DE3650043T2

DE3650043T2 - Nachweis von Mykoplasma durch Hybridisierung von DNS.

Info

Publication number: DE3650043T2
Application number: DE3650043T
Authority: DE
Inventors: Ulf Gobel; Eric J Stanbridge
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1986-06-25
Filing date: 1986-06-25
Publication date: 1995-01-19
Anticipated expiration: 2006-06-26
Also published as: EP0250662B1; DE3650043D1; ATE110418T1; EP0250662A1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung nimmt allgemein Bezug auf das Gebiet der Biologie und insbesondere auf die Gebiete Biomedizin, Biochemie und Molekularbiologie.

Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung

Mycoplasmen sind eine Gruppe pathogener Mikroorganismen aus der Klasse der Mollicutes, welche dadurch charakterisiert sind, daß sie nur eine kleine Größe aufweisen und keine Zellwand besitzen. Diese Mikroorganismen gehören zu den kleinsten bekannten Organismen, welche frei in der Natur vorkommen können und sind bedeutende Krankheitserreger für Mensch, Pflanze und Tier. Beispielsweise stellen atypische Pneumonie und nicht von Gonokokken verursachte Urethritis allgemeine bekannte Mycoplasmeninfektionen beim Menschen dar. Mycoplasmen sind auch mit rheumatischer Arthritis, Spontanabort, Unfruchtbarkeit und anderen Krankheiten des Genitaltrakts sowie mit gewissen Stadien der Autoimmunkrankheit in Verbindung gebracht worden. Darüber hinaus sind Mycoplasmen allgemein als Verunreiniger für Zellkulturen bekannt. In der biologischen Forschung stellt die Kontamination von Gewebskulturen mit Mycoplasmen ein ernstes Problem dar, welches eine ständige Überwachung erfordert.
Es ist nicht überraschend, daß diese Organismen äußerst anspruchsvoll sind und gegenwärtig gibt es keine kosteneffektiven spezifischen diagnostischen Verfahren zum Nachweis des Auftretens von Mycoplasma-Infektionen. Die meist verwendeten Nachweismethoden für Mycoplasmen in klinischen Proben sind serologischer Art oder beruhen auf Kulturen. Die serologischen Verfahren unterliegen fälschen Positivaussagen und die Kulturverfahren sind teuer, zeitaufwendig und ermüdend. Viele der gegenwartigen biochemischen Techniken zum Nachweis mikrobieller Verunreiniger in Zellkulturen weisen Mycoplasmen nicht spezifisch nach, sondern zeigen das Vorkommen jedes Prokaryonten oder von einfachen Eukaryonten, wie beispielsweise Hefen und Pilzen an und einige können sogar Viren nachweisen. Solch ein Test ist dann von Vorteil, wenn man nur an der Kenntnis über einen vorhandenen mikrobiellen Erreger interessiert ist, aber wenn man auf der Suche nach einem vermuteten ursächlichen Erreger für eine tierische oder menschliche Krankheit ist, liegt es auf der Hand, den Erreger so vollständig wie möglich zu klassifizieren.
Des weiteren werden die obigen Verfahren durch spezielle Probleme beeinträchtigt. So hat man es beispielsweise mit "nicht kultivierbaren" Mycoplasmen zu tun, welche nicht durch herkömmliche Kulturmethoden nachgewiesen werden können. Zusätzlich kann im Falle eines Immunfluoreszenztests mehr als ein Antikörper zur Identifizierung des jeweiligen Organismus erforderlich sein, da mehr als neun unterschiedliche Mycoplasmenarten als bekannte Verunreiniger von Gewebskulturen auftreten. Auch das Anfärben von DNA ist nicht notwendigerweise spezifisch auf Mycoplasmen.
Ein einfaches, empfindliches, spezifisches, kosteneffektives und schnelles Nachweissystem für Mycoplasmen war daher ein großes Erfordernis auf dem Gebiet der diagnostischen Medizin und der biologischen Forschung.
Der Einsatz der Nucleotidsequenzhomologie und der Kinetik bei der Nucleinsäurehybridisierung ist zu einer breit angewendeten Technik zum Nachweis unterschiedlicher Organismen in Zellen und Zellkulturen geworden. Vor dieser Erfindung waren aber zuverlässige und spezifische DNA-Sonden zum Nachweis von Mycoplasmen nicht verfügbar.
Die WO-84102721 beschreibt ein System zum Nachweis des Vorkommens von Organismen der Gattung Legionella und von Bakterien im allgemeinen. Es gibt darin jedoch keine Lehre oder gar einen Hinweis darauf, wie die spezifische Unterscheidung verbessert werden könnte, oder auf besonderes Sondenmaterial.
Die vorliegende Erfindung geht aus von der Verwendung spezifischer Genfragmente aus ribosomaler RNA von Mycoplasmen, welche über eine Vielzahl von Techniken markiert oder gekennzeichnet werden, wie beispielsweise mit der Radioisotopmarkierung, der Biotinmarkierung, PEI-Peroxidase- Konjugaten, ELISA-Methoden mittels Markierung mit fluoreszierenden Antikörpern, zum spezifischen und empfindlichen Nachweis von Mycoplasmen in klinischen Proben, Zellen oder Zellkulturen mittels Hybridisierung von DNA oder RNA.
