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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung und zum
Assay von Molekülen
von Interesse unter Verwendung von Affinitätsmatrices in der Gegenwart
eines Detergens zur Verfügung.
Diese Isolierungsverfahren finden auf verschiedenen Gebieten der
Biologie, wie z. B. der Proteinreinigung, der Nukleinsäurereinigung,
der Assays mit hohem Durchsatz, der diagnostischen Assays, der funktionalen
Genomik, der funktionalen Proteomik, des Phagendisplays und der
Proteinexpressionsanalyse, Anwendung.
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Affinitätsabtrennungsverfahren
werden zunehmend für
die Isolierung oder die Quantifizierung von biologischen Molekülen verwendet.
Chromatographieverfahren, die magnetisch anziehbare Affinitätspartikel oder
Beads zur Abtrennung spezifischer Moleküle von einer Flüssigkeit
verwenden, sind in der biochemischen, biomedizinischen und molekularbiologischen
Forschung gut belegt. Affinitätsabtrennungsverfahren
umfassen die Suspension von fein verteilten Affinitätsmatrixpartikeln
in einer Lösung,
die Moleküle
von Interesse in einer unreinen oder verdünnten Form enthält. Die
Moleküle
von Interesse werden auf Grund spezifischer oder nichtspezifischer
Wechselwirkungen zwischen den Molekülen und einem der Oberfläche der
Affinitätspartikel zugeordneten
Affinitätsliganden
für solche
Moleküle
auf den Matrixpartikeln gefangen oder immobilisiert. Die Affinitätspartikel
und die gebundenen Zielmoleküle
von Interesse können
dann unter Anwendung verschiedener Standardverfahren, wie z. B.
Filtrieren, Zentrifugieren, Dekantieren, abgetrennt oder zusammengesammelt werden.
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Besonders
nützliche
Materialien und Verfahren verwenden insbesondere für automatisierte
Abtrennungsprozesse magnetisch anziehbare Affinitätsbeads.
Nach Binden des Zielmoleküls
führt ein
Anlegen eines magnetischen Felds an das Gefäß, das die magnetischen Affinitätspartikel
(Beads) enthält,
dazu, dass sie zu der Quelle des Felds migrieren, wobei auf diese
Art und Weise die Beads an der Wand des Gefäßes gesammelt und konzentriert
werden. Jetzt, wo das magnetische Feld noch angelegt ist, kann der
Rückstand
der Lösung
und der ungebundenen Komponenten (der Überstand) entfernt werden,
indem er ausgegossen wird oder indem eine Pipettiervorrichtung verwendet
wird, wobei das magnetisch gesammelte Pellet magnetischer Partikel
intakt gelassen wird. Dann kann/können weitere Lösung(en)
dazugegeben und das magnetische Feld entfernt werden, wobei auf
diese Art und Weise ein Resuspendiertwerden der Beads ermöglicht wird.
Falls die Wechselwirkung zwischen den magnetischen Affinitätsbeads
und den Molekülen
von Interesse unterbrochen wird (Zielmolekül eluiert), können die
Moleküle
erfasst werden, indem das Feld erneut angelegt wird und der Überstand,
der die gereinigten konzentrierten Moleküle von Interesse enthält, entfernt
und bewahrt wird. Falls die Affinitätsbeads in einem Assay verwendet
werden, in dem z. B. nur die Gegenwart des Zielmoleküls ermittelt
oder quantifiziert werden muss, ist eine Eluierung aus der Affinitätsmatrix
nicht erforderlich und die Beads, die gebundene Moleküle von Interesse
aufweisen, können
einem Detektionsreagens, wie z. B. einem markierten Antikörper oder
Enzym, ausgesetzt werden.
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Eine
manuelle Verarbeitung von Affinitätsbeads beschränkt den
möglichen
Durchsatz, und um den Durchsatz zu erhöhen, wurden sowohl für Einzelproben-
als auch Mehrprobengefäße etliche
automatisierte und halbautomatisierte Technologien entwickelt. Magnetische
Affinitätsbeads,
wie oben erwähnt,
eignen sich mühelos
für solch
automatisierte und halbautomatisierte Technologien und Praktiker
sind im Stande, durch eine bessere Abtrennung der magnetischen Beads
und durch ein Erhöhen
der Anzahl an pro Operation verarbeiteten Proben einen höheren Durchsatz
zu erzielen. Eine Verarbeitung kann entweder dadurch, dass die magnetische
Quelle in Bezug auf die Gefäße bewegt
wird (siehe die WO 96131781), oder dadurch, dass das Gefäß in Bezug
auf eine einzige oder mehrere magnetische Quellen bewegt wird (siehe
die U.S.-Patente 5,128,103 und 5,147,529), erhöht werden. Bei bestimmten Beispielen
ist der Durchsatz erhöht
worden, indem die magnetische Quelle neben den Pipettierspitzen,
die die magnetischen Beads enthielten, platziert wurde (siehe die
WO 97/44671, die WO 97/31105 und die
EP
0 691 541 ) oder indem unter Verwendung eines automatisierten
Pipettiersystems die Flüssigkeit
von den magnetischen Beads entfernt wurde (siehe das U.S.-Patent
5,458,785).
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Viele
geeignete Affinitätsliganden
sind für
eine Verwendung bei einer Herstellung von Affinitätsmatrixpartikeln,
die in der Lage sind, ein Molekül
von Interesse zu binden, bekannt. Bei einer Ligandenklasse, die erfolgreich
bei Affinitätsabtrennungen
verwendet wurde, handelt es sich um Metallchelatbinder. Die Verwendung
einer Metallchelataffinitätschromatographie
zur Proteinisolierung wurde 1975 von Porath et al. eingeführt (siehe
Porath et al., Nature, 258: 598–599
(1975)). Diese Technologie ist seitdem erfolgreich bei vielen Arten von
Abtrennungen angewendet worden (siehe Übersichtsartikel, z. B. Lonnerdal
et al., J. Appl. Biochem., 4: 203–208 (1982) und Sulkowski,
Trends in Biotechnology, 3: 1–7
(1985)). Eine Metallchelataffinitätsabtrennung basiert auf der
Entdeckung, dass Metallionen, wie z. B. Nickel, Kupfer und Zink,
gebunden an oder immobilisiert auf ein festes Substrat oder Matrix,
wie z. B. Agarose- oder Silika-Gele, an einer reversiblen Wechselwirkung
mit Elektronendonorgruppen, die sich auf der Oberfläche von
Proteinen befinden, insbesondere den Imidazolseitenketten von Histidin,
teilnehmen können.
Das Protein wird bei einem pH-Wert, bei dem die Elektronendonorgruppe
zumindest teilweise in nicht protonierter Form zugegen ist, an das
Chromatographiegel gebunden und kann anschließend mit Hilfe eines Puffers
mit einem niedrigeren pH-Wert, bei dem die Elektronendonorgruppe
protoniert wird, eluiert werden. Als Chelatdonor ist Nitrilotriessigsäure (NTA), über einen
Spacer an die Trägermatrix
gebunden, sehr zuverlässig
gewesen (siehe z. B. das U.S.-Patent 5,047,513).
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Ungeachtet
des zum Fangen des Moleküls
von Interesse verwendeten Ligandtypen leiden Affinitätsabtrennungsverfahren
unter einem gemeinsamen Beadverlustproblem während des Abtrennungsprozesses. Dieses
Problem wurde während
automatisierter wie auch manueller Beadverarbeitung jedes Mal, wenn
die Affinitätsbeads
gewaschen wurden, Moleküle
aus den Beads eluiert wurden oder Überstandsflüssigkeiten entfernt oder zurückgeholt
wurden, festgestellt. Falls die Beads am Boden eines Gefäßes, wie
z. B. einer Mikrotiterplatte, gesammelt werden, besteht ein hohes
Risiko, dass, während
die Lösung
entfernt wird, einige Beads ebenfalls entfernt werden. Der Verlust
oder die Entfernung von Beads führt
zu nicht nachvollziehbaren Ergebnissen, ungenauer Quantifizierung
von gebundenen Materialien, geringeren Ausbeuten bei Reinigungsprotokollen
und einem niedrigeren Assaydurchsatz.
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Die
PCT-Veröffentlichung
WO 98/31840 (siehe Seite 7, Zeile 12 bis Seite 11, Zeile 8) offenbart
ein Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial, insbesondere
Nukleinsäuren,
das die Schritte umfasst: Bereitstellen eines Mediums, das das biologische
Zielmaterial umfasst; Bereitstellen von magnetischen Silikapartikeln;
Bilden eines Komplexes der magnetischen Silikapartikel mit dem biologischen
Zielmaterial; Entfernen des Komplexes durch Anlegen eines magnetischen
Felds und Eluieren des biologischen Zielmaterials. Die WO 98/31840 äußert sich
allerdings weder zu der Verwendung eines Detergens während des
Isolierungsprozesses noch zu dem Problem eines Affinitätspartikelverlusts
während
Abtrennungsprozessen.
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Die
JP 0118451 (siehe Zusammenfassung)
offenbart ein Adsorbens für
eine Affinitätsabtrennung
von Protease. Dieses Adsorbens enthält Salicylphthalsäure oder
deren Derivative und die unmodifizierte Carbonsäuregruppe dient als ein Ligand
für die
Enzyme. Das mit diesem Adsorbens gereinigte Enzym enthält geringe Mengen
an Verunreinigungen und ist deshalb insbesondere für Enzyme
in flüssigem
Detergens nützlich.
Die
JP 01180451 äußert sich
allerdings zu der Verwendung eines Detergens während des offenbarten Reinigungsprozesses
wie auch zu dem Problem eines Affinitätspartikelverlusts während Abtrennungsprozessen überhaupt
nicht.
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Die
PCT-Veröffentlichung
WO 96/18731 (siehe Seite 5, Zeile 14 bis Seite 14, Zeile 31) offenbart
ein Verfahren für
die Isolierung von Nukleinsäuren
aus einer Probe, das die Verwendung von chaotropen Agenzien und
Alkohol umgeht. Genauer gesagt, umfasst das offenbarte Verfahren
die Schritte: in Kontakt bringen der Probe mit einem Detergens und
einem festem Träger,
z. B. Affinitätspartikeln,
wodurch die Nukleinsäure
an den Träger
gebunden wird, und Abtrennen des Trägers mit der gebundenen Nukleinsäure von
der Probe. Das Detergens wie in der WO 96/18731 verwendet, wird
vorteilhaft verwendet, um die Bindung von Kontaminanten, wie z.
B. Proteinen, an den festen Träger
zu verhindern, und um das Nukleinsäure enthaltende Material, z.
B. Zellen, zu lysieren. Allerdings gibt die WO 96/18731 keinen Hinweis
darauf, wie der Verlust der oben erwähnten Affinitätspartikel
während
des Isolierungsprozesses zu verhindern ist.
