｓ ｒＲＮＡ）へのハイブリダイゼあ
ろう。検出グローブ （都合がよいのはある程度の特異
性のあるもの〕は、放射活性、螢光，化学発光、色その
他に基づく好適な検出スキームの一部であり（検出部
），それは全ハイプリダイゼ−ション複合体の存在を報
告するであろう。
Ｕ− ８， ライム病因学的因子（例えばボレリアブ
ルグドルフェリ（ Ｂｏｒｒｅｌ ｉａ ｂｕｒｇｄｏ
ｒｆｅｒｉ ））の特異的検出のためには，捕捉のため
のブローフ１ ６ １ ７−および検出のための１６１
６．１６１８．１６１９− １６２０、１６２１−Ｅた
は１６２２の組合せが好適な検定系における最も好適な
対であろう。
ルグドルフェリ（ Ｂｏｒｒｅｌ ｉａ ｂｕｒｇｄｏ
ｒｆｅｒｉ ））の特異的検出のためには，捕捉のため
のブローフ１ ６ １ ７−および検出のための１６１
６．１６１８．１６１９− １６２０、１６２１−Ｅた
は１６２２の組合せが好適な検定系における最も好適な
対であろう。
例えば捕捉グローブとしてのグローブ１６２０は含的で
はあるが，ある種のハイブリダイゼーション条件下，２
つの別のアメリカのダニ媒介性の動物からヒトへの病原
物であるボレリア ヘルム／（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｈｅ
ｒｍｓｉｉ）およびボレリア トウリカテ（Ｂｏｒｒｅ
ｌｉａ ｔｕｒｉｃａｔａｅ ） も同様に包含して
しまう。
はあるが，ある種のハイブリダイゼーション条件下，２
つの別のアメリカのダニ媒介性の動物からヒトへの病原
物であるボレリア ヘルム／（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｈｅ
ｒｍｓｉｉ）およびボレリア トウリカテ（Ｂｏｒｒｅ
ｌｉａ ｔｕｒｉｃａｔａｅ ） も同様に包含して
しまう。
実施例６： ヒトｍ液試料からのライム病の臨床診断
血液は超音波処理，ガラスビーズとの激しい攪拌＋ Ｓ
ＤＳのごとき試薬を用いての界面活性剤溶解１たは化学
的処置によるごとくして全核酸含量を得るように好適に
処理され、またはもしくは細菌細胞は細胞溶解に続いて
例えば６デュポン アイソレーター システム”により
部分精製される。
ＤＳのごとき試薬を用いての界面活性剤溶解１たは化学
的処置によるごとくして全核酸含量を得るように好適に
処理され、またはもしくは細菌細胞は細胞溶解に続いて
例えば６デュポン アイソレーター システム”により
部分精製される。
アデンシン残基の重合体伸張物が付いているグローブ１
６２０および６２−リン標識を含むプロープ１６２１が
グアニジウムインチオシアネートのごときカオトロピッ
ク緩衝液中試料と理想的に混合される。オリゴーチミジ
ンで誘導体化してある磁気粒子ビーズが都合がよいよう
に含まれている。
６２０および６２−リン標識を含むプロープ１６２１が
グアニジウムインチオシアネートのごときカオトロピッ
ク緩衝液中試料と理想的に混合される。オリゴーチミジ
ンで誘導体化してある磁気粒子ビーズが都合がよいよう
に含まれている。
磁気粒子，グローブ１６２０＋ボレリア プルグドルフ
ェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ）
またはその近碌の関係種の標的１６８ ｒＲＮＡ
およびグローブ１６２１から成るハイプリダイゼ−ショ
ン複合体が形成する。反応管の底部近くの外部へ磁石を
存在させると磁気粒子一ノ・イブリダイゼーション複合
体が管の内部壁へ接着され，試料マトリックス，非結合
プロープその他のごとき未反応成分を除去することが可
能になる。ビーズープローブー標的複合体の再水利およ
び変性を繰返すと，好都合なことに著しくバックグラウ
ドを減少させることが可能である（ＵＳＳＮコリンズ９
２２．１５５ＥＰＡ８７３０９３８、２によシ完全に説
明されている）。この実施％Ｊにおいて，最終的検出は
ビーズを膜上にスポットし，オートラジオグラフィーに
より検出された。
ェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ）
またはその近碌の関係種の標的１６８ ｒＲＮＡ
およびグローブ１６２１から成るハイプリダイゼ−ショ
ン複合体が形成する。反応管の底部近くの外部へ磁石を
存在させると磁気粒子一ノ・イブリダイゼーション複合
体が管の内部壁へ接着され，試料マトリックス，非結合
プロープその他のごとき未反応成分を除去することが可
能になる。ビーズープローブー標的複合体の再水利およ
び変性を繰返すと，好都合なことに著しくバックグラウ
ドを減少させることが可能である（ＵＳＳＮコリンズ９
２２．１５５ＥＰＡ８７３０９３８、２によシ完全に説
明されている）。この実施％Ｊにおいて，最終的検出は
ビーズを膜上にスポットし，オートラジオグラフィーに
より検出された。
実施例４： 他の試料からのライム病の臨床診断実施例
６に示された方法が理想的に追従されるが，しかしなが
ら抑液試料が置換され，尿試料，皮膚試料，ヒト関節滑
液．バイオプシまたは他の組織または液体が使用される
。別の試料を適応させ，処理するために明らかな小さな
改変がなされるであろうが，それにより標的核酸が適切
に存在する。
６に示された方法が理想的に追従されるが，しかしなが
ら抑液試料が置換され，尿試料，皮膚試料，ヒト関節滑
液．バイオプシまたは他の組織または液体が使用される
。別の試料を適応させ，処理するために明らかな小さな
改変がなされるであろうが，それにより標的核酸が適切
に存在する。
実施例５： ライム病の獣医学的診断
