KR100550462B1 - 리케챠 균 검출용 프라이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리케챠 균을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 민감도가 높은 리케챠 균 검출용 프라이머, 상기 프라이머를 함유하는 PCR 키트 및 상기 PCR 키트를 이용한 리케챠 균의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 groEL 유전자를 이용하여 민감도가 높게 Rickettsia 균을 검출할 수 있고, 특히 네스티드 PCR을 통해 검사의 민감도와 특이성을 월등히 높일 수 있어, 분리-동정과정을 단축시키는 것이 가능하고, 시료 오염과 검체 내 방해물질에 따른 오진을 줄일 수 있다.

리케챠, 쭈쭈가무시, 검출, 열성질환, 티푸스, 프라이머, DNA 칩

Description

리케챠 균 검출용 프라이머{Primer for Detecting Rickettsia}

도 1은 본 발명에 따른 4개의 프라이머를 이용한 네스티드 PCR을 수행한 후 전기영동을 한 결과를 나타낸 사진으로, (A)는 Rickettsia 6개 균주인 R. typhi Wilmington, R. prowazekii Breinl, R. sibirica 246, R. conorii Indian Tick Typhus, R. japonica YH 및 R. akari MK와 Orientia 5개 균주인 O. tsutsugamushi Karp, O. tsutsugamushi Kato, O. tsutsugamushi Kawasaki, O. tsutsugamushi Gilliam 및 O. tsutsugamushi Boryong와 Coxiella burnetii, Ehrlichia sennetsu, Borrelia burgdorferi sensu lato 및 Borrelia hermsii 그리고 네가티브 대조군(negative control)인 DW에 대해 프라이머 OF-OR로 1차 PCR을, OFN-ORN으로 2차 PCR을 수행하여 네스티드 PCR을 마친 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인 1번은 R. typhi Wilmington, 2번은 R. prowazekii Breinl, 3번은 R. sibirica 246, 4번은 R. conorii Indian Tick Typhus, 5번은 R. japonica YH, 6번은 R. akari MK이고, 7번은 O. tsutsugamushi Karp, 8번은 O. tsutsugamushi Kato, 9번은 O. tsutsugamushi Kawasaki, 10번은 O. tsutsugamushi Gilliam, 11번은 O. tsutsugamushi Boryong, 12번은 Coxiella burnetii, 13번은 Ehrlichia sennetsu, 14번은 Borrelia burgdorferi sensu lato, 15번은 Borrelia hermsii, 그리고 16번은 DW 이다.

(B)는 R. prowazekii Breinl, R. japonica YH, R. typhi 87-91 및 R. typhi 87-100과 Leptospira 10개 균주인 L. interrogans Lai, L. interrogans KK1, L. interrogans KK2, L. interrogans M06, L. interrogans M07, L. interrogans 2, L. interrogans 23, L. interrogans 98, L. interrogans 102 및 L. interrogans 130), 그리고 네가티브 대조군인 DW에 대해 프라이머 OF-OR로 1차 PCR을, OFN-ORN으로 2차 PCR을 수행하여 네스티드 PCR을 마친 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인1번은 R. prowazekii Breinl, 2번은 R. japonica YH, 3번은 R. typhi 87-91, 4번은 R. typhi 87-100이고 5번은 L. interrogans Lai, 6번은 L. interrogans KK1, 7번은 L. interrogans KK2, 8번은 L. interrogans M06, 9번은 L. interrogans M07, 10번은 L. interrogans 2, 11번은 L. interrogans 23, 12번은 L. interrogans 98, 13번은 L. interrogans 102, 14번은 L. interrogans, 그리고 15번은 DW 이다.

발명의 분야

본 발명은 리케챠 균 검출용 프라이머, 상기 프라이머를 함유하는 PCR 키트 및 상기 PCR 키트를 이용한 리케챠 균의 검출방법에 관한 것이다.

발명의 배경

리케챠는 이, 벼룩, 진드기(louse, mite, tick) 등의 절지동물(Arthropod)에서 살고 있다가 우발적으로 사람에게 전파되어 리케챠 질환을 일으킨다. 리케챠 질환은 작은 동맥, 정맥, 모세혈관의 내피세포(endothelial cell)에서 증식하면서 혈관염을 일으킨다. 증상은 열이 나고 두통이 있으며 특징적인 피부발진을 동반한다.