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Nun
wurde unvermutet dargestellt, dass die Verwendung geringer Mengen
an Detergenzien in Verbindung mit der Verwendung der Affinitätsbeads
den Verlust an Beads erheblich reduzieren kann. Die hier beschriebene
Erfindung ermöglicht
die manuelle und automatische Verarbeitung von Affinitätsbeads,
insbesondere magnetischen Beads, in Multiwell- und Einwellgefäßen. Es
können
handelsübliche
Multiwell- und/oder Einwellformate (z. B. Mikrotiterplatten) und
Roboter (z. B. BioRobot) verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Abtrennungsverfahren zur Verfügung, die
hoch flexibel sind und die sich durch einen hohen Probendurchsatz
ohne die Gefahr eines Probendurcheinanders auszeichnen. Diese und
weitere Aspekte und Vorteile der Erfindung werden aus der/den unten
präsentierten
Beschreibung und Beispielen ersichtlich.
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Die
Erfindung stellt Verfahren zum Abtrennen einer fein geteilten Partikelmatrix
von einer Lösung
zur Verfügung,
um einen Verlust an Partikeln oder Beads von der Matrix zu minimieren.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Isolieren
von Molekülen
von Interesse aus einer Probe oder aus einer Lösung unter Verwendung von Affinitätspartikeln
oder Beads zur Verfügung.
Die hier beschriebenen Verfahren stellen die Mittel zum Reduzieren
eines Verlusts an Affinitätspartikeln
oder Beads während
eines Abtrennungsprozesses, zum Erhöhen der Ausbeuten an Zielmolekülen von
Interesse und zum Erhöhen
der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Assayverfahren auf Basis
von Affinitätsabtrennungen
zur Verfügung.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich in ihren umfassendsten Aspekten
auf ein Verfahren zum Abtrennen von Partikeln von einer Lösung, das
die Schritte umfasst:
- (a) Vereinigen einer
Lösung
mit einer fein geteilten Partikelmatrix in der Gegenwart eines Detergens;
- (b) Sammeln der Partikel der Partikelmatrix, z. B. durch Zentrifugieren,
Filtrieren, Magnetkraft (falls die Partikel magnetisch anziehbar
sind) usw.;
- (c) Entfernen von Überstandslösung.
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Wo
es sich bei den Partikeln um Affinitätspartikel handelt, stellt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Isolieren eines Moleküls von Interesse
aus einer Lösung
in einem Gefäß zur Verfügung, das
die Schritte umfasst:
- (a) in Kontakt bringen
der Lösung
mit Affinitätspartikeln,
die in der Lösung
unlöslich
sind und im Stande sind, sich in der Gegenwart eines Detergens an
das Molekül
von Interesse zu binden; und
- (b) Abtrennen der Affinitätspartikel
von dem Rückstand
der Lösung – z. B.
durch Einführen
eines magnetischen Felds über
das Gefäß (für magnetische
Affinitätsbeads),
Zentrifugieren, Filtrieren usw.
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Alternativ
können
die Affinitätspartikel
vor dem Kontaktierungsschritt mit einem Detergens behandelt werden.
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Die
Affinitätspartikel
und gebundenen Moleküle
von Interesse können,
abhängig
von dem Zweck der Abtrennung (d. h. ob das Molekül von Interesse untersucht,
detektiert, gewonnen oder aus der Lösung gereinigt wird), weiteren
Schritten unterzogen werden. Solche zusätzlichen Schritte umfassen
z. B. Waschschritte, in denen die abgetrennten Partikel in einer
anderen Lösung
resuspendiert werden; Eluierungsschritte, in denen die abgetrennten
Partikel Lösungsbedingungen
ausgesetzt werden, die zu einer Unterbrechung der Affinitätswechselwirkung
zwischen den Partikeln und den Molekülen von Interesse führen, was
dazu führt,
dass die Moleküle
aus den Partikeln gelöst
werden; Assay- oder Detektionsschritte, wobei die abgetrennten Partikel
mit Detektionsreagenzien, wie z. B. für das gebundene Molekül von Interesse
spezifischen markierten monoklonalen Antikörpern, in Kontakt gebracht
werden.
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In
einer bestimmten Ausführungsform
der Erfindung umfasst ein magnetisches Abtrennungsverfahren:
- (a) in Kontakt bringen einer Lösung mit
magnetischen Partikeln in einem Gefäß in der Gegenwart eines Detergens;
- (b) in Nähe
zueinander bringen des Gefäßes und
eines Magnets, wodurch die magnetischen Partikel innerhalb des Gefäßes immobilisiert
werden (d. h. durch Magnetkraft);
- (c) Entfernen von Überstand
aus dem Gefäß;
- (d) Dazugeben neuer Lösung
zu dem Gefäß; und
- (e) Abtrennen des Gefäßes und
des Magnets und Resuspendieren der Partikel in der neuen Lösung.
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Es
versteht sich, dass die Schritte (d) und (e) in der vorhergehenden
Ausführungsform
umgekehrt werden können – und zwar
mit demselben Ergebnis.
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Die
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung können
auf die Abtrennung von Molekülen
von verschiedenen Lösungen
angewendet werden. Bei Molekülen
von Interesse kann es sich zum Beispiel um Peptide, Polypeptide
oder Proteine handeln. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung
werden vorzugsweise angewendet, um 6x-His-Tag-Proteine zu isolieren.
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Bei
magnetischen Partikeln, die in bevorzugten Verfahren der vorliegenden
Erfindung nützlich
sind, kann es sich um jedes aus einer Vielzahl von Materialien einschließlich zum
Beispiel ferromagnetischer Beads, superparamagnetischer Beads und
deren Kombinationen handeln. Bei den Partikelmatrixmaterialien,
die gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung vorteilhaft abgetrennt werden, kann es
sich um jegliche Festsubstratmaterialien, die in der/den Lösung(en),
in der/denen sie suspendiert werden, unlöslich sind, handeln. Typische
Beispiele umfassen partikuläre
Agarose, Silika, Nitrocellulose, Cellulose, Acrylamid, Latex, Polystyrol,
Polyacrylat, Polymethacrylat, Polyethylenpolymere, wie z. B. Polyvinylalkohol,
Glaspartikel, Silikate, wie z. B. Calcium-, Magnesium-, und Aluminiumsilikate,
Metalloxide, wie z. B. Titanoxide, Zinnoxide usw., Apatite und deren
Kombinationen.
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Bei
den in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Detergenzien
handelt es sich um nichtionische, anionische zwitterionische und
kationische Detergenzien und deren Kombinationen. Die Konzentration
eines in den Verfahren der Erfindung verwendeten Detergens beträgt vorzugsweise
zumindest ungefähr
0,0005–2,0%
(V/V). In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Detergens um ein nichtionisches Detergens
ausgewählt
aus einer Gruppe bestehend aus Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40 und
deren Kombinationen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt
es sich bei dem Detergens um das kationische Detergens Dodecyltrimethylammoniumchlorid.
In einer weiteren Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Detergens um ein
anionisches Detergens ausgewählt
aus einer Gruppe bestehend aus Natriumdodecylsulfat (SDS), Sarkosyl
und deren Kombinationen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt
es sich bei dem Detergens um das zwitterionische Detergens CHAPS.
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Gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung sollte die Konzentration eines Detergens
ungefähr 2%
(V/V) nicht überschreiten.
Die Konzentration eines nichtionischen Detergens gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung beträgt
vorzugsweise zumindest ungefähr
0,005% (V/V). Die Konzentration eines anionischen Detergens gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung beträgt
vorzugsweise zumindest ungefähr 0,05%
(V/V) und überschreitet
nicht ungefähr
1% (V/V). Die Konzentration eines kationischen Detergens gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung beträgt
vorzugsweise zumindest ungefähr
0,5% (V/V) und überschreitet
nicht ungefähr
1% (V/V). Die Konzentration eines zwitterionischen Detergens gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung beträgt
vorzugsweise zumindest ungefähr
0,01% (V/V) und überschreitet nicht
ungefähr
2% (V/V). Das nichtionische Detergens Tween 20 (Polyoxyethylen (20)
sorbitolmonolaurat) wird in den Verfahren der vorliegenden Erfindung
bei Verwendung in der Isolierung von Nukleinsäuren oder Proteinen insbesondere
bevorzugt mit einer Konzentration von zumindest ungefähr 0,05%
(V/V) verwendet.
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Dadurch,
dass eine geringe Menge an Detergens zu der Lösung dazugegeben wird oder
die Matrixpartikel oder Beads mit einer geringen Menge an Detergens
behandelt werden, stellt diese Erfindung in einem Affinitätssystem
eine Verbesserung bei Signal, Signal-Rausch-Verhältnis,
Reproduzierbarkeit und Ausbeute zur Verfügung.
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1 ist
ein schematisches Diagramm, das hier erwogene bestimmte Typen von
Affinitätswechselwirkungen
und Assays, die gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung verbessert werden können, darstellt. 1A stellt ein Binden eines Moleküls von Interesse
(6) an einen Affinitätsliganden
(4) immobilisiert auf einem Bead (2) eines Matrixmaterials
dar. 1B stellt einen zweistufigen
Fang eines Bindungspartners (12) für ein interagierendes Molekül (6)
dar, das durch Bindung an oder Komplexieren mit einem Affinitätsliganden (8)
auf einem Matrixbead (2) immobilisiert worden ist, z. B.
wie wo ein Chelatmetall (8) auf einem Matrixbead (2)
einen Histidin-Tag (10) gebunden an ein Protein (6)
bindet, wobei das Protein (6) wiederum im Stande ist, ein
weiteres Protein (12) zu binden. 1C stellt
die Verwendung von Affinitätsbeads
(2 + 4) dar, die zu einer Bindung an einen Komplex
(13) aus zwei Bindungspartnern (12 und 14),
wie z. B. einem Antikörper/Antigen-Komplex oder einem
Bindungskomplex aus einer Zelle und einem Protein oder einem kleinen
Molekül,
das mit einem Oberflächenantigen
reagiert, in der Lage sind.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Abtrennen fester
Partikel von einer Lösung, während ein
Verlust an Partikeln minimiert wird. Die Verfahren sind besonders
für Abtrennungen
nützlich,
die eine Isolierung von Molekülen
von Interesse unter Verwendung einer Affinitätsmatrix von Beads oder Partikeln, besonders
magnetischen Affinitätsbeads
oder Partikeln, erfordern. Insbesondere basieren die hier offenbarten Verfahren
der Erfindung auf der Entdeckung, dass, wenn die Beads mit einem
Detergens behandelt oder ihm ausgesetzt werden, die Verarbeitung
der Partikel verbessert wird, und in Bezug auf eine Isolierung eines
Moleküls
von Interesse unter Verwendung von Affinitätspartikeln, die in der Lage
sind, das Molekül
von Interesse zu binden, die Ausbeute eines solchen isolierten Moleküls verbessert
wird und die Reproduzierbarkeit der Abtrennung verbessert wird.
Die Verwendung solcher Detergenzien reduziert auch einen Verlust
an Partikeln während
Abtrennungsprozessen erheblich und erhöht für Affinitätsabtrennungen ein Signal und
ermöglicht
höhere
Signal-Rausch-Verhältnisse.