実施列６に示された方法が理想的に追従されるが，しか
しながら，試験される試料はイヌ，ネコウマまたは他の
動物からのものである。そのような試料は実施例６１た
ぱ４に記載されている型のものであろう。
しながら，試験される試料はイヌ，ネコウマまたは他の
動物からのものである。そのような試料は実施例６１た
ぱ４に記載されている型のものであろう。
実施ｇＡＪ６： ボレリア（ Ｂｏｒｒｅｌｉａ ）
ｒ ＤＮＡ のポリメラーゼ増幅反応による増幅を 用いるヒト試料からのライム病の臨 床診断 試料処理は実施例乙に記載された方法のごとくＤＮＡを
得るように計画された。プロープ／プライマ−１６４３
およびグローブ／プライマー１６６７がポリメラーゼチ
ェーン反応に臨床試料と連結して用いられる。得られる
物質はここに示した任意のグローブと１サンドインチ”
／゛イプリダイゼーション（実施例２つにおいて都合良
く検定できる。ポリメラーゼチェーン反応．それ自身，
プロープ１６４６を例えばプロープ１６２０（図１参照
つと連結して用いることにより高度に特異的にできる。
ｒ ＤＮＡ のポリメラーゼ増幅反応による増幅を 用いるヒト試料からのライム病の臨 床診断 試料処理は実施例乙に記載された方法のごとくＤＮＡを
得るように計画された。プロープ／プライマ−１６４３
およびグローブ／プライマー１６６７がポリメラーゼチ
ェーン反応に臨床試料と連結して用いられる。得られる
物質はここに示した任意のグローブと１サンドインチ”
／゛イプリダイゼーション（実施例２つにおいて都合良
く検定できる。ポリメラーゼチェーン反応．それ自身，
プロープ１６４６を例えばプロープ１６２０（図１参照
つと連結して用いることにより高度に特異的にできる。
続いての検出はプロープ：１６１６−１６１７− １６
１８１たは１６１９を用いて達成され，約８５０塩基対
の長さのポリヌクレオチド内へのヌクレオチド三リン酸
の取込みにより測定できる。
１８１たは１６１９を用いて達成され，約８５０塩基対
の長さのポリヌクレオチド内へのヌクレオチド三リン酸
の取込みにより測定できる。
実施例７： ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ） スピロ
ヘータ感染に対する個々のダニの試験 地方特有であることが知られている与えられた地域内の
ダニの感染の潜在性を確かめるため、エーテル麻酔する
かまたは凍結させて固定化したダ＝’ｋニトロセルロー
スまたはナイロン膜上でつぶした。そのようにして調製
された多くのダニは同じ膜上で同時に処理してもよい；
各々の個々のダニは他の試料から約１１離さねばならな
い。フィルターは次に製造元により推奨されているごと
く塩基中で変性され中和される。６２−リンにて高い比
活性で標識されたグローブ１６２２もしくはここに記載
されている他のプロープの１つがダニパネルヘハイプリ
ダイズされる。洗浄によりノ・イブリダイズしなかった
グローブを除去した後，フィルターはＸ一線フィルムへ
１から１０日間暴露される。フィルム上の黒点がライム
スピロヘータを含むダニを示している。
ヘータ感染に対する個々のダニの試験 地方特有であることが知られている与えられた地域内の
ダニの感染の潜在性を確かめるため、エーテル麻酔する
かまたは凍結させて固定化したダ＝’ｋニトロセルロー
スまたはナイロン膜上でつぶした。そのようにして調製
された多くのダニは同じ膜上で同時に処理してもよい；
各々の個々のダニは他の試料から約１１離さねばならな
い。フィルターは次に製造元により推奨されているごと
く塩基中で変性され中和される。６２−リンにて高い比
活性で標識されたグローブ１６２２もしくはここに記載
されている他のプロープの１つがダニパネルヘハイプリ
ダイズされる。洗浄によりノ・イブリダイズしなかった
グローブを除去した後，フィルターはＸ一線フィルムへ
１から１０日間暴露される。フィルム上の黒点がライム
スピロヘータを含むダニを示している。
実施例８： 液体／・イブリダイゼーションによるボレ
リア（ Ｂｏｒｒｅｌ ｉａ ）スビロ／Ｘ−タのため
の個々のダニの試験 液体ハイプリダイゼーション検定は、高い感度および同
じ試料で１回以上の検定が実施できるという利点を持っ
てお９，そのため実施例７の方法より好適である。本実
施例においては．ヒト皮膚から除かれたごとき個々のダ
ニはカオトロビツク緩衝液中でホモジナイズされ、この
ホモジネートの分画が実施例２に記載した”サンドイン
チ”法と類似の処方で検定される。
リア（ Ｂｏｒｒｅｌ ｉａ ）スビロ／Ｘ−タのため
の個々のダニの試験 液体ハイプリダイゼーション検定は、高い感度および同
じ試料で１回以上の検定が実施できるという利点を持っ
てお９，そのため実施例７の方法より好適である。本実
施例においては．ヒト皮膚から除かれたごとき個々のダ
ニはカオトロビツク緩衝液中でホモジナイズされ、この
ホモジネートの分画が実施例２に記載した”サンドイン
チ”法と類似の処方で検定される。
実施ｇ？Ｊ９： 地域中のライム病の地方特有的存在の
ための地方からのダニの試験 個々の採集場所からの多数のダニをプールし．カオトロ
ピック緩衝液中でホモジナイスして実施例７筐たは８で
記載したごとくして検定された。
ための地方からのダニの試験 個々の採集場所からの多数のダニをプールし．カオトロ
ピック緩衝液中でホモジナイスして実施例７筐たは８で
記載したごとくして検定された。
陽性信号は地域内でのスピロヘータの存在を示している
が，流行度の定量的評価はできない。
が，流行度の定量的評価はできない。
実施例１０： 皮膚バイオブ７試料へのその場でのブロ