리케챠는 크게 세 가지 군으로 나누어지는데, 유행성 발진티푸스(epidemic typus)를 일으키는 R. prowazekii, 뮤린 티푸스(murine typus: 발진열)를 일으키는 R. typhi가 포함된 티푸스 그룹(TG), 약 20개의 균종이 포함된 반점열 그룹(Spotted fever group: SFG) 및 쭈쭈가무시병을 일으키는 Orientia tsutsugamushi가 포함된 스크럽 티푸스 그룹(Scrub typhus group: STG)이다. Rickettsia는 6개의 질환이 지난 12년 동안 발생했을 정도로 지금도 새로운 질환 (균종)이 발생되고 있다.

그러나 Rickettsia 균군들에 의한 리케치아증과 Orientia tsutsugamushi가 포함된 스크럽 티푸스 그룹(Scrub typhus group)에 의해 일어나는 쯔쯔가무시병은 감염시 유사한 임상증상을 나타내 임상적으로 감별하기는 매우 힘들다. 이들의 치료를 위하여는 Rickettsia와 Orientia tsutsugamushi 감별하는 것이 절대적으로 필요하다. 원인균이 어떤 균군에 속하는지 확인되면 치료제의 선택을 달리해야 하므로, 초기 대응책으로 Rickettsia의 존재여부를 탐지하는 것과 더불어 원인균이 Rickettsia 인지, Orientia tsutsugamushi 인지를 빨리 감별하는 것이 필수적인 것 이다.

이러한 Rickettsia 진단에는 혈청학적 진단이 가장 많이 쓰인다. 바일-펠릭스(Weil-Felix)법은 검사의 특이도나 민감도가 떨어져 최근에는 사용하지 않고, 면역형광항체법, 면역효소법이 가장 흔히 사용되고 있다. 그러나 이 방법 또한 다른 박테리아와의 교차 반응으로 위양성 반응이 많고, 반점열 그룹(spotted fever group)의 Rickettsia 균종을 구분할 수 없는 단점이 있다. 웨스턴 블롯 면역분석법(Western blot immunoassay)은 반점열 그룹의 Rickettsia 균종 구분에 유용하나, Rickettsia가 키우기 어렵고 검사시간이 많이 걸리는 단점이 있다.

PCR의 장점은 검체 내에 아주 작은 양의 DNA만 있어도 쉽게 검출할 수 있다는 것과 채취 후 10-11시간이면 검사 결과를 얻을 수 있다는 것이다. 하지만 방법상의 문제로 증폭된 DNA가 다른 시료를 오염시킬 우려와 검체내의 방해물질 때문에 아직까지 세균분야에서는 배양을 완전 대신할 수는 없다는 문제점이 있다. 이런 점들을 보완하기 위하여 PCR의 여러 가지 변형과 새로운 형태의 증폭방법이 개발되어 상품화 되어있고 이들 중 가장 보편적인 것이 네스티드 PCR(nested PCR)이다.

PCR을 이용한 Rickettsia 동정법으로는 16S rRNA 염기서열을 이용하는 방법을 많이 사용하지만, 이 방법은 염기서열이 너무 유사해, 균종 구분은 되지만 같은 균종 내 구분에는 적합하지 않아 시트르산염 합성효소(citrate synthase: gltA)와 rOmpA (ompA)를 코딩하는 유전자의 염기서열을 이용하는 방법들을 많이 사용하고 있다.

하지만, ompA 유전자의 염기서열을 이용하는 방법은 동정에 아주 유용하나, R. akari, R. australis, R. helvetica, R. bellii, R. canada, R. typhi 및 R. prowazekii의 동정에는 사용할 수 없다. 따라서 이 7가지 균종은 gltA 유전자의 염기서열을 이용하는 방법을 따로 사용해야 하는 번거로움이 있었다. 본 발명자들이 gltA 유전자를 사용해본 결과 Rickettsia를 잘 증폭시키지 못하는 단점이 있었다.