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In
den folgenden Abschnitten werden die Begriffe "Probe" und "Lösung" verwendet, um jede
Präparation,
die ein Molekül
von Interesse enthält,
oder jegliches Medium, in dem die abzutrennenden Partikel dispergiert
werden können,
zu beschreiben. Das Molekül
von Interesse in einer Probe kann sich in jedem von einer Vielzahl
von Reinheitszuständen,
von zum Beispiel weniger als 1% rein bis höher als 90% rein, befinden.
Nützliche
Proben und Lösungen
umfassen rohe Zelllysate oder biologische Fluide, die von Menschen
oder anderen Lebewesen, Pflanzen, Bakterien oder Viren gewonnen
oder extrahiert werden, und die ein Molekül von Interesse enthalten können.
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Der
Begriff "Gefäß" wird verwendet,
um einen Träger,
ein Well, eine Platte, ein Röhrchen,
einen Objektträger,
ein Filter, einen Behälter
oder eine Schale, der/die die Probe oder die Lösung während hier beschriebener Reinigungs-
oder Isolierungsprozeduren enthält,
zu beschreiben.
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Der
Begriff "Affinitätspartikel" wird verwendet,
um jedes Partikel, das einen Affinitätsliganden trägt, der in
der Lage zu einer Bindung (Bildung eines Affinitätskomplexes) mit einem Molekül von Interesse
ist, zu beschreiben. Jeder Affinitätsligand, der eine annehmbare
Affinität
und Spezifität
für das
Molekül
von Interesse unter den Bedingungen des Kontaktierungsschritts aufweist,
kann verwendet werden. Solche Affinitätsliganden zur Verwendung auf
Partikelmatrices umfassen, ohne Einschränkung, Antikörper für ein bestimmtes
Antigen, Antigene für
einen bestimmten Antikörper,
Antikörper,
die eine Molekülklasse,
wie z. B. eine Klasse von IgG-Molekülen (z. B. Anti-Human-IgG,
Anti-Maus-IgG),
erkennen, Streptavidin (oder Streptavidin-markierte Fusionsproteine)
zum Binden von Biotin oder Biotin-markierten Fusionsproteinen, Glutathion
zum Binden von GST, Cellulose zum Binden von CBD, Amylose zum Binden
von MBP, Ionenaustauschharze, zur Ausbildung von Wechselwirkungen
befähigte
hydrophobe Harze, Oligo-dT zum Binden eines Poly-A-Schwanzes von mRNA,
Nukleinsäurepolynukleotide
zum Binden von komplementären
Polynukleotiden, Liganden zum Binden von Zellen (d. h. Binden von
Molekülen
für Zelloberflächenmarker),
Phagenliganden, Antikörper,
die Zell- oder Phagenoberflächenantigene
erkennen, und jeden anderen Typ von Polypeptid, Nukleotid oder kleinem
Molekül,
der zu Affinitätswechselwirkungen
mit einem Bindungspartner, egal ob einem weiteren Protein, DNA,
RNA oder kleinem Molekül,
in der Lage ist. Besondere Erwähnung
finden Metallchelataffinitätspartikel,
insbesondere Nickelionenchelatmaterialien, wie z. B. Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA)-beschichtete
Agarosebeads.
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Der
Begriff "Matrixmaterial" wird verwendet,
um jedes einer Vielzahl von festen Materialien, die in einer Probe
oder einer Lösung
dispergierbar sind, zu beschreiben. Solche Materialien sind wohlbekannt
und umfassen zum Beispiel Agarose, Silika, Nitrocellulose, Cellulose,
Acrylamid, Latex, Polystyrol, Polyacrylat, Polymethacrylat, Polyethylenpolymere,
wie z. B. Polyvinylalkohol, Glasspartikel, Silikate, wie z. B. Calcium-,
Magnesium- und Aluminiumsilikate, Metalloxide, wie z. B. Titanoxide,
Zinnoxide usw., Apatite und deren Kombinationen. Solche Materialien
trifft man üblicherweise
in der Form fein verteilter Pulver an, wobei die Materialien die Form
von kleinen Partikeln oder Beads aufweisen, so dass eine Suspension
in einer Lösung
eine Matrix aus Partikeln bildet, die bei ausreichender Konzentration
die Konsistenz eines Harzes oder Gels annimmt. Partikelmaterialien,
die in der Lage sind, ein Molekül
von Interesse in einer Lösung
zu binden, werden als "Affinitätspartikel" oder eine "Affinitätsmatrix" bezeichnet. Matrixmaterialien
können
magnetisch sein. Der Begriff "magnetisches
Matrixmaterial" wird
verwendet, um ein Matrixmaterial zu beschreiben, das Metallpartikel
enthält,
die zu einem Magnetfeld hingezogen werden. Die magnetisch anziehbaren
Metall- oder Metalloxidpartikel sind überall oder in dem Kern der
Matrixpartikel eingebettet. Sofern nicht anders angegeben, werden
die Begriffe "Partikel" und "Beads" bei einem Beschreiben
der in den Verfahren der Erfindung nützlichen Matrixmaterialien
untereinander austauschbar verwendet.
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Der
Begriff "Einführen eines
magnetischen Feldes" wird
verwendet, um jeglichen Mechanismus zu beschreiben, durch den eine
Magnetkraft angelegt wird, um die magnetischen Matrixpartikel anzuziehen
oder zu sammeln. Das magnetische Feld kann durch jede Anzahl an
Verfahren, einschließlich
aber nicht beschränkt auf
automatisierte Verfahren, die einen einzelnen oder mehrere Magnete
an verschiedenen Positionen eines Gefäßes, das die magnetischen Partikel
enthält,
einführen,
um die magnetischen Partikel zu sammeln oder vorübergehend zu immobilisieren,
oder durch manuelle Lokalisierung eines Magnets, um dasselbe Ergebnis zu
erzielen, eingeführt
werden.
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Der
Begriff "His-Tag-Protein", "6x-His-Tag-Protein" oder "Poly-His-Tag-Protein" wird verwendet,
um ein Fusionsprotein zu beschreiben, in dem an ein Protein von
Interesse eine ein Metall chelatisierende Gruppe gebunden ist, die
ein Polypeptidsegment bestehend aus einer Mehrzahl von Histidinresten
oder anderen chelatisierenden Aminosäuren, wie z. B. Cystein, Arginin
oder Serin, insbesondere bevorzugt ein Segment, das vollständig aus Histidinresten
besteht, aufweist. Vorzugsweise weist die Mehrzahl von Histidinresten
zumindest zwei oder mehrere, insbesondere bevorzugt sechs solche
Reste, die ein "6x-His-Tag"-Protein bilden,
auf. Fusionsproteine, die einen Affinitätspeptidtag enthalten, werden
leicht aus Proben einschließlich
Kulturen aus rekombinanten eukaryotischen und prokaryotischen Organismen,
die transformiert sind, um solche Fusionsproteine zu erzeugen, gereinigt.
Die Fusionsproteine, die ein Affinitätspeptid enthalten, können auch
zum Testen auf ein Molekül
von Interesse verwendet werden. Die Affinität eines Poly-His-Tags für Kupfer,
Nickel, Kobalt oder Zink ermöglicht
es, dass das Fusionsprodukt unter Verwendung der Metallchelataffinitätschromatographie
(Hochuli et al., Bio/Technology, 6: 1321–1325 (1988)) mit bis zu 95%
Reinheit schnell von der Masse an anderen bakteriellen Proteinen
abgetrennt wird. Diese Affinität
ermöglicht
auch ein wirksames Fangen eines Moleküls von Interesse und ein Prüfen auf
seine Gegenwart in einer bekannten oder unbekannten Probe. Das Fusionsprotein
ermöglicht
auch Bindungsuntersuchungen und Fangassays. Weitere Affinitätstags können ebenfalls
verwendet werden und werden unten erörtert.
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In
der vorliegenden Erfindung kann ein Detergens während der ganzen hier beschriebenen
Verfahren dazugegeben werden, um eine Abtrennung und eine Sammlung
von Partikelsubstraten zu verbessern. In bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung ist in dem Bindungsschritt, wenn die Probe und die
Affinitätspartikel
vereinigt werden, das heißt,
wenn das Molekül
von Interesse zuerst mit der Affinitätsmatrix in Kontakt gebracht
wird, ein Detergens zugegen (siehe Beispiele 1–3). Das Detergens kann vor
dem Dazugeben der Affinitätspartikel
zu der Probe dazugegeben werden. Alternativ kann das Detergens eingebracht
werden, nachdem die Affinitätspartikel
und die Probe zunächst
gemischt oder in Kontakt miteinander gebracht wurden (siehe Beispiel
4). Affinitätsbeads
können
auch in einer wässrigen
Lösung
oder einem Puffer, der ein Detergens enthält, suspendiert werden und
dann mit einer Probe, die ein Molekül von Interesse enthält, vereinigt
werden. Die Beads können
auch mit einem Detergens inkubiert, gewaschen, aufbewahrt und später verwendet
werden, während
die Vorteile der vorliegenden Erfindung dennoch realisiert werden.
Vorzugsweise werden die Beads einem Detergens ausgesetzt, nachdem
eine Bindung an ein Molekül
von Interesse stattgefunden hat, aber bevor die Beads gesammelt
oder konzentriert werden.
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Zwar
möchte
man nicht an irgendeine wissenschaftliche Theorie gebunden sein,
doch sind die Affinitätsbeads
bei Aussetzung an ein Detergens wie hier beschrieben, im Stande,
kompaktere Aggregate oder Pellets zu bilden, wenn sie, z. B. durch
Zentrifugieren oder das Anlegen eines magnetischen Felds (wo magnetische
Beads verwendet werden), gesammelt oder konzentriert werden. Es
scheint, dass die Gegenwart eines in dem Reinigungsprozess verwendeten
Detergens die Ladungseigenschaften des Matrixmaterials ändert, so dass
während
einer Sammlung eine kompaktere Anordnung von Matrixpartikeln oder
Beads gebildet wird. Die kompakte Anordnung ermöglicht eine wirksamere Entfernung
von ungebundenen Molekülen
und demzufolge ein wirksameres Waschen oder Eluieren des Moleküls von Interesse.
Das verbesserte Packen der Affinitätsbeads während eines Sammelns reduziert
einen Beadverlust während
der Verarbeitung und verbessert dadurch die Ausbeute an gebundenen
Molekülen
und verbessert die Zuverlässigkeit
und die Folgerichtigkeit von Messungen oder Assays, die die Beads
verwenden.
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Es
sollte darauf geachtet werden, dass die Detergenskonzentration die
Bindung des Moleküls
von Interesse an die Affinitätspartikel
nicht wesentlich beeinträchtigt.
Um solch eine Beeinträchtigung
während
der Bindungsphase einer Abtrennungsprozedur zu vermeiden, kann das
Detergens aus diesem Bindungsschritt weggelassen werden und während der
Wasch- oder Eluierungsschritte des Verfahrens eingebracht werden. Man
sollte allerdings nicht vergessen, dass jegliche Sammel- oder Waschschritte,
die vor der Einbringung eines Detergens gemäß der Erfindung ausgeführt werden,
durch (vermeidbaren) Beadverlust und verringerte Ausbeute und Genauigkeit
gekennzeichnet sind.