ープのハイブリダイゼーシ ョン 皮膚は．特にライム病の第１期の間スピロヘータを可視
化するのに１つのより良い場所である。
ープのハイブリダイゼーシ ョン 皮膚は．特にライム病の第１期の間スピロヘータを可視
化するのに１つのより良い場所である。
例えばプロープ１６２２のごときプロープをユーダミン
１たぱフルオレセイ／で標識する。スライド上の皮膚バ
イオグシ試料をハイプリダイゼーションを促進する条件
下螢光プローブとインキユベトシ，結合されなかったプ
ロープを洗浄する。
１たぱフルオレセイ／で標識する。スライド上の皮膚バ
イオグシ試料をハイプリダイゼーションを促進する条件
下螢光プローブとインキユベトシ，結合されなかったプ
ロープを洗浄する。
螢光顕微鏡下で観察すると特徴的ならせん状細菌細胞の
螢光が見えるであろう。
螢光が見えるであろう。
ここに示した方法またはグローブに対して攬々の改変が
本発明の精神または範囲から離れることなくなされるで
あろうことが当業者には容易に認められるであろう。特
に，１つまたは２つの末端ヌクレオチドを欠失させ，伴
なわれる・・イブリダイゼーション条件の調整を行うご
ときプロープの改変は均等物と考えられる。
本発明の精神または範囲から離れることなくなされるで
あろうことが当業者には容易に認められるであろう。特
に，１つまたは２つの末端ヌクレオチドを欠失させ，伴
なわれる・・イブリダイゼーション条件の調整を行うご
ときプロープの改変は均等物と考えられる。
第１図は、
本発明の二車プロ
ブ捕捉／検出ア
・ノセイを示す模式図である。
（外４名〕
図面の浄書（内容に変更なし）
手
続
補
正
書（方式）
２，発明の名称
ライム病スピロヘータ検出のための核酸プローブ３．
補正をする者
事件との関係
住所
名 称 シーン
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、前もって決定されたストリンジェンシー条件下、￥
ボレリア￥￥ブルグドルフェリ￥（￥Ｂｏｒｒｅｌｉａ
ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ￥）のｒＲＮＡまたはｒＲＮＡ
遺伝子（ｒＤＮＡ）へハイブリダイズできる核酸断片。 ２、前記断片がヒト、真菌または非−スピロヘータ細菌
のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとハイブリダイズできない特
許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ３、前記断片がプローブ１６１６、１６１７、１６１８
、１６１９、１６２０、１６２１、１６２２、１６４３
および１６３７からなる群から選択されるプローブ内の
任意の１０の連続的なヌクレオチドからなる配列の少く
とも９０％と相補的である特許請求の範囲第２項記載の
核酸断片。 ４、前記断片がプローブ１６１６、１６１７、１６１８
、１６１９、１６２０、１６２１、１６２２、１６４３
および１６３７からなる群から選択されるプローブ内の
任意の１０の連続的なヌクレオチドからなる配列の少く
とも９０％と相同的である特許請求の範囲第２項記載の
核酸断片。 ５、少くとも２つの核酸断片からなるプローブの組であ
って、少くともその１つはプローブ１６１６、１６１７
、１６１８、１６１９、１６２０、１６２１、１６２２
、１６４３、１６３７およびその相補配列からなる群よ
り選択される前記プローブの組。 ６、プローブ１６１６またはその相補的配列である特許
請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ７、プローブ１６１７またはその相補的配列である特許
請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ８、プローブ１６１８またはその相補的配列である特許
請求の範囲第１項記載の核酸断片。 ９、プローブ１６１９またはその相補的配列である特許
請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １０、プローブ１６２０またはその相補的配列である特
許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １１、プローブ１６２１またはその相補的配列である特
許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １２、プローブ１６２２またはその相補的配列である特
許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １６、プローブ１６４３またはその相補的配列である特
許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １４、プローブ１６３７またはその相補的配列である特
許請求の範囲第１項記載の核酸断片。 １５、下記の段階からなることを特徴とする試料中のラ
イム病またはボレリア病の病因学的因子を検出する方法
。 ａ）前記試料を少くとも１つの核酸断片と、前記断片を
前記ライム病を起こす￥ボレリア￥（￥Ｂｏｒｒｅｌｉ
ａ￥）種のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ（もし前記試料中に
存在するなら）とハイブリダイズさせる条件下接触させ
、それによりハイブリッド核酸複合体を形成させる。こ
こで前記核酸断片は非−スピロヘータ細菌のｒＲＮＡお