이에 본 발명자들은 Rickettsia 균의 새로운 검출방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, groEL 유전자 일부 분절의 특이 염기서열을 토대로, 극소량의 Rickettsia DNA만 검체에 존재해도 간편하고 특이적으로 탐지할 수 있는 네스티드 PCR(nested PCR)용 프라이머 쌍을 개발하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국 본 발명의 주된 목적은 Rickettsia의 존재를 탐지하면서 Orientia tsutsugamushi로 오진하는 것을 막을 수 있고, 소량의 Rickettsia DNA만 검체에 존재해도 간편하고 특이적으로 Rickettsia 균을 탐지할 수 있는 프라이머를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 함유하는 네스티드 PCR 키트 및 상기 프라이머를 이용한 리케챠 균의 검출방법을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열 1 내지 서열 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 필수적으로 함유하는 리케챠 균 검출용 프라이머를 제공한다. 이때, 서열 1 및 서열 2에서 W는 A 또는 T이다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머를 함유하는 리케챠 균 검출용 네스티드 PCR 키트를 제공한다.

삭제

또한, 본 발명은 서열 1 내지 서열 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 리케챠 균 검출용 DNA 칩을 제공한다.

삭제

본 발명에 있어서, 리케챠 균주는 R. sibirica, R. conorii, R. japonica, R. akari, R. typhi 및 R. prowazekii로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 GroEL 단백질이 샤페론(chaperone)으로써 모든 생물체에서 보존되어 있고, 세포 및 박테리아의 생존에 절대 필요하며, 특히 스트레스에 저항하는 단백질로 알려져 있어 Rickettsia 균주들의 진화를 잘 반영할 수 있으리라 판단되는 groEL 유전자를 PCR의 표적으로 선택하였다.

groEL 유전자는 STG 균주에도 존재해 TG와 SFG의 Rickettsia 균주들과 잘 구분되고 있다. 또한 16S rRNA 유전자의 시퀀스 동일성(sequence similarity)과 비교해 보았을 때, groEL 유전자가 더 다양성이 크다.

또한, 본 발명의 DNA 칩을 이용하여 임상샘플의 상기 세 가지 균주 감염여부를 확인하기 위하여 서열 1 내지 서열 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드가 집적되어 있는 DNA 칩과 임상샘플로부터 추출한 DNA를 하이브리다이제이션 시켜 형광을 측정하는 등 공지의 검출방법으로 리케챠 균을 검출할 수 있다.

본 발명자들은 Rickettsia와 Orientia tsutsugamushi 균주들의 groEL 유전자의 염기서열을 근거로, Rickettsia의 groEL DNA만을 증폭시키고 Orientia tsutsugamush의 groEL DNA는 증폭시키지 않는 네스티드 PCR용 프라이머를 고안하였다. 네스티드 PCR은 1차 PCR 산물에 사용한 프라이머보다 약간 작은 프라이머를 사용하여 다시 한번 2차 PCR을 시행하므로 총 4개의 프라이머가 존재한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 네스티드 PCR을 통한 리케챠 균의 검출을 예시하였으나, 본 발명에 따른 서열 1 내지 서열 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 기질 상에 집적되어 있는 DNA 칩을 이용하여 리케챠 균을 검출하는 것은 당업자에게 있 어 자명하다 할 것이다.

실시예 1: 검체 균주의 준비

Rickettsia 균주로는 R. sibirica 246 (ATCC; American type culture collection, VR-151), R. conorii Indian Tick Typhus (ATCC VR-597), R. japonica YH (ATCC VR-1363), R. akari MK (ATCC VR-148), R. typhi Wilmington (ATCC VR-148) 및 R. prowazekii Breinl (ATCC VR-142)와 Orientia tsutsugamushi를 사용하였고, O. tsutsugamushi 균주로는 O. tsutsugamushi Karp (ATCC VR-150), O. tsutsugamushi Kato (ATCC VR-609), O. tsutsugamushi Kawasaki (Ogawa, National Institute of Infectious Disease, Japan), O. tsutsugamushi Gilliam 및 O. tsutsugamushi Boryong (국립보건원)을 검체균주로 사용하였다.