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Die
Verfahren dieser Erfindung sind besonders nützlich, wo die Affinitätsmatrix
in der Form magnetisch anziehbarer Partikel oder "magnetischer Beads", wie man sie in
der Technik üblicherweise
bezeichnet, erfolgt.
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Die
Gegenwart eines Detergens ist das entscheidende Element der Verfahren
der vorliegenden Erfindung. Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung
kann das Detergens entweder durchweg durch die ganze Prozedur zugegen
sein oder es kann dazugegeben werden, wenn die Probe mit den Affinitätspartikeln
in Kontakt gebracht wird. Sobald die Beads mit dem Detergens behandelt
worden sind, können
alle nachfolgenden Schritte in der Prozedur mit oder ohne Detergens
ohne eine wesentliche Auswirkung auf Ausbeute oder Reproduzierbarkeit
als Folge eines Beadverlusts ausgeführt werden (siehe Beispiel
6).
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Wenn
das Detergens am Beginn der Prozedur zu der Probe dazugegeben wird,
muss man Acht geben, so dass die Konzentration des Detergens die
Wechselwirkung des Moleküls
von Interesse und des Matrixbeads nicht beeinträchtigt. Die Konzentration des
Detergens in den hier beschriebenen Abtrennungsverfahren liegt in
dem Bereich von ungefähr
0,0005% bis 2,0% (V/V).
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Detergenzien
bilden eine Klasse von polaren Lipiden, die sich durch ihre Löslichkeit
in Wasser auszeichnen. Sie weisen eine zweiteilige Struktur mit
einem hydrophoben Teil und einem hydrophilen Teil auf. Die Gegenwart
dieser zwei Gruppen macht Detergenzien nicht nur bei einer Lysis
von Lipidmembranen, einer Solubilisation von Antigenen und einem
Waschen von Immunkomplexen nützlich,
sondern sie kann auch die Ladungseigenschaften von Materialien in
einer Probe, wie z. B. in hier bevorzugten Ausführungsformen die Ladungseigenschaft
von magnetischen Affinitätspartikeln, ändern. Viele
verschiedene Chemikalien können
als Detergenzien bezeichnet werden und können in den Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Die meisten Detergenzien weisen hydrophobe
Bereiche mit einer 6- bis 16-gliedrigen Alkylkette (entweder mit oder
ohne eine Phenol-Struktur)
oder eine Struktur, die dem aromatischen hydrophoben Anteil von
Gallensalzen gleicht, auf. Der hydrophobe Bereich vieler Detergenzien
kann Lipiddoppelschichten und Zellmembrane zerreißen, was
zu einer Auflösung
der Doppelschicht oder Membrankomponenten führt. Solche Detergenzien sind
in einer Vielzahl von biochemischen Protokollen einschließlich hier
beschriebener Verfahren besonders nützlich.
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Detergenzien
werden auch basierend auf dem in einem Detergensmolekül vorhandenen
Typ von hydrophiler/n Gruppe(n) klassifiziert. Diese Gruppen können anionisch,
kationisch, amphoter, nichtionisch und zwitterionisch sein. Gewöhnlich sind
nichtionische Detergenzien (z. B. Tween 20 und Triton X-100) und
zwitterionische Detergenzien (z. B. CHAPS) geringer denaturierend
zu Proteinen als ionische Detergenzien (z. B. SDS). Von den ionischen
Detergenzien sind Natriumcholat und Natriumdesoxycholat geringer
denaturierend als andere ionische Detergenzien.
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Viele
Eigenschaften von Detergenzien können
durch drei Werte beschrieben werden: die kritische Mizellbildungskonzentration
(CMC), das Mizellenmolekulargewicht (MMW) und die Hydrophil-Lipophil-Balance (HLB).
Bei der CMC handelt es sich um die Konzentration, bei der sich monomere
Detergensmoleküle
verbinden, um Mizellen zu bilden. Unterhalb dieser Konzentration
kommen Detergensmoleküle
in erster Linie als Monomere vor, die sich an hydrophobe Moleküle binden
oder sie spalten können,
ohne dass die hydrophoben Moleküle
in wässrigen
Lösungen
gelöst
werden. Oberhalb der CMC bilden die Detergensmoleküle Mizellen, die
bei einem Lösen
hydrophober Moleküle
in wässrigen
Lösungen
wirksam werden. Bei dem MMW handelt es sich um das Molekulargewicht
einer durch ein bestimmtes Detergens gebildeten Mizelle. Es kann
schwierig sein, Detergenzien mit großen MMWs, wie z. B. die nichtionischen
Detergenzien, durch Dialyse zu entfernen.
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Allerdings
besteht ein Vorteil bei einer Verwendung einiger nichtionischer
Detergenzien in der Fähigkeit,
Moleküle
in einem nicht denaturierten Zustand, der maßgebliche Funktionseigenschaften
der Moleküle bewahrt,
zu lösen.
Die HLB gibt einen numerischen Wert für die gesamten hydrophilen
Eigenschaften des Detergens an. Werte oberhalb von 7 zeigen an,
dass das Detergens in Wasser löslicher
ist als in Ölen.
Für die meisten
biologischen und biochemischen Protokolle sind HLB-Werte von 12,
5 und höher
erforderlich. Zwar gibt es Ausnahmen, doch können die HLB-Werte verwendet
werden, um einen allgemeinen Überblick
darüber zu
geben, wie denaturierend ein Detergens gegenüber Biomolekülen, besonders
Proteinen, ist. Werte zwischen 12 und 16 sind relativ nicht denaturierend,
während
Werte oberhalb von 20 eine zunehmende Denaturierungseigenschaft
anzeigen. Allerdings trifft diese Korrelation nicht immer zu und
unterscheidet sich von einem Protein zum anderen. Sowohl die CMC
als auch das MMW variieren bei unterschiedlichen Puffern. Gewöhnlich reduziert
ein Dazugeben von Salzen die CMC und erhöht die Mizellengröße. Die
Zugabe von so wenig wie 100 mM NaCl kann in diesen Werten dramatische Änderungen
induzieren. Das Änderungsausmaß bei der
CMC oder dem MMW, hervorgerufen durch ein Verändern der Temperatur oder des
pH, variiert auch abhängig
von dem Detergens. Zwei Detergenzien, die durch Temperatur und pH
drastisch beeinflusst werden, sind Natriumdodecylsulfat (SDS) (Temperatur
unterhalb von 20°C
führt oft
zu Kristallisation) und Natriumdesoxycholat (DOC) (unter ungefähr pH 7,5
unlöslich).
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Die
Detergenzien, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können,
können aus
jeglichen anionischen, kationischen nichtionischen oder zwitterionischen
Detergenzien und deren Kombinationen ausgewählt werden. In der vorliegenden
Erfindung nützliche
anionische Detergenzien umfassen – sind aber nicht beschränkt auf – Natriumdodecylsulfat
(SDS), Natriumdodecyl-N-sarkosinat, Natriumcholat, Natriumdesoycholat.
In der vorliegenden Erfindung nützliche
kationische Detergenzien umfassen – sind aber nicht beschränkt auf – Dodecyltrimethylammoniumchlorid,
Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB). Die in den hier beschriebenen
Verfahren nützlichen
zwitterionischen Detergenzien umfassen – sind aber nicht beschränkt auf – 3-[(Cholamido-propyl)-dimethyl-ammonium]-1-propansulfonat
(CHAPS), BigCHAPS, CHAPSO, DDMAU, N-Dodecyl-N,N-dimethylglycin,
Lauryldimethylaminoxid (LADAO, LDAO) und 3-Dodecyl-dimethylammonium-propan-1-sulfonat.
In der vorliegenden Erfindung nützliche
nichtionische Detergenzien umfassen – sind aber nicht beschränkt auf – Polyoxyethylen
(10) cetylalkohol (z. B. Brij 56TM, ICI
Americas Inc.); Polyoxyethylen (20) cetylalkohol (z. B. Brij 58TM, ICI Americas Inc.); Polyoxyethylen (23)
laurylalkohol (z. B. Brij 35TM, ICI Americas
Inc.); Polyoxyethylen (4-5) p-t-octylphenol (Triton X-45); Polyoxyethylen
(7-8) p-t-octylphenol (Triton X-114); Polyoxyethylen (9) p-t-octylphenol
(Nonidet P-40); Polyoxyethylen (9-10) p-t-octylphenol (Triton X-100);
Polyoxyethylen (9-10) nonylphenol (Triton N-101); Polyoxyethylen
(20) sorbitolmonolaurat (z. B. Tween 20TM,
ICI Americas Inc.); Polyoxyethylen (20) sorbitolmonopalmitat (z.
B. Tween 40TM, ICI Americas Inc.); Polyoxyethylen
(20) sorbitolmonooleat (z. B. Tween 80TM,
ICI Americas Inc.); Octyl-β-Glucosid; APO-10; APO-12;
Cyclohexyl-n-ethyl-β-D-maltosid;
Cyclohexyl-n-hexyl-β-D-maltosid; Cyclohexyl-n-methyl-β-maltosid; n-Decanoyl-sucrose;
n-Decyl-β-D-Glucopyranosid; n-Decyl-β-maltopyranosid;
n-Decyl-β-D-thiomatosid;
n-Dodecanoylsucrose und Heptan-1,2,3-triol. In den Verfahren der
vorliegenden Erfindung werden nichtionische Detergenzien, wie z.
B. Tween 20, Triton X-100 und Nonidet P-40, insbesondere bevorzugt
verwendet. Verfahren der Erfindung, die solche nichtionischen Detergenzien
umfassen, sind besonders wirksam bei einer Reduzierung eines Verlusts
an Affinitätspartikeln
oder Beads während
verschiedener Handhabungen (z. B. Beadsammlung, Waschungen, Eluierung),
einem Erhöhen
von Ausbeuten an Molekülen
von Interesse, die unter Verwendung von Partikelaffinitätsmatrices
isoliert werden, einem Erhöhen
der Reproduzierbarkeit (Reduzieren von Varianz) von Ergebnissen,
einem Erhöhen
des in einem Assay erzielten Signals, einem Erhöhen eines Signal-Rausch-Verhältnisses
und einem Erhöhen
des Signals, das aus der Bindung des Moleküls von Interesse in einem Fangassay
erfolgt.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung sind leicht für weit verbreitete
Probengefäße, wie
z. B. Multiwellplatten, adaptierbar. Diese Multiwellsysteme sind
für eine
Verwendung in halb- oder vollautomatisierten Assaysystemen, die
handelsüblich
sind, besonders gut geeignet. Eine Reihe von verschiedenen automatisierten
Systemen ist erhältlich
und könnte
mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die PCT-Veröffentlichung
WO 96/31781 zum Beispiel beschreibt ein automatisiertes System,
das magnetische Beads verarbeitet und das bis zu 16 speziell entwickelte
Probengefäße verarbeitet.
Der Magnet wird auf den verschiedenen Stufen des Assayprozesses
in Relation zu den Röhrchen
bewegt, um die Bindungs-, Wasch- und Eluierungsschritte des Assays
zu unterstützen.