よびｒＤＮＡとはハイブリダイズしない。 ｂ）前記ハイブリッド核酸複合体を前記￥ボレリア￥（
￥Ｂｏｒｒｅｌｉａ￥）種の存在の指標として検出する
。 １６、前記接触段階の前記核酸断片がプローブ１６１６
、１６１７、１６１８、１６１９、１６２０、１６２１
、１６２２、１６４３および１６３７からなるプローブ
の群より選択される特許請求の範囲第１５項記載の方法
。 １７、前記接触段階がプローブ１６４３からなる核酸断
片を含み、および前記検出段階がさらに前記試料を１６
３７、１６１６、１６１７、１６１８、１６１９、１６
２０、１６２１および１６２２からなるプローブの群よ
り選択される第２の核酸断片と接触させることを含む特
許請求の範囲第１５項記載の方法。 １８、さらに前記￥ボレリア￥（￥Ｂｏｒｒｅｌｉａ￥
）種（もし存在するなら）の１６ＳｒＲＮＡまたは１６
ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をポリメラーゼチェーン反応によ
り増幅する段階を含む特許請求の範囲第１５項記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41607289A | 1989-10-02 | 1989-10-02 | |
| US416072 | 1989-10-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03216200A true JPH03216200A (ja) | 1991-09-24 |
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Family
ID=23648425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26491690A Expired - Fee Related JP3194942B2 (ja) | 1989-10-02 | 1990-10-02 | ライム病スピロヘータ検出のための核酸プローブ |
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|---|---|
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| CA (1) | CA2025178A1 (ja) |
| DE (1) | DE69026995T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5912117A (en) * | 1990-03-07 | 1999-06-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Method for diagnosis of lyme disease |
| SG47447A1 (en) | 1990-06-15 | 1998-04-17 | Univ Yale | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| WO1993003184A1 (en) * | 1991-08-09 | 1993-02-18 | Mccann Associates, Inc. | Method for detecting lyme disease and composition |
| WO1993024658A1 (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-09 | Gen Trak, Inc. | Signal amplification probe and methods of use |
| US5658757A (en) * | 1993-03-31 | 1997-08-19 | The Regents Of The University Of California | Cloned leptospira outer membrane protein |
| ATE194391T1 (de) * | 1995-01-19 | 2000-07-15 | Gen Probe Inc | Amplifikationsoligonukleotide und sonden für borrelia, die mit lyme kranheit assoziiert sind |
| US5932220A (en) * | 1995-05-08 | 1999-08-03 | Board Of Regents University Of Texas System | Diagnostic tests for a new spirochete, Borrelia lonestari sp. nov. |
| US5853974A (en) | 1995-06-07 | 1998-12-29 | Chiron Corporation | Enhancement of alkaline phosphatase with SDS in chemiluminescent substrates |
| ZA964896B (en) | 1995-06-07 | 1997-01-08 | Connaught Lab | Expression of lipoproteins |
| DE19605475C1 (de) * | 1996-02-14 | 1997-11-20 | Deutsches Krebsforsch | Verfahren zur Erkennung des Erkrankungsrisikos nach Arthropodenstich |