대조균주로는 Coxiella burnetii (ATCC VR-145), Ehrlichia sennetsu (ATCC VR-367), Borrelia burgdorferi B31 (ATCC 35210) 및 Borrelia hermsii (Yanagihara, University of Shizuoka, Japan)를 사용하였고, 네가티브 대조군(negative control)으로 DW를 사용하였다.

실시예 2: 네스티드 PCR의 수행

상기 실시예 1에서 준비된 균주들에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 하기 서열 1 내지 4의 프라이머를 사용하여 네스티드 PCR을 수행하였다. 1차 증폭은 서열 1(OF)과 서열 2(OR)의 프라이머를 사용하였고, 2차 증폭은 서열 3(OFN)과 서열 4(ORN)의 프라이머를 각각 사용하였다. 서열 1 및 서열 2의 시퀀스 중 W는 A 또는 T이다.

서열 1: 5’-GTTGAAGTWGTTAAAGG-3’(OF)

서열 2: 5’-TTTTTCTTTWTCATAATC-3’(OR)

서열 3: 5’-GTAGTTAAAGGTATGATGTTTGATA-3’(OFN)

서열 4: 5’-ATCTTCAATATTTTTCTTATCACCG-3’(ORN)

1차 증폭은 OF와 OR 프라이머 각각 20pmol과 DW, 주형 DNA 10ng을 섞어 최종 부피 20㎕를 맞춘 뒤, PCR 혼합물 튜브(AccuPower PCR PreMix, Bioneer, Korea)에 섞고, 첫번째 변성 94℃ 5분, 15 싸이클로 변성 94℃ 30초, 어닐링 44℃ 45초, 연장(extension) 72℃ 45초, 최종 연장 72℃ 5분으로 PCR(Perkin-Elmer Cetus, Model 9600 Thermocycler, Norwalk, U.S.A.)을 수행하였다. 2차 증폭은, 1차 증폭산물 1㎕를 프라이머 OFN과 ORN과 함께 PCR 튜브에 섞고 첫번째 변성 94℃ 5분, 26싸이클로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 연장(extension) 72℃ 45초, 최종 연장 72℃ 5분으로 PCR을 수행하였다. 네스티드 PCR 프라이머 세트의 올리고 뉴클레오티드 및 각 반응조건은 표 1에 나타낸 바와 같다. 표 1의 시퀀스 중 W는 A 또는 T이다.

프라이머	시퀀스	PCR 반응조건	DNA 크기(bp)
OF	GTTGAAGTWGTTAAAGG	94℃ 30s, 44℃ 45s, 72℃ 45s, 15cycle	534
OR	TTTTTCTTTWTCATAATC
OFN	GTAGTTAAAGGTATGATGTTTGATA	94℃ 30s, 44℃ 45s, 72℃ 45s, 15cycles	468
ORN	ATCTTCAATATTTTTCTTATCACCG

실시예 3: PCR 산물의 전기영동의 수행 및 결과 확인

실시예 2의 PCR에서 생성된 산물을 1.2% 아가로스 겔에 전기영동 하였다.

상기 네스티드-PCR에 사용한 프라이머쌍들에 의해 Rickettsia 6개 균주에서만 468bp 크기로 증폭되었고, Orientia tsutsugamushi와 다른 비교 균주들은 증폭되지 않았다. 특히 일반 PCR보다 월등히 적은 양의 주형 DNA를 사용하였으나 특이적으로 Rickettsia만을 잘 증폭하여 Rickettsia의 감염을 쉽게 탐지할 수 있고 O. tsutsugamushi와의 감별이 용이함을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명에 따른 4개의 프라이머를 이용한 네스티드 PCR을 수행한 후 전기영동을 한 결과를 나타낸 사진이다.