Ein Teil der Erfindung befaßt sich damit, eine DNA-Sequenz aus dem 165 Mycoplasma-RNA-Gen zur Verfügung zu stellen, welche eine Nucleotidsequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe AACACGTATC, CGAATCAGCTATGTCG, GAGGTT---AAC, ATCCGGATTTATT, TCTCAGTTCGGATTGA, AGGTGGTGCATGGTTG, TCCTGGCTCAGGAT, ATACATAGGT, AACTATGTGC, AATTTTTCACAATG, und TCTCGGGTCT, welche für ribosomale RNA (rRNA) von Mycoplasmen kodieren, wobei T Thymin, G Guanin, A Adenin, C Cytosin bedeuten und . . . . eine Nucleotiddeletion innerhalb der Sequenz bezüglich der Vergleichssequenz in E.coli anzeigt. Diese Fragmente unterscheiden sich wesentlich von dem 16S RNA-Gen von E.coli und bilden somit die Grundlage für Mycoplasma-spezifische Sonden, welche sich aus markierten, zu den obigen Sequenzen komplementären Nucleotidsequenzen zusammensetzen.
In einem weiteren Teil der Erfindung werden identifizierte DNA-Sequenzen eines 16S RNA-Gens zur Verfügung gestellt, welche Nucleotidsequenzen enthalten, die ausgewählt sind aus der Gruppe ACGGGTGAGT, TAATACCGCAT, TACGGGAGGCAGCAGT, GTGGGGAGCAAA, AGGATTAGATACCCT, CCGTAAACGAT, GAATTGACGGGG, CCCGCACAAG, GGTGGAGCATGT, TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA, GGGATGACGT, ACGTGCTACAATG, CTAGTAATCG, TGTACACACCGCCCGTCA, AAGTCGTAACAAGGTA, und TGGATCACCTCCTT, welche für prokaryotische rRNA kodieren. Diese Fragmente stellen Teile innerhalb des 16S RNA-Gens dar, die für alle E.coli und alle untersuchten Mycoplasmen identisch sind. Generelle Sonden für alle Prokaryonten setzen sich aus markierten Nucleotidsequenzen zusammen, welche zu diesen Fragmenten komplementär sind.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung zur Identifizierung einer speziellen Nucleotidsequenz zur Verwendung als mykoplasmaspezifische Sonde oder als für Mollicutes im allgemeinen spezifische Sonde, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
a. Klonen des gesamten Operon von Ribosomen-RNA, oder Teilen davon, einer speziellen Spezies von Mycoplasma in einen Bakteriophagen oder Plasmidvektor;
b. sondenmäßige Untersuchung der resultierenden Ribosomen-RNA- Genfragmente mit einem nicht-mycoplasmischen prokaryotischen Ribosomen-RNA-Operon oder Fragmenten davon;
c. Kennzeichnen der Fragmente, die mit dem nicht-mycoplasmischen prokaryotischen Ribosomen-RNA-Operon hybridisieren;
d. Identifizieren mykoplasma-spezifischer Fragmente durch differentielle Hybridisierung;
e. Unterklonen mykoplasma-spezifischer Fragmente in einen Sequenzierungsvektor;
f. Sequenzierung der resultierenden untergeklonten mycoplasma-spezifischen. Fragmente;
g. Wiederholen der Schritte a, b, c, d, e und f für andere Mitglieder der Klasse Mollicutes;
h. Vergleichen der in Schritt f und Schritt g erhaltenen Sequenzen; und
i. Identifizierung einer Sequenz, die allen Mycoplasma-Spezies gemeinsam ist, sich jedoch von der entsprechenden Sequenz in nicht-mycoplasmischen Prokaryonten zur Verwendung als mycoplasmaspezifische Sonde unterscheidet oder von Sequenzen, die für eine bestimmte Mycoplasma-, Ureaplasma-, Acholeplasma- oder Spiroplasma-Spezies spezifisch sind, zur Verwendung als Sonden, die für individuelle Spezies von Mycoplasmen, Ureaplasmen, Acholeplasmen und Spiroplasmen spezifisch sind.
Dieses Verfahren kann Verwendung finden in einem Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins eines prokaryotischen Organismus der Klasse Mollicutes, der eine Nucleinsäure mit einer speziellen Nucleotidsequenz enthält, die in Nucleinsäuren aus den prokaryotischen Organismen vorhanden ist, jedoch in Nucleinsäuren aus eukaryotischen Organismen nicht vorhanden ist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
Identifizierung der speziellen Nucleotidsequenz nach dem oben beschriebenen Verfahren;
Kontaktieren eines Mediums, das eine Nucleinsäure oder ein Nucleinsäurefragment aus dem die genannte spezielle Nucleotidsequenz enthaltenden prokaryotischen Organismus enthalten kann, mit einem Oligonucleotid, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die zu der genannten speziellen Nucleotidsequenz komplementär ist;
wodurch das Oligonucleotid mit jeglicher Nucleinsäure oder jeglichem Nucleinsäurefragment aus dem die genannte spezielle Nucleotidsequenz enthaltenden prokaryotischen Organismen, die bzw. das in dem Medium vorhanden sein kann, hybridisiert; und
Detektieren des Vorhandenseins jeglicher Nucleinsäure oder jeglichen Nucleinsäurefragments, die bzw. das mit dem Oligonucleotid hybridisiert hat.
Andere Teile der Erfindung betreffen die zum Nachweis von Mycoplasmen oder Prokaryonten im allgemeinen verwendeten spezifischen biologischen Sonden gemäß dem oben beschriebenen Verfahren und den Nachweis und die Herstellung solcher Sonden.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die einzige in der Zeichnung dargestellte Figur zeigt den Ablauf eines Slot-Blots zur Verdeutlichung der vorliegenden Erfindung.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfindung wird nun beschrieben, indem zunächst genau die bei der Herstellung und Verwendung der erfindungsgemäßen biologischen Sonden hinzukommenden spezifischen Schritte dargelegt werden und dann beschrieben wird, wie besondere, für die Erfindung nützliche Nucleotidsequenzen bestimmt werden.

Synthese von Desoxyoligonucleotiden

Das 16bp Desoxyoligonukleotid GCTTAGTCGATACAGC, welches komplementär zu einer der oben angeführten 165 RNA-Gensequenzen von Mycoplasmen ist, wurde unter Verwendung der Phosphortriester- Festphasenmethode synthetisiert, welche in der Schrift von M.H. Caruthers et al., Genetic Engineering, Vol. 4, 1-17, Plenum Publishing Co. (1982) beschrieben wird, welche hiermit als Stand der Technik eingeführt wird.
Jedes der anderen zuvor erwähnten Desoxyoligonucleotide oder jedes andere erwünschte Oligonucleotid kann auf ähnliche Weise hergestellt werden. Anstelle einer DNA-Sonde kann es beispielsweise wünschenswert sein, eine RNA-Sonde, wie beispielsweise ein rekombinantes SP6 Vektortranskript mit der Sequenz CGAAUCAGCUAUGUCG zu synthetisieren.
DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybridisierung an ribosmale RNA-Moleküle erhöht die Nachweisempfindlichkeit um den Faktor von mehreren Hundert im Vergleich zu jeder DNA-DNA- oder RNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden gegen DNA-Sequenzen auf dem Genom, da die Verwendung einer solchen Sonde Mehrfachkopien von ribosomaler RNA pro Mycoplasma oder Eubakterienzelle nachweist.

Untersuchung von Desoxyoligonucleotiden

Unter Anwendung des in C.C. Richardson, Procedures in Nucleic Acid Research (Cantoni, G. L. and Davies, D.R., Hrg.), Band 2, Seiten 815-828, Harper and Row, New York (1971) beschriebenen Verfahrens, welches hiermit als Stand der Technik angeführt wird, wurden die oben beschriebenen Desoxyoligonucleotide mit ³²P am 5'-Ende markiert. Die erhaltenen markierten Desoxyoligonucleotide wurden sodann als Sonden verwendet, welche auf Mycoplasma spezifisch sind. Die Spezifizität für Mycoplasmen wurde mittels Slot-Blot-Hybridisierung nachgewiesen, wie es in M. Cammingham, Anal. Biochem. 128,415-421(1983), welche hiermit als Stand der Technik eingeführt wird, beschrieben ist. Zu diesem Zweck fand ein 1600 bp DNA-Fragment von Mycoplasma pneumoniae Verwendung, welches in pUC8 kloniert worden war. Das 1600 bp-Fragment enthält die oben beschriebenen Desoxyoligonucleotide aus 16 Basen. Ein genomischer Verdau von E. coli, einem repräsentativen prokaryotischen Eubakterium wurde auch mittels Verdaus mit dem Enzym HindIII durchgeführt. Nach dem in J.J. Lary et al, Proc. Nacl. Acad. Sci U.S.A. 80 : 4045-4049 (1983) beschriebenen Verfahren, welches hiermit als Stand der Technik eingeführt wird, wurde die verdaute E. coli-DNA und das 1600 pb M. pneumoniae-DNA- Fragment auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die DNA-Fragmente enthaltenden Nitrocellulosefilter wurden über einen Zeitraum von 2 Std. bei 80ºC unter reduziertem Druck in einem Ofen getrocknet und zum ³2P-markierten Desoxyoligonucleotid hybridisiert. Die Entwicklung der erhaltenen, in der Zeichnung wiedergegebenen Slot-Blots zeigte für das M. pneumoniae-DNA- Segment Blots von zunehmender Intensität bei 0,00034 ng, 0,0034 ng, 0,034 ng, 0,34 ng und 3,4 ng (berechnet für 16 Basenpaare) und keine Blots für das E.coli- DNA-Segment bei 0,00015 ug, 0,0015 ug, 0,015 ug, 0,15 ug und 1,5 ug, was die Spezifizität der Desoxyoligonucleotidsonde für Mycoplasma anzeigt. Das Desoxynucleotid mit der Sequenz GCTTAGTCGATACAGC kann somit als Mycoplasma-spezifische Sonde eingesetzt werden, welche mit Mycoplasmen-DNA hybridisiert, jedoch nicht mit DNA anderer prokaryotischer Organismen. Andererseits kann beispielsweise ein Desoxyoligonucleotid mit der Sequenz GCTTAGTCGATACAGC, welche zu einer der prokaryotischen kodierenden Gensequenzen komplementär ist, als Prokaryonten-spezifische Sonde eingesetzt werden, welche mit Prokaryonten, jedoch nicht mit Eukaryonten hybridisiert.
Zum Nachweis von Mycoplasmen in infizierten Zellen erwies sich das folgende Verfahren als wirkungsvoll. Über einen Zeitraum von 2 Minuten bei 37ºC werden die Zellen einer Trypsinspaltung unterzogen, unter Verwendung von 1-2 T75-Gewebskulturflaschen mit Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin, 0,04% EDTA in PBS). Die mit Trypsin behandelten Zellen werden in 1-2 ml Anwachsmedium resuspendiert und in einer Menge von 50-100 ul (1 · 10&sup5; bis 1 · 10&sup6; Zellen) auf ein mit 10 · SSC (1 · SSC: 15 mM Natriumcitrat, 150 mM NaCl, pH 7,4) angefeuchtetes Nitrocellulusefilter aufgetupft unter Verwendung eines von Schleicher und Schuell Inc., Keene, N.H. erhältlichen Minifold H Slot-Blot- Hybridisierungsgerätes. Die beim Slot-Blot-Verfahren eingesetzten DNA-Proben werden mit Alkali (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) über einen Zeitraum von 5-10 Minuten bei Raumtemperatur denaturiert und über einen Zeitraum von 5-10 Minuten bei Raumtemperatur unter Verwendung von 0,5 M Tris pH 7,2 und 3,0 M NaCl neutralisiert. Der Filter wird sodann mit 2 · SSC 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur gewaschen und im Vakuum für 2 Stunden bei 80ºC getrocknet. Der Filter wird über einen Zeitraum von 2 Stunden bei 65ºC vorhybridisiert unter Verwendung eines Vorhybridisierungspuffers, welcher aus 0,5 mM EDTA, 5 mM Tris, pH 7,5, 5 · Denhardt und 100 ug/ml hitzedenaturierter DNA aus Heringsspermien besteht. Unter Verwendung der erfindungsgemaßen Sonden mit einer zu 1-2 · 10&sup6; cpm bestimmten Konzentration an mit ³²P-markiertem Desoxyoligonucleotid, einer spezifischen Aktivität > 10&sup8; cpm/ug in einem Hybridisierungspuffer, welcher aus 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,7 M NaCl, 1 · Denhardt, 0,5% SDS, 10% Dextransulfat und 100 ug/ml hitzedenaturierter DNA aus Heringsspermien besteht, erfolgt die Hybridisierung bei 65ºC über einen Zeitraum von 16 Stunden. Nach der Hybridisierung wird der Filter 2-4 Stunden lang bei 65ºC mit 2 · SET, 0,2% SDS (1 · SET: 30 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl) und 1-2 Stunden bei Raumtemperatur mit 4 mM Tris-Base gewaschen. Der Filter wird sodann getrocknet und auf einen Röntgenfilm unter Verwendung von 1 oder 2 Dupont Cronex Verstärkerfolien aufgetragen.

Nachweis bestimmter Nucleotidsequenzen

Während die vorhergehende Beschreibung der vorliegenden Erfindung lehrt, wie einzelne Nucleotidsequenzen hergestellt und verwendet werden können, kann der weiter gefaßte Umfang dieser Erfindung dadurch ausgeführt werden, indem die zur Bestimmung einzelner Nucleotidsequenzen Verwendung findenden Techniken untersucht werden, welche als Mycoplasma-spezifische Sonden, Sonden die im allgemeinen auf Prokaryonten spezifisch sind, auf einzelne Mycoplasma- Ureaplasma-, Acholeplasma- und Spiroplasma-Spezies spezifische Sonden von Nutzen sind.
Die Klonierung des ribosomalen RNA-Genoms von M. pneumoniae erfolgte mittels HindIII-Verdaus der gesamten M. pneumoniae-DNA und Ligierung des HindIII-Fragments an den mittels HindIII verdauten Vektor pUC8. Die erhaltenen ribosomalen RNA-Genfragmente wurden gemäß dem Verfahren in Gobel und Mitarbeiter Science 226 : 1211-1213 (1984), welches hiermit als Stand der Technik eingeführt wird, mit dem ribosomalen RNA-Operon von E. coli in dem pKK 3535-Plasmid sondiert, um klonierte Fragmente zu identifizieren, welche ribosomale Sequenzen enthielten. Ein 1600 bp Fragment wurde anhand der Hybridisierung an Mycoplasma-Species und nicht an E. coli- oder Säuger-DNA unter scharfen Hybridisierungsbedingungen ausgewählt. Dieses 1600 bp Fragment wurde aus dem pUC8-Vektor mittels HindIII-Verdaus entfernt und an die M13Mp8-DNA eines Bakterien-Vims zur Sequenzierung ligiert, unter Verwendung der Didesoxy-Methode nach Sanger, welche in Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74 : 5463-5467 (1977) beschrieben ist, welche hiermit als Stand der Technik eingeführt wird.
Ein Vergleich der Sequenzen aus den Mycoplasma-Spezies M. pneumoniae, M. capricolum und Mycoplasma-Spezies PG 50 mit denen aus E. coli zeigten, daß all diese Mycoplasma-Spezies gewisse Sequenzen gemeinsam hatten, die sich jedoch von denen von E. coli unterschieden. Diese Sequenzen könnten synthetisiert, markiert und als Mycoplasma-spezifische Sonden verwendet werden. Beispielsweise würde die Sequenz GCTTAGTCGATACAGC eine Mycoplasmaspezifische Sonde darstellen. Andere Sequenzen waren sowohl diesen Mycoplasma-Spezies als auch E. coli gemeinsam. Letztere Sequenzen könnten synthetisiert, markiert und als Sonden verwendet werden, welche für alle prokaryotischen Spezies spezifisch sind. Wieder andere Sequenzen waren für einzelne Mycoplasma-Spezies einmalig und könnten synthetisiert, markiert und als Spezies-spezifische Sonden von Mycoplasmen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein spezifisches, empfindliches und schnelles Verfahren zum Nachweis von Mycoplasmen in kontaminierten Zellkulturen oder anderen biologischen Umgebungen zur Verfügung. Alternativ kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, eine ribosomale DNA- Sonde aus einer in allen Prokaryonten erhalten gebliebenen Domäne zur Verfügung zu stellen. Solch eine Probe würde bei einer schnellen und empfindlichen Diagnose von Bakteriaemie oder Blutvergiftung bei Mensch oder Tier äußerst nützlich sein. Die vorliegende Erfindung kann auch dazu benutzt werden, ribosomale DNA-Sonden zur Verfügung zu stellen, welche für einzelne Mycoplasma-, Acholeplasma-, Ureaplasma-, Spiroplasma bzw. Eubakterien- Spezies spezifisch sind. Diese Sonden werden für solche Organismen von besonderem Nutzen sein, wo wenig oder keine Information über deren genetische Ausstattung vorliegt.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele von Desoxyoligonucleotiden und Mycoplasma-Spezies genau beschrieben worden war, sollte es für einen Fachmann auf der Hand liegen, daß verschiedene Abwandlungen möglich sind. Die Erfindung soll daher solche Abwandlungen mit einschließen, und eine Beschränkung sollte sich entsprechend nur nach den anliegenden Patentansprüchen ausrichten.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung einer speziellen Nukleotidsequenz zur Verwendung als mykoplasmaspezifische Sonde oder als für Mollicutes im allgemeinen spezifische Sonde, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

a. Klonen des gesamten Operon von Ribosomen-RNA, oder Teilen davon, einer speziellen Spezies von Mykoplasma in einen bakteriophagen oder Plasmidvektor;

b. sondenmäßige Untersuchung der resultierenden Ribosomen- RNA-Genfragmente mit einem nicht-mykoplasmischen prokaryontischen Ribosomen-RNA-Operon oder Fragmenten davon;

c. Kennzeichnen der Fragmente, die mit dem nicht-mykoplasmischen prokaryontischen Ribosomen-RNA-Operon hybridisieren;

d. Identifizieren mykoplasmaspezififischer Fragmente durch differentielle Hybridisierung;

e. Unterklonen mykoplasmaspezifischer Fragmente in einen Sequenzierungsvektor;

f. Sequenzierung der resultierenden untergeklonten mykoplasmaspezifischen Fragmente;

g. Wiederholen der Schritte a, b, c, d, e und f für andere Mitglieder der Klasse Mollicutes;

h. Vergleichen der in Schritt f und Schritt g erhaltenen Sequenzen; und

i. Identifizieren einer Sequenz, die allen Mykoplasmaspezies gemeinsam ist, sich jedoch von der entsprechenden Sequenz in nicht-mykoplasmischen Prokaryonten zur Verwendung als mykoplasmaspezifische Sonde unterscheidet; oder von Sequenzen, die für eine bestimmte Mykoplasma-, Ureaplasma-, Acholeplasma- oder Spiroplasmaspezies spezifisch sind, zur Verwendung als Sonden, die für individuelle Spezies von Mykoplasmen, Ureaplasmen, Acholeplasmen und Spiroplasmen spezifisch sind.

2. Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins eines prokaryontischen Organismus der Klasse Mollicutes, der eine Nukleinsäure mit einer speziellen Nukleotidsequenz enthält, die in Nukleinsäuren aus den prokaryontischen Organismen vorhanden ist, jedoch in Nukleinsäuren aus eukaryontischen Organismen nicht vorhanden ist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

Identifizieren der speziellen Nukleotidsequenz nach dem Verfahren von Anspruch 1;

Kontaktieren eines Mediums, das eine Nukleinsäure oder ein Nukleinsäurefragment aus dem die genannte spezielle Nukleotidsequenz enthaltenden prokaryontischen Organismus enthalten kann, mit einem Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu der genannten speziellen Nukleotidsequenz komplementär ist;

wodurch das Oligonukleotid mit jeglicher Nukleinsäure oder jeglichem Nukleinsäurefragment aus dem die genannte spezielle Nukleotidsequenz enthaltenden prokaryontischen Organismus, die bzw. das in dem Medium vorhanden sein kann, hybridisiert; und

Detektieren des Vorhandenseins jeglicher Nukleinsäure oder jeglichen Nukleinsäurefragments, die bzw. das mit dem Oligonukleotid hybridisiert hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem prokaryontischen Organismus um eine Spezies der Gattung Mykoplasma handelt und die genannte spezielle Nukleotidsequenz nur in prokaryontischen Nukleinsäuren aus der Spezies der Gattung Mykoplasma vorhanden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem prokaryontischen Organismums um Mykoplasma capricolum handelt und die genannte spezielle Nukleotidsequenz nur in prokaryontischen Nukleinsäuren aus Mykoplasma capricolum vorhanden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem prokaryontischen Organismums um Mykoplasma der Spezies PG50 handelt und die genannte spezielle Nukleotidsequenz nur in prokaryontischen Nukleinsäuren aus Mykoplasma der Spezies PG50 vorhanden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem prokaryontischen Organismums um Mykoplasma pneumoniae handelt und die genannte spezielle Nukleotidsequenz nur in prokaryontischen Nukleinsäuren aus Mykoplasma pneumoniae vorhanden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem prokaryontischen Organismums um eine Ureaplasma-Spezies handelt und die genannte spezielle Nukleotidsequenz nur in prokaryontischen Nukleinsäuren aus dieser genannten Ureaplasma-Spezies vorhanden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem prokaryontischen Organismums um eine Spiroplasma-Spezies handelt und die genannte spezielle Nukleotidsequenz nur in prokaryontischen Nukleinsäuren aus dieser genannten Spiroplasma-Spezies vorhanden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem prokaryontischen Organismums um eine Acholeplasma-Spezies handelt und die genannte spezielle Nukleotidsequenz nur in prokaryontischen Nukleinsäuren aus dieser genannten Acholeplasma-Spezies vorhanden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Nukleinsäurefragment, das die genannte spezielle Nukleotidsequenz enthält, um das 16S-RNA- Gen handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Nukleinsäurefragment, das die genannte spezielle Nukleotidsequenz enthält, um das 23S-RNA- Gen handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Nukleinsäurefragment, das die genannte spezielle Nukleotidsequenz enthält, um das 5S-RNA- Gen handelt.

13. Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins eines prokaryontischen Organismus der Klasse Mollicutes, der eine Nukleinsäure mit einer speziellen Nukleotidsequenz enthält, die in Nukleinsäuren aus den prokaryontischen Organismen vorhanden ist, jedoch in Nukleinsäuren aus eukaryontischen Organismen nicht vorhanden ist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

Kontaktieren eines Mediums, das eine Nukleinsäure oder ein Nukleinsäurefragment aus dem die genannte spezielle Nukleotidsequenz enthaltenden prokaryontischen Organismus enthalten kann, mit einem Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu der genannten speziellen Nukleotidsequenz komplementär ist, wodurch das Oligonukleotid mit jeglicher Nukleinsäure oder jeglichem Nukleinsäurefragment aus dem die spezielle Nukleotidsequenz enthaltenden prokaryontischen Organismus, die bzw. das in dem Medium vorhanden sein kann, hybridisiert; und

Detektieren des Vorhandenseins einer jeglichen Nukleinsäure oder eines jeglichen Nukleinsäurefragments, die bzw. das mit dem Oligonukleotid hybridisiert hat;

dadurch gekennzeichnet, daß die genannte spezielle Nukleotidsequenz wenigstens eine der folgenden mykoplasmaspezifischen Sequenzen oder eine zu wenigstens einer der nachfolgenden Sequenzen komplementäre Sequenz beinhaltet:

AACACGTATC, CGAATCAGCTATGTCG, GAGGTT-AAC, ATCCGGATTTATT, TCTCAGTTCGGATTGA, AGGTGGTGCATGGTTG, TCCTGGCTCAGGAT, ATACATAGGT, AACTATGTGC, AATTTTTCACAATG, TCTCGGGTCT und TAGATATATG.

14. Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins eines prokaryontischen Organismus, der eine Nukleinsäure mit einer speziellen Nukleotidsequenz aufweist, die in Nukleinsäuren aus prokaryontischen Organismen vorhanden ist, jedoch in Nukleinsäuren aus eukaryontischen Organismen nicht vorhanden ist,

wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

Kontaktieren eines Mediums, das eine Nukleinsäure oder ein Nukleinsäurefragment aus dem die genannte spezielle Nukleotidsequenz enthaltenden prokaryontischen Organismus enthalten kann, mit einem Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu der genannten speziellen Nukleotidsequenz komplementär ist, wodurch das Oligonukleotid mit jeglicher Nukleinsäure oder jeglichem Nukleinsäurefragment aus dem die genannte spezielle Nukleotidsequenz enthaltenden prokaryontischen Organismus, die bzw. das in dem Medium vorhanden sein kann, hybridisiert; und

dadurch gekennzeichnet, daß die genannte spezielle Nukleotidsequenz wenigstens eine der folgenden prokaryontischen Sequenzen oder eine zu wenigstens einer der nachfolgenden Sequenzen komplementäre Sequenz beinhaltet: ACGGGTGAGT, TAATACCGCAT, TACGGGAGGCAGCAGT, GTGGGGAGCAAA, AGGATTAGATACCCT, CCGTAAACGAT, GAATTGACGGGG, CCCGCACAAG, GGTGGAGCATGT, TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA, GGGATGACGT, ACGTGCTACAATG, CTAGTAATCG, TGTACACACCGCCCGTCA, AAGTCGTAACAAGGTA und TGGATCACCTCCTT.

15. Mykoplasmaspezifische Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer speziellen Nukleotidsequenz hybridisiert, die wenigstens eine der folgenden mykoplasmaspezifischen Sequenzen oder eine zu wenigstens einer der nachfolgenden Sequenzen komplementäre Sequenz beinhaltet: AACACGTATC, CGAATCAGCTATGTCG, GAGGTT-AAC, ATCCGGATTTATT, TCTCAGTTCGGATTGA, AGGTGGTGCATGGTTG, TCCTGGCTCAGGAT, ATACATAGGT, AACTATGTGC, AATTTTTCACAATG, TCTCGGGTCT und TAGATATATG.

16. Prokaryontenspezifische Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer speziellen Nukleotidsequenz hybridisiert, die wenigstens eine der folgenden prokaryontischen Sequenzen oder eine zu wenigstens einer der nachfolgenden Sequenzen komplementäre Sequenz beinhaltet: ACGGGTGAGT, TAATACCGCAT, TACGGGAGGCAGCAGT, GTGGGGAGCAAA, AGGATTAGATACCCT, CCGTAAACGAT, GAATTGACGGGG, CCCGCACAAG, GGTGGAGCATGT, TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA, GGGATGACGT, ACGTGCTACAATG, CTAGTAATCG, TGTACACACCGCCCGTCA, AAGTCGTAACAAGGTA und TGGATCACCTCCTT.

17. Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: AACACGTATC, CGAATCAGCTATGTCG, GAGGTT-AACC, ATCCGGATTTATT, TCTCAGTTCGGATTGA, AGGTGGTGCATGGTTG, TCCTGGCTCAGGAT, ATACATAGGT, AACTATGTGC, AATTTTTCACAATG, TCTCGGGTCT, TAGATATATG, ACGGGTGAGT, TAATACCGCAT, TACGGGAGGCAGCAGT, GTGGGGAGCAAA, AGGATTAGATACCCT, CCGTAAACGAT, GAATTGACGGGG, CCCGCACAAG, GGTGGAGCATGT, TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA, GGGATGACGT, ACGTGCTACAATG, CTAGTAATCG, TGTACACACCGCCCGTCA, AAGTCGTAACAAGGTA, TGGATCACCTCCTT, sowie dazu komplementären Sequenzen, wobei T Thymin, G Guanin, A Adenin, C Cytosin und - eine Nukleotidauslöschung innerhalb der Sequenz bedeuten.

18. Deoxyoligonukleotid, das die Nukleotidsequenz GCTTAGTCGATACAGC enthält.

19. Oligonukleotid, das die Nukleotidsequenz CGAAUCAGCUAUGUCG enthält.