| ATE339514T1 (de) | 1996-07-16 | 2006-10-15 | Gen Probe Inc | Verfahren zum nachweis und amplifikation von nukleinsäuresequenzen unter verbrauch von modifizierten oligonukleotiden mit erhöhter zielschmelztemperatur (tm) |
| US7070925B1 (en) | 1996-07-16 | 2006-07-04 | Gen-Probe Incorporated | Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe |
| US6458584B1 (en) * | 1996-12-23 | 2002-10-01 | University Of Chicago | Customized oligonucleotide microchips that convert multiple genetic information to simple patterns, are portable and reusable |
| AU8151898A (en) * | 1997-06-20 | 1999-01-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Lyme disease vaccines |
| US6902893B1 (en) * | 1997-06-20 | 2005-06-07 | Gil H. Choi | Lyme disease vaccines |
| US6140083A (en) * | 1998-07-23 | 2000-10-31 | The Regents Of The University Of California | Leptospiral outer membrane protein, LipL46 |
| DE60026641T2 (de) * | 1999-07-15 | 2007-01-25 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Trennung von teilchenförmigen Substraten aus einer Lösung indem man den Teilchenverlust minimiert |
| US20020182647A1 (en) * | 2001-04-30 | 2002-12-05 | Emmert-Buck Michael R. | Histoscreen method |
| US9126165B1 (en) | 2002-04-24 | 2015-09-08 | The University Of North Carolina At Greensboro | Nucleic acid arrays to monitor water and other ecosystems |
| US8048623B1 (en) | 2002-04-24 | 2011-11-01 | The University Of North Carolina At Greensboro | Compositions, products, methods and systems to monitor water and other ecosystems |
| US8383342B2 (en) | 2002-04-24 | 2013-02-26 | The University Of North Carolina At Greensboro | Compositions, products, methods and systems to monitor water and other ecosystems |
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| CN110184336B (zh) * | 2019-05-05 | 2022-11-18 | 昆明医科大学 | 叶酸受体folr2及其编码基因的应用 |
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|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| WO1988003957A1 (en) * | 1986-11-24 | 1988-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| AU2932889A (en) * | 1987-12-01 | 1989-07-05 | Amoco Corporation | Detection of salmonella |
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-
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- 1993-10-27 US US08/144,212 patent/US5466577A/en not_active Expired - Fee Related
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