ES2112824T5 - Sondas de acidos nucleicos para deteccion y/o cuantificacion de organismos no virales. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA PREPARAR SONDAS, ASI COMO A VARIAS SONDAS PARA EMPLEO EN ENSAYOS DE HIBRIDACION CUALITATIVA O CUANTITATIVA. EL METODO COMPRENDE LA CONSTRUCCION DE UN OLIGONUCLEOTIDO QUE ES SUFICIENTEMENTE COMPLEMENTARIO PARA HIBRIDIZARSE A UNA REGION DE RARN SELECCIONADA POR SER ESPECIFICA DE UN ORGANISMO O GRUPO DE ORGANISMOS NO VIRICOS QUE SE QUIEREN DETECTAR, SELECCIONANDOSE DICHA REGION POR COMPARACION DE UNA O MAS SECUENCIAS VARIABLES DE LA REGION DEL RARN DE DICHO ORGANISMO O GRUPO DE ORGANISMOS NO VIRICOS, CON LAS CORRESPONDIENTES DE UNO O MAS ORGANISMOS NO-VIRICOS DE LOS QUE SE QUIEREN DISTINGUIR. TAMBIEN SE REFIERE LA INVENCION A SONDAS PARA ENSAYOS DE HIBRIDACION DE MYCOBACTERIUM AVIUM, MYCOBACTERIUM INTRACELLULARE, BACTERIA COMPLEJA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, MYCOPLASMA PNEUMONIAE, LEGIONELLA, SALMONELLA, CHLAMYDIA TRACHOMATIS, CAMPYLOBACTER, PROTEUS MIRABILIS, ENTEROCOCCUS, ENTEROBACTER CLOACAE, E.COLI, PSEUDOMONAS DE GRUPO I NEISSERIA GONORRHOEA, BACTERIAS Y HONGOS.
Description
Sondas de ácidos nucleicos para detección y/o
cuantificación de organismos no virales.
Las invenciones descritas y reivindicadas en la
presente se refieren a sondas y ensayos basados en el uso de
material genético, tal como ARN. Más particularmente, las
invenciones se refieren al diseño y construcción de sondas de ácido
nucleico, y a la hibridación de tales sondas con el material
genético de organismos no virales diana, en ensayos para la
detección y/o cuantificación de los mismos, en muestras objeto de
ensayo, por ejemplo, esputos, orina, sangre y secciones de tejidos,
alimentos, suelo y agua.
Dos cadenas simples de ácido nucleico,
constituidas por nucleótidos, pueden asociarse ("hibridarse")
para formar una estructura de doble hélice, en la que las dos
cadenas de polinucleótidos que discurren en direcciones opuestas se
mantienen juntas por medio de enlaces de hidrógeno (una forma débil
de enlace químico) entre pares de compuestos complementarios,
ubicados en la parte central y denominados "bases".
Generalmente, en la estructura de doble hélice de los ácidos
nucleicos, la base adenina (A), por ejemplo, está unida por enlace
de hidrógeno a la base timina (T) o uracilo (U), mientras que la
base guanina (G) está unida por enlace de hidrógeno a la base
citosina (C). En cualquier punto a lo largo de la cadena, se pueden
encontrar, por tanto, los pares de bases AT ó AU, TA ó UA, GC ó CG.
Se pueden encontrar también pares de bases AG y GU, además de los
pares de bases tradicionales ("canónicos"). Suponiendo que una
primera cadena simple de ácido nucleico es suficientemente
complementaria de una segunda cadena, y que las dos se reúnen en
condiciones que promuevan su hibridación, se obtendrá ácido
nucleico de cadena doble. En condiciones adecuadas, pueden formarse
los híbridos ADN/ADN, ARN/ADN ó
ARN/ARN.
ARN/ARN.
En términos generales, hay dos procedimientos
básicos para la hibridación del ácido nucleico. En uno de ellos,
que se conoce como hibridación "en solución", tanto una
secuencia "sonda" de ácido nucleico, como las moléculas de
ácido nucleico de una muestra objeto de ensayo, están libres en
solución. En el otro método, el ácido nucleico de la muestra está
usualmente inmovilizado sobre un soporte sólido, y la secuencia
sonda está libre en solución.
Una sonda puede ser una secuencia de ácido
nucleico de cadena simple, que es complementaria, en un cierto
grado, de las secuencias de ácido nucleico que se trata de detectar
("secuencias diana"). La sonda puede, además, estar marcada.
Una descripción básica del uso de la hibridación de ácido nucleico
como procedimiento para la detección de secuencias de ácido
nucleico particulares, se presenta en el documento
EP-A-0131052.
El documento WO84/02721 se refiere a un método
para detectar, identificar y cuantificar organismos y virus. El
documento contiene una descripción del uso de ensayos con sonda de
ácido nucleico. Contiene asimismo amplias reivindicaciones
dirigidas a una sonda que "se hibrida con el rARN de dicho grupo
de organismos no virales y no se hibrida de modo detectable con el
rARN de otros organismos no virales...". La solicitud PCT
describe métodos para obtener tales sondas, que incluyen: un
Procedimiento A dirigido a la obtención de clones que contienen
sondas potenciales y utiliza un escrutinio por hibridación para
seleccionar la sonda; un Procedimiento B que describe cómo
sintetizar, por vía biológica, un grupo de sondas, seleccionando una
sonda por métodos de hibridación; y un Procedimiento C, que implica
la selección de sondas basándose en una comparación de
secuencias.
El documento
EP-A-0133671 se refiere a un método
de hibridación de ácido nucleico para detectar bacterias en una
muestra objeto de ensayo, empleando una sonda de polinucleótido que
tiene una secuencia de bases que es homóloga de, al menos, una
secuencia de bases del ácido nucleico de prácticamente todas las
bacterias que se sospecha que están presentes.
El documento
EP-A-0232085 describe una sonda de
ADN que comprende una secuencia de ADN esencialmente complementaria
de una parte del rARN de una especie de Campylobacter, que es capaz
de hibridarse con el rARN de una especie de Campylobacter y no es
capaz de hibridarse con el rARN de una especie que no sea de
Campylobacter.
El documento
EP-A-0245129 describe una sonda de
hibridación para detectar la existencia de bacterias en una
muestra, que comprende
penta-deca-desoxirribonucleótidos
particulares y porciones de los mismos.
El documento
EP-A-0250662 se refiere a un método
para determinar la presencia de un organismo procariótico, por
contacto de una muestra que contiene el organismo, con un fragmento
de ácido nucleico del organismo, y detección de la presencia de los
oligonucleótidos hibridados.
El documento
EP-A-0277237 se refiere a un método
para el ensayo de bacterias en una muestra, empleando una sonda
preparada por marcaje de un ADN o ARN, el cual ADN o ARN contiene
una secuencia de bases complementaria de una secuencia de, al
menos, doce bases de ARN ribosómico de E. coli.
También se describen, en dichas solicitudes,
métodos para determinar la presencia de organismos que contienen
ARN en una muestra que pueda contener tales organismos; dichos
métodos comprenden las etapas de reunir ácidos nucleicos de una
muestra con una sonda que comprende moléculas de ácido nucleico que
son más cortas que la secuencia de la subunidad de rARN de la que
se derivó y que son suficientemente complementarias para hibridarse
con el rARN de uno o más organismos no virales o grupos de
organismos no virales, incubar la mezcla en condiciones de
hibridación especificadas, y ensayar la mezcla resultante para
detectar la hibridación de la sonda y cualquier rARN de la muestra
objeto de ensayo. La invención se describe incluyendo el uso de una
sonda que detecta sólo subsecuencias de una subunidad de rARN que
son iguales o suficientemente parecidas, en organismos o grupos de
organismos particulares, y se afirma que detecta la presencia o
ausencia de cualquiera o cualesquiera de dichos organismos
particulares en una muestra, incluso en presencia de muchos
organismos no afines.
Los autores han descubierto y describen en la
presente un método y medios para diseñar y construir sondas de ADN
para su uso para la detección de secuencias singulares de rARN en un
ensayo destinado a la detección y/o cuantificación de cualquier
grupo de organismos no virales. Algunas de las sondas de la
invención descritas en la presente pueden usarse para detectar y/o
cuantificar una sola especie o cepa de organismo no viral y otras
pueden usarse para detectar y/o cuantificar los miembros de un
género completo o de una agrupación filogenética deseada.
Conforme a la invención, se proporciona un
método para preparar una sonda como la definida en la reivindicación
1.
La invención proporciona además una sonda para
un ensayo de hibridación como la definida en la reivindicación 38 ó
39.
En un método de preparación y uso de la sonda,
un desoxioligonucleótido de cadena simple, de secuencia particular
y longitud definida, se emplea en un ensayo de hibridación para
determinar la presencia o la cantidad de rARN de organismos diana
particulares no virales, con el fin de distinguirlos de sus vecinos
conocidos filogenéticamente más próximos. Se describen y
reivindican secuencias sonda que son específicas, respectivamente,
para subsecuencias variables de rARN de 16S de Mycobacterium
avium, Mycobacterium intracellulare y las bacterias del complejo
de Mycobacterium tuberculosis, y que no reaccionan de forma
cruzada con ácidos nucleicos de cada una de las otras, o de
cualquier otra especie bacteriana o agente infeccioso respiratorio.
Se describe y reivindica también una sonda específica para una
subsecuencia de la región variable de rARN de 23S de las bacterias
del complejo de Mycobacterium tuberculosis, como son las
sondas para la región variable de rARN útiles en ensayos de
hibridación para el género Mycobacterium (específica para el rARN
de 23S), Mycoplasma pneumoniae (específica para el rARN de
5S y 16S), Chlamydia trachomatis (específica para el rARN de
16S y 23S), Enterobacter cloacae (específica para el rARN de
23S), Escherichia coli (específica para el rARN de 16S),
Legionella (específica para el rARN de 16S y 23S), Salmonella
(específica para el rARN de 16S y 23S), Enterococci (específica para
el rARN de 16S), Neisseria gonorrhoeae (específica para el
rARN de 16S), Campylobacter (específica para el rARN de 16S),
Proteus mirabilis (específica para el rARN de 23S),
Pseudomonas (específica para el rARN de 23S), hongos (específica
para el rARN de 18S y 28S), y bacterias (específica para el rARN de
16S y 23S).
En una realización del método de ensayo, una
muestra objeto de ensayo se somete primero a condiciones en las que
se libera el rARN de cualesquiera organismos no virales presentes en
dicha muestra. El rARN así liberado es de cadena simple y, por
tanto, está disponible para la hibridación con material genético
suficientemente complementario. El contacto entre una sonda, que
puede estar marcada, y el rARN diana puede realizarse en solución,
en condiciones que promuevan la hibridación entre las dos cadenas.
La mezcla de reacción se ensaya luego para detectar la presencia de
la sonda hibridada. Las numerosas ventajas del presente método para
la detección de organismos no virales frente a los procedimientos
de la técnica anterior, incluyendo su precisión, simplicidad,
economía y rapidez, se pondrán de manifiesto de modo más completo en
la descripción detallada que aparece a continuación.
La Figura 1 es un listado de la estructura
primaria del rARN de 16S bacteriano correspondiente a Escherichia
coli, representando los números de referencia estándar de los
pares de bases.
La Figura 2 es un listado de la estructura
primaria del rARN de 23S bacteriano correspondiente a Escherichia
coli, representando los números de referencia estándar de los
pares de bases.
La Figura 3 es un listado de la estructura
primaria del rARN de 5S bacteriano correspondiente a Escherichia
coli, representando los números de referencia estándar de los
pares de bases.
La Figura 4 es un listado de la estructura
primaria del rARN de 18S correspondiente a Saccharomyces
cerevisiae, representando los números de referencia estándar de
los pares de bases.
La Figura 5 es un listado de la estructura
primaria del rARN de 28S correspondiente a Saccharomyces
cerevisiae, representando los números de referencia estándar de
los pares de bases.
La Figura 6 es un diagrama que muestra las
posiciones en el rARN de 16S (utilizando los números de referencia
de E. coli) que difieren entre 12 conjuntos diferentes de
organismos afines. En el Ejemplo 1, verbigracia, 99,7 se refiere a
la similitud en el rARN de 16S entre Clostridium botulinium y
Clostridium subterminale.
La Figura 7 es un diagrama que muestra las
posiciones en las primeras 1500 bases del rARN de 23S (utilizando
los números de referencia de E. coli) que difieren entre 12
conjuntos diferentes de organismos afines.
La Figura 8 es un diagrama que muestra las
posiciones en las bases terminales del rARN de 23S (utilizando los
números de referencia de E. coli) que difieren entre 12
conjuntos diferentes de organismos afines.
La Figura 9 es una representación esquemática de
la ubicación de sondas capaces de hibridarse con el rARN de
16S.
La Figura 10 es una representación esquemática
de la ubicación de sondas capaces de hibridarse con las primeras
1500 bases del rARN de 23S.
La Figura 11 es una representación esquemática
de la ubicación de sondas capaces de hibridarse con las bases
terminales del rARN de 23S.
Los siguientes términos y expresiones, tal como
se usan en esta descripción y reivindicaciones, se definen así:
nucleótido: una subunidad de un ácido
nucleico, que consta de un grupo fosfato, un azúcar de 5 carbonos y
una base que contiene nitrógeno. En el ARN, el azúcar de 5 carbonos
es ribosa. En el ADN, es una 2-desoxirribosa. El
término incluye también los análogos de tales subunidades.
polímero nucleotídico: al menos dos
nucleótidos enlazados por enlaces fosfodiéster.
oligonucleótido: un polímero
nucleotídico, generalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente
100 nucleótidos de longitud, pero que puede tener una longitud de
más de 100 nucleótidos.
sonda de ácido nucleico: una secuencia de
ácido nucleico de cadena simple capaz de combinarse con una
secuencia de ácido nucleico diana complementaria de cadena simple,
para formar una molécula de cadena doble (híbrido). Una sonda de
ácido nucleico puede ser un oligonucleótido o polímero
nucleotídico.
híbrido: el complejo formado entre dos
secuencias de ácido nucleico de cadena simple, por apareamientos de
bases de Watson-Crick o apareamientos de bases no
canónicas entre las bases complementarias.
hibridación: el proceso por el que dos
cadenas complementarias de ácidos nucleicos se combinan para formar
moléculas de cadena doble (híbridos).
complementariedad: una propiedad
conferida por la secuencia de bases de una cadena simple de ADN ó
ARN que puede formar un híbrido o cadena doble ADN:ADN, ARN:ARN ó
ADN:ARN, a través de enlaces de hidrógeno entre pares de bases de
Watson-Crick sobre las respectivas cadenas. La
adenina (A) complementa usualmente a la timina (T) o uracilo (U),
mientras que la guanina (G) complementa usualmente a la citosina
(C).
grado de rigor: expresión usada para
describir la temperatura y composición del disolvente, que existen
durante la hibridación y en las etapas inmediatas siguientes del
proceso. En condiciones de alto grado de rigor, sólo se formarán
híbridos de ácidos nucleicos muy homólogos; no se formarán híbridos
si ni hay un grado suficiente de complementariedad. Por
consiguiente, el grado de rigor de las condiciones del ensayo
determina la magnitud de la complementariedad necesaria entre dos
cadenas de ácido nucleico que forman un híbrido. El grado de rigor
se elige para maximizar la diferencia de estabilidad entre la diana
y la secuencia que no es diana.
especificidad de la sonda: característica
de una sonda, que describe su capacidad para distinguir entre la
secuencia diana y las no diana. Depende de la secuencia y de las
condiciones del ensayo. La especificidad de la sonda puede ser
absoluta (esto es, sonda capaz de distinguir entre organismos diana
y cualesquiera organismos no diana) o puede ser funcional (esto es,
sonda capaz de distinguir entre el organismo diana y cualquier otro
organismo normalmente presente en una muestra particular). Muchas
secuencias sonda pueden utilizarse para una especificidad amplia o
restringida, dependiendo de las condiciones de uso.
región variable: polímero nucleotídico
que difiere en, al menos, una base entre el organismo diana y los
organismos no diana contenidos en una muestra.
región conservada: una región que no es
variable.
divergencia de la secuencia: proceso por
el cual los polímeros nucleotídicos se hacen menos parecidos durante
la evolución.
convergencia de la secuencia: proceso por
el cual los polímeros nucleotídicos se hacen más parecidos durante
la evolución.
bacterias: miembros del grupo
filogenético eubacterias, que se considera uno de los tres reinos
primarios.
Tm: temperatura a la cual el 50% de una
sonda se convierte desde la forma hibridada en la forma no
hibridada, en presencia de una diana.
estabilidad térmica: una condición o
estado de la incubación para la hibridación o de la incubación para
la separación, en la que se forman híbridos estables de la sonda
con la diana (híbridos sonda:diana) y en la que no pueden formarse
híbridos de la sonda con una secuencia que no sea diana (híbridos
sonda:no diana), debido a su inestabilidad. Los factores que
afectan a la estabilidad térmica pueden afectar a la especificidad
de la sonda, y por tanto, han de ser controlados. El que una
secuencia sonda sea útil para detectar sólo un tipo específico de
organismo depende en gran medida de la diferencia de estabilidad
térmica entre los híbridos sonda:diana ("S:D") y los híbridos
sonda:no diana ("S:ND"). Al diseñar las sondas, la Tm de S:D
menos la Tm de S:ND debe ser tan grande como sea posible.
Además de un método novedoso para seleccionar
secuencias sonda, los autores han descubierto que es posible crear
una sonda de ADN complementaria de una secuencia particular de rARN
obtenida de un único microorganismo diana y emplear con éxito dicha
sonda en un ensayo sin reacción cruzada para la detección de dicho
microorganismo único, incluso en presencia de sus vecinos
taxonómicos o filogenéticos más estrechamente afines conocidos. Con
la excepción de los virus, todos los organismos procarióticos
contienen moléculas de rARN que incluyen rARN de 5S, rARN de 16S y
una molécula mayor de rARN, conocida como rARN de 23S. Como es
sabido, los eucariotas tienen moléculas de rARN de 5,0S, 5,8S, 18S
y 28S ó estructuras análogas. (La expresión "rARN del tipo de
16S" se usa a veces para referirse al rARN encontrado en la
subunidad ribosómica pequeña, incluyendo el rARN de 18S y de 17S.
Análogamente, la expresión "rARN del tipo de 23S" se usa a
veces para referirse al rARN encontrado en la subunidad ribosómica
grande. "rARN del tipo de 5S" se usa a veces para referirse al
rARN encontrado en la subunidad ribosómica grande. rARN de 5,8S es
equivalente al extremo 5' del rARN del tipo de 23S). Estas
moléculas de rARN contienen secuencias de nucleótidos que son muy
conservadas entre todos los organismos hasta ahora examinados. Se
conocen métodos que permiten determinar una porción significativa de
estas secuencias de rARN. Por ejemplo, cebadores de
oligonucleótidos complementarios, de aproximadamente 20 a 30 bases
de longitud, pueden hibridarse con regiones universalmente
conservadas de rARN purificado, que son específicas para las
subunidades de 5S, 16S ó 23S y prolongarse con la enzima
transcriptasa inversa. La degradación química o las reacciones de
secuenciación por el método del didesoxinucleótido, pueden usarse
para determinar la secuencia de nucleótidos del producto prolongado
(Lane, D.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,
6955-59 (1985)).
En la presente invención, la comparación de una
o más regiones variables secuenciadas de rARN de un organismo
diana, con una o más secuencias de regiones variables de rARN de una
especie bacteriana estrechamente afín, se utiliza para seleccionar
una secuencia singular para el rARN del organismo diana. El rARN es
preferible al ADN como sonda diana, debido a su relativa abundancia
y estabilidad en la célula y debido a sus esquemas de conservación
filogenética.
A pesar de la naturaleza muy conservada del
rARN, los autores han descubierto que algunas regiones de la
molécula de rARN que pueden variar en su secuencia, pueden variar
incluso entre especies estrechamente afines y pueden, por tanto,
utilizarse para distinguir entre tales organismos. Las diferencias
en la molécula de rARN no se distribuyen al azar a lo largo de toda
la molécula, sino que están más bien agrupadas en regiones
específicas. El grado de conservación también varía, creando un
esquema singular de conservación a través de las subunidades de ARN
ribosómico. El grado de variación y su distribución pueden
analizarse a fin de localizar sitios diana para las sondas de
diagnóstico. Este método de selección de la sonda puede usarse para
seleccionar más de una secuencia que sea singular para el rARN de
un organismo diana.
Los autores han identificado regiones variables
por análisis comparativo de secuencias de rARN, tanto publicadas en
la bibliografía como secuencias que han sido determinadas por los
propios autores, utilizando procedimientos conocidos en la técnica.
Se emplea un ordenador Sun Microsystems (TM) para análisis
comparativo. El compilador es capaz de manejar muchas secuencias de
datos al mismo tiempo. Los ordenadores de este tipo y los programas
de ordenador que pueden utilizarse o adaptarse para los fines aquí
descritos, son productos comercialmente disponibles.
Generalmente, sólo unas pocas regiones son
útiles para distinguir entre especies estrechamente afines de un
género filogenéticamente conservado, por ejemplo, la región de las
bases 400 a 500 del extremo 5' de la molécula de rARN de 16S. Un
análisis de los organismos estrechamente afines (Figuras 6, 7 y 8)
revela las posiciones específicas (regiones variables) que varían
entre los organismos estrechamente afines. Estas regiones variables
de las moléculas de rARN son los candidatos apropiados para el
diseño de la sonda.
Las Figuras 6, 7 y 8 presentan las variaciones
en los rARN de 16S y 23S, entre dos bacterias diferentes con
magnitudes decrecientes de similitud entre ellos. Un análisis más
profundo de estas cifras revela algunos esquemas sutiles entre
estos organismos estrechamente afines. En todos los casos
estudiados, se ha visto suficiente variación entre el organismo
diana y los afines filogenéticos más próximos encontrados en la
misma muestra, para diseñar la sonda que interesa. Asimismo, en
todos los casos estudiados hasta la fecha, el porcentaje de
similitud entre el organismo (u organismos) diana y los organismos
filogenéticamente más afines encontrados en la misma muestra, ha
estado comprendido entre 90% y 99%. Es interesante señalar que hubo
bastante variación incluso entre los rARN de Neisseria
gonorrhoeae y Neisseria meningitidis (véase el Ejemplo
21) para diseñar sondas, a pesar de que los estudios de homología
ADN:ADN sugirieron que estas dos especies podrían realmente ser una
misma.
Estas cifras también muestran que las
diferencias se distribuyen a lo largo de todos los rARN de 16S y
23S. Muchas de las diferencias, sin embargo, se agrupan en unas
pocas regiones. Estas posiciones en el rARN son buenas candidatas
para el diseño de sondas, con las condiciones de ensayo de la
presente invención. Se ha observado también que las posiciones de
estas densidades de variación aumentadas se sitúan generalmente en
las mismas regiones de los rARN de 16S y 23S, para valores
comparables de los porcentajes de similitud. De este modo, los
autores han observado que ciertas regiones de los rARN de 16S y 23S
son los sitios más apropiados en los que existe una variación
significativa entre el organismo diana y los afines filogenéticos
más próximos encontrados en una muestra. Se han descrito y
reivindicado sondas específicas para las especies, que se hibridan
en estas regiones de variación significativa entre el organismo
diana y los afines filogenéticos más próximos encontrados en una
muestra.
Las Figuras 9, 10 y 11 constituyen una
representación esquemática de la ubicación de las sondas descritas
y reivindicadas en la presente. Debido a que los rARN de 16S y 23S
no contienen, por lo regular, secuencias de duplicación de una
longitud superior a unos seis nucleótidos, las sondas diseñadas por
estos métodos son específicas para una o unas pocas posiciones en
el ácido nucleico diana.
La evolución de la secuencia en cada una de las
regiones variables (por ejemplo, abarcando un mínimo de 10
nucleótidos) es, en su mayor parte, divergente, no convergente. Por
consiguiente, se pueden diseñar correctamente sondas basadas en
unas pocas secuencias de rARN que difieran entre el organismo diana
y sus afines filogenéticamente más próximos. Las restricciones
biológicas y estructurales sobre la molécula de rARN que mantiene
una estructura primaria, secundaria y terciaria homóloga durante
toda la evolución, y la aplicación de tales restricciones a los
diagnósticos con sondas, constituyen el objeto del estudio en curso.
Cuanto mayor sea la distancia evolucionaria entre los organismos,
mayor será el número de regiones variables que pueden usarse para
distinguir los organismos.
Una vez que se han identificado las regiones
variables, se alinean las secuencias para poner de manifiesto las
áreas de máxima homología o "armonización". Llegado este
momento, se examinan las secuencias para identificar regiones de
sonda potenciales. Dos objetivos importantes en el diseño de una
sonda son maximizar la homología con la(s)
secuencia(s) diana (se recomienda una homología superior al
90%) y minimizar la homología con la(s) secuencia(s)
no diana (se recomienda una no homología inferior al 90% con las
secuencias no diana). Los autores han identificado las siguientes
directrices útiles para diseñar sondas de las características
deseadas.
En primer lugar, las sondas deben ubicarse de
modo que minimicen la estabilidad del híbrido formado por la sonda
y el ácido nucleico que no sea diana. Esto puede conseguirse
minimizando la longitud de complementariedad perfecta con los
organismos no diana, evitando regiones ricas en G y C que posean
homología con las secuencias no diana, y ubicando la sonda de modo
que abarque tantas faltas de apareamiento desestabilizantes como sea
posible (por ejemplo, los pares de bases dG:rU son menos
desestabilizantes que algunos otros).
En segundo lugar, debe maximizarse la
estabilidad del híbrido formado por la sonda y el ácido nucleico
diana. Esto puede conseguirse evitando secuencias largas ricas en A
y T, terminando los híbridos con pares de bases G:C y diseñando la
sonda con una Tm apropiada. Los puntos de comienzo y terminación de
la sonda deben elegirse de modo que la longitud y el porcentaje de
G y el porcentaje de C den como resultado una Tm aproximadamente 2
a 10ºC más alta que la temperatura a la que se realice el ensayo
final. La importancia y el efecto de diversas condiciones de ensayo
se explicarán con más detalle en la presente memoria. En tercer
lugar, las regiones del rARN de las que se sabe que forman
estructuras fuertes, inhibidoras de la hibridación, son menos
preferidas. Finalmente, deben evitarse las sondas con una extensa
auto-complementariedad.
En algunos casos pueden existir varias
secuencias de una región particular que suministren sondas con las
características de hibridación deseadas. En otros casos, una
secuencia puede ser significativamente mejor que otra que difiera
sólo en una única base.
El siguiente esquema indica como pueden
seleccionarse secuencias singulares en una realización de la
invención, que es útil para la detección de un ácido nucleico en
presencia de secuencias de ácido nucleico estrechamente afines. En
este ejemplo, las secuencias de rARN se han determinado para los
organismos A a E, y sus secuencias, representadas por números, se
alinean como se indica. Se ve que la secuencia 1 es común a todos
los organismos A a E. Las secuencias 2 a 6 se encuentran sólo en
los organismos A, B y C, mientras que las secuencias 8, 9 y 10 son
singulares para el organismo A. Por lo tanto, una sonda
complementaria de las secuencias 8, 9 ó 10 se hibridaría
específicamente con el organismo A.
En los casos en que se conocen los esquemas de
variación de una macromolécula, por ejemplo, rARN, se puede centrar
la atención en regiones específicas, como candidatas adecuadas para
el diseño de sondas. Sin embargo, no siempre es necesario
determinar la secuencia de ácido nucleico completa para obtener una
secuencia sonda. La prolongación a partir de un solo cebador de
oligonucleótido cualquiera, puede suministrar hasta 300 a 400 bases
de secuencia. Cuando se utiliza un solo cebador para secuenciar
parcialmente el rARN del organismo diana y organismos estrechamente
afines al diana, se puede hacer una alineación, como se indicó
anteriormente. Evidentemente, si se encuentra una secuencia sonda
útil, no es necesario continuar la secuenciación del rARN usando
otros cebadores. Si, por el contrario, no se obtiene ninguna
secuencia sonda útil de la secuenciación con un solo cebador, o si
se desea mayor sensibilidad, pueden usarse otros cebadores para
obtener más secuencias. En aquellos casos en que no se comprenden
bien los esquemas de variación para una molécula, pueden requerirse
más datos de secuencias antes de diseñar la sonda.
Así, en los Ejemplos 1 a 3 que se presentan más
adelante, se utilizaron dos cebadores derivados de 16S. El primer
cebador no suministró secuencias sonda que cumplieran los criterios
enumerados en la presente. El segundo cebador suministró secuencias
sonda que resultaron ser útiles, después de su caracterización y
ensayo de especificidad, tal como se describe. En el Ejemplo 4, se
utilizaron seis cebadores 23S, antes de mostrar la ubicación de la
secuencia sonda.
Una vez que se ha identificado una secuencia
presuntamente singular, se sintetiza un oligonucleótido de ADN
complementario. Este oligonucleótido de cadena simple servirá como
sonda en la reacción del ensayo de hibridación de ADN y rARN.
Oligonucleótidos definidos pueden sintetizarse por cualquiera de
varios métodos bien conocidos, incluyendo la síntesis química
automatizada en fase sólida, empleando precursores de
cianoetil-fosforamiditos (Barone, A.D. et
al., Nucleic Acids Research 12, 4051-60
(1984)). En este método, se sintetizan desoxioligonucleótidos sobre
soportes de polímeros sólidos. La liberación del oligonucleótido del
soporte se realiza por tratamiento con hidróxido de amonio a 60ºC,
durante 16 horas. La solución se seca y el producto bruto se
disuelve en agua y se separa en geles de poliacrilamida, que
generalmente pueden variar del 10 al 20%, dependiendo de la longitud
del fragmento. La banda principal, que se visualiza por iluminación
posterior con luz ultravioleta, se corta del gel con una hoja de
afeitar y se extrae con acetato de amonio 0,1 M, pH 7,0, a
temperatura ambiente, durante 8 a 12 horas. Después de una
centrifugación, el sobrenadante se filtra a través de un filtro de
0,4 \mum y se desala en una columna P-10
(Pharmacia). Por supuesto, pueden emplearse otros métodos bien
conocidos para la construcción de oligonucleótidos
sintéticos.
sintéticos.
Los actuales sintetizadores de ADN pueden
producir grandes cantidades de ADN sintético. Después de la
síntesis, el tamaño del ADN recién preparado se examina por
filtración en gel y se detectan generalmente moléculas de tamaños
variados. Algunas de estas moléculas representan eventos de síntesis
abortadas, que se producen durante el proceso de síntesis. Como
parte de la purificación posterior a la síntesis, el ADN sintético
se fracciona usualmente por tamaños y sólo se conservan aquellas
moléculas que tienen la longitud apropiada. Por consiguiente, es
posible obtener una población de moléculas de ADN sintético de
tamaño uniforme.
Se ha supuesto generalmente, sin embargo, que el
ADN sintético está compuesto inherentemente de una población
uniforme de moléculas, todas del mismo tamaño y secuencia de bases,
y que las características de hibridación de cada una de las
moléculas de la preparación debe ser la misma. En realidad, las
preparaciones de moléculas de ADN sintético son heterogéneas, y se
componen de números significativos de moléculas que, aunque tienen
el mismo tamaño, son de algún modo diferentes entre sí y tienen
características de hibridación diferentes. Incluso distintas
preparaciones de la misma secuencia pueden a veces tener
características de hibridación diferentes.
Por consiguiente, preparaciones de la misma
secuencia de sonda sintética pueden tener características de
hibridación diferentes. Debido a esto, la especificidad de las
moléculas sonda de distintas preparaciones puede ser diferente. Han
de examinarse las características de hibridación de cada
preparación, para determinar las condiciones de hibridación que han
de emplearse, a fin de obtener la especificidad de la sonda deseada.
Por ejemplo, la sonda sintética descrita en el Ejemplo 4 que figura
más adelante, tiene el perfil de especificidad descrito en la Tabla
14. Estos datos se obtuvieron usando las condiciones de hibridación
y de ensayo descritas. Una preparación separada de esta sonda, que
tiene características de hibridación diferentes, puede no tener
precisamente el mismo perfil de especificidad, cuando se ensaya en
las condiciones presentadas en el Ejemplo 4. Se han hecho tales
preparaciones de sondas. Para obtener la especificidad deseada,
estas sondas pueden hibridarse y ensayarse en condiciones
diferentes, incluyendo concentración salina y/o temperatura. Las
condiciones reales en las que ha de usarse la sonda deben
determinarse, o adaptarse a los requisitos existentes, para cada
lote de sonda, puesto que la técnica de síntesis del ADN es algo
imperfecta.
Después de la síntesis y purificación de una
secuencia particular de oligonucleótido, pueden utilizarse varios
procedimientos para determinar la aceptabilidad del producto final.
El primero es la electroforesis en gel de poliacrilamida, que se
usa para determinar el tamaño. El oligonucleótido se marca usando,
por ejemplo, ^{32}P-ATP y polinucleótido quinasa
de T4. La sonda marcada se precipita en etanol, se centrifuga y el
sedimento seco se vuelve a poner en suspensión en tampón de carga
(formamida al 80%, NaOH 20 mM, EDTA 1 mM, azul de bromofenol al
0,1% y xileno-cianol al 0,1%). Las muestras se
calientan durante 5 min, a 90ºC y se cargan en un gel de
poliacrilamida desnaturalizante. La electroforesis se realiza en
tampón TBE (Tris HCl 0,1 M, pH 8,3, ácido bórico 0,08 M, EDTA 0,002
M), durante 1 a 2 horas, a 1.000 voltios. Después de la
electroforesis del oligonucleótido, el gel se expone a una película
de rayos X. El tamaño del oligonucleótido se calcula a partir de la
migración de estándares de oligonucleótido que se desplazan al mismo
tiempo.
La secuencia del oligonucleótido sintético puede
también comprobarse marcándolo en el extremo 5' con
^{32}P-ATP y polinucleótido quinasa de T4,
sometiéndolo a técnicas de degradación química estándar (Maxam, A.M.
y Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,
560-64 (1980)), y analizando los productos en geles
de poliacrilamida. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de
la sonda es perfectamente complementaria de la secuencia singular
de rARN identificada previamente, aunque no es necesario que así
sea.
Ha de determinarse también el perfil de fusión,
incluyendo la temperatura de fusión (Tm) de los híbridos de
oligonucleótido y rARN. Una forma de determinar Tm es hibridar un
oligonucleótido marcado con ^{32}P con su ácido nucleico diana
complementario, a 50ºC, en tampón de fosfato 0,1 M, pH 6,8. La
mezcla de hibridación se diluye y se pasa sobre una columna de
hidroxiapatito de 2 cm, a 50ºC. La columna se lava con tampón de
fosfato 0,1 M, y SDS al 0,02% para eluir todas las sondas de cadena
simple, no hibridadas. La temperatura de la columna se baja luego
15ºC y se aumenta por incrementos de 5ºC hasta que toda la sonda se
eluye (de cadena simple). A cada temperatura, se eluye la sonda no
hibridada y se determinan las cuentas por minuto (cpm) que hay en
cada fracción. El número de cpm que aparecen unidas al
hidroxiapatito, dividido por el número total de cpm añadidas a la
columna, es igual al porcentaje de hibridación de la sonda con el
ácido nucleico diana.
A continuación se presenta el esquema de un
método alternativo para determinar la estabilidad térmica de un
híbrido. Una porción del ácido nucleico híbrido se diluye en 1 ml de
tampón de fosfato 0,12 M, SCS al 0,2%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, o de
un tampón de hibridación adecuado. Se calienta esta solución de 1 ml
a 45ºC durante 5 min y se pone en un baño de agua a temperatura
ambiente, para enfriarla, durante 5 min. Se ensaya esta solución de
1 ml que contiene el híbrido, sobre una columna de hidroxiapatito,
que captura el híbrido, mientras que la sonda no fijada se arrastra
por lavado. Si se emplea una solución de hibridación que no sea el
tampón de fosfato 0,12 M, será necesaria, para la fijación, una
dilución de la solución de hibridación en el cocktail de tampón de
fosfato 0,12 M. Se mantiene la toma de porciones del híbrido
previamente formado y la dilución en 1 ml de solución de
hibridación o en la solución estándar del tampón de fosfato 0,12 M
descrita arriba, mientras se eleva, a la vez, 5ºC la temperatura de
calentamiento. Se continúa esto, hasta que se disocia todo el
híbrido. El punto en el que la mitad del híbrido se convierte en la
forma disociada, se considera que da el valor de Tm. La Tm de un
híbrido dado variará en función de la solución de hibridación que se
esté utilizando, porque la estabilidad térmica depende de la
concentración de diferentes sales, detergentes y otros solutos que
afectan a la estabilidad relativa del híbrido en condiciones de
desnaturalización térmica.
Debido a que el alcance y especificidad de las
reacciones de hibridación, tales como las descritas en la presente,
están afectadas por varios factores, el manejo de uno o más de
dichos factores determinará la sensibilidad y especificidad de una
sonda particular, sea o no perfectamente complementaria de su diana.
Por ejemplo, la composición de bases de la sonda puede ser
significativa, porque los pares de bases G-C
presentan mayor estabilidad térmica que los pares de bases
A-T, debido al enlace de hidrógeno adicional. Por
consiguiente, la hibridación que implica ácidos nucleicos
complementarios de más alto contenido en G-C, será
estable a temperaturas más altas.
Los autores han descubierto que la longitud de
la secuencia de ácido nucleico diana y, por consiguiente, la
longitud de la secuencia sonda, puede ser también importante. Aunque
es posible que se hibriden ácidos nucleicos que no sean
perfectamente complementarios, la porción más larga de la secuencia
de bases perfectamente homóloga determinará normalmente, de modo
principal, la estabilidad del híbrido. Aunque pueden usarse sondas
de oligonucleótido de diferentes longitudes y composición de bases,
las sondas de oligonucleótido preferidas en esta invención tienen
una longitud entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 bases, y
son homólogas del ácido nucleico diana, al menos en un 75 a 100%,
aproximadamente. Para la mayoría de las aplicaciones, se prefiere
una homología de 95 a 100% con el ácido nucleico diana.
La fuerza iónica y la temperatura de incubación
deben también tenerse en cuenta al construir una sonda. Es sabido
que la tasa de hibridación crece a medida que aumenta la fuerza
iónica de la mezcla de reacción, y que la estabilidad térmica de
los híbridos crece con el aumento de la fuerza iónica. En general,
la hibridación óptima para las sondas de oligonucleótido sintéticas
de aproximadamente 15 a 50 bases de longitud, tiene lugar
aproximadamente 5ºC por debajo de la temperatura de fusión, para un
dúplex dado. La incubación a temperaturas inferiores a la óptima
puede permitir que se hibriden secuencias de bases mal apareadas y
puede, por tanto, dar como resultado una especificidad
reducida.
En cuanto a la concentración del ácido nucleico,
es sabido que la tasa de hibridación es proporcional a la
concentración de las dos especies de ácido nucleico
interaccionantes. Así, la presencia de compuestos tales como el
dextrano y el sulfato de dextrano, que se cree que aumentan la
concentración local de las especies de ácido nucleico, dará como
resultado una tasa incrementada de hibridación. Otros agentes que
conducen a tasas incrementadas de hibridación están especificados
en el documento EP-A-0229442. En
cambio, los reactivos químicos que rompen los enlaces de hidrógeno,
tales como la formamida, urea, DMSO y alcoholes, aumentarán el
grado de rigor de la hibridación.
Las sondas de oligonucleótido seleccionadas
pueden marcarse por cualquiera de varios métodos bien conocidos.
Los marcadores útiles incluyen radioisótopos, así como grupos
reporteros no radiactivos. Los marcadores isotópicos incluyen
^{3}H, ^{35}S, ^{32}P, ^{125}I cobalto y ^{14}C. La
mayoría de los métodos de marcaje isotópico implican el uso de
enzimas e incluyen los métodos conocidos de traslado de cortes,
marcaje en el extremo, síntesis de la segunda cadena, y
transcripción inversa. Cuando se usan sondas
radio-marcadas, la hibridación puede detectarse por
autorradiografía, contaje de centelleo o contaje gamma. El método de
detección seleccionado dependerá de las condiciones de hibridación
y del radioisótopo particular utilizado para el marcaje.
También pueden usarse para el marcaje materiales
no isotópicos, que pueden introducirse por la incorporación de
nucleótidos modificados mediante el uso de enzimas o por
modificación química de la sonda, por ejemplo, mediante el uso de
grupos enlazadores no nucleotídicos. Los marcadores no isotópicos
incluyen moléculas fluorescentes, moléculas quimiluminiscentes,
enzimas, cofactores, sustratos de enzimas, haptenos u otros
ligandos. Los autores prefieren usar actualmente ésteres de
acridinio.
En una realización del ensayo de hibridación de
ADN y rARN de la invención, una sonda marcada y los ácidos
nucleicos bacterianos diana se ponen en contacto en solución. El
rARN puede ser liberado de las células bacterianas por un método de
rompimiento sónico. Otros métodos conocidos para romper las células
incluyen el uso de enzimas, choque osmótico, tratamiento químico y
movimiento vorticial con perlas de vidrio. Después de la liberación
del rARN o al mismo tiempo que ésta se produce, puede añadirse la
sonda marcada, en presencia de agentes acelerantes, e incubarse a
la temperatura óptima de hibridación, durante un período de tiempo
necesario para lograr una hibridación significativa. Después de
este período de incubación, puede añadirse hidroxiapatito a la
mezcla de reacción, para separar los híbridos de sonda y rARN, de
las moléculas de sonda no hibridadas. El sedimento de
hidroxiapatito se lava, se vuelve a centrifugar y se detectan los
híbridos por medios acordes con el marcador utilizado.
A continuación se presentan veintiuna
realizaciones ilustrativas de las invenciones reivindicadas, en las
que una sonda o sondas sintética(s), complementarias de una
secuencia singular de rARN de un organismo diana o de un grupo de
organismos, se determina(n), construye(n) y
utiliza(n) en un ensayo de hibridación.
Mycobacterium son bacilos no móviles, aeróbicos,
no decolorables por los ácidos, no decolorables por los alcoholes.
Su contenido de lípidos es alto y su crecimiento lento.
Mycobacterium avium y Mycobacterium intracellulare se
designan conjuntamente como M.
avium-intracellulare, porque son difíciles de
diferenciar. Recientemente se demostró que el complejo de M.
avium, que incluye M. intracellulare, es el segundo
Mycobacterium clínicamente significativo más comúnmente aislado
(Good, R.C. et al., J. Infect. Dis. 146,
829-33 (1982)). Hay evidencia más reciente de que
estos organismos son una causa común de infección oportunista en
pacientes con SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) (Gill,
V.J. et al., J. Clin. Microb. 22, 543-46
(1985)). El tratamiento de dichas infecciones en los pacientes de
SIDA es difícil, porque estos organismos son resistentes a la
mayoría de los fármacos empleados contra la tuberculosis. Con
frecuencia, se usa en la terapia una combinación de cinco fármacos.
La gravedad de estas infecciones requiere, además, un diagnóstico
rápido, del que no se disponía con anterioridad a la
presente
invención.
invención.
Los miembros del complejo de Mycobacterium
tuberculosis (Mtb) incluyen Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum y Mycobacterium
microti. Los tres primeros son patógenos para los seres humanos,
mientras que el último es patógeno para los animales. Estos
organismos producen granulomas de desarrollo lento sobre la piel o
pueden invadir órganos internos. La tuberculosis de los pulmones
puede diseminarse por otras partes del cuerpo a través del sistema
circulatorio, el sistema linfático o el tracto intestinal. A pesar
de los avances en sanidad y el advenimiento de una quimioterapia
eficaz, las enfermedades originadas por Mycobacterium, en
particular la tuberculosis, siguen representando un importante
problema de salud, de alcance mundial.
El método clásico para detectar bacterias en una
muestra objeto de ensayo implica el cultivo de la muestra, a fin de
aumentar el número de células bacterianas presentes, obteniéndose
crecimientos de colonias observables que puedan identificarse y
contarse. Si se desea, los cultivos pueden también someterse a un
ensayo adicional para determinar la susceptibilidad antimicrobiana.
Actualmente, los procedimientos más ampliamente utilizados para la
detección, aislamiento e identificación de especies de
Mycobacterium son el untamiento ("smear") de bacilos no
decolorables por los ácidos (AFB) (usando las técnicas de
Ziehl-Neelsen o fluorocrómicas), métodos de cultivo
usando medios de Lowenstein-Jensen y medios de
Middlebrook, y ensayos bioquímicos. El AFB se basa en el alto
contenido de lípidos de Mycobacterium, para retener el colorante
después de su exposición a ácido y alcohol. Aunque el ensayo de
untamiento de AFB es relativamente rápido y simple de realizar, no
siempre detecta las micobacterias, y no distingue entre
Mycobacterium avium y las especies no implicadas en la
tuberculosis, entre Mycobacterium intracellulare y las
especies no implicadas en la tuberculosis, o entre los bacilos del
complejo de Mycobacterium tuberculosis y las especies no
implicadas en la tuberculosis. Para una identificación segura de
las especies infecciosas de Mycobacterium, el clínico ha de
basarse en los resultados de cultivos, que pueden requerir, en
cualquier caso, de 3 a 8 semanas de crecimiento, seguido de un
extenso ensayo bioquímico. Se han desarrollado otros ensayos,
basados en la detección de productos metabólicos de
Mycobacterium, usando sustratos marcados con
carbono-14. En particular, el instrumento Bactec
(TM) puede detectar la presencia de Mycobacterium al cabo de
6 a 10 días, desde el momento de la inoculación (Gill, V.J., ut
supra). Sin embargo, el ensayo no distingue entre las especies
de Mycobacterium. Con frecuencia, es importante hacer esta
determinación de modo que puedan prescribirse fármacos particulares
a los que el organismo sea sensible. Por los métodos tradicionales
de cultivo, esto requiere un tiempo adicional de 2 a 3 semanas; y
para el método Bactec, un tiempo adicional de 6 a 10 días.
Asimismo, en los siguientes Ejemplos se exponen
realizaciones específicas para Mycoplasma pneumoniae,
Mycobacterium, Legionella, Salmonella, Chlamydia trachomatis,
Campylobacter, Proteus mirabilis, Enterococcus, Enterobacter
cloacae, E. coli, Pseudomonas del Grupo I, bacterias,
hongos y Neisseria gonorrhoeae.
Como se indica en los siguientes Ejemplos, la
presente invención ofrece ventajas significativas frente a cada uno
de los métodos de la técnica anterior citados, no sólo por la
precisión mejorada, especificidad y sencillez del ensayo, sino
también por la fuerte reducción del tiempo necesario para hacer un
diagnóstico. La invención hace posible un diagnóstico definitivo y
la iniciación de un tratamiento eficaz el mismo día del ensayo.
A continuación se describe la preparación de un
desoxioligonucleótido de cadena simple, de secuencia singular y
longitud definida, que se marca y utiliza como sonda en un ensayo de
hibridación en solución, para detectar la presencia de rARN de
Mycobacterium avium. Esta secuencia singular es específica
para el rARN de Mycobacterium avium y no reacciona
significativamente de forma cruzada, en las condiciones de
hibridación de este Ejemplo, con los ácidos nucleicos de cualquier
otra especie bacteriana o agente infeccioso respiratorio, incluyendo
la Mycobacterium intracellulare, estrechamente afín. Esta
sonda es capaz de distinguir las dos especies, aunque hay
aproximadamente un 98% de homología entre el rARN de las dos
especies. En este Ejemplo, así como en los Ejemplos 2 y 3, se
obtuvieron secuencias para M. avium, complejo de M.
tuberculosis, M. intracellulare y organismos afines, usando un
cebador específico para una región muy conservada del rARN de 16S.
La secuencia de este cebador, derivada del rARN de E. coli,
fue 5'-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA
AT-3'. Se mezclaron 5 ng de cebador con 1 \mug de
cada uno de los rARN que se trata de secuenciar, en presencia de KCl
0,1 M y Tris HCl 20 mM, pH 8,3, a un volumen final de 10 \mul.
Las mezclas de reacción se calentaron durante 10 min, a 45ºC y
seguidamente se pusieron sobre hielo. Se añadieron 2,5 \mul de
^{35}S-dATP y 0,5 \mul de transcriptasa
inversa. La mezcla se distribuyó en cuatro tubos, cada uno de los
cuales contiene didesoxi A, G, T ó C. Las concentraciones de estos
nucleótidos se dan en Lane et al. ut supra. Las
muestras se incubaron durante 30 min, a 40ºC, y se precipitaron
seguidamente en etanol, se centrifugaron y se liofilizaron los
sedimentos. Los sedimentos se volvieron a poner en suspensión en 10
\mul de colorantes de formamida (formamida al 100%, azul de
bromofenol al 0,1% y xileno-cianol al 0,1%), y se
cargaron en 80 cm de geles de poliacrilamida al 8%. Se aplicaron
2.000 V a los geles durante 2 a 4 h.
De este modo, se determinaron las secuencias de
nucleótidos del rARN de 16S de Mycobacterium avium y de los
que se consideraron sus vecinos filogenéticamente más próximos,
Mycobacterium intracellulare y Mycobacterium
tuberculosis, por el método de Lane, D.J. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, 6955 (1985). Además de determinar las
secuencias de rARN para los organismos citados arriba, se
secuenciaron también una gama de Mycobacterium clínicamente
significativas. Éstas incluyeron M. fortuitum, M.
scrofulaceum y M. chelonae. Se secuenciaron asimismo
miembros seleccionados de varios géneros estrechamente afines a
Mycobacterium, incluyendo Rhodococcus bronchialis,
Corynebacterium xerosis y Norcardia asteroides.
Se alinearon secuencias parciales del rARN de
dichos organismos, para conseguir la máxima homología de los
nucleótidos, usando programas de ordenador comercialmente
disponibles en Intelligenetics, Inc., 1975, El Camino Real West,
Mountain View, California 94040-2216 (Programa
IFIND). A partir de esta alineación, se determinaron regiones de
secuencia singular para Mycobacterium avium. La sonda se
seleccionó de modo que fuese perfectamente complementaria de una
secuencia de ácido nucleico diana y de modo que tuviese un 10% ó más
de faltas de apareamiento con el rARN alineado de su vecino
conocido filogenéticamente más próximo. Se eligió una secuencia de
38 bases de longitud. Los números de bases no apareadas respecto a
la secuencia de Mycobacterium avium fueron como sigue:
Mycobacterium tuberculosis (8); Mycobacterium
intracellulare (5); Mycobacterium scrofulaceum (6);
Mycobacterium chelonae (12); y Mycobacterium
fortuitum (10).
La siguiente secuencia de cADN se caracterizó
por los criterios de longitud, Tm y análisis de secuencia, como se
describió anteriormente, antes de la Tabla titulada "Esquema
ilustrativo de las relaciones de secuencias entre bacterias
afines", y se determinó que es específica para el rARN de
Mycobacterium avium:
- ACC GCA AAA GCT TTC CAC CAG AAG ACA TGC GTC TTG AG.
Esta secuencia es complementaria de un segmento
singular encontrado en el rARN de 16S de Mycobacterium avium.
El tamaño de la sonda es de 38 bases. La sonda tiene una Tm de 74ºC
y el análisis de secuencia por el método de Maxam & Gilbert
(1980), ut supra, confirmó que la sonda estaba correctamente
sintetizada. La sonda es capaz de hibridarse con el rARN de M.
avium, en la región correspondiente a las bases 185 a 225 del
rARN de 16S de E. coli.
Para demostrar la reactividad de esta secuencia
hacia Mycobacterium avium, se ensayó como sonda en reacciones
de hibridación, en las condiciones que a continuación se indican.
Las sondas de oligonucleótido marcadas en el extremo con ^{32}P
se mezclaron con 1 \mug (7\times10^{-13} moles) de rARN
purificado de Mycobacterium avium y se hicieron reaccionar
en tampón de hibridación PB 0,12 M (cantidades equimolares de
Na_{2}HPO_{4} y NaH_{2}PO_{4}), EDTA 1 mM y SDS
(dodecilsulfato de sodio) al 0,02%, durante 60 min, a 65ºC, a un
volumen final de 50 \mul. La sonda se mezcló, en tubos separados,
con el tampón de hibridación, en presencia y en ausencia de la
diana, respectivamente. Después de la separación en hidroxiapatito,
como se esquematiza en la patente
EP-A-0131052 mencionada
anteriormente, los híbridos se cuantificaron por contaje de
centelleo. Estos resultados se presentan en la Tabla 1 y ponen de
manifiesto que la sonda tiene un alto grado de reacción con la
diana homóloga, y muy poca unión no específica al
hidroxiapatito.
hidroxiapatito.
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La especificidad de la sonda para M.
avium se ensayó mezclando la sonda marcada con ^{32}P con el
rARN liberado de células de otras 29 especies de micobacterias por
técnicas de ruptura sónica. Se pusieron en suspensión
1\times10^{8} células en 0,1 ml de SDS al 5% y se sometieron a
ultrasonidos durante 10 min, a 50-60ºC. Se añadió
1,0 ml de tampón de hibridación
(diisobutil-sulfosuccinato de sodio al 45%, tampón
de fosfato 40 mM, pH 6,8, y EDTA 1 mM), y la mezcla se incubó
durante 60 min, a 72ºC. Después de la incubación, se añadieron 4,0
ml de solución de hidroxiapatito (tampón de fosfato de sodio 0,14 M,
pH 6,8, SDS al 0,02% y 1,0 g de hidroxiapatito por cada 50 ml de
solución) y se incubó durante 5 min, a 72ºC. La muestra se
centrifugó y el sobrenadante se eliminó. Se añadieron 4,0 ml de
solución de lavado (fosfato de sodio 0,14 M, pH 6,8) y la muestra se
sometió a movimiento vorticial, se centrifugó y el sobrenadante se
eliminó. La cantidad de radiactividad unida al hidroxiapatito se
determinó por contaje de centelleo. Los resultados se presentan en
la Tabla 2 e indican que la sonda es específica para
Mycobacterium avium y no reacciona con ninguna otra especie
de micobacterias, incluida Mycobacterium intracellulare.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Como se muestra en la Tabla 3, la sonda tampoco
reaccionaba con el rARN de cualquiera de los patógenos respiratorios
que se ensayaron también por el método que se acaba de describir.
Ni reaccionaba tampoco la sonda con ninguna otra especie de
bacteria estrechamente afín o filogenéticamente más diversa,
ensayada también por el método citado (Tabla 4).
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\newpage
Después de la alineación descrita en el Ejemplo
1, la siguiente secuencia se caracterizó por los criterios antes
mencionados de longitud, Tm y análisis de secuencia, y se determinó
que es específica para Mycobacterium intracellulare:
- ACC GCA AAA GCT TTC CAC CTA AAG ACA TGC GCC TAA AG.
La secuencia es complementaria de un segmento
singular encontrado en el rARN de 16S de Mycobacterium
intracellulare. El tamaño de la sonda fue de 38 bases. La sonda
tiene una Tm de 75ºC y el análisis de secuencia confirmó que la
sonda estaba correctamente sintetizada. La sonda se hibrida con el
ARN de M. intracellulare, en la región correspondiente a las
bases 185 a 225 del rARN de 16S de E. coli.
Para demostrar la reactividad de esta secuencia
hacia el rARN de Mycobacterium intracellulare, la sonda se
ensayó en reacciones de hibridación, en las condiciones que a
continuación se indican. La sonda de oligonucleótido marcada en el
extremo con ^{32}P se mezcló con 1 \mug (7\times10^{-13}
moles) de rARN purificado de Mycobacterium intracellulare y
se hizo reaccionar en PB 0,12 M (cantidades equimolares de
Na_{2}HPO_{4} y NaH_{2}PO_{4}), EDTA 1 mM y SDS
(dodecil-sulfato de sodio) al 0,2%, durante 60 min,
a 65ºC, a un volumen final de 50 \mul. La sonda se mezcló, en
tubos separados, con el tampón de hibridación, en presencia y en
ausencia del rARN diana de Mycobacterium intracellulare,
respectivamente. Después de la separación en hidroxiapatito, como
se esquematizó anteriormente, los híbridos se cuantificaron por
contaje de centelleo. Estos resultados se presentan en la Tabla
5.
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Estos datos muestran que la sonda tiene un alto
grado de reacción con su diana homóloga y muy poca unión no
específica al hidroxiapatito.
La especificidad de la sonda para
Mycobacterium intracellulare se ensayó mezclando la sonda
marcada con ^{32}P, con el rARN liberado de células de otras 29
especies de micobacterias por técnicas de ruptura sónica. Todos los
ensayos de hibridación se realizaron como se describe en el Ejemplo
1. La Tabla 6 indica que la sonda es específica para
Mycobacterium intracellulare y no reacciona con ninguna otra
especie de micobacterias, incluida Mycobacterium avium.
Estos resultados son impresionantes, teniendo en cuenta el 98% de
homología del rARN respecto a M. avium; 98% de homología
respecto a M. kansasii; 98% de homología respecto a M.
asiaticum; y 97% de homología respecto a M.
tuberculosis.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Como se muestra en la Tabla 7, la sonda no
reaccionaba con el rARN de cualquiera de los patógenos respiratorios
probados en el ensayo de hibridación. Ni reaccionaba tampoco la
sonda con ninguna otra especie de bacteria estrechamente afín o
filogenéticamente más diversa, de las que fueron probadas (Tabla
8).
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Después de la alineación descrita en el Ejemplo
1, la siguiente secuencia se caracterizó por los tres criterios
antes mencionados de tamaño, secuencia y Tm, y se determinó que es
específica para el complejo de organismos Mtb (Mycobacterium
tuberculosis), Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
africanum, Mycobacterium bovis y Mycobacterium
microti:
- 1.
- TAA AGC GCT TTC CAC CAC AAG ACA TGC ATC CCG TG.
La secuencia es complementaria de un segmento
singular encontrado en el rARN de 16S de las bacterias del complejo
Mtb. El tamaño de la sonda es de 35 bases. La sonda tiene una Tm de
72ºC y el análisis de secuencia confirmó que la sonda estaba
correctamente sintetizada. La sonda es capaz de hibridarse en la
región correspondiente a las bases 185 a 225 del rARN de 16S de
E. coli.
Para demostrar la reactividad de esta secuencia
hacia el complejo Mtb, la sonda se ensayó en reacciones de
hibridación, en las condiciones que a continuación se indican. La
sonda de oligonucleótido marcada en el extremo con ^{32}P se
mezcló con 1 \mug (7\times10^{-13} moles) de rARN purificado
de Mycobacterium tuberculosis y se hizo reaccionar en tampón
de hibridación PB 0,12 M (cantidades equimolares de
Na_{2}HPO_{4} y NaH_{2}PO_{4}), EDTA 1 mM y SDS
(dodecil-sulfato de sodio) al 0,2%, durante 60 min,
a 65ºC, a un volumen final de 50 \mul. La sonda se mezcló, en
tubos separados, con el tampón de hibridación, en presencia y en
ausencia del rARN diana de Mycobacterium tuberculosis,
respectivamente. Después de la separación en hidroxiapatito, como se
esquematizó anteriormente, los híbridos se cuantificaron por
contaje de centelleo. Los resultados se presentan en la Tabla 9.
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Estos datos muestran que la sonda tiene un alto
grado de reacción con la diana homóloga y muy poca unión no
específica al hidroxiapatito.
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La especificidad de la sonda para el complejo
Mtb se ensayó mezclando la sonda marcada con ^{32}P, con el rARN
liberado de células de los cuatro bacilos del complejo Mtb y de
otras 25 especies de micobacterias por técnicas de ruptura sónica.
Todos los ensayos de hibridación se realizaron como se describe en
el Ejemplo 1. La Tabla 10 indica que la sonda es específica para
los organismos comprendidos dentro del complejo Mtb y no reacciona
con ninguna otra especie de micobacteria.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Como se muestra en la Tabla 11, la sonda no
reaccionaba con el rARN de cualquiera de los patógenos respiratorios
probados en el ensayo de hibridación. Ni reaccionaba tampoco la
sonda con ninguna otra especie de bacteria estrechamente afín o
filogenéticamente más diversa, de las que fueron probadas (Tabla
12).
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\newpage
Se prepararon y ensayaron dos derivados de la
sonda del Ejemplo 3 (designados a continuación con los números 2 y
3):
- 2.
- CCG CTA AAG CGC TTT CCA CCA CAA GAC ATG CAT CCC G
- 3.
- ACA CCG CTA AAG CGC TTT CCA CCA CAA GAC ATG CAT C.
Las tres sondas tienen valores parecidos de Tm
(72ºC, 73,5ºC y 72,3ºC, respectivamente) y características de
hibridación también parecidas.
La hibridación con el complejo de organismos de
Mycobacterium tuberculosis fue del 68 a 75% y la hibridación
no específica con el hidroxiapatito fue inferior al 2%. A
continuación se presentan los resultados de las pruebas de estos
derivados en el ensayo de hibridación.
La sonda específica para el rARN de 23S del
complejo de M. tuberculosis se obtuvo usando un cebador que
era complementario de una región muy conservada del rARN de 23S. La
secuencia de este cebador, derivada del rARN de E. coli, fue
5'-AGG AAC CCT TGG GCT TTC GG-3'. Se
mezclaron 5 ng de este cebador con 1 \mug de rARN de M.
tuberculosis y otras especies de Mycobacterium
estrechamente afines y se siguió el procedimiento descrito para los
Ejemplos 1, 2 y 3. Después de una alineación como se describe en el
Ejemplo 1, se determinó que la siguiente secuencia es específica
para el complejo de organismos Mtb, Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis y Mycobacterium
microti:
- TGC CCT ACC CAC ACC CAC CAC AAG GTG ATG T.
La secuencia es complementaria de un segmento
singular encontrado en el rARN de 23S de las bacterias del complejo
Mtb. La sonda de oligonucleótido se caracterizó como se ha descrito
anteriormente, por los criterios de longitud, Tm y análisis de
secuencia. El tamaño de la sonda es de 31 bases. La sonda tiene una
Tm de 72,5ºC y el análisis de secuencia confirmó que la sonda
estaba correctamente sintetizada. La sonda es capaz de hibridarse en
la región correspondiente a las bases 1155 a 1190 del rARN de 23S
de E. coli.
Para demostrar la reactividad de esta secuencia
hacia el complejo Mtb, la sonda se ensayó en reacciones de
hibridación, en las condiciones que a continuación se indican. Las
sondas de oligonucleótido marcadas en el extremo con ^{32}P se
mezclaron con 1 \mug (7\times10^{-13} moles) de rARN
purificado de Mycobacterium tuberculosis y se hicieron
reaccionar en tampón de hibridación PB 0,12 M (cantidades
equimolares de Na_{2}HPO_{4} y NaH_{2}PO_{4}), EDTA 1 mM y
SDS (dodecil-sulfato de sodio) al 0,2%, durante 60
min, a 65ºC, a un volumen final de 50 \mul. La sonda se mezcló,
en tubos separados, con el tampón de hibridación, en presencia y en
ausencia del rARN diana de Mycobacterium tuberculosis,
respectivamente. Después de la separación en hidroxiapatito, como
se esquematizó anteriormente, los híbridos se cuantificaron por
contaje de centelleo. Los resultados se presentan en la Tabla
14.
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Estos datos muestran que la sonda tiene un alto
grado de reacción con la diana homóloga y muy poca unión no
específica al hidroxiapatito.
La especificidad de la sonda para el complejo
Mtb se ensayó mezclando la sonda marcada con ^{32}P, con el rARN
liberado de células de los cuatro bacilos del complejo Mtb y de
otras 25 especies de micobacterias por técnicas de ruptura sónica.
Todos los ensayos de hibridación se realizaron como se describe en
el Ejemplo 1. La Tabla 15 indica que la sonda es específica para
los organismos comprendidos dentro del complejo Mtb y no reacciona
con ninguna otra especie de micobacteria.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Tres sondas adicionales para el complejo de
Mycobacterium tuberculosis, Ejemplos 5 a 7 de la presente
Memoria, se identificaron usando dos cebadores singulares,
complementarios del rARN de 23S. La primera secuencia es:
- CCA TCA CCA CCC TCC TCC GGA GAG GAA AAG G.
La secuencia de este Ejemplo 5 se obtuvo usando
un cebador 23S con la secuencia 5'-GGC CAT TAG ATC
ACT CC -3'. Se caracterizó y se demostró que es específica para el
complejo de organismos de Mycobacterium tuberculosis,
incluyendo Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
africanum y Mycobacterium bovis. Esta secuencia,
procedente de rARN de 23S, tiene una longitud de 31 bases y una Tm
de 72ºC. Esta sonda es capaz de hibridarse con el ARN de los
organismos arriba mencionados, en la región correspondiente a las
bases 540 a 575 de rARN de 23S de E. coli.
Para demostrar la reactividad y especificidad de
esta sonda para el complejo de Mycobacterium tuberculosis,
se ensayó como sonda en reacciones de hibridación, en las
condiciones que a continuación se indican. La sonda de
oligonucleótido marcada en el extremo con ^{32}P, se mezcló con el
rARN liberado de células de 30 especies de micobacterias por
técnicas de ruptura sónica. Se pusieron en suspensión
3\times10^{7} células en 0,1 ml de SDS al 5% y se sometieron a
ultrasonidos durante 15 min, a 50-60ºC. Se añadió 1
ml de tampón de hibridación
(diisobutil-sulfosuccinato de sodio al 45%, tampón
de fosfato 40 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM), y la mezcla se
incubó durante 2 h, a 72ºC. Después de la incubación, se añadieron 4
ml de hidroxiapatito al 2% (peso/vol), tampón de fosfato de sodio
0,12 M, pH 6,8, SDS al 0,02%, azida de sodio al 0,02%, y se incubó
durante 5 min, a 72ºC. La muestra se centrifugó y el sobrenadante
se eliminó. Se añadieron 4 ml de solución de lavado (tampón de
fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8, SDS al 0,02%, azida de sodio al
0,02%) y la muestra se sometió a movimiento vorticial, se
centrifugó y el sobrenadante se eliminó. La cantidad de
radiactividad unida al hidroxiapatito se determinó por contaje de
centelleo. Los resultados se presentan en la Tabla 16 e indican que
la sonda es específica para el complejo de organismos de
Mycobacterium tuberculosis.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La Tabla 17 muestra que la sonda tampoco
reaccionaba de forma cruzada con el ARN de cualquiera de los
organismos estrechamente afines ensayados por el método que se
acaba de describir.
La segunda sonda para el complejo de
Mycobacterium tuberculosis se obtuvo usando un cebador 23S
con la secuencia 5'-CCT GAT TGC CGT CCA GGT TGA GGG
AAC CTT TGG G-3'. Su secuencia es:
- CTG TCC CTA AAC CCG ATT CAG GGT TCG AGG TTA GAT GC.
Esta secuencia, procedente de rARN de 23S, tiene
una longitud de 38 bases y una Tm de 75ºC. Se hibrida en la región
correspondiente a las bases 2195 a 2235 de rARN de 23S de E.
coli.
Como en el caso de la sonda para el complejo del
Ejemplo 5, se caracterizó esta secuencia y se demostró que es
específica para el complejo de organismos de Mycobacterium
tuberculosis, incluyendo Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium africanum y Mycobacterium bovis.
Para demostrar la reactividad y especificidad de
la sonda de este Ejemplo 6 para el complejo de Mycobacterium
tuberculosis, se ensayó como sonda en reacciones de hibridación,
en las condiciones descritas para la sonda del Ejemplo 5. Los
resultados se presentan en la Tabla 18 e indican que la sonda es
específica para el complejo de organismos de Mycobacterium
tuberculosis, con la excepción de Mycobacterium
thermoresistibile, un producto aislado raro, que no es un patógeno
humano.
La Tabla 19 muestra que la sonda tampoco
reaccionaba de forma cruzada con el ARN de cualquiera de los
organismos filogenéticamente muy afines, ensayados por el método
que se acaba de describir.
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La siguiente sonda adicional para el complejo de
Mycobacterium tuberculosis también se ha identificado usando
un cebador 23S con la misma secuencia que en el Ejemplo 6, es decir,
5'-CCT GAT TGC CGT CCA GGT TGA GGG AAC CTT TGG
G-3':
- AGG CAC TGT CCC TAA ACC CGA TTC AGG GTT C.
Esta secuencia, procedente de rARN de 23S, tiene
una longitud de 31 bases y una Tm de 71ºC. Se hibrida en la región
correspondiente a las bases 2195 a 2235 de rARN de 23S de E.
coli.
Como en el caso de las sondas para el complejo
de Mycobacterium tuberculosis de los Ejemplos 5 y 6, se
caracterizó también esta secuencia y se demostró que es específica
para el complejo de organismos de Mycobacterium tuberculosis,
incluyendo Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
africanum y Mycobacterium bovis.
Para demostrar la reactividad y especificidad de
esta sonda para el complejo de Mycobacterium tuberculosis,
se ensayó como sonda en reacciones de hibridación, en las
condiciones descritas para la sonda del Ejemplo 5. La Tabla 20
muestra que la sonda es específica para el complejo de organismos de
Mycobacterium tuberculosis.
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La Tabla 21 muestra que la sonda tampoco
reaccionaba de forma cruzada con el ARN de cualquiera de los
organismos estrechamente afines, ensayados por el método que se
acaba de describir.
Es notable que sondas que solapan puedan tener
una especificidad idéntica. Compárense, por ejemplo, las sondas de
los Ejemplos 6 y 7:
- Ejemplo 6: CTG TCC CTA AAC CCG ATT CAG GGT TCG AGG TTA GAT GC
- Ejemplo 7: AGG CAC TGT CCC TAA ACC CGA TTC AGG GTT C
Pueden existir varias secuencias de una región
particular que suministren sondas con las características de
hibridación deseadas. En otros casos, una secuencia sonda puede ser
significativamente mejor que otra sonda que difiere en una sola
base. En general, cuanto mayor es la diferencia de secuencias (% de
no apareamiento) entre un organismo diana y otro no diana, más
probable es que se pueda alterar la sonda sin afectar a su utilidad
para una aplicación específica. Este fenómeno también se demostró
por las sondas derivadas del Ejemplo 3.
En el Ejemplo 7, se añadieron cinco bases al
extremo 5' de la sonda del Ejemplo 6, y se eliminaron 12 bases del
extremo 3'. Las dos sondas tienen características de hibridación
esencialmente idénticas.
El género Mycobacterium es
particularmente difícil de distinguir de Nocardia,
Corynebacterium y Rhodococcus. Estos géneros tienen
antígenos, precipitinas y números de G y C comunes. A pesar de que
estos organismos también presentan 92 a 94% de homología de rARN
con los organismos enumerados arriba, los autores de la presente han
diseñado sondas que detectan todos los miembros del género
Mycobacterium, sin reaccionar de forma cruzada con los géneros
afines.
Además de las sondas para las especies de
Mycobacterium ya descritas, se identificaron cuatro sondas
específicas para miembros del género Mycobacterium, usando
un cebador complementario de rARN de 16S y un cebador complementario
de rARN de 23S. La secuencia 1 se obtuvo usando un cebador 16S con
la secuencia 5'-TTA CTA GCG ATT CCG ACT
TCA-3'. Las secuencias 2, 3 y 4 se obtuvieron usando
un cebador 23S con la secuencia 5'-GTG TCG GTT TTG
GGT ACG-3'. La secuencia 1 es capaz de hibridarse
con ARN del género Mycobacterium en la región correspondiente
a las bases 1025 a 1060 del rARN de 16S de E. coli. Las
secuencias 2 a 4 se hibridan en las regiones correspondientes a las
siguientes bases del rARN de 23S de E. coli, en el sistema de
numeración de la presente Memoria (véase la Figura 2): 1440 a 1475;
1515 a 1555; 1570 a 1610, en el sistema de numeración de la presente
Memoria.
Se caracterizaron las siguientes secuencias y se
demostró que son específicas para el género
Mycobacterium:
-
23
La secuencia 1, de rARN de 16S, tiene una
longitud de 30 bases y una Tm de 73ºC. La secuencia 2, de rARN de
23S, tiene una longitud de 33 bases y una Tm de 75ºC. La secuencia
3, de rARN de 23S, tiene una longitud de 35 bases y una Tm de 76ºC.
La secuencia 4, de rARN de 23S, tiene una longitud de 33 bases y una
Tm de 73ºC.
Para demostrar la reactividad y especificidad de
la sonda 1 para los miembros del género Mycobacterium, se
ensayó como sonda en reacciones de hibridación, en las condiciones
que a continuación se indican. Las sondas de oligonucleótido,
marcadas con ^{125}I, se mezclaron con el rARN liberado de células
de 30 especies de micobacterias por técnicas de ruptura sónica. Se
pusieron en suspensión 3\times10^{7} células en 0,1 ml de SDS
al 5% y se sometieron a ultrasonidos durante 15 min, a
50-60ºC. Se añadió 1 ml de tampón de hibridación
(diisobutil-sulfosuccinato al 45%, fosfato de sodio
40 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM), y la mezcla se incubó durante
2 h, a 72ºC. Después de la incubación, se añadieron 2 g/l de
solución de separación (que contiene 2,5 g/l de microesferas
magnéticas catiónicas, tampón de fosfato de sodio 0,17 M, pH 6,8,
Tritón X-100 (TM) al 7,5%, azida de sodio al
0,02%), y se incubó durante 5 min, a 72ºC. Se recogieron los
híbridos de ARN y sonda, unidos a las partículas magnéticas, y el
sobrenadante se eliminó. Se añadió 1 ml de solución de lavado
(tampón de fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8,
diisobutil-sulfosuccinato al 14%, Tritón
X-100 al 5%, azida de sodio al 0,02%), las
partículas se recogieron y el sobrenadante se eliminó. Esta etapa se
repitió dos veces. La cantidad de radiactividad unida a las
partículas magnéticas se determinó en un contador gamma. Los
resultados se presentan en la Tabla 22 e indican que las sondas se
hibridan con los organismos del género Mycobacterium y que una
combinación de sondas detectará a todos los miembros del género. La
Tabla 23 muestra que las sondas no reaccionan con otras bacterias
estrechamente afines.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los micoplasmas son pequeñas bacterias aeróbicas
que carecen de paredes celulares. Se estima que el Mycoplasma
pneumoniae causa de 8 a 15 millones de infecciones al año. Las
infecciones pueden ser asintomáticas o variar en gravedad desde una
bronquitis y neumonía leve a grave. Se cree que el organismo causa
aproximadamente 10% de las neumonías en la población general y 10
a 50% de las neumonías de miembros de grupos que están en contacto
estrecho y prolongado, tales como estudiantes de colegios y personal
militar.
Hasta ahora, el diagnóstico requería el
aislamiento del organismo en cultivo o la demostración de un aumento
en el título de anticuerpos. El cultivo del organismo implica la
inoculación de especímenes del tracto respiratorio en agar o medios
bifásicos que contienen inhibidores del crecimiento bacteriano. El
examen del crecimiento en períodos de 3 a 4 días y de 7 a 10 días
se utiliza para establecer la presencia o ausencia de cualquier
micoplasma. El Mycoplasma pneumoniae debe luego identificarse
por hemoadsorción (la capacidad de M. pneumoniae para
adherirse a eritrocitos de oveja o de cobaya), hemolisis (la
capacidad de M. pneumoniae para producir hemolisis beta de
eritrocitos de oveja o cobaya en agar con sangre), inhibición del
crecimiento por anticuerpos específicos, o inmunofluorescencia con
anticuerpos específicos. La presente invención ofrece ventajas
significativas sobre cada uno de estos métodos de la técnica
anterior, debido a la sencillez del ensayo y a la fuerte reducción
del tiempo necesario para lograr un diagnóstico.
Una sonda específica para el rARN de 5S de M.
pneumoniae se obtuvo por comparación de secuencias de rARN
conocidas. Las secuencias particulares alineadas fueron de M.
pneumoniae, M. gallisepticum y Ureaplasma urealyticum
(Rogers, M.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,
1160-64 (1985)), M. capricolum (Hori, H
et. al., Nucleic Acids Research 9, 5407-10
(1981)) y Spiroplasma sp. (Walker, R.T. et al.,
Nucleic Acids Research 10, 6363-67 (1982)). Las
alineaciones se realizaron como se describió anteriormente. El rARN
de 5S puede aislarse y secuenciarse como se indica en Rogers et
al., o puede prepararse un cebador que es complementario de una
región conservada en el rARN de 5S y realizarse la secuenciación
como se esquematiza en los Ejemplos 1 a 4. La región conservada de
rARN de 5S está documentada en Fox, G.E. y Woese, C.R., Nature 256,
505-07 (1975). Se determinó que la siguiente
secuencia es específica para Mycoplasma pneumoniae:
- GCT TGG TGC TTT CCT ATT CTC ACT GAA ACA GCT ACA TTC GGC.
La secuencia es complementaria de un segmento
singular encontrado en el rARN de 5S de Mycoplasma
pneumoniae, en la región correspondiente a las bases 65 a 108
del rARN de 5S de E. coli, y se seleccionó por comparación
con las secuencias de rARN de 5S de Mycoplasma gallisepticum,
Spiroplasma mirum y Ureaplasma urealyticum. La sonda de
oligonucleótido se caracterizó como se describió anteriormente. El
tamaño de la sonda fue de 42 bases. La sonda tiene una Tm de
71,5ºC.
Para demostrar la reactividad de esta secuencia
hacia Mycoplasma pneumoniae, la sonda se ensayó en reacciones
de hibridación, en las condiciones que a continuación se indican.
La sonda de oligonucleótido marcada en el extremo con ^{32}P se
mezcló con 1 \mug (7\times10^{-13} moles) de rARN purificado
de Mycoplasma pneumoniae y se hizo reaccionar en PB 0,12 M
(cantidades equimolares de Na_{2}HPO_{4} y NaH_{2}PO_{4}),
EDTA 1 mM y SDS (dodecil-sulfato de sodio) al 0,2%,
durante 60 min, a 65ºC, a un volumen final de 50 \mul. La sonda
se mezcló, en tubos separados, con el tampón de hibridación, en
presencia y en ausencia del rARN diana de Mycoplasma
pneumoniae, respectivamente. Después de la separación en
hidroxiapatito, como se esquematizó anteriormente, los híbridos se
cuantificaron por contaje de centelleo. Estos resultados se
presentan en la Tabla 24.
Estos datos muestran que la sonda tiene un alto
grado de reacción con su diana homóloga y muy poca unión no
específica al hidroxiapatito.
La especificidad de la sonda 5S para M.
pneumoniae se ensayó mezclando la sonda marcada con ^{32}P,
con el rARN liberado de células de otras especies de Mycoplasma.
Todos los ensayos de hibridación se realizaron como se describe en
el Ejemplo 1. La Tabla 25 indica que la sonda es específica para
Mycoplasma pneumoniae y no reacciona con ninguna otra
especie de Mycoplasma.
Como se muestra en la Tabla 26, la sonda no
reaccionaba con cualquier otra especie de bacteria estrechamente
afín o filogenéticamente diversa.
Se obtuvieron cuatro secuencias sonda
adicionales (a las que se asignan a continuación los números 2 a 5)
específicas para Mycoplasma pneumoniae, utilizando cuatro
cebadores singulares, complementarios de regiones conservadas de
rARN de 16S. Las regiones corresponden, respectivamente, a las bases
190 a 230, 450 a 490, 820 a 860 y 1255 a 1290 de rARN de 16S de
E. coli. La secuencia sonda #1 se obtuvo usando un cebador
con la secuencia 5'-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA
AT-3'. La secuencia sonda #2 se obtuvo usando un
cebador con la secuencia 5'-GTA TTA CCG CGG CTG CTG
GC-3'. La secuencia sonda #3 se obtuvo usando un
cebador con la secuencia 5'-CCG CTT GTG CGG GCC CCC
GTC AAT TC-3'. La secuencia sonda #4 se obtuvo
usando un cebador con la secuencia 5'-CGA TTA CTA
GCG ATT CC-3'. Las reacciones de secuenciación se
realizaron como se esquematizó en los ejemplos anteriores. Las
secuencias de M. pneumoniae se compararon con secuencias de
Mycoplasma genitalium, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma
gallisepticum y Spiroplasma mirum.
Se caracterizaron las siguientes secuencias
sonda, conforme a los criterios descritos en el Ejemplo 1 de la
solicitud de patente, y se demostró que son específicas para
Mycoplasma pneumoniae:
- 2.
- AAT AAC GAA CCC TTG CAG GTC CTT TCA ACT TTG AT
- 3.
- CAG TCA AAC TCT AGC CAT TAC CTG CTA AAG TCA TT
- 4.
- TAC CGA GGG GAT CGC CCC GAC AGC TAG TAT
- 5.
- CTT TAC AGA TTT GCT CAC TTT TAC AAG CTG GCG AC.
La sonda #2 tiene una longitud de 35 bases y una
Tm de 67ºC. La sonda #3 tiene una longitud de 35 bases y una Tm de
66ºC. La sonda #4 tiene una longitud de 30 bases y una Tm de 69ºC.
La sonda #5 tiene una longitud de 35 bases y una Tm de 66ºC.
Cuando se mezclaron las cuatro sondas y se
utilizaron en ensayos de hibridación a 60ºC, del mismo modo que en
los ejemplos anteriores, se encontró que son específicas para M.
pneumoniae. Las sondas no reaccionan de forma cruzada con otros
patógenos respiratorios o con cualquier organismo representante del
árbol filogenético bacteriano (Tabla 28).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El género Legionella contiene 22
especies, que son, todas ellas, potencialmente patógenas para los
seres humanos. Estos organismos causan la enfermedad de los
legionarios, una neumonía aguda, o la fiebre de Pontiac, una
enfermedad febril, aguda, no neumónica, que no es de consecuencias
fatales.
Se ha demostrado que hay especies de
Legionella que son responsables de la neumonía nosocomiana,
que se da predominantemente entre pacientes
inmuno-comprometidos.
La legionelosis, que incluye la enfermedad de
los legionarios y la fiebre de Pontiac, se diagnostica sobre la
base de síntomas clínicos, mediante ensayos de fluorescencia directa
o indirecta con anticuerpos, y por cultivo, empleando un extracto
de levadura con carbón tamponado (BCYE) en agar, que contiene
agentes microbianos selectivos. No se conoce, en la técnica
anterior, ningún ensayo individual definitivo para este género.
(Véase el Manual of Systematic Bacteriology de Bergey, pág. 283,
ed. de 1984). Los ensayos con anticuerpos fluorescentes no son
capaces de identificar todas las especies de Legionella, sino sólo
unas pocas para las que existen anticuerpos. El método del cultivo
no constituye un diagnóstico definitivo para las especies de
Legionella.
Las secuencias de oligonucleótido descritas a
continuación, cuando se usan como sondas en un ensayo de hibridación
de ácido nucleico, identifican correctamente todas las especies de
Legionella. Este ensayo es más sensible que el cultivo o los
ensayos con anticuerpos, y acorta significativamente el tiempo de
identificación y, por consiguiente, el de diagnóstico. El ensayo
representa, por tanto, una mejora significativa frente a los métodos
de diagnóstico anteriores.
Se obtuvieron tres secuencias sonda específicas
para el género Legionella utilizando tres cebadores singulares,
complementarios de regiones conservadas de rARN de 16S y de 23S. La
secuencia sonda 1 se obtuvo usando un cebador 16S con la secuencia
5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C-3'.
La secuencia sonda 2 se obtuvo usando un cebador 23S con la
secuencia 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC
CTT-3'. La secuencia sonda 3 se obtuvo usando un
cebador 16S con la secuencia 5'-GCT CGT TGC GGG ACT
TAA CCC ACC AT-3'. La secuenciación con estos
cebadores se realizó como se describió en los ejemplos
anteriores.
Se caracterizaron las tres secuencias
siguientes, conforme a los criterios descritos en el Ejemplo 1, y se
demostró que son específicas para el género Legionella. Los
vecinos filogenéticamente más próximos Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus y
Acinetobacter calcoaceticus se usaron como comparaciones con
las secuencias de las especies de Legionella.
- 1.
- TAC CCT CTC CCA TAC TCG AGT CAA CCA GTA TTA TCT GAC C
- 2.
- GGA TTT CAC GTG TCC CGG CCT ACT TGT TCG GGT GCG TAG TTC
- 3.
- CAT CTC TGC AAA ATT CAC TGT ATG TCA AGG GTA GGT AAG G.
La secuencia 1, de rARN de 16S, tiene una
longitud de 40 bases y una Tm de 72ºC. La secuencia 2, de rARN de
23S, tiene una longitud de 42 bases y una Tm de 73ºC. La secuencia
3, de rARN de 16S, tiene una longitud de 40 bases y una Tm de 68ºC.
Estas secuencias son capaces de hibridarse con el ARN del género
Legionella en las regiones correspondientes,
respectivamente, a las bases 630 a 675 de rARN de 16S de E.
coli; 350 a 395 de rARN de 23S de E. coli; y 975 a 1020
de rARN de 16S de E. coli. Cuando se mezclaron las sondas,
tenían una Tm media combinada de 73ºC. El análisis en geles de
poliacrilamida demostró que cada una de las sondas tenía la
longitud correcta, y el análisis de secuencias demostró que cada una
poseía la secuencia de bases correcta.
Cuando se mezclaron las tres sondas y se
utilizaron en un ensayo de hibridación, se encontró que son
específicas para el género Legionella (Tablas 29 y 30) y que no
reaccionaban de forma cruzada con otros patógenos respiratorios o
con cualquier organismo seleccionado del árbol filogenético (Tablas
31 y 32). El uso de más de una sonda, es decir, de una mezcla de
sondas, puede conducir a una sensibilidad aumentada del ensayo y/o a
un aumento en el número de organismos no virales que se pueden
detectar.
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Se obtuvieron tres secuencias sonda adicionales
(a las que se asignaron los números 4 a 6), específicas para el
género Legionella, utilizando dos cebadores complementarios
de regiones conservadas de rARN de 23S. La secuencia 4 se preparó a
partir de un cebador 23S con la secuencia 5'-CCT TCT
CCC GAA GTT ACG G-3'. Las secuencias sonda 5 y 6 se
prepararon a partir de un cebador 23S con la secuencia
5'-AAG CCG GTT ATC CCC GGG GTA ACT
TTT-3'. La secuenciación con estos cebadores se
realizó como se describió en los ejemplos anteriores.
Se caracterizaron las tres secuencias
siguientes, conforme a los criterios descritos anteriormente, y se
demostró que son específicas para el género Legionella. Los
vecinos filogenéticamente más próximos Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus y
Acinetobacter calcoaceticus se usaron para comparaciones con
las secuencias de las especies de Legionella.
- 4.
- GCG GTA CGG TTC TCT ATA AGT TAT GGC TAG C
- 5.
- GTA CCG AGG GTA CCT TTG TGC T
- 6.
- CAC TCT TGG TAC GAT GTC CGA C.
La sonda 4, complementaria del rARN de 23S en la
región correspondiente a las bases 1585 a 1620 del rARN de 23S de
E. coli, tiene una longitud de 31 bases y una Tm de 67ºC. La
sonda 5, complementaria del rARN de 23S en la región
correspondiente a las bases 2280 a 2330 del rARN de 23S de E.
coli, tiene una longitud de 22 bases y una Tm de 66ºC. La sonda
6, complementaria de rARN de 23S en la misma región que la sonda 5,
tiene una longitud de 22 bases y una Tm de 63ºC.
Cuando se mezclaron las tres sondas con la sonda
3 anterior y se utilizaron en un ensayo de hibridación como se
describe para las sondas 1 a 3, se encontró que eran específicas
para el género Legionella (Tabla 33) y que no reaccionaban
de forma cruzada con otros patógenos respiratorios o con cualquier
organismo seleccionado del árbol filogenético (Tablas 34 y 35). El
uso de más de una sonda, es decir, de una mezcla de sondas, puede
mejorar la sensibilidad del ensayo y/o aumentar el número de
organismos no virales detectados.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Chlamydia son bacterias intracelulares
estrictas, no móviles, gram-negativas. La especie
C. trachomatis está asociada con el tracoma endémico (la
forma prevenible de ceguera más común), conjuntivitis de inclusión y
linfogranuloma venéreo (LGV). Es una causa importante de uretritis
no gonocócica en el hombre y puede causar cervicitis y salpingitis
aguda en la mujer. La enfermedad ocular o neumonía clamídica puede
desarrollarse en los recién nacidos que pasan a través del canal de
nacimiento infectado.
Hay varios métodos conocidos en la técnica para
la identificación de C. trachomatis en el tracto urogenital,
por ejemplo, por tinción inmunofluorescente directa o inmunoensayo
enzimático de especímenes clínicos. El método preferido sigue
siendo, sin embargo, el cultivo del organismo en células McCoy
tratadas con cicloheximida. El cultivo celular va seguido de una
tinción de anticuerpos morfológicos o fluorescentes, para confirmar
la identidad del organismo.
Las secuencias de oligonucleótido descritas a
continuación, cuando se utilizan como sondas en el ensayo de
hibridación de ácido nucleico identifican correctamente los
productos del aislamiento de Chlamydia trachomatis. Este
ensayo tiene la misma sensibilidad que los ensayos con cultivos o
anticuerpos, y en comparación con el cultivo, acorta
significativamente el tiempo necesario para la identificación y por
tanto, para el diagnóstico.
Kingsbury, D.T. y E. Weiss, J. Bacteriol. 96,
1421-23 (1968); Moulder, J.W. ASM News Vol. 50, Nº 8
(1984) comunican que hay un mero 10% de homología de ADN entre
C. trachomatis y C. psittaci. Además, estas
publicaciones muestran que cepas diferentes de C.
trachomatis difieren en la homología de ADN. Weisberg, W.G.
et al., J. Bacteriol. 167, 570-74 (1986)
publicaron las secuencias de rARN de 16S de C. psittaci y
observaron que C. trachomatis y C. psittaci comparten
una homología de rARN superior al 95%. De estas publicaciones puede
deducirse que sería difícil desarrollar: (1) sondas capaces de
hibridarse con todas las cepas de C. trachomatis; y (2)
sondas capaces de distinguir entre C. trachomatis y C.
psittaci. Las siguientes sondas cubren ambos objetivos.
Se prepararon diez secuencias sonda específicas
para Chlamydia trachomatis, utilizando siete cebadores
singulares, complementarios de regiones conservadas de rARN de 16S
y de 23S. La secuencia sonda 1 se obtuvo a partir de un cebador 16S
con la secuencia 5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA
C-3'. La secuencia sonda 2 se obtuvo usando un
cebador 16S con la secuencia 5'-CCG CTT GTG CGG GCC
CCC GTC AAT TC-3'. Las secuencias sonda 3 y 4 se
obtuvieron usando un cebador 16S con la secuencia
5'-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA
AT-3'. Las secuencias sonda 5 y 6 se obtuvieron
usando un cebador 23S con la secuencia 5'-CTT TCC
CTC ACG GTA-3'. Las secuencias sonda 7 y 8 se
obtuvieron usando un cebador 23S con la secuencia
5'-CCT TCT CCC GAA GTT ACG G-3'. La
secuencia sonda 9 se obtuvo usando un cebador 23S con la secuencia
5'-TCG GAA CTT ACC CGA CAA GGA ATT
TC-3'. La secuencia sonda 10 se obtuvo usando un
cebador de secuencia 5'-CTA CTT TCC TGC GTC
A-3'.
Se caracterizaron las diez secuencias
siguientes, conforme a los criterios descritos en el Ejemplo 1, y se
demostró que eran específicas para el rARN de Chlamydia
trachomatis. El vecino filogenéticamente más próximo
Chlamydia psittaci se usó para comparación con la secuencia
de Chlamydia trachomatis.
La secuencia 1, de rARN de 16S, tiene una
longitud de 30 bases y una Tm de 66ºC. La secuencia 2, de rARN de
16S, tiene una longitud de 32 bases y una Tm de 67ºC. La secuencia
3, de rARN de 16S, tiene una longitud de 39 bases y una Tm de 70ºC.
La secuencia 4, de rARN de 16S, tiene una longitud de 33 bases y una
Tm de 69ºC. La secuencia 5, de rARN de 23S, tiene una longitud de
41 bases y una Tm de 71ºC. La secuencia 6, de rARN de 23S, tiene
una longitud de 30 bases y una Tm de 72ºC. La secuencia 7, de rARN
de 23S, tiene una longitud de 33 bases y una Tm de 72ºC. La
secuencia 8, de rARN de 23S, tiene una longitud de 30 bases y una Tm
de 71ºC. La secuencia 9, de rARN de 23S, tiene una longitud de 35
bases y una Tm de 74ºC. La secuencia 10 tiene una longitud de 28
bases y una Tm de 72ºC.
La reactividad y especificidad de las sondas se
probó en ensayos de hibridación. Las sondas de oligonucleótido 1 y
2, marcadas en el extremo con ^{32}P, se mezclaron con ARN
purificado o ARN liberado de, al menos, 10^{7} organismos, en
0,55 ml de diisobutil-sulfosuccinato al 41%,
dodecil-sulfato de sodio al 3%, fosfato de sodio
0,03 M, pH 6,8, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, a 60ºC (sonda 1) ó a 64ºC
(sonda 2), durante 1 hora. Los híbridos se unieron al
hidroxiapatito como se describió en los Ejemplos anteriores y la
cantidad de radiactividad unida se determinó por contaje de
centelleo. La Tabla 36 muestra que las sondas 1 y 2 se hibridan bien
con todos los serotipos de C. trachomatis ensayados. La
sonda 1 no reacciona con ninguna cepa de C. psittaci ensayada
y la sonda 2 no reacciona con dos de las cepas. La sonda 2 sí que
reacciona con la cepa de poliartritis ovina de C. psittaci,
un organismo del que no se conoce que infecte a los seres humanos.
La Tabla 37 muestra la reactividad y especificidad de las sondas 3
a 9, cuando se marcan con ^{125}I y se usan como mezcla. En este
caso, los híbridos se unieron a partículas magnéticas catiónicas.
Estas sondas se hibridan bien con todas las cepas de C.
trachomatis ensayadas y no se hibridan con ninguna cepa de C.
psittaci. Las sondas 3 a 9 se ensayaron, además, frente a un
panel de organismos comúnmente encontrados en el tracto urogenital
(Tabla 38) y una sección filogenética de organismos (Tabla 39). En
todos los casos, se comprobó que las sondas eran específicas. La
sonda 10 tiene un 25% de falta de homología con C. psittaci,
y por tanto, debe ser específica para
C. trachomatis.
C. trachomatis.
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Las campilobacterias son bastones curvos
gram-negativos, microaerófilos, móviles. El género
tiene gran diversidad y es distinto de otros géneros. Aunque el
género está bien definido, se está produciendo cierta revisión a
nivel de especies (Romaniuk, P.J. et al., J. Bacteriol. 169,
2137-41 (1987)). Tres especies de Campylobacter,
Campylobacter jejuni, C. coli y C. laridis, producen
enteritis en los seres humanos. La enfermedad lleva consigo
diarrea, fiebre, náuseas, dolor abdominal y, en algunos casos,
vómitos. Estos organismos producen un número estimado de 2 millones
de infecciones por año en los EE.UU. (estimación basada en el número
de casos de enfermedad diarreica inducidos por Salmonella y
Shigella). Otros miembros del género producen septicemias en los
seres humanos y abortos e infertilidad en las ovejas y el ganado
vacuno.
El diagnóstico de Campylobacter enteritis
depende en la actualidad del crecimiento y aislamiento del organismo
en cultivo, seguido de varios ensayos bioquímicos. El crecimiento
óptimo de las campilobacterias requiere condiciones especiales,
tales como baja presión de oxígeno y alta temperatura (42ºC). No
existe una recomendación de un conjunto único de condiciones para
el aislamiento de todas las especies de Campylobacter.
Las secuencias de oligonucleótido que se
enumeran a continuación, cuando se usan en un ensayo de hibridación,
se hibridan con el rARN de 16S de la especie de
Campylobacter que interesa. La presente invención ofrece
ventajas significativas frente a los métodos de la técnica anterior
para la detección de Campylobacter, porque una sonda puede
detectar todos los Campylobacter de interés; las otras dos
sondas detectan los Campylobacter entéricos y una puede
detectar los productos del aislamiento de Campylobacter en
seres humanos. Además, las sondas ofrecen ventajas frente a la
técnica anterior, desde el punto de vista de la facilidad del
ensayo, y reducen fuertemente el tiempo necesario para la
identificación, y por tanto, para el diagnóstico.
Las cuatro sondas que se hibridan con el rARN de
16S de las especies de Campylobacter de interés, se
construyeron usando tres cebadores singulares complementarios del
rARN de 16S. Las secuencias 1 y 2 se prepararon usando un cebador
16S con la secuencia 5'-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA
C-3'. La secuencia 3 se preparó usando un cebador
16S con la secuencia 5'-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC
AAT TC-3'. La secuencia 4 se preparó usando un
cebador 16S con la secuencia 5'-GCT CGT TGC GGG ACT
TAA CCC AAC AT-3'.
Se caracterizaron las siguientes secuencias y se
demostró que se hibridan con Campylobacter jejuni, C. coli y
C. laridis. Los vecinos filogenéticamente más próximos
Vibrio parahaemolyticus y Wollinella succinogenes se
usaron para comparación con las secuencias de
Campylobacter.
-
43
La secuencia 1, de rARN de 16S, tiene una
longitud de 23 bases y una Tm de 65ºC. La secuencia 2, de rARN de
16S, tiene una longitud de 26 bases y una Tm de 64ºC. La secuencia
3, de rARN de 16S, tiene una longitud de 25 bases y una Tm de 66ºC.
La secuencia 4, de rARN de 16S, tiene una longitud de 24 bases y una
Tm de 61ºC. La secuencia 1 es capaz de hibridarse en la región
correspondiente a las bases 405 a 428 del rARN de 16S de E.
coli; la secuencia 2 es capaz de hibridarse en la región
correspondiente a las bases 440 a 475 del rARN de 16S de E.
coli; la secuencia 3 es capaz de hibridarse en la región
correspondiente a las bases 705 a 735 del rARN de 16S de E.
coli; la secuencia 4 es capaz de hibridarse en la región
correspondiente a las bases 980 a 1010 del rARN de 16S de E.
coli.
La reactividad y especificidad de las sondas
para Campylobacter se probó en ensayos de hibridación. Las
sondas de oligonucleótido, marcadas en el extremo con ^{32}P, se
mezclaron con ARN purificado o ARN liberado de células en
dodecil-sulfato de sodio al 0,1%. Se añadió 0,5 ml
de solución de hibridación
(diisobutil-sulfosuccinato al 41%, fosfato de sodio
30 mM, pH 6,8, dodecil-sulfato de sodio al 0,7%,
EDTA 1 mM, EGTA 1 mM), y la mezcla se incubó a 60ºC durante 1 a 1,5
horas. Después de la incubación, se añadieron 2 a 2,5 ml de solución
de separación (hidroxiapatito al 2%, fosfato de sodio 0,12 M, pH
6,8, dodecil-sulfato de sodio al 0,02%) y la mezcla
se incubó a 60ºC durante cinco minutos. La muestra se centrifugó y
el sobrenadante se eliminó. Se añadieron 2,5 ml de solución de
lavado (fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8,
dodecil-sulfato de sodio al 0,02%) y la muestra se
sometió a un proceso de mezcla, se centrifugó
y el sobrenadante se eliminó. La cantidad de radiactividad unida al hidroxiapatito se determinó por contaje de centelleo.
y el sobrenadante se eliminó. La cantidad de radiactividad unida al hidroxiapatito se determinó por contaje de centelleo.
La Tabla 40 indica que las sondas se hibridan
bien con las especies de Campylobacter de interés, C.
jejuni, C. coli y C. laridis. La sonda 1 detecta todas
las especies de Campylobacter ensayadas, las sondas 2 y 4
detectan sólo los Campylobacter entéricos, y la sonda 3
detecta todas las especies de Campylobacter, excepto C.
sputorum, un organismo aislado del ganado vacuno. Por
consiguiente, todas las sondas son útiles para identificar
Campylobacter en las muestras de heces. La elección de la
sonda que deba usarse para otras aplicaciones dependerá del nivel
de especificidad requerida (esto es, los Campylobacter
entéricos, o todas las especies de Campylobacter).
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La Tabla 41 indica que las sondas no se hibridan
con organismos estrechamente afines u organismos encontrados en el
tracto gastrointestinal.
Las sondas específicas para los Campylobacter
entéricos, sondas 2 y 4, se ensayaron ulteriormente y se
comprobó que no reaccionan con los rARN de otros organismos
encontrados en el tracto gastrointestinal.
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Los estreptococos son bacterias cocoides
gram-positivas, negativas a la oxidasa. El género se
ha dividido en 18 grupos, A a R, basándose en los carbohidratos
específicos del grupo. Los estreptococos del grupo D se subdividen
además en los enterococos (S. faecium, S. faecalis, S. avium
y S. gallinarum) y los no enterococos S. bovis, S.
Equinus, S. faecium, S. faecalis y S. avium son
considerados como los enterococos médicamente importantes. Algunas
especies de estreptococos son patógenos humanos; otros constituyen
la flora normal de la boca y el intestino, pero son capaces de
causar enfermedades, cuando se introducen en otros lugares. Dos
ejemplos son S. faecium y S. faecalis, que se
encuentran normalmente en el intestino, pero pueden extenderse para
causar bacteremia, infecciones en las heridas y una cifra tan alta
como el 10% de las infecciones del tracto urinario, en los
EE.UU.
Los métodos actuales de detección de los
enterococos requieren el cultivo del espécimen durante 18 a 72
horas, seguido de una batería de ensayos bioquímicos. La secuencia
de oligonucleótido mostrada a continuación, cuando se usa en un
ensayo de hibridación, detecta correctamente Streptococcus
faecalis, S. avium y S. faecium. La sonda de la
invención no reacciona de forma cruzada con otros
Streptococci o Staphylococci que son muy estrechamente
afines en cuanto a homología de ADN (Kiepper-Baez,
1981, 1982; Schliefer, 1984). La presente invención también reduce
el número de ensayos que se han de realizar sobre una muestra y
rebaja fuertemente el tiempo necesario para la identificación y por
tanto, para el diagnóstico. Esto representa una mejora significativa
frente a los métodos de la técnica anterior.
La secuencia sonda se identificó usando un
cebador complementario de rARN de 16S, con la secuencia
5'-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT
TC-3'. Se caracterizó la siguiente secuencia y se
encontró que era específica para tres enterococos, S. faecium,
S. faecalis y S. avium. Los vecinos filogenéticamente más
próximos S. agalactiae, S. bovis, S. pneumoniae y S.
pyogenes, se usaron para comparación con las secuencias que
interesan.
- 1.
- TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA.
La secuencia tiene una longitud de 35 bases y
una Tm de 72ºC. Es capaz de hibridarse en la región correspondiente
a las bases 825 a 860 del rARN de 16S de E. coli. Para
demostrar la reactividad y especificidad de la sonda, se utilizó en
un ensayo de hibridación con ARN purificado o ARN liberado de
células. Una suspensión que contiene al menos 10^{7} células en
dodecil-sulfato de sodio al 2%, se sometió a
movimiento vorticial en presencia de perlas de vidrio. Se mezcló
0,1 ml de suspensión con 0,1 ml de tampón de hibridación (fosfato de
sodio 0,96 M, pH 6,8, EDTA 0,002 M, EGTA 0,002 M) y se incubó a
65ºC durante 2 horas. Después de la incubación, se añadieron 5 ml
de hidroxiapatito al 2%, fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8,
dodecil-sulfato de sodio al 0,02%, y la mezcla se
incubó durante 10 min, a 65ºC. La muestra se centrifugó y el
sobrenadante se eliminó. Se añadieron 5 ml de solución de lavado
(tampón de fosfato 0,12 M, pH 6,8, dodecil-sulfato
de sodio al 0,02%) y las muestras se sometieron a movimiento
vorticial, se centrifugaron y el sobrenadante se eliminó. La
cantidad de radiactividad unida al hidroxiapatito se determinó por
contaje de centelleo. La Tabla 43 muestra que la sonda reacciona
bien con S. faecium, S. faecalis y S. avium y no
reacciona con otros organismos estrechamente afines.
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Los pseudomónadas son bacilos
gram-negativos, no fermentativos, que no forman
esporas. Los pseudomónadas son habitantes habituales del suelo y el
agua y raras veces infectan a los individuos sanos. Cuando los
organismos encuentran a pacientes ya comprometidos, pueden provocar
una variedad de síndromes clínicos, que incluyen infecciones de
heridas, infecciones post-quirúrgicas, septicemia,
diarrea infantil e infecciones del tracto respiratorio y del
urinario. Los miembros del género Pseudomonas son
particularmente importantes de identificar en una muestra clínica,
debido a la resistencia de los organismos a los antibióticos. Los
estudios de homología con ácido nucleico han dividido el género en
cinco clases de homologías, conocidas como grupos I a V de ARN. Un
83% de todos los productos clínicos aislados de Pseudomonas
son del grupo I de ARN, y Pseudomonas aeruginosa es, con
gran diferencia, la especie aislada más frecuentemente.
Los métodos actuales de detección de
Pseudomonas requieren el cultivo de una muestra del paciente
durante 24 a 72 horas, seguido de una batería de ensayos
bioquímicos. La secuencia de oligonucleótido que figura a
continuación, cuando se usa en un ensayo de hibridación, detecta el
grupo I, clínicamente importante, de Pseudomonas. La
presente invención reduce el número de ensayos que han de realizarse
sobre una sola muestra, y rebaja el tiempo de detección. Esto
representa una mejora significativa frente a los métodos de la
técnica anterior.
La secuencia se obtuvo con un cebador
complementario de una región conservada de rARN de 23S, con la
secuencia 5'-CTT TCC CTC ACG
GTA-3'. Se comprobó que la siguiente secuencia
detecta el grupo I de pseudomónadas:
- 1.
- CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT.
La sonda tiene una longitud de 35 bases y una Tm
de 70ºC. Es capaz de hibridarse con el ARN del grupo I de
Pseudomonas, en la región correspondiente a las bases 365 a
405 del rARN de 23S de E. coli. Para demostrar la
reactividad y especificidad de la sonda, se usó en un ensayo de
hibridación. El oligonucleótido marcado en el extremo con ^{32}P
se mezcló con el ARN liberado de, al menos, 10^{7} organismos por
métodos estándar, en fosfato de sodio 0,48 M, pH 6,8,
dodecil-sulfato de sodio al 1%, EDTA 1 mM, EGTA 1
mM, y se incubó a 65ºC durante 2 horas. Después de la incubación,
los híbridos de ARN y ADN se unieron a hidroxiapatito, como se
describió en los ejemplos anteriores, y la cantidad de radiactividad
unida se determinó por contaje de centelleo. La Tabla 44 demuestra
que la sonda reaccionaba bien con las 8 especies del grupo I de
pseudomónadas que se ensayaron. La sonda no reaccionó con el ARN de
los organismos del grupo II ó del grupo V. Se apreció una escasa
reacción con Pseudomonas acidovorans, un organismo del grupo
III que representa menos del 1% de todos los productos aislados de
bacilos no fermentativos en las muestras clínicas.
La Tabla 45 demuestra que la sonda no reacciona con otros organismos estrechamente afines que se ensayaron.
La Tabla 45 demuestra que la sonda no reacciona con otros organismos estrechamente afines que se ensayaron.
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Los Ejemplos 15 a 18 describen sondas para las
Enterobacteriaceae, que son organismos todos ellos muy afines
a nivel del ADN. Diferencias incluso más pequeñas existen a nivel
del rARN. Por ejemplo, el rARN de 16S de Proteus vulgaris es
homólogo al 93% con E. coli. Estos factores ilustran las
dificultades asociadas con la preparación de sondas de rARN
específicas para este grupo de organismos. Sin embargo, los autores
de la presente han creado sondas para Enterobacter cloacae,
Proteus mirabilis, Salmonella y E. coli.
Los miembros del género Enterobacter son
bacilos gram-negativos móviles, que no forman
esporas, que pertenecen a la familia de las
Enterobacteriaceae. El género es un grupo grande y
heterogéneo. Se han definido ocho especies, pero sólo cinco son
clínicamente significativas. Enterobacter cloacae y E.
aerogenes son los productos aislados más comunes y están
asociados con infecciones genitourinarias, pulmonares, de la sangre
y del sistema nervioso central, así como de los tejidos blandos,
todo ello en seres humanos.
El método actual de identificación de
Enterobacter cloacae en muestras de pacientes implica el
cultivo del espécimen en placas de agar, durante 18 a 24 horas,
seguido de una batería de ensayos bioquímicos. La secuencia de
oligonucleótido descrita a continuación, cuando se usa como sonda en
un ensayo de hibridación de ácido nucleico, identifica
correctamente al Enterobacter cloacae. La presente invención
reduce el número de ensayos que se han de realizar sobre una sola
muestra, así como el tiempo necesario para la identificación, y por
tanto, para el diagnóstico, y representa, por consiguiente, una
mejora significativa frente a los métodos de la técnica
anterior.
La sonda específica para Enterobacter
cloacae se obtuvo con un cebador complementario de una región
conservada de rARN de 23S, con la secuencia 5'-CAG
TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3'.
Se caracterizó la siguiente secuencia y resultó
ser específica para E. cloacae. Los vecinos filogenéticamente
más próximos Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus
vulgaris, Salmonella enteritidis y Citrobacter freundii
se usaron como comparaciones con la secuencia de E.
cloacae.
- 1.
- GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC.
La sonda tiene una longitud de 29 bases y una Tm
de 68ºC. Es capaz de hibridarse con el ARN de E. cloacae en
la región correspondiente a las bases 305 a 340 del rARN de 23S de
E. coli. Para demostrar la reactividad y especificidad de la
sonda para E. cloacae, se usó en un ensayo de hibridación. La
sonda de oligonucleótido marcada en el extremo con ^{32}P se
mezcló con el ARN liberado de, al menos, 10^{7} organismos, en
dodecil-sulfato de sodio al 1%, fosfato de sodio
0,48 M, pH 6,8 (volumen final 0,2 ml), y se incubó a 60ºC durante 2
horas. Después de la incubación, se añadieron 5 ml de
hidroxiapatito al 2%, fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8,
dodecil-sulfato de sodio al 0,02%, y la mezcla se
incubó durante 10 min, a 60ºC. La muestra se centrifugó y el
sobrenadante se eliminó. Se añadieron 5 ml de solución de lavado
(tampón de fosfato 0,12 M, pH 6,8, dodecil-sulfato
de sodio al 0,02%), la muestra se sometió a movimiento vorticial,
se centrifugó y el sobrenadante se eliminó. La cantidad de
radiactividad unida al hidroxiapatito se determinó por contaje de
centelleo. Los resultados se presentan en la Tabla 46 y demuestran
que la sonda reacciona bien con E. cloacae y no reacciona con
el ARN de organismos estrechamente afines.
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La Tabla 47 muestra que la sonda no reacciona
con el ARN de organismos encontrados en la orina.
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Los miembros del género Proteus son
bacilos móviles, gram-negativos, que no forman
esporas, que pertenecen a la familia de las
Enterobacteriaceae. Se han descrito cuatro especies de
Proteus y tres de ellas, Proteus mirabilis, P.
vulgaris y P. penneri, causan enfermedades a los seres
humanos.
El tipo más común de infección por
Proteus afecta al tracto urinario, pero también se producen
septicemia, neumonía e infecciones de heridas. Proteus
mirabilis es la especie aislada con más frecuencia y puede ser
responsable de hasta el 10% de todas las infecciones agudas, no
complicadas, del tracto urinario. Es deseable la identificación del
organismo causante, a nivel de especie, más bien que a nivel de
género, debido a las diferencias en la susceptibilidad a
antibióticos entre las especies.
El método actual de identificación de Proteus
mirabilis en muestras de pacientes implica el cultivo del
espécimen en placas de agar, durante 18 a 24 horas, seguido de una
batería de ensayos bioquímicos. La secuencia de oligonucleótido
descrita a continuación, cuando se usa como sonda en un ensayo de
hibridación de ácido nucleico, identifica correctamente al
Proteus mirabilis. La presente invención reduce el número de
ensayos que se han de realizar sobre una muestra, así como el
tiempo necesario para la identificación, y por tanto, para el
diagnóstico y el tratamiento. Esto representa una mejora
significativa frente a los métodos de la técnica anterior.
La sonda específica para Proteus
mirabilis se obtuvo con un cebador complementario de una región
conservada de rARN de 23S, con la secuencia 5'-CAG
TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3'.
Se caracterizó la siguiente secuencia y resultó
ser específica para Proteus mirabilis. Los vecinos
filogenéticamente más próximos, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Proteus vulgaris y Salmonella enteritidis se
usaron como comparaciones con la secuencia de Proteus
mirabilis.
- 1.
- CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC.
Esta sonda es capaz de hibridarse con el ARN de
P. mirabilis en la región correspondiente a las bases 270 a
305 del rARN de 23S de E. coli. La sonda tiene una longitud
de 33 bases y una Tm de 66ºC. Para demostrar la reactividad y
especificidad de la sonda para P. mirabilis se usó en un
ensayo de hibridación. La sonda de oligonucleótido marcada en el
extremo con ^{32}P se mezcló con el ARN liberado de, al menos,
10^{7} organismos, en dodecil-sulfato de sodio al
1%, fosfato de sodio 0,48 M, pH 6,8, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM (volumen
final 0,2 ml), y se incubó a 64ºC durante 2 horas. Después de la
incubación, se añadieron 5 ml de hidroxiapatito al 2%, fosfato de
sodio 0,12 M, pH 6,8, dodecil-sulfato de sodio al
0,02%, y la mezcla se incubó durante 10 min, a 64ºC. La muestra se
centrifugó y el sobrenadante se eliminó. Se añadieron 5 ml de
solución de lavado (fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8,
dodecil-sulfato de sodio al 0,02%), la muestra se
sometió a movimiento vorticial, se centrifugó y el sobrenadante se
eliminó. La cantidad de radiactividad unida al hidroxiapatito se
determinó por contaje de centelleo. Los resultados se presentan en
la Tabla 48 y demuestran que la sonda reacciona bien con P.
mirabilis y no reacciona con otras 27 bacterias estrechamente
afines. La Tabla 49 pone de manifiesto que la sonda no reacciona
con otras 24 bacterias filogenéticamente diversas y dos levaduras,
ensayadas de la misma manera que los organismos de la Tabla 48.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los miembros del género Salmonella son
bacilos móviles, gram-negativos, que no forman
esporas, que pertenecen a la familia de las
Enterobacteriaceae. Todas las salmonellas son estrechamente
afines y algunos microbiólogos las consideran como una sola
especie. Se han identificado cinco subgrupos, utilizando estudios de
homología de ácido nucleico, y se han descrito más de 1400
serotipos diferentes. Todos los serotipos han sido implicados en
enfermedades entéricas humanas, desde la gastroenteritis
autolimitada de síntomas leves, hasta la gastroenteritis grave con
bacteremia, y la fiebre tifoidea, una enfermedad que puede producir
la muerte. S. cholerasuis, S. paratyphi A y S. typhi
son los serotipos más frecuentemente asociados con la enfermedad
grave y la bacteremia. El diagnóstico de la enteritis inducida por
Salmonella depende de la detección del organismo en muestras
de heces. Puesto que la infección tiene lugar principalmente por
ingestión de leche, agua y alimentos contaminados, son de
importancia crítica los métodos para identificar Salmonella
en estos productos, antes de suministrarlos a los consumidores.
Los métodos actuales para la detección de los
miembros del género Salmonella requieren el cultivo del
espécimen, durante 1 a 3 días, en medios selectivos, seguido de una
batería de ensayos bioquímicos. A menudo, se necesita una etapa de
enriquecimiento para aislar la Salmonella de las muestras
clínicas o productos alimenticios. Las secuencias de
oligonucleótido presentadas a continuación, cuando se usan en un
ensayo de hibridación, identifican correctamente a los miembros del
género Salmonella. Las sondas de la presente invención son
específicas para todos los miembros del género y no reaccionan con
los otros géneros de Enterobacteriaceae estrechamente
afines. Estas sondas reducen el número de ensayos que se han de
realizar sobre una muestra y rebajan fuertemente el tiempo
necesario para la identificación. Esto representa una mejora
significativa frente a los métodos de la técnica anterior.
Las sondas específicas para el género Salmonella
se obtuvieron con dos cebadores complementarios de rARN de 16S y de
23S. La secuencia 1 se obtuvo usando un cebador 16S con la secuencia
5'-TTA CTA GCG ATT CCG ACT TCA-3'.
La secuencia 2 se obtuvo usando un cebador 23S con la secuencia
5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3'.
Se caracterizaron las siguientes secuencias y se encontró que eran
específicas para el género Salmonella:
- 1.
- CTC CTT TGA GTT CCC GAC CTA ATC GCT GGC
- 2.
- CTC ATC GAG CTC ACA GCA CAT GCG CTT TTG TGT A.
La secuencia 1, de rARN de 16S, tiene una
longitud de 30 bases y una Tm de 73ºC. La secuencia 2, de rARN de
23S, tiene una longitud de 34 bases y una Tm de 71ºC. Estas sondas
son capaces de hibridarse en las regiones correspondientes a las
bases 1125 a 1155 del rARN de 16S de E. coli y 335 a 375 del
rARN de 23S de E. coli, respectivamente. Para demostrar la
reactividad y especificidad de la sonda 1 para los miembros del
género Salmonella, el oligonucleótido marcado en el extremo
con ^{32}P se ensayó como sonda en una reacción de hibridación.
ARN purificado o ARN liberado de, al menos, 10^{7} organismos por
métodos estándar, se mezcló con 1 ml de tampón de hibridación
(concentración final: diisobutil-sulfosuccinato al
43%, fosfato de sodio 60 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM) y se
incubó a 72ºC durante 2 a 12 horas. Después de la incubación, se
añadieron 5 ml de solución de separación (hidroxiapatito al 2%,
fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8, dodecil-sulfato de
sodio al 0,02%), y las muestras se sometieron a un proceso de
mezcla, se incubaron durante 5 min, a 72ºC, se centrifugaron y los
sobrenadantes se eliminaron. Se añadieron 4 ml de solución de lavado
(fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8, dodecil-sulfato
de sodio al 0,02%) y las muestras se sometieron a movimiento
vorticial, se centrifugaron y los sobrenadantes se eliminaron. La
cantidad de radiactividad unida al hidroxiapatito se determinó por
contaje de centelleo. Los resultados presentados en la Tabla 50
indican que una combinación de las dos sondas se hibridó con los 5
subgrupos de Salmonella y con la totalidad de los 31
serotipos que se ensayaron.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La especificidad de las sondas para los miembros
del género Salmonella se demostró con reacciones de hibridación que
contienen ARN de organismos estrechamente afines con Salmonella. Los
resultados se presentan en la Tabla 51.
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La Tabla 52 muestra que las sondas 1 y 2 para
Salmonella no se hibridan con organismos filogenéticamente
diversos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Escherichia coli es un bacilo
gram-negativo, que no forma esporas, que pertenece a
la familia de las Enterobacteriaceae. Se han descrito cinco
especies de Escherichia: E. coli, que representa más
del 99% en los productos aislados en la clínica, E. hermanii, E.
blattae, E. vulneris y E. fergusonii. E. coli es
una causa destacada de las infecciones del tracto urinario,
bacteremia y meningitis neonatal, y puede provocar un tipo de
gastroenteritis conocida como diarrea del viajero.
El método actual de identificación de E.
coli en muestras de pacientes implica el cultivo del espécimen
en placas de agar, durante 18 a 72 horas, seguido de una batería de
ensayos bioquímicos sobre colonias aisladas. La secuencia de
oligonucleótido descrita a continuación, cuando se usa como sonda en
un ensayo de hibridación de ácido nucleico, detecta correctamente
al E. coli, incluso en presencia de otros organismos. La
presente invención reduce el número de ensayos que se han de
realizar sobre una muestra, así como el tiempo necesario para la
identificación, y por tanto, para el diagnóstico y el tratamiento.
Esto representa una mejora significativa frente a los métodos de la
técnica anterior.
La sonda específica para E. coli se
derivó de la secuencia publicada de E. coli (Brosius et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4801-05
(1978)), usando Proteus vulgaris (Carbon et al.,
Nucleic Acids Research 9, 2325-33 (1981)),
Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, Enterobacter
gergoviae y Citrobacter freundii para comparación. La
secuencia sonda se muestra a continuación.
- 1.
- GCA CAT TCT CAT CTC TGA AAA CTT CCG TGG.
Esta sonda se hibrida con el ARN de E.
coli en la región de 995 a 1030 del rARN de 16S. La sonda tiene
una longitud de 30 bases y una Tm de 66ºC. Para demostrar la
reactividad y especificidad de la sonda para E. coli, se usó
en un ensayo de hibridación. La sonda de oligonucleótido marcada en
el extremo con ^{32}P se mezcló con dos oligonucleótidos no
marcados, de secuencias 5'-TGG ATG TCA AGA CCA GGT
AAG GTT CTT CGC GTT GCA TCG-3' y
5'-CTG ACG ACA GCC ATG CAG CAC CTG TCT CAC GGT TCC
CGA AGG CA-3', y con ARN purificado, o ARN liberado
de células con detergente y calor, en
dodecil-sulfato de sodio (SDS) al 1%, fosfato de
sodio 0,48 M, pH 6,8, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM (volumen final 0,2 ml),
y se incubó a 60ºC durante 2 horas. Después de la incubación, se
añadieron 5 ml de hidroxiapatito al 2%, fosfato de sodio 0,12 M, pH
6,8, dodecil-sulfato de sodio al 0,02%, y la mezcla
se incubó durante 10 min, a 60ºC. La muestra se centrifugó y el
sobrenadante se eliminó. Se añadieron 5 ml de solución de lavado
(fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8, dodecil-sulfato de
sodio al 0,02%), la muestra se sometió a movimiento vorticial, se
centrifugó y el sobrenadante se eliminó. La cantidad de
radiactividad unida al hidroxiapatito se determinó por contaje de
centelleo.
Un ejemplo de uso de esta sonda sería la
detección de E. coli en muestras de orina. La Tabla 53 señala
que la sonda detecta 7 de las 8 cepas de E. coli ensayadas.
La sonda también reacciona con E. fergusonii, un organismo
que se encuentra sólo raras veces en la orina.
La Tabla 54 muestra que la sonda no reacciona
con ningún otro género ensayado, excepto Shigella, otro
organismo raramente aislado en la orina. Estos resultados ponen de
manifiesto que la sonda será útil para detectar E. coli en
muestras de orina.
Las bacterias abarcan un grupo de organismos
unicelulares que tienen diversidad morfológica y fisiológica y que
ocupan la mayor parte de los ambientes o medios naturales. Aunque
muchas bacterias son inofensivas o beneficiosas para su medio o
para el hospedante, algunas son nocivas y provocan enfermedades. La
presencia de cualquier bacteria en ciertas ubicaciones es no
deseable o indicativa de enfermedad (por ejemplo, en medios de
cultivo, productos farmacéuticos, fluidos del cuerpo tales como
sangre, orina o fluido cerebroespinal, y biopsias de tejidos).
Niveles bajos de bacterias se consideran aceptables en otros
productos tales como el agua potable y productos alimenticios.
Existe, por consiguiente, la necesidad de encontrar medios para
detectar y cuantificar las bacterias de una muestra.
El método actual de detección y cuantificación
del total de bacterias en una muestra requiere el cultivo en muchos
tipos de medios, en condiciones diferentes de temperatura y
atmósfera. Hasta la fecha, no hay un ensayo único para detectar o
cuantificar todas las bacterias. Las secuencias de oligonucleótidos
presentadas a continuación, cuando se usan en un ensayo de
hibridación, detectan una amplia sección filogenética de bacterias.
La presente invención reduce el número de ensayos que se han de
realizar, además de rebajar el tiempo necesario para el ensayo. La
comparación de los resultados de la hibridación de una muestra
desconocida con un conjunto de estándares, permitirá cierta
cuantificación del número de bacterias presentes. Esto representa
una mejora significativa frente a los métodos de la técnica
anterior.
Las sondas bacterianas se diseñaron después de
un examen de las secuencias publicadas de rARN y de las secuencias
determinadas en Gen-Probe. Las secuencias
empleadas para la comparación comprenden: Agrobacterium
tumefaciens (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,
4443 (1985)), Anacystis nidulans (Tomioka y Sugiura, Mol.
Gen. Genet. 191, 46 (1983), Douglas y Doolittle, Nucleic Acids
Research 12, 3373 (1984)), Bacillus subtilis (Green et
al., Gene 37, 261 (1985)), Bacillus stearothermophilus
(Kop et al., DNA, 3, 347 (1984)), Bacteroides fragilis
(Weisburg et al., J. Bacteriol. 164, 230 (1985)),
Chlamydia psittaci (Weisburg et al., J. Bacteriol.
167, 570 (1986)), Desulfovibrio desulfuricans (Oyaizu y
Woese, System Appl. Microbiol., 6, 257 (1985)), Escherichia
coli (Brosius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 201
(1980)), Flavobacterium heparium (Weisburg et al., J.
Bacteriol. 164, 230 (1985)), Heliobacterium chlorum (Woese
et al., Science 229, 762 (1985)), Mycoplasma PG50
(Frydenberg y Christiansen, DNA 4, 127 (1985)), Proteus
vulgaris (Carbon et al., Nucleic Acids Research 9, 2325
(1981)), Pseudomonas testosteroni (Yang et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, 4443 (1985)), Rochalimaea quintana
(Weisburg et al., Science 230, 556 (1985)), Saccharomyces
cerevisiae (Rubstov et al., Nucleic Acids Research 8,
5779 (1980), Georgiev et al., Nucleic Acids Research 9, 6953
(1981)), y humano (Torczynski et al., DNA 4, 283 (1985);
González et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7666
(1985)).
Se comprobó que las siguientes secuencias se
hibridan con una amplia sección filogenética de bacterias, y no con
rARN de levadura o humano:
-
59
La sonda 1 tiene una longitud de 30 bases y una
Tm de 70ºC. La sonda 2 tiene una longitud de 33 bases y una Tm de
69ºC. La sonda 3 tiene una longitud de 26 bases y una Tm de 67ºC. La
sonda 4 tiene una longitud de 27 bases y una Tm de 69ºC. La sonda 5
tiene una longitud de 24 bases y una Tm de 66ºC. La sonda 6 tiene
una longitud de 23 bases y una Tm de 62ºC. La sonda 7 tiene una
longitud de 34 bases y una Tm de 66ºC. Las sondas 1 a 3 se hibridan
con rARN de 16S en las siguientes regiones, respectivamente
(correspondientes a bases de E. coli): 330 a 365, 675 a 715,
y 1080 a 1110. Las sondas 4 a 7 se hibridan con rARN de 23S en las
siguientes regiones, respectivamente (correspondientes a bases de
E. coli): 460 a 490, 1050 a 1080, y 1900 a 1960 (sondas 6 y
7). Los oligonucleótidos interaccionan con regiones del rARN que
son muy conservadas entre las eubacterias. Esto significa que
pueden emplearse como sondas pan-bacterianas en un
ensayo de hibridación. Un segundo uso es como herramienta para
obtener una secuencia de rARN. Por ejemplo, un oligonucleótido puede
hibridarse con el rARN que interesa y prolongarse con transcriptasa
inversa. La secuencia del ADN resultante puede determinarse y
utilizarse para deducir la secuencia complementaria de rARN, como se
describe en la Descripción detallada de la invención.
Una aplicación de la invención es la detección
de bacterias en la orina (bacteriuria). Para demostrar la
reactividad y especificidad de las sondas para las bacterias
encontradas en la orina, dichas sondas se usaron en ensayos de
hibridación. Las sondas de oligonucleótido marcadas en el extremo
con ^{32}P o marcadas con ^{125}I, se mezclaron con el ARN
liberado de células por métodos estándar (por ejemplo, por técnicas
de ruptura con ultrasonidos, detergente con perlas de vidrio o
lisis enzimática). La sonda se mezcló con el ARN en fosfato de
sodio 0,48 M, pH 6,8, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM,
dodecil-sulfato de sodio al 1% (volumen final 0,2
ml), y se hibridó a 60ºC durante 2 horas. Se añadieron 5 ml de
hidroxiapatito al 2%, fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8,
dodecil-sulfato de sodio al 0,02%, y la mezcla se
incubó durante 10 min, a 60ºC. La mezcla se centrifugó y el
sobrenadante se eliminó. Se añadieron 5 ml de solución de lavado
(fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8, dodecil-sulfato
de sodio al 0,02%), y la muestra se sometió a un proceso de mezcla,
se centrifugó y el sobrenadante se eliminó. La cantidad de
radiactividad unida al hidroxiapatito se determinó por contaje de
centelleo. Las Tablas 55 a 68 demuestran la especificidad de estas
sondas y ponen de manifiesto que una combinación de sondas podría
usarse para detectar todas las bacterias que se han
ensayado.
ensayado.
La Tabla 55 muestra que la sonda 1 se hibrida
con el ARN de las bacterias comúnmente aisladas en la orina y no
detecta el ARN de levadura. La Tabla 56 muestra que la sonda 1
detecta bacterias filogenéticamente diversas y no se hibrida con el
ARN humano.
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La Tabla 57 muestra que la sonda 2 se hibrida
con el ARN de las bacterias comúnmente encontradas en la orina,
excepto Ureaplasma urealyticum, y no se hibrida con el rARN
de levadura.
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La Tabla 58 muestra que la sonda 2 detecta
bacterias filogenéticamente diversas y no se hibrida con el rARN
humano.
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La Tabla 59 muestra que la sonda 3 se hibrida
con el ARN de las bacterias comúnmente encontradas en la orina y no
detecta el rARN de levadura.
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La Tabla 60 muestra que la sonda 3 detecta
bacterias filogenéticamente diversas y no se hibrida con el rARN
humano.
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La Tabla 61 muestra que la sonda 4 se hibrida
con el ARN de las bacterias comúnmente encontradas en la orina y no
detecta el rARN de levadura.
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La Tabla 62 muestra que la sonda 4 detecta
bacterias filogenéticamente diversas y no se hibrida con el rARN
humano.
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La Tabla 63 muestra que la sonda 5 se hibrida
con el ARN de las bacterias comúnmente encontradas en la orina y no
detecta el rARN de levadura.
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La Tabla 64 muestra que la sonda 5 detecta
bacterias filogenéticamente diversas y no se hibrida con el ARN
humano.
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La Tabla 65 muestra que la sonda 6 se hibrida
con el ARN de las bacterias comúnmente encontradas en la orina y no
detecta el rARN de levadura.
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La Tabla 66 muestra que la sonda 6 detecta
algunas bacterias filogenéticamente diversas y no se hibrida con el
ARN humano.
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La Tabla 67 muestra que la sonda 7 se hibrida
con el ARN de las bacterias comúnmente encontradas en la orina y no
detecta el rARN de levadura.
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La Tabla 68 muestra que la sonda 7 detecta
bacterias filogenéticamente diversas y no se hibrida con el ARN
humano.
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Los hongos abarcan un grupo de organismos
eucarióticos simples que tienen diversidad morfológica y
fisiológica. Los autores de la presente invención estiman, usando
las secuencias publicadas de tres hongos, Neurospora crassa,
Podospora y Saccharomyces, que los rARN de los hongos son
homólogos de E. coli al 58 a 60%, y son homólogos entre sí
al 84 a 90%. Algunos hongos crecen como células individuales
(levaduras), otros como filamentos multinucleares (mohos) y otros
pueden crecer como células individuales o como filamentos
multicelulares (hongos dimórficos). Aunque muchos hongos son
habitantes inofensivas de sus medios, otros son nocivos y provocan
enfermedades. La presencia de cualquier hongo en ciertas
ubicaciones es no deseable o indicativa de enfermedad (por ejemplo,
en medios de cultivo, productos farmacéuticos, fluidos del cuerpo
tales como sangre, orina o fluido cerebroespinal, y biopsias de
tejidos). Niveles bajos de hongos se consideran aceptables en otros
productos tales como el agua potable y los productos ali-
menticios. Esto ha creado la necesidad de disponer de medios para detectar y cuantificar los hongos de una muestra.
menticios. Esto ha creado la necesidad de disponer de medios para detectar y cuantificar los hongos de una muestra.
Los métodos actuales de detección y
cuantificación de los hongos implican el examen microscópico de las
muestras y el cultivo en diferentes medios. Aunque la mayoría de
las levaduras pueden desarrollarse a partir de muestras clínicas en
cuestión de unos días, algunos hongos filamentosos necesitan hasta
cuatro semanas de tiempo de cultivo, después de lo cual se aplican
procedimientos especiales de tinción, análisis bioquímicos y ensayos
con antígenos. Las secuencias de oligonucleótidos presentadas a
continuación, cuando se usan en un ensayo de hibridación, detectan
las cinco levaduras más comúnmente aisladas en el ámbito clínico,
Candida albicans, Torulopsis glabrata, Candida tropicalis,
Candida parapsilosis y Candida krusei. Se detectan
también otros cinco hongos que representan a los géneros
Trichosporon, Blastomyces, Cryptococcus y
Saccharomyces. La presente invención permite la detección en
una etapa de estos organismos y, en cuanto al cultivo, reduce el
tiempo de identificación o eliminación de estos hongos, como causa
de una infección. Esto representa una mejora significativa frente a
los métodos de la técnica anterior.
Las cuatro sondas que se hibridan con los
organismos de interés, se identificaron usando tres cebadores
complementarios de regiones conservadas de rARN de 18S ó de 28S. La
secuencia 1 se obtuvo usando un cebador 18S con la secuencia
5'-AGA ATT TCA CCT CTG-3'. La
secuencia 2 se obtuvo usando un cebador 28S con la secuencia
5'-CCT TCT CCC GAA GTT ACG G-3'.
Las secuencias 3 y 4 se obtuvieron usando un cebador 28S con la
secuencia 5'-TTC CGA CTT CCA TGG CCA CCG
TCC-3'. Se caracterizaron las siguientes secuencias
y se comprobó que se hibridan con el rARN de hongos. Las secuencias
de rARN de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces
carlsbergensis, Escherichia coli y humano se usaron para
comparación con las secuencias de interés.
La secuencia 1, de rARN de 18S, tiene una
longitud de 30 bases y una Tm de 68ºC. La secuencia 2, de rARN de
23S, tiene una longitud de 32 bases y una Tm de 67ºC. La secuencia
3, de rARN de 23S, tiene una longitud de 40 bases y una Tm de 66ºC.
La secuencia 4, de rARN de 23S, tiene una longitud de 40 bases y una
Tm de 68ºC. La secuencia 1 se hibrida en la región correspondiente
a las posiciones 845 a 880 del rARN de 18S de Saccharomyces
cerevisiae. La secuencia 2 se hibrida en la región
correspondiente a las posiciones 1960 a 2000 del rARN de 28S de
Saccharomyces cerevisiae y las secuencias 3 y 4 se hibridan
en la región de 1225 a 1270 del rARN de 28S.
Para demostrar la reactividad y especificidad de
estas sondas para el ARN de hongos, se usaron en ensayos de
hibridación. Las sondas de oligonucleótido marcadas con ^{32}P ó
con ^{125}I se mezclaron con ARN purificado o con el ARN liberado
de células por técnicas estándar de lisis, en 0,2 ml de fosfato de
sodio 0,48 M, pH 6,8, dodecil-sulfato de sodio al
1%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, y se incubaron a 60ºC durante 2 horas.
Después de la incubación, se añadieron 5 ml de hidroxiapatito al
2%, fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8, dodecil-sulfato
de sodio al 0,02%, y las muestras se incubaron durante 10 min, a
60ºC. Las muestras se centrifugaron y los sobrenadantes se
eliminaron. Se añadieron 5 ml de fosfato de sodio 0,12 M, pH 6,8, y
dodecil-sulfato de sodio al 0,02%, las muestras se
sometieron a un proceso de mezcla, se centrifugaron y los
sobrenadantes se eliminaron. Los resultados se presentan en la
Tabla 69. La sonda 1 detecta los diez hongos que se ensayaron, la
sonda 2 detecta las seis levaduras que se ensayaron, la sonda 3
detecta cinco de las seis levaduras, y la sonda 4 detecta sólo
C. krusei. Por consiguiente, la sonda 4 podría usarse para
detectar e identificar C. krusei en muestras; la sonda 1, la
2 ó la combinación de 3 y 4 podrían usarse para detectar las
levaduras; y la sonda 1 podría usarse para detectar cualquiera de
los diez organismos relacionados en la Tabla 69.
Un uso potencial de estas sondas es identificar
levaduras en muestras de orina u otros fluidos del cuerpo
normalmente estériles. Las sondas se hibridaron con un panel de las
bacterias más comúnmente aisladas en la orina y se observó que no
reaccionaban (Tabla 70). La Tabla 71 muestra que las sondas no se
hibridan con bacterias filogenéticamente diversas o con el ARN
humano.
Se prepararon también dos derivados de estas
sondas:
- CCC GAC CGT CCC TAT TAA TCA TTA CGA TGG TCC TAG AAA C
- CCC GAC CGT CCC TAT TAA TCA TTA CGA TGG.
El primer derivado trabaja bien a 65ºC, el
segundo a 60ºC.
La gonorrea es una de las infecciones
bacterianas que se presenta más comúnmente en los EE.UU., con más de
dos millones de casos comunicados anualmente. Esta enfermedad, de
transmisión sexual, produce generalmente uretritis anterior en los
varones y afecta al cuello del útero en las mujeres. Aunque pueden
aparecer complicaciones graves e incluso esterilidad en los
individuos no tratados, son frecuentes las infecciones
asintomáticas, con las que los portadores propagan la enfermedad
sin su conocimiento.
El agente causante, Neisseria
gonorrhoeae, es un diplococo gram-negativo,
positivo a la oxidasa, con requisitos estrictos de crecimiento. El
método usado para el diagnóstico depende del sitio de infección y de
los síntomas del paciente. La uretritis gonocócica de los varones
se diagnostica con buena sensibilidad y especificidad usando la
tinción de Gram. Generalmente, hay que realizar un cultivo, que
requiere de 24 a 72 horas, para confirmar el diagnóstico de
gonorrea de todas las mujeres y de los varones asintomáticos.
Después de la detección del organismo por su crecimiento en el
cultivo, debe identificarse el Neisseria gonorrhoeae por
otros ensayos, tales como la degradación de carbohidratos,
coaglutinación, tamices de anticuerpos fluorescentes o ensayos con
sustrato de enzima
cromógeno.
cromógeno.
Neisseria gonorrhoeae es particularmente
difícil de detectar y de distinguir usando una sonda de ácido
nucleico, porque es muy estrechamente afín a N.
meningitidis. Los datos publicados en Kingsbury, D.T., J.
Bacteriol. 94, 870-74 (1967), muestran una
homología ADN:ADN para las dos especies de aproximadamente 80 a 94%.
De acuerdo con las directrices establecidas por el Comité ad
hoc sobre Conciliación de Enfoques a la Sistemática Bacteriana,
Intl. J. System Bacteriol. 37, 463-64 (1987), la
definición filogenética de una especie significa generalmente una
homología ADN:ADN de 70% ó superior. A pesar de que puede
considerarse que estos organismos son una misma especie, bajo los
principios establecidos, los autores de la presente fueron capaces
de preparar sondas que pueden
distinguirlos.
distinguirlos.
Como cabía esperar, la homología de rARN entre
N. gonorrhoeae y N. meningitidis es aun mayor, debido
a las regiones conservadas conocidas. Se observó una diferencia del
1,0% entre las secuencias de rARN de 16S, y una diferencia del 1,1%
entre las secuencias de rARN de 23S, de N. gonorrhoeae y
N. meningitidis, usando los datos de secuenciación obtenidos
por los propios autores.
La preparación de una sonda para N.
gonorrhoeae se complicó por el hecho de que en algunos sitios en
que diferían N. meningitidis y N. gonorrhoeae, otras
especies de Neisseria eran similares a N. gonorrhoeae. Las
pocas faltas de apareamiento que existen entre estas dos especies
están en las regiones más variables, esto es, en las regiones que
varían no sólo entre especies, sino también de cepa a cepa. A pesar
de que algunos creían que las especies no podían distinguirse en
absoluto, y otros creían que el rARN se conservaba demasiado para
ser útil en diagnósticos con sondas, los autores de la presente
fueron capaces de preparar sondas con las que pueden diferenciarse
N. gonorrhoeae y N. meningitidis.
La presente invención ofrece ventajas
significativas frente a cada uno de los métodos de la técnica
anterior; las sondas son más específicas y más rápidas que los
métodos de cultivo. Se cree, además, que las sondas son más
sensibles (es decir, son capaces de detectar un número más pequeño
de organismos en una muestra clínica) que los métodos de la técnica
anterior.
Los cebadores utilizados para identificar estas
secuencias sonda tenían las siguientes secuencias:
- 1.
- GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA AT
- 2.
- GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C
- 3.
- GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC ACC AT.
Cada uno de los sitios de rARN elegidos como
diana, tenía, al menos, dos faltas de apareamiento con E.
coli, N. meningitidis, N. cinerea, N. lactamica, N.
mucosa y Kingella kingae.
Se sintetizaron oligonucleótidos complementarios
de secuencias adyacentes a las regiones de la sonda, y se usaron en
la mezcla de hibridación.
Se caracterizaron las siguientes secuencias y se
puso de manifiesto que son específicas para Neisseria
gonorrhoeae. Los vecinos filogenéticamente más próximos,
Neisseria meningitidis, N. cinerea, N. lactamica, N. mucosa y
Kingella kingae, se usaron para comparación con la secuencia
de N. gonorrhoeae.
- 1.
- CCG CCG CTA CCC GGT AC
- 2.
- TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC
- 3.
- GAG CAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG TA.
La secuencia 1, complementaria de rARN de 16S en
la región de 125 a 150, tiene una longitud de 17 bases y una Tm de
56ºC. La secuencia 2, complementaria de rARN de 16S en la región de
455 a 485, tiene una longitud de 21 bases y una Tm de 63ºC. La
secuencia 3, complementaria de rARN de 16S en la región de 980 a
1015, tiene una longitud de 29 bases y una Tm de 57ºC.
La reactividad y especificidad de las sondas
para Neisseria gonorrhoeae se demostró con un ensayo de
hibridación. Se yodaron las tres sondas de oligonucleótido y se
mezclaron con oligonucleótidos no marcados, de secuencia
5'-CCC CTG CTT TCC CTC TCT AGA CGT ATG CGG TAT TAG
CTG ATC TTT CG-3', 5'-GCC TTT TCT
TCC CTG ACA AAA GTC CTT TAC AAC CCG-3',
5'-GGC ACG TAG TTA GCC GGT GCT TAT TCT TCA GGT
AC-3' y 5'-GGT TCT TCG CGT TGC ATC
GAA TTA ATC CAC ATC ATC CAC CGC-3', y con ARN
purificado en fosfato de sodio 0,48 M, pH 6,8,
dodecil-sulfato de sodio (SDS) al 0,5%, y se
incubaron a 60ºC durante 1 hora. Después de la incubación, se
añadieron 4 ml de hidroxiapatito al 2%, fosfato de sodio 0,12 M, pH
6,8, SDS al 0,02%, y la mezcla se incubó durante 5 min, a 60ºC. Las
muestras se centrifugaron y los sobrenadantes se eliminaron. Se
añadieron 5 ml de solución de lavado (fosfato de sodio 0,12 M, pH
6,8, SDS al 2%) y las muestras se sometieron a un proceso de mezcla,
se centrifugaron y los sobrenadantes se eliminaron. La cantidad de
radiactividad unida al hidroxiapatito se determinó en un contador
gamma.
La Tabla 72 muestra que las sondas se hibridan
bien con el ARN de N. gonorrhoeae y no se hibridan con las
otras especies ensayadas.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se han preparado y utilizado también los
siguientes derivados de Neisseria:
- GAG GAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG
- GAG GAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG TAA
- CCC GCT ACC CGG TAC GTT C
- CCG CTA CCC GGT ACG TTC.
Aunque los ejemplos de comportamiento expuestos
se establecieron usando el formato de ensayo estándar previamente
descrito, las sondas específicas pueden utilizarse bajo una amplia
variedad de condiciones experimentales. Por ejemplo, pueden
incluirse aditivos en las soluciones de reacción, para proporcionar
las condiciones de reacción óptimas para una hibridación acelerada.
Tales aditivos pueden comprender tampones, quelantes, agentes
precipitantes de compuestos orgánicos y ácidos nucleicos, tales como
detergentes, dihidroxibenceno, dodecil-sulfato de
sodio, diisobutil-sulfosuccinato de sodio,
tetradecil-sulfato de sodio, sarcosilo y las sales
de metales alcalinos y sales de amonio de (SO_{4})^{2-},
(PO_{4})^{3-}, Cl^{-} y HCOO^{-}. Tales aditivos
pueden utilizarse por los expertos en la técnica para proporcionar
las condiciones óptimas para que tenga lugar la reacción de
hibridación. Estas condiciones para la hibridación acelerada de
moléculas de ácido nucleico de cadena simple para formar moléculas
de cadena doble, son el objeto de los documentos
EP-A-0167366 y
EP-A-0229442.
La presente invención puede aplicarse a
organismos no virales de muestras purificadas o de muestras clínicas
no purificadas, tales como esputos, heces, tejidos, sangre, fluidos
espinal o sinovial, suero, orina u otros fluidos corporales, u
otras muestras tales como muestras del medio ambiente o de
alimentos. Antes de la ruptura de las células y la hibridación, las
células pueden ponerse en suspensión o en solución. En el caso de
las citadas muestras no purificadas, las células pueden permanecer
intactas y no tratadas, en su propio medio biológico, antes del
ensayo.
Las sondas de la presente invención pueden
utilizarse en un ensayo solas o en combinación con diferentes
sondas. Varias sondas individuales pueden también enlazarse durante
la síntesis del ácido nucleico. Esto da como resultado una molécula
sonda que contiene múltiples secuencias sonda, y por tanto,
múltiples especificidades. Por ejemplo, puede sintetizarse una
molécula de ácido nucleico única que contenga las secuencias para
Mycobacterium avium y para Mycobacterium
intracellulare descritas en los Ejemplos 1 y 2. Cuando se
hibrida con el rARN de M. avium o de M.
intracellulare esta sonda se hibridará completamente. Si las dos
secuencias sonda se combinaron separadamente en un ensayo, sólo la
mitad de las sondas individuales mezcladas se hibridará con el rARN
de M. avium o de M. intracellulare. Otras
realizaciones pueden también ponerse en práctica dentro del alcance
de las reivindicaciones. Por ejemplo, las sondas pueden marcarse
con una variedad de marcadores, como se ha descrito, y pueden
incorporarse en estuches para diagnóstico.
Claims (169)
1. Un método para preparar una sonda para su uso
en un ensayo de hibridación cualitativo o cuantitativo, que
comprende construir un oligonucleótido, que es suficientemente
complementario para hibridarse, en condiciones de hibridación, con
una secuencia de rARN, seleccionada para que sea singular para un
organismo no viral o un grupo de organismos no virales que se trata
de detectar, seleccionándose dicho oligonucleótido por:
a) identificación de una o más regiones
variables candidatas por comparación de una o más secuencias de rARN
de la región variable de un organismo diana no viral o grupo de
organismos diana no virales, con una o más secuencias de rARN de la
región variable del organismo afín conocido más próximo para
seleccionar una secuencia singular para el rARN del organismo o los
organismos diana; y
b) sintetizar un oligonucleótido complementario
para la secuencia de rARN singular,
en el que la estabilidad térmica de los híbridos
sonda:ácido nucleico diana es mayor que la estabilidad térmica de
los híbridos sonda:ácido nucleico no diana;
en el que dicho o dichos organismos diana se
seleccionan de una o más especies de un género o uno o más géneros
de una familia.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha región de rARN se selecciona para que tenga, al menos,
aproximadamente una diferencia de secuencia de una base, respecto a
la correspondiente secuencia de rARN del organismo afín conocido
más próximo a dicho organismo no viral o grupo de organismos no
virales que se trata de detectar.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha región de rARN se selecciona para que tenga, al menos,
aproximadamente una diferencia de secuencia del 10% ó más de las
bases, respecto a la correspondiente secuencia de rARN del
organismo afín conocido más próximo a dicho organismo no viral o
grupo de organismos no virales que se trata de detectar.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha región de rARN se elige del grupo que consta de rARN de 5S,
de 16S y de 23S.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha región de rARN se elige del grupo que consta de rARN de 5,0S,
de 5,8S, de 18S y de 28S.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 10 nucleótidos.
7. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 15 nucleótidos.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 20 nucleótidos.
9. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 30 nucleótidos.
10. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de aproximadamente 20
nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos.
11. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de aproximadamente 30
nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos.
12. El método de la reivindicación 2, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 10 nucleótidos.
13. El método de la reivindicación 2, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 15 nucleótidos.
14. El método de la reivindicación 2, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 20 nucleótidos.
15. El método de la reivindicación 2, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 30 nucleótidos.
\newpage
16. El método de la reivindicación 2, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de aproximadamente 20
nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos.
17. El método de la reivindicación 2, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de aproximadamente 30
nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos.
18. El método de la reivindicación 2, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 10 nucleótidos.
19. El método de la reivindicación 3, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 15 nucleótidos.
20. El método de la reivindicación 3, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 20 nucleótidos.
21. El método de la reivindicación 3, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de, al menos,
aproximadamente 30 nucleótidos.
22. El método de la reivindicación 3, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de aproximadamente 20
nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos.
23. El método de la reivindicación 3, en el que
dicho oligonucleótido tiene una longitud de aproximadamente 30
nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos.
24. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha sonda es complementaria, al menos aproximadamente al 75%, de
dicha región de rARN.
25. El método de la reivindicación 2, en el que
dicho oligonucleótido es complementario, al menos aproximadamente
al 75%, de dicha región de rARN.
26. El método de la reivindicación 3, en el que
dicho oligonucleótido es complementario, al menos aproximadamente
al 75%, de dicha región de rARN.
27. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha sonda es perfectamente complementaria de dicha región de
rARN.
28. El método de la reivindicación 2, en el que
dicha sonda es perfectamente complementaria de dicha región de
rARN.
29. El método de la reivindicación 3, en el que
dicha sonda es perfectamente complementaria de dicha región de
rARN.
30. Un método para preparar una sonda o una
combinación de sondas, para su uso en un ensayo de hibridación
cualitativo o cuantitativo, que comprende construir un polímero
nucleotídico que sea suficientemente complementario para hibridarse
con una región de rADN o rARN, seleccionada para distinguir un
organismo no viral diana o un primer grupo de organismos no virales
diana, que se trata de detectar, de, al menos, un organismo que no
es diana o de un segundo grupo de organismos no diana, que pueden
estar presentes en una muestra, en el que dichos organismos o grupo
de organismos no diana son afines filogenéticos de dichos organismos
o grupo de organismos diana, seleccionándose dicha región de rADN o
rARN mediante:
- comparación de una o más secuencias de bases
de nucleótidos de rADN o rARN de dicho organismo no viral o grupo
de organismos no virales que se trata de detectar, con una o más
secuencias de bases de nucleótidos de rADN o rARN de dichos
organismos no diana o grupo de organismos no diana;
- alineamiento de dichas secuencias de bases de
nucleótidos de rADN o rARN de dicho organismo no viral o grupo de
organismos no virales, con dichas secuencias de bases de nucleótidos
de rADN o rARN de dichos organismos o grupo de organismos no diana,
de modo que se identifiquen las regiones de homología; y
- selección de dicho polímero nucleotídico
maximizando la homología de dicho polímero nucleotídico con las
regiones de dicho rADN o rARN de dicho organismo no viral o grupo de
organismos no virales que se trata de detectar, al mismo tiempo que
se minimiza la homología de dicho polímero nucleotídico con las
secuencias de rADN o rARN de dicho organismo o grupo de organismos
no diana, que se trata de distinguir de aquellos; seleccionándose
dicho organismo o grupo de organismos que se trata de detectar, de
una o más especies de un género o de uno o más géneros de una
familia.
31. El método de la reivindicación 30, en el que
dicho polímero nucleotídico es homólogo, al menos aproximadamente
al 90%, de las regiones de dicho rADN o rARN de dicho organismo no
viral o grupo de organismos no virales que se trata de detectar.
32. El método de la reivindicación 30, en el que
dicho oligonucleótido sonda tiene una homología inferior a
aproximadamente 90% con las secuencias de rADN o rARN de dichos
afines filogenéticamente más próximos, que se trata de distinguir de
los buscados.
33. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 32, que comprende la etapa adicional de
comprobar que no hay reactividad cruzada de dicha sonda, por
hibridación de dicho oligonucleótido sonda con los organismos no
virales o grupos de organismos no virales que se trata de distinguir
por medio de dicha sonda.
34. Un método para preparar una sonda, para su
uso en un ensayo de hibridación cualitativo o cuantitativo, que
comprende construir un oligonucleótido que sea suficientemente
complementario para hibridar una región de rADN o rARN,
seleccionada para que sea singular para un organismo no viral o un
grupo de organismos no virales que se trata de detectar,
seleccionándose dicha región de rADN o rARN mediante:
- comparación de una o más secuencias de bases
de nucleótidos de rADN o rARN de dicho organismo no viral o grupo
de organismos no virales que se trata de detectar, con una o más
secuencias de bases de nucleótidos de rADN o rARN de sus afines
filogenéticamente más próximos;
- alineamiento de dichas secuencias de bases de
nucleótidos de rADN o rARN de dicho organismo no viral o grupo de
organismos no virales, con dichas secuencias de rADN o rARN de
dichos afines filogenéticamente más próximos, de modo que se
identifiquen las regiones de rADN o rARN hipervariables entre las
especies;
selección de dicho oligonucleótido sonda en
dicha región hipervariable entre las especies, maximizando la
homología de dicho oligonucleótido sonda con las regiones de dicho
rADN o rARN de dicho organismo no viral o grupo de organismos no
virales que se trata de detectar, al mismo tiempo que se minimiza la
homología de dicho oligonucleótido sonda con las secuencias de rADN
o rARN de dichos afines filogenéticamente más próximos que se trata
de distinguir de aquellos;
seleccionándose dicho organismo o grupo de
organismos que se trata de detectar, de una o más especies de un
género o de uno o más géneros de una familia.
35. El método de la reivindicación 34, en el que
dicho oligonucleótido sonda es homólogo, al menos aproximadamente
al 90%, de las regiones de dicho rADN o rARN de dicho organismo no
viral o grupo de organismos no virales que se trata de detectar.
36. El método de la reivindicación 34, en el que
dicho oligonucleótido sonda no tiene una homología superior a
aproximadamente 90% con las secuencias de rADN o rARN de dichos
afines filogenéticamente más próximos, que se trata de distinguir de
los buscados.
37. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 34 a 36, que comprende la etapa adicional de
comprobar que no hay reactividad cruzada de dicha sonda, por
hibridación de dicho oligonucleótido sonda con los organismos no
virales o grupos de organismos no virales que se trata de distinguir
por medio de dicha sonda.
38. Una sonda de polímero nucleotídico para un
ensayo de hibridación, para un organismo no viral o un grupo de
organismos no virales, en forma sustancialmente aislada, que
comprende un oligonucleótido de 10 a 100 nucleótidos, capaz de
hibridarse, en condiciones de hibridación rigurosa, con, al menos,
10 nucleótidos de una región variable de rARN o rADN, seleccionada
para que sea singular para dicho organismo no viral o grupo de
organismos no virales; en el que dicha sonda se hibrida, en
condiciones de hibridación