Die U.S.-Patente 5,128,103 und 5,147,529 beschreiben auch ein automatisiertes
System, in dem einzelne Probenröhrchen
automatisch an einem oder mehreren Magneten vorbeigeleitet werden,
um Beads, die gebundene Moleküle
von Interesse enthalten, aufzuspüren.
Die Patentveröffentlichungen
WO 97/44671, WO 97/31105 und
EP
0 691 541 beschreiben Roboter oder Vorrichtungen, in denen
magnetische Beads von Flüssigkeit
innerhalb einer Pipettenspitze abgetrennt werden, indem ein externer
Magnet neben der Spitze positioniert wird. Das ermöglicht es,
dass bis zu 24 Proben gleichzeitig verarbeitet werden. In dem U.S.-Patent 5,458,785
wird eine Magnetkonstruktion beschrieben, die die Entfernung von
Flüssigkeiten von
den magnetischen Beads durch automatisiertes Pipettieren ermöglicht.
Dieses System weist einen ringförmigen
Magnet, der das Probengefäß umgibt,
und einen zweiten Magnet, der am Boden des Probengefäßes positioniert
ist, auf. Ein Positionieren des Probengefäßes bei einem dieser Magneten
beeinflusst die Form und die Dichte des magnetischen Beadpellets,
wobei die Beads immobilisiert werden, um durch eine Pipettierung die
Entfernung von Flüssigkeiten
zu ermöglichen,
ohne die Beads zu unterbrechen oder mitzureißen. Dieses Magnetsystem ist
allerdings nicht für
Multiwellplatten geeignet.
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Die
vorliegende Erfindung verbessert die Anwendung von Multi- und Einwellprozeduren,
da die Gegenwart eines Detergens auf verschiedenen Stufen des Isolierungsschemas
eine bessere Abtrennung von magnetischen Beads oder Partikeln von
den Wellwänden
und eine wirksamere Sammlung all der Beads zu der Quelle des magnetischen
Felds hin ermöglicht.
Eine bessere Abtrennung und Sammlung von Beads verbessert die Ausbeute
des Moleküls
von Interesse, das an die magnetischen Affinitätsbeads gebunden wird, und die
Reproduzierbarkeit der Assays in den vorher genannten automatisierten
Systemen. Demgemäß reduzieren
diese Verfahren auch die Anzahl von Malen, die eine Prozedur ausgeführt werden
muss, um ein Molekül von
Interesse in einer Probe(n) zu isolieren oder zu detektieren. Die
vorliegende Erfindung kann auf das Reinigungs- oder Isolierungsschema
einer Vielzahl von Molekülen,
umfassend – aber
nicht beschränkt
auf – Peptide,
Polypeptide, Proteinnukleotide, Nukleinsäuren (Polynukleotide), Kohlenhydrate,
Lipide und organische Moleküle
umfassend synthetisierte organische Moleküle oder jeden Typ von Molekül oder Molekülkomplex,
abtrennbar durch Affinitätswechselwirkungen
mit einem geeigneten Substrat, angewendet werden.
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Affinitätsbeads
zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung zeichnen sich durch
einen Oberflächenaffinitätsliganden
für ein
Molekül
von Interesse aus. Jeder Affinitätsligand,
der unter den Bedingungen des Kontaktierungsschritts eine annehmbare
Affinität
und Spezifität
für das
Molekül
von Interesse aufweist, kann verwendet werden. Man kennt viele Typen
von Affinitätsliganden,
und geeignete Affinitätsliganden
zur Verwendung auf Partikelmatrices in der vorliegenden Erfindung
umfassen, ohne Einschränkung,
Antikörper
für ein
bestimmtes Antigen, Antigene für
einen bestimmten Antikörper,
Antikörper,
die eine Molekülklasse,
wie z. B. eine Klasse von IgG-Molekülen (z. B. Anti-Human-IgG,
Anti-Maus-IgG) erkennen, Streptavidin (oder Streptavidin-markierte
Fusionsproteine) zum Binden von Biotin oder Biotin-markierten Fusionsproteinen,
Glutathion zum Binden von GST, Cellulose zum Binden von CBD, Amylose
zum Binden von MBP, Ionenaustauschharze, zur Ausbildung von Wechselwirkungen
befähigte
hydrophobe Harze, Oligo-dT zum Binden eines Poly-A-Schwanzes von mRNA,
Nukleinsäurepolynukleotide
zum Binden komplementärer
Polynukleotide, Liganden zum Binden von Zellen (d. h. Binden von
Molekülen
für Zelloberflächenmarker),
Phagenliganden, Antikörper,
die Zell- oder Phagenoberflächenantigene
erkennen, und jeden anderen Polypeptid-Typ oder Komplex (siehe 1 und
Erörterung
unten), der zu Affinitätswechselwirkungen
mit einem Bindungspartner, egal ob einem anderen Protein, DNA, RNA
oder kleinem Molekül,
in der Lage ist. Besondere Erwähnung
finden Metallchelataffinitätsliganden,
insbesondere Nickelionenchelatmaterialien, wie z. B. Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA)-beschichtete
Partikel. Ni-NTA-beschichtete magnetische Agarosebeads werden insbesondere
zur Isolierung von His-Tag-Molekülen
von Interesse bevorzugt.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich zum
Durchführen
von Abtrennungen auf Basis von Protein/Protein-Wechselwirkungen.
Das Zielmolekül
von Interesse kann entweder bekannt oder unbekannt sein. Affinitätsabtrennungsanwendungen
werden besonders wichtig beim Beurteilen von unbekannten Proteinen
und Entschlüsseln
ihrer Funktion in der Proteomik, z. B. wo eine große Menge
an genetischem Material verarbeitet wird und ein Bestimmen der Funktionalität der codierten
Proteine unerlässlich
ist.
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Die
Abtrennungstypen, für
die die Entdeckung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfassen, ohne
Einschränkung,
Assay- und/oder Reinigungsverfahren, Reinigungs- und/oder Fangassays,
Fang- oder Affinitätsimmobilisierung
eines Moleküls
von Interesse, Detektion eines Moleküls von Interesse, Reinigung
(d. h. Isolierung, Eluierung und Gewinnung) eines Moleküls von Interesse
usw. 1 stellt typische Abtrennungen, die erwogen werden,
dar: Zum Beispiel kann in 1A ein Affinitätsbead bestehend
aus einem Partikelmatrixmaterial (2) beschichtet mit Affinitätsliganden
(4), verwendet werden, um ein Molekül von Interesse (6), bei
dem es sich um jede Art von Bindungspartner (d. h. Molekül, Antigen,
Protein, Polynukleotid usw.) für
den Affinitätsliganden
handeln kann, zu binden oder zu fangen, wie oben erörtert wird.
Nach dem Fang kann das Molekül
von Interesse (6) auf dem Affinitätsbead (2 + 4)
detektiert oder unter Verwendung bekannter Prozeduren nach einer
Abtrennung von der ursprünglichen
Probe aus dem Affinitätsbead
eluiert werden. Bei einem weiteren in 1B dargestellten
Typ von erwogener Affinitätswechselwirkung
werden ein Affinitätsbead,
das aus Matrixpartikeln (2) besteht und ein Affinitätsligand
(8) verwendet, um ein Molekül von Interesse (6),
z. B. ein Protein durch eine synthetische Bindungsstruktur (10),
die zu einer Reaktion mit dem Affinitätsliganden (8) auf
dem Bead im Stande ist, zu immobilisieren. Dieses Affinitätsbead/immobilisierter
Molekülkomplex
kann darüber
hinaus verwendet werden, um mit einem weiteren Molekül (12),
d. h. welches zu einer Bindung an ein Molekül (6) oder den Affinitätskomplex
(2 + 8 + 10 + 6) im Stande ist,
zu interagieren. Das Affinitätsbead
kann zum Beispiel ein Agarosebead (2) mit Chelatmetallionen
(8), wie z. B. mit einem Ni-NTA magnetischen Agarosebead,
umfassen, und ein Protein von Interesse (6) kann auf den
Affinitätsbeads
(2 + 8) durch einen 6x-His-Tag (10) gebunden
an das Protein (6), dessen Tag (10) mit dem Metallchelat
(8) auf dem Bead (2) reagiert, gefangen werden.
Nach der Bildung dieses Komplexes kann das Protein (6)
verwendet werden, um ein weiteres Molekül, das im Stande ist, mit einem
weiteren Teil des Proteins zu reagieren, zu fangen. Man erkennt,
dass dieses Verfahren verwendet werden kann, um das Protein (6)
zu fangen, dann zu detektieren oder zu eluieren, um den Proteinbindungspartner
(12) zu fangen und dann zu detektieren oder zu eluieren,
um den Komplex des Proteins (6) und seines Bindungspartners
(12) zu fangen und dann zu detektieren oder zu eluieren
oder um das Protein (6) und/oder den Bindungspartner (12)
aus einer Lösung,
zu der die Affinitätsbeads dazugegeben
werden, zu entfernen. Schließlich
stellt 1C die Verwendung eines Affinitätsbeads
bestehend aus einem Bead (2) beschichtet mit einem Affinitätsliganden
(4) zur Bindung mit einem vorgeformten Komplex (13)
der Bindungspartner (12 und 14) dar. Die Komplexe
können
gemäß der gewünschten
Verwendung gefangen, dann detektiert, eluiert oder entfernt werden.
Gemäß der vorliegenden
Erfindung führt
eine Behandlung der Affinitätsbeads
(2, mit 4, 8) mit geringen Mengen eines
Detergens an einem Punkt in diesen Prozessen, bevor die Beads zur
Abtrennung von einer Lösung
oder einer Probe gesammelt werden, zu einer besseren Verarbeitung
der Beads (und was immer sie komplexiert haben mögen) und reduziertem Beadverlust
während einer
Abtrennung und einer Resuspension.
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In
Detektionsverfahren kann das Molekül von Interesse unter Verwendung
jeder Art von Assaysignal beobachtet werden (z. B. chromogene, fluoreszierende,
radioaktive oder enzymatische Reaktion).
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In
Reinigungsverfahren kann die Reinigungsstrategie abhängig davon,
ob eine native Form eines Moleküls
oder die denaturierte Form des Moleküls gereinigt wird, variieren.
Da die biochemischen Eigenschaften des Moleküls von Interesse von dem einzelnen
Molekül
selbst abhängig
sind und diese Eigenschaften eine Bindung an Affinitätspartikel
nachhaltig beeinflussen können,
variiert die genaue Prozedur zur Reinigung einer bestimmten Form
eines Moleküls.
Gewöhnlich
wird die Reinigung eines Moleküls
von Interesse durch Minimieren nichtspezifischer Bindung an Affinitätspartikel
verbessert. Zum Beispiel werden in dem Fall einer Isolierung eines
His-Tag-Proteins nichtspezifische Wechselwirkungen dadurch minimiert,
dass in den ersten Schritten in der Reinigung niedrige Konzentrationen
an Imidazol in den Lysis/Bindungspuffern verwendet werden. Die Gegenwart
von Imidazol mit Konzentrationen bis zu 20 mM verhindert in wirksamer
Weise die Bindung vieler kontaminierender Proteine an die Affinitätspartikel,
ohne dass die Bindungseigenschaften des His-Tag-Proteins von Interesse
beeinflusst werden.
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Falls
ein Protein von Interesse von Zellen gereinigt werden muss, können die
Zellen, die das Protein von Interesse enthalten, unter Verwendung
von Ultraschall oder Homogenisierung nach einer Behandlung mit Lysozym
(zum Beispiel mit 1 mg/ml) lysiert werden. Solche Prozeduren können bei
Zellen, die in Multiwellplatten, wie z. B. 96-Well Flachbodenplatten,
kultiviert werden, durchgeführt
werden. Um einen Proteinabbau zu verhindern, werden Zellen und Puffer üblicherweise
zu allen Zeiten bei 0°C–4°C gehalten,
und die Zugabe von Proteaseinhibitoren kann ebenfalls erforderlich
sein. Bei nativen Bedingungen sollten alle Puffer eine ausreichende
Ionenstärke
enthalten, um nichtspezifische Wechselwirkungen zwischen Proteinen
und magnetischen Affinitätspartikeln,
falls sie verwendet werden, zu verhindern. Zum Beispiel sollte die
Mindestsalzkonzentration während
Bindungs- und Waschungsschritten üblicherweise ungefähr 300 mM
NaCl betragen und die Höchstkonzentration
sollte nicht 2 M NaCl überschreiten.
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Für denaturierende
Bedingungen werden Zellen üblicherweise
entweder in 6 M Guanidin-Hydrochlorid (GuHCl)
oder 8 M Harnstoff lysiert. Es wird bevorzugt, die Zellen in dem
milderen Denaturans, Harnstoff, zu lysieren, so dass das Zelllysat
direkt auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel
analysiert werden kann. Allerdings ist GuHCl ein wirksameres Solubilisations-
und Zellysisreagens und kann zum Solubilisieren einiger Proteine
bevorzugt werden.
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Das
Binden kann mit Proben unter nativen oder denaturierenden Bedingungen
ausgeführt
werden. Für einige
Moleküle
von Interesse kann eine Abtrennung auch ausgeführt werden, ohne die Proben
zu klären,
man sollte aber darauf achten, dass die Probe nicht zu konzentriert
ist. Zum Beispiel sollte das Volumen einer rohen, ungereinigten
E. coli-Zelllysatprobe nicht mehr als 1/5 oder 1/10 des Kulturvolumens
betragen (z. B. werden Zellen aus 1 ml Kultur vorzugsweise in 0,2
ml oder allermindestens 0,1 ml Lysispuffer lysiert). Desoxyribonukleinsäure (DNA),
die die Abtrennung der Beads stören
kann, kann durch eine DNase-Behandlung eliminiert werden. Wenn ungeklärte Lysate
verwendet werden, können
Ausbeute und Reinheit isolierter Proteine etwas reduziert sein.
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Waschungs-
und Eluierungschritte werden in Erwägung gezogen, wo eine Gewinnung
hoch gereinigter oder konzentrierter Zielmoleküle erwünscht wird. Für viele
Anwendungen sind Wasch- und/oder Eluierungsschritte jedoch nicht
erforderlich – wie
da, wo das Ziel der Isolierungsprozedur nur eine Detektion der Gegenwart
oder der Abwesenheit eines Moleküls
ist, oder wo das Ziel darin besteht, ein bestimmtes Molekül von Interesse
selektiv zu entfernen und eine Probe (Überstand), die im Wesentlichen
frei von dem Molekül
von Interesse ist, zu erhalten. Für solche Anwendungen kann die
gebundene Matrix/Molekülkomplex
mit jeder Reihe von in der Technik bekannten Verfahren umfassend,
aber nicht beschränkt
auf, Antikörperdetektion
des Komplexes oder des immobilisierten Zielmoleküls, auf die Gegenwart oder
die Abwesenheit des Moleküls
untersucht werden. Für
Anwendungen, bei denen ein Waschungsschritt eingesetzt wird, kann
jede geeignete Waschlösung
verwendet werden. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung eines Waschpuffers
50 mM NaH2PO4, 300
mM NaCl, 20 mM Imidazol bei pH 8,0 für Assays von physiologischen
Proben, wo magnetische Beads verwendet werden, betragen. Die Zusammensetzung
des Waschpuffers für
eine Abtrennung unter denaturierenden Bedingungen kann 8 M Harnstoff,
0,1 M NaH2PO4, 0,01
M Tris-Cl, 0,05% Tween 20, pH 6,3 betragen.
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Waschungsschritte
in einem Abtrennungsprozess, wo magnetisch anziehbare Affinitätsbeads
verwendet werden, werden ausgeführt,
indem zuerst ein magnetisches Feld (das die Beads und (jegliche
gebundenen Moleküle
von Interesse) gegen die Wand des Gefäßes neben dem magnetischen
Feld immobilisiert) angelegt wird und dann die ungebundenen Moleküle und der
Puffer (z. B. durch Pipettieren oder Dekantieren) entfernt werden,
wonach die magnetischen Beads in der Abwesenheit des magnetischen
Felds in einer Waschlösung resuspendiert
werden. Die nichtspezifische Bindung ungebundener Moleküle an die
magnetischen Beads kann durch Waschen mit Puffern mit leicht reduziertem
pH oder mit Puffern, die eine niedrige Konzentration an Imidazol
enthalten, verhindert werden. Nachdem die Matrixbeads in einer geeigneten
Waschlösung
resuspendiert werden, wird das magnetische Feld erneut eingeführt und
die Matrixbeads werden an der Quelle des magnetischen Felds gesammelt.
Eine Abtrennung der Beads von dem Überstand in jedem der oben
genannten Schritte kann ausgeführt
werden, indem das Gefäß umgekehrt
und der Überstand
ausgegossen wird (wobei die Beads durch den Magnet zurückbehalten
werden) oder indem der Überstand
manuell, halbautomatisch oder durch Roboter aus dem Gefäß gesaugt
oder pipettiert wird. Die Gegenwart des Detergens in jedem Abtrennungsschritt
gewährleistet
eine bessere Sammlung (Immobilisierung) der Affinitätsbeads
und führt
zu reduziertem Beadverlust. Waschschritte können beliebig oft wiederholt
werden, um Kontaminanten oder andere nichtspezifische und ungebundene
Moleküle
von den Affinitätsbeads
abzutrennen.
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Bei
einigen Abtrennungen kann eine Eluierung des gebundenen Moleküls von Interesse
aus Affinitätspartikeln
wünschenswert
sein. Wie bei Waschschritten kann auch ein Eluierungsschritt in
bestimmten Anwendungen, wie z. B. wenn es ausreicht, das Molekül von Interesse
auf der Affinitätsmatrix
lediglich zu immobilisieren und seine Gegenwart dort zu detektieren,
nicht erforderlich sein. Allerdings kann in Anwendungen, die den
Eluierungsschritt erfordern, eine Eluierung vorteilhaft in der Gegenwart
eines Detergens gemäß dieser
Erfindung durchgeführt
werden, um eine wirksame Abtrennung des Matrixmaterials von dem
eluierten Molekül von
Interesse zu ermöglichen.
Die Zusammensetzung des Eluierungspuffers variiert abhängig von
dem zu eluierenden Molekül.
Zum Beispiel kann die Zusammensetzung des in Abtrennungen unter
nativen Bedingungen verwendeten Eluierungspuffers 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl,
250 mM Imidazol, bei pH 8,0 betragen. Die Zusammensetzung des Eluierungspuffers
zur Abtrennung unter denaturierenden Bedingungen kann jedoch 8 M
Harnstoff, 0,1 M NaH2PO4,
0,01 M Tris-Cl, 0,05% Tween 20, bei pH 4,5 betragen. Als ein bestimmtes
Beispiel können
6x-His-Tag-Proteine
aus magnetischen NTA-Agarosebeads entweder durch Konkurrenz mit
Imidazol oder durch Reduzieren des pH freigesetzt werden. Monomere
werden gewöhnlich
mit Imidazolkonzentrationen von höher als 100 mM oder bei ungefähr pH 5,9
freigesetzt, wohingegen Multimere mit 200 mM Imidazol oder bei ungefähr ph 4,5
freigesetzt werden. Gewöhnlich
werden Eluierungspuffer, die 250 mM Imidazol (pH 8) enthalten, oder
Puffer bei pH 4,5 (z. B. Puffer-E, Qiagen GmbH) empfohlen.
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In
dem Fall von 6x-His-Tag-Proteinen können in dem Eluierungsschritt
auch 100 mM EDTA verwendet werden, wenn sie durch magnetische Beads,
die Ni-NTA-Binder enthalten, gereinigt werden. EDTA chelatiert Nickelionen
und entfernt sie von den NTA-Gruppen. Das führt dazu, dass alles gebundene
Protein als ein Protein-Metall-Komplex eluiert.
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Weitere
Ausführungsformen
und Lehren der Erfindung werden durch die folgenden nicht beschränkenden
Beispiele zur Verfügung
gestellt.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1: Automatisierte
Reinigung von 6x-His-Tag-Thioredoxin unter nativen Bedingungen unter
Verwendung von Ni-NTA-beschichteten magnetischen Agarosebeads.
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Dieses
Beispiel demonstriert die positiven Auswirkungen der Zugabe eines
Detergens auf Ausbeute und Einheitlichkeit bei einer automatisierten
Proteinreinigungsprozedur unter Verwendung von ferromagnetischen
Agarosebeads unter nicht denaturierenden Bedingungen.
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E.
coli M15-Zellen (80 ml Aliquot), die ein 6x-His-Tag rekombinantes
Thioredoxin-Fusionsprotein
exprimieren, wurden in einem Lysispuffer (50 mM NaH2PO4, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 1
mg/ml Lysozym) lysiert. Das Lysat wurde zentrifugiert, um die unlysierten
Zellen und Zelldebris zu entfernen, und der Überstand (geklärtes Lysat)
wurde in 80 Wells einer 96-Well-Flachbodenmultiwellplatte aliquotiert.
Ein nichtionisches Detergens, Tween 20 (Sigma Inc.), wurde zu 40
der Proben zu einer Endkonzentration von 0,05% (V/V) dazugegeben.
Um die Auswirkung des Detergens auf die Proteinausbeute zu vergleichen,
enthielten all die während
der ganzen Prozedur verwendeten Puffer 0,05% (V/V) Tween 20. Die
in den Kontrollwells verwendeten Puffer enthielten während der
ganzen Prozedur kein Detergens. Alle Proben wurden auf einem automatisierten
Pipettiersystem (z. B. BioRobot 9600, Qiagen GmbH) platziert und
alle weiteren Pipettierschritte wurden automatisch ausgeführt. Zu
jeder Probe wurde ein 20 μl
Aliquot einer 5% (V/V)-Suspension aus Ni-NTA-beschichteten magnetischen
Agarosebeads dazugegeben und die Mischungen wurden 1 Stunde lang bei
Raumtemperatur auf einer Schüttlerplattform
bei 750 rpm inkubiert. Während
dieses Schritts wurde das Thioredoxinprotein spezifisch über seinen
6x-His (Hexahistidin)-Tag an die Ni-NTA-Gruppen auf den Agarosebeads
gebunden. Im Anschluss an die Bindung wurden alle ungebundenen Zellbestandteile
entfernt, indem die Multiwellplatte auf einem magnetischen Separator
für 96-Well-Platten
(z. B. 96-Well-Magnet,
Qiagen GmbH, 1999 Produktführer
Kat. Nr. 36915) platziert wurde, bei 300 rpm 1 Minute lang geschüttelt wurde,
um eine Beadabtrennung fertig zu stellen, und der Überstand
mit den Sonden des Roboters entfernt wurde. Dadurch, dass die in
der Gegenwart von Tween 20 und ohne Tween 20 verarbeiteten Proben
verglichen wurden, konnten klare Unterschiede in dem Abtrennungsverhalten
der magnetischen Beads festgestellt werden. Während Beads, die in Puffern,
die Tween 20 enthielten, suspendiert wurden, in einem kompakten
Pellet in dem magnetischen Feld nahe der Oberfläche der Flüssigkeit gesammelt wurden,
trennten sich Beads in Puffern ohne Tween in einem diffusen Pellet
am Boden jedes Wells ab. Die diffusen Pellets auf dem Boden der
Wells führten
zu Beadverlust während
des Pufferentfernungsschritts.
-
Anschließend wurde
die Multiwellplatte von dem Magnet entfernt. Die Beads wurden durch
die Zugabe von 200 μl
Waschpuffer (50 mM NaH2PO4,
pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, mit oder ohne 0,05% Tween 20)
in jedem Well resuspendiert und 2 Min. lang bei 750 rpm geschüttelt. Anschließend wurde
eine Entfernung des Waschpuffers durchgeführt, indem die Multiwellplatte
auf einen 96-Well-Magneten platziert wurde, bei 300 rpm 1 Min. lang
geschüttelt
wurde und der Überstand
aspiriert wurde. Der Waschschritt wurde ein zweites Mal mit einem
geringeren Volumen (100 μl)
wiederholt, um eine Resuspension der magnetischen Beads in einem geringen
Eluierungspuffervolumen zu ermöglichen.
Ein 60 μl-Aliquot eines Eluierungspuffers
(50 mM NaH2PO4,
pH 8,0, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, mit oder ohne 0,05% Tween
20) wurde zu den Beads dazugegeben und eine Eluierung wurde ausgeführt, indem
die Platte auf einer Schüttlerplattform
5 Min. lang bei Raumtemperatur bei 750 rpm inkubiert wurde. Die
eluierten Proteine wurden durch Platzieren der Multiwellplatte auf
dem 96-Well-Magneten und 2 Min. langem Schütteln der Platte bei 300 rpm
geerntet. Der das eluierte Protein enthaltende Puffer wurde dann
in eine neue Multiwellplatte transferiert. Der Proteingehalt in
dem Eluat jedes Wells wurde durch das Bradford-Verfahren (BioRad,
Inc.) gemessen. Die durchschnittliche Ausbeute und die statistischen
Werte werden in einer Tabelle 1 angegeben.
-
-
Wie
in der Tabelle 1 dargestellt wird, ergaben Proben ohne Detergens
auf Grund des Verlusts an magnetischen Beads mit gebundenem Protein
während
der Waschschritte weniger Protein als Proben, die das Detergens
enthielten. Darüber
hinaus war die Varianz zwischen verschiedenen Wells in der Abwesenheit
eines Detergens auf Grund von ungleichmäßigem Beadverlust viel höher.
-
BEISPIEL 2: Automatisierte
Reinigung von 6x-His-Tag-Thioredoxin unter denaturierenden Bedingungen
unter Verwendung von Ni-NTA-beschichteten magnetischen Agarosebeads
in der Gegenwart eines nichtionischen Detergens.
-
Dieses
Beispiel demonstriert, dass eine Proteinreinigung unter denaturierenden
Bedingungen (8 M Harnstoff) in einer automatisierten Prozedur unter
Verwendung von magnetischen Agarosebeads in der Gegenwart eines
nichtionischen Detergens erheblich bessere Ausbeuten ergibt.
-
Eine
Proteinreinigung wurde unter Verwendung der folgenden Pufferlösungen ausgeführt: Lysispuffer (8
M Harrnstoff, 0,1 M NaH2PO4,
0,01 M Tris, pH 8,0), Waschpuffer (8 M Harnstoff, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris,
pH 6,3) und Eluierungspuffer (8 M Harnstoff, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris, pH 4,5). E. coli M15-Zellen
(80 ml Aliquot), die ein 6x-His-Tag rekombinantes Thioredoxin-Fusionsprotein
exprimieren, wurden in einem Lysispuffer (50 mM NaH2PO4, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 1
mg/ml Lysozym) lysiert. Das Lysat wurde zentrifugiert, um die unlysierten
Zellen und Debris zu entfernen, und der Überstand (geklärtes Lysat)
wurde in 80 Wells einer 96-Well-Flachbodenmultiwellplatte aliquotiert.
Eine Hälfte
der Proben wurde mit 0,05% Tween 20 nichtionischem Detergens versorgt
und eine Hälfte
der Proben wurde in der Abwesenheit eines Detergens untersucht.
Das Abtrennungsverhalten der magnetischen Beads wies Eigenschaften
auf, die denjenigen unter nativen Bedingungen ähnlich waren, aber der Beadverlust
während
der Pufferentfernungsschritte war sogar höher. Als Folge verlor die Mehrheit
der Wells, die kein Detergens enthielten, all ihre Beads.
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Der
Proteingehalt in dem Eluat jedes Wells wurde durch das Bradford-Verfahren
ermittelt. Die durchschnittliche Ausbeute und die statistischen
Werte werden in einer Tabelle 2 angegeben. Proben ohne das Detergens
ergaben viel weniger Protein. In den meisten Fällen wurde in Wells ohne Detergens
auf Grund des Verlusts der magnetischen Beads kein Protein detektiert.
Die Varianz zwischen verschiedenen Wells war in Wells ohne Detergens
ebenfalls viel höher.
-
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BEISPIEL 3: Automatisierte
Reinigung von 6x-His-Tag-Chloramphenicol-Acetyl-Tansferase unter nativen Bedingungen
unter Verwendung von Ni-NTA-beschichteten magnetischen Silikabeads.
-
Dieses
Beispiel demonstriert die positiven Auswirkungen der Zugabe eines
Detergens in einer automatisierten Proteinreinigungsprozedur unter
Verwendung von superparamagnetischen Silikabeads.
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Eine
Proteinreinigung wurde wie in dem Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, außer dass
an Stelle von Agarosebeads 20 μl
einer 1,25% (V/V)-Suspension aus Ni-NTA-beschichteten magnetischen
Silikabeads verwendet wurden. Ein 40 ml-Aliquot aus E. coli-Zellen,
die ein 6x-His-Tag
rekombinantes Chloramphenicol-Acetyl-Transferase-Fusionsprotein
exprimieren, wurde wie in dem Beispiel 1 beschrieben lysiert und
das geklärte Lysat
wurde in dem Assay verwendet.
-
In
dem Abtrennungsverhalten der Silikabeads in Puffern, die ein Detergens
(Tween 20) enthielten, wurde im Vergleich zu den Beads in Puffern
ohne Detergens ein deutlicher Unterschied festgestellt. Während die
Beads in der Gegenwart eines Detergens in einem kompakten Pellet
nahe der Oberfläche
der Flüssigkeit gesammelt
wurden, trennten sich die Beads in Puffern ohne Detergens in einem
diffusen Pellet am Boden jedes Wells ab. Während des Pufferentfernungsschritts
entstand ein Beadverlust. In einigen Fällen führte die automatisierte Prozedur
in Wells, die kein Detergens enthielten, zu einem vollständigen Beadverlust.
-
Der
Proteingehalt in dem Eluat jedes Wells wurde gemäß dem Bradford-Verfahren ermittelt.
Die durchschnittliche Ausbeute und die statistischen Werte werden
in einer Tabelle 3 angegeben. Proben ohne Detergens (Tween 20) ergaben
auf Grund des Verlusts an magnetischen Beads während der Pufferentfernungsschritte
weniger Protein als Proben, die ein Detergens enthielten. Die Varianz
zwischen verschiedenen Wells war ohne Detergens auf Grund eines
ungleichmäßigen Beadverlusts
erheblich höher.
-
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BEISPIEL 4: Automatisierter
Immunoassay von 6x-His-Tag-Thioredoxin unter Verwendung von Ni-NTA-beschichteten
magnetischen Agarosebeads.
-
Dieses
Beispiel demonstriert die positiven Auswirkungen der Zugabe eines
Detergens auf die Einheitlichkeit einer automatisierten Proteinassayprozedur
unter Verwendung von magnetischen Agarosebeads.
-
Gereinigtes
6x-His-Tag-Thioredoxin wurde in einem Dilutionspuffer (50 mM NaH2PO4, pH 8,0, 300
mM NaCl, 20 mM Imidazol) zu 50 ng pro 200 μl verdünnt. Ein 200 μl-Aliquot
der Proteinverdünnung
wurde in 24 Wells einer 96-Well-Multiwellplatte pipettiert. Als
Negativkontrolle wurden 200 μl
des obigen Puffers ohne Thioredoxin in 24 Wells pipettiert.
-
Die
Multiwellplatte wurde auf der Arbeitsbühne eines automatisierten Pipettiersystems
(z. B. BioRobot 9600, Qiagen GmbH) platziert und in jedes Well wurden
20 μl einer
5% (V/V)-Suspension
aus Ni-NTA-beschichteten magnetischen Agarosebeads verteilt. Die
Platte wurde auf einer Schüttlerplattform
bei Raumtemperatur 45 Min. lang bei 750 rpm geschüttelt, um
dem Ziel-His-Tag-Protein eine Bindung an die Beads zu ermöglichen.
Im Anschluss an den Bindungsschritt wurden zu 12 Wells der Platte
0,1% Tween 20 nichtionisches Detergens dazugegeben. Für alle folgenden
Schritte wurden diese Wells in der Gegenwart von 0,05% Tween 20
nichtionischem Detergens verarbeitet, wohingegen die anderen 12
Wells während
des gesamten Prozesses ohne Detergens verarbeitet wurden.
-
Nach
einer Inkubation für
weitere 15 Min. wurde die Platte auf einen magnetischen Separator
für 96-Well-Platten
(z. B. 96-Well-Magnet, Qiagen GmbH, 1999 Produktführer Kat.
Nr. 36915) transferiert und 1 Min. lang bei 300 rpm geschüttelt, um
eine Beadabtrennung fertig zu stellen. Überstände wurden aspiriert, die Platte
wurde von dem Magneten entfernt und die magnetischen Beads wurden
durch die Zugabe von 200 μl eines
Waschpuffers (50 mM NaH2PO4,
pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol mit oder ohne 0,05% Tween 20) in
jedem Well resuspendiert, dann 5 Min. lang bei 750 rpm geschüttelt. Der
Waschpuffer wurde wie oben beschrieben entfernt und die Beads wurden
in 200 μl
50 mM NaH2PO4, pH
8,0, 300 mM NaCl, 3% BSA enthaltend einen polyklonalen Antikörper, der
Thioredoxin erkennt, resuspendiert. Wie vorher beschrieben wird,
wurde eine Hälfte
der Wells auf der Platte mit einem Detergens inkubiert; die andere
Hälfte
wurde in der Abwesenheit eines Detergens inkubiert. Die Platte wurde
eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 750 rpm geschüttelt, um die
Bindung des Antikörpers
an das immobilisierte Thioredoxin zu ermöglichen. Der Puffer wurde wie
oben beschrieben entfernt und die Beads wurden zweimal gewaschen.
Anschließend
wurden 200 μl
eines mit Meerrettichperoxidase gekoppelten sekundären Antikörpers in
den Puffer, der 50 mM NaH2PO4,
pH 8,0, 300 mM NaCl, 3% BSA mit oder ohne Tween enthielt, dazugegeben.
-
Die
Platte wurde bei 750 rpm eine Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Die
Beads wurden zweimal gewaschen und die Menge an immobilisierter
Peroxidase wurde durch die Zugabe von 200 μl Farbreagens (10 mg o-Phenylendiamin
in 25 ml Natriumphosphatpuffer, pH 5,0, 25 μl H2O2) ermittelt. Die Platte wurde 10 Minuten
lang bei Raumtemperatur inkubiert und die optische Dichte wurde
bei 450 nm gelesen.
-
Das
Abtrennungsverhalten der magnetischen Beads wies mit einer erheblichen
Menge an Beadverlust während
der pufferentfernungsschritte – besonders
in den Wells ohne ein Detergens – ähnliche Eigenschaften auf,
wie sie in Reinigungsverfahren beobachtet wurden. Dieser Beadverlust
führte
zu niedrigeren Signalen und höherer
Standardabweichung zwischen den Wells, die kein Detergens enthielten.
-
Das
durchschnittliche OD-Signal und die statistischen Werte werden in
einer Tabelle 4 angegeben. Der in den Wells ohne Thioredoxin ermittelte
OD-Wert des Hintergrundsignals betrug im Durchschnitt 0,117 in Wells
mit einem Detergens und 0,109 in Wells ohne ein Detergens.
-
-
BEISPIEL 5: Auswirkung
verschiedener Detergenzien in unterschiedlichen Konzentrationen
auf das Abtrennungsverhalten von auf einem 96-Well-Magneten platzierten
magnetischen Agarosebeads.
-
Dieses
Beispiel beschreibt die positiven Auswirkungen einer großen Vielzahl
von Detergenzien auf das Abtrennungsverhalten magnetischer Beads.
-
Eine
20 μl-Probe
einer 5% (V/V)-Suspension aus magnetischen Agarosebeads wurde in
200 μl destillierten
Wassers verdünnt.
Konzentrationen von 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, 0,01%, 0,005% und 0,0005%
von Detergenzien, die verschiedenen Klassen angehören, wurden
dazugegeben und das Abtrennungsverhalten der magnetischen Beads
wurde, nachdem das Probengefäß (96-Well-Platte)
auf einem geeigneten magnetischen Separator (z. B. 96-Well-Magnet, Qiagen GmbH,
Produktführer
1999 Kat. Nr. 36915) platziert wurde, beobachtet. Tween 20, Triton
X-100 und Nonidet P-40 wurden als Beispiele für nichtionische Detergenzien
getestet, Natriumdodecylsulfat wurde als ein anionisches Detergens
getestet, CHAPS wurde als ein zwitterionisches Detergens getestet
und Dodecyltrimethylammoniumchlorid wurde als ein kationisches Detergens
getestet. In allen Fällen,
mit allen Detergenzien, bildeten die Beads ein kompaktes Pellet
nahe der Oberfläche
der Flüssigkeit,
nachdem die Platten zu dem Magnet transferiert wurden. Dagegen trennten
sich die Beads in einem diffusen Pellet am Boden der Wells ab, wenn
kein Detergens dazugegeben wurde. Die Ergebnisse werden in einer
Tabelle 5 dargelegt. Tabelle
5
- k
- = kompaktes Pellet
nahe der Oberfläche
der Flussigkeit, unter Verwendung magnetischer Abtrennung
- d
- = diffuses Pellet
am Boden der Wells
- n. d.
- = nicht durchgeführt
-
Ausreichende
Konzentrationen von Detergenzien für eine verbesserte Beadabtrennung
waren zwischen den Detergensklassen verschieden. Während nichtionische
Detergenzien bis auf 0,0005% (V/V) runter reduziert werden konnten,
um eine wirksame Beadabtrennung zu ermöglichen, wurde das anionische
Detergens mit 0,05% (V/V) benötigt,
das zwitterionische Detergens wurde mit 0,01% (V/V) benötigt und
das kationische Detergens wurde mit 0,5% (V/V) benötigt.
-
BEISPIEL 6: Automatisierter
Immunoassay von 6x-His-Tag-Thioredoxin unter Verwendung von Ni-NTA-beschichteten
magnetischen Agarosebeads mit Detergens nur in dem ersten Puffer.
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Dieses
Beispiel demonstriert, dass die Zugabe von Detergens nur in dem
ersten Schritt ausreicht, um die Einheitlichkeit einer automatisierten
Proteinassayprozedur unter Verwendung von magnetischen Agarosebeads
zu verbessern.
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Gereinigtes
6x-His-Tag-Thioredoxin wurde in einem Dilutionspuffer (50 mM NaH2PO4, pH 8,0, 300
mM NaCl, 20 mM Imidazol) zu 50 ng pro 200 μl verdünnt. 200 μl der Proteinverdünnung wurden
in jedes von 12 Wells einer 96-Well-Mikroplatte pipettiert. Darüber hinaus
wurden zu 12 Wells derselben 96-Well-Mikroplatte 200 μl desselben
Puffers ohne Thioredoxin als eine Negativkontrolle dazugegeben.
Die Multiwellplatte wurde auf der Arbeitsbühne eines automatisierten Pipettiersystems
(BioRobot 9600, Qiagen GmbH) platziert und 20 μl einer 2,5% (V/V)-Suspension
aus Ni-NTA-beschichteten magnetischen Agarosebeads wurden in jedes
Well verteilt. Die Beads in proteinhaltigen Wells banden das 6x-His-Tag-Protein
während
eines 45 Minuten langen Inkubierens auf einer Schüttlerplattform
bei 750 rpm bei Raumtemperatur. Im Anschluss an den Bindungsschritt
wurden 0,1% Tween 20 nichtionisches Detergens zu jedem der 8 Wells
dazugegeben. Für
alle nachfolgenden Schritte wurden 4 der 8 Wells in der Gegenwart
von 0,005% Tween 20 verarbeitet und die verbleibenden 4 Wells wurden
in der Abwesenheit eines Detergens verarbeitet. Die verbleibenden
4 Wells jeder Thioredoxinkonzentration wurden während des ganzen Prozesses
ohne ein Detergens verarbeitet. Die Platte wurde 15 Minuten lang
bei Raumtemperatur inkubiert und wurde anschließend wie oben beschrieben zu
einem magnetischen Separator für
96-Well-Platten transferiert und 2 Minuten lang bei 750 rpm geschüttelt, um
eine Beadabtrennung fertig zu stellen. Überstand wurde aspiriert und
die Platte wurde von dem Magneten entfernt. Die magnetischen Beads
wurden in 200 μl
eines Waschpuffers (50 mM NaH2PO4, pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, mit
und ohne 0,005% Tween 20) resuspendiert und die Platte wurde 5 Minuten
lang bei 750 rpm geschüttelt.
Der Waschpuffer wurde wie zuvor entfernt und die Beads wurden in
200 μl eines
Bindungspuffers (50 mM NaH2PO4,
pH 8,0, 300 mM NaCl, 3% BSA, mit und ohne 0,005% Tween 20), der
einen polyklonalen Antikörper
enthielt, der Thioredoxin erkennt, resuspendiert. Wie oben beschrieben
wird, wurden einige Wells in der Gegenwart oder der Abwesenheit
eines Detergens inkubiert. Die Platte wurde auf einem Schüttler bei Raumtemperatur
eine Stunde lang bei 750 rpm inkubiert. Der Puffer wurde wie oben
beschrieben entfernt und die Beads wurden zweimal in einem Waschpuffer
gewaschen. Anschließend
wurden 200 μl
eines mit Meerrettichperoxidase gekoppelten sekundären Antikörpers, verdünnt in einem
Bindungspuffer +/–0,005%
Tween 20 in jedem Well dazugegeben und die Platte wurde auf einem
Schüttler
eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 750 rpm geschüttelt. Der
Bindungspuffer wurde entfernt und die Beads wurden viermal mit einem
Waschpuffer gewaschen. Die Menge an immobilisierter Peroxidase wurde
durch die Zugabe von 200 μl
Farbreagens (10 mg o-Phenylendiamin in 25 ml Natriumphosphatpuffer,
pH 5,0, 25 μl
H2O2) ermittelt.
Die Platte wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubiert und
die optische Dichte wurde bei 450 nm gelesen.
-
Der
Vergleich der drei Sätze
von Wells, die in der Gegenwart oder der Abwesenheit eines Detergens oder
der Gegenwart oder der Abwesenheit von Thioredoxin verarbeitet wurden,
hat Unterschiede beim Abtrennungsverhalten der magnetischen Beads
aufgezeigt. Beads in Proben, die das Detergens nach dem Bindungsschritt
erhielten, wurden, gleichgültig
ob das Detergens zu den nachfolgenden Schritten dazugegeben wurde,
während
der ganzen Prozedur in einem kompakten Pellet nahe der Oberfläche der
Flüssigkeit
gesammelt. Dagegen trennten sich die Proben in der Abwesenheit eines
Detergens während
des Bindungsschrittes in diffusen Pellets am Boden jedes Wells ab,
was einen Beadverlust während
der Prozedur zur Folge hatte. Dieser Beadverlust führte zu
niedrigeren Signalen und höheren
Standardabweichungen zwischen Wells. In all den Proben betrug der
durchschnittliche OD-Wert
des Hintergrundsignals zwischen 0,063 und 0,071. Die statistischen
Werte der Mengen werden in einer Tabelle 6 dargestellt.
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Standardprotokolle
für molekularbiologische
Anwendungen, Enzymologie, Protein- und Nukleinsäurenchemie werden in gedruckten
Veröffentlichungen,
wie z. B. dem Molecular Cloning-A laboratory Manual, Cold Spring
Harbour, N. Y. (Sambrook et al. 1989), den PCT Protocols-A Guide
to Methods and Applications, Academic Press, N. Y. (Innis et al.,
eds. 1990), dem PCR Primer-A Laboratory Manual, CSHL Press (Dieffenbach
und Dveksler, eds. 1995) und den Methods in Enzymology, Academic
Press, Inc., genau beschrieben.