도 1에서 (A)는 Rickettsia 6개 균주인 R. typhi Wilmington, R. prowazekii Breinl, R. sibirica 246, R. conorii Indian Tick Typhus, R. japonica YH 및 R. akari MK와 Orientia 5개 균주인 O. tsutsugamushi Karp, O. tsutsugamushi Kato, O. tsutsugamushi Kawasaki, O. tsutsugamushi Gilliam 및 O. tsutsugamushi Boryong와 Coxiella burnetii, Ehrlichia sennetsu, Borrelia burgdorferi sensu lato 및 Borrelia hermsii 그리고 네가티브 대조군(negative control)인 DW에 대해 프라이머 OF-OR로 1차 PCR을, OFN-ORN으로 2차 PCR을 수행하여 네스티드 PCR을 마친 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인1번은 R. typhi Wilmington, 2번은 R. prowazekii Breinl, 3번은 R. sibirica 246, 4번은 R. conorii Indian Tick Typhus, 5번은 R. japonica YH, 6번은 R. akari MK이고, 7번은 O. tsutsugamushi Karp, 8번은 O. tsutsugamushi Kato, 9번은 O. tsutsugamushi Kawasaki, 10번은 O. tsutsugamushi Gilliam, 11번은 O. tsutsugamushi Boryong, 12번은 Coxiella burnetii, 13번은 Ehrlichia sennetsu, 14번은 Borrelia burgdorferi sensu lato, 15번은 Borrelia hermsii, 그리고 16번은 DW이다.

도 1에서 (B)는 R. prowazekii Breinl, R. japonica YH, R. typhi 87-91 및 R. typhi 87-100과 Leptospira 10개 균주인 L. interrogans Lai, L. interrogans KK1, L. interrogans KK2, L. interrogans M06, L. interrogans M07, L. interrogans 2, L. interrogans 23, L. interrogans 98, L. interrogans 102 및 L. interrogans 130), 그리고 네가티브 대조군인 DW에 대해 프라이머 OF-OR로 1차 PCR을, OFN-ORN으로 2차 PCR을 수행하여 네스티드 PCR을 마친 후, 1.2% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 이때, M은 마커이고, 레인1번은 R. prowazekii Breinl, 2번은 R. japonica YH, 3번은 R. typhi 87-91, 4번은 R. typhi 87-100이고 5번은 L. interrogans Lai, 6번은 L. interrogans KK1, 7번은 L. interrogans KK2, 8번은 L. interrogans M06, 9번은 L. interrogans M07 , 10번은 L. interrogans 2, 11번은 L. interrogans 23, 12번은 L. interrogans 98 , 13번은 L. interrogans 102, 14번은 L. interrogans, 그리고 15번은 DW 이다.

상기 두 프라이머 쌍을 이용하여 네스티드 PCR을 수행하면, 검체에 존재하는 Rickettsia DNA 만을 단일밴드로 증폭시키므로 검체 내에 Rickettsia가 존재함을 확인할 수 있었고, Rickettsia와 O. tsutsugamushi 중 특이적으로 Rickettsia 만을 증폭시키므로 Rickettsia와 O. tsutsugamushi를 감별할 수 있었다. 특히 네스티드 PCR을 시행하므로 검사의 민감도와 특이도를 월등히 높일 수 있어 장시간 걸리는 분리-동정과정을 단축시킬 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명에서는 표적 DNA로서 groEL 유전자를 이용하여 민감도가 높은 Rickettsia와 O. tsutsugamushi를 감별하고 탐지할 수 있는 네스티드-PCR용 프라이머 쌍을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면 groEL 유전자를 이용하여 민감도가 높게 Rickettsia 균을 검출할 수 있고, 특히 네스티드 PCR을 통해 검사의 민감도와 특이성을 월등히 높일 수 있어, 분리-동정과정을 단축시키는 것이 가능하고, 시료 오염과 검체 내 방해물질에 따른 오진을 줄일 수 있다.

<110> Konkuk University <120> Primer for Detecting Rickettsia <130> KUP03-042 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer (W is A or T) <400> 1 gttgaagtwg ttaaagg 17 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer (W is A or T) <400> 2 tttttctttw tcataatc 18 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 gtagttaaag gtatgatgtt tgata 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 atcttcaata tttttcttat caccg 25

Claims (7)

1. 서열 1 내지 서열 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 필수적으로 함유하는 리케챠 균 검출용 프라이머.
2. 제1항에 있어서, 리케챠 균주는 R. sibirica, R. conorii, R. japonica, R. akari, R. typhi 및 R. prowazekii로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프라이머.
3. 제1항의 프라이머를 함유하는 리케챠 균 검출용 네스티드 PCR 키트.
4. 삭제
5. 서열 1 내지 서열 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 리케챠 균 검출용 DNA 칩.
6. 삭제
7. 삭제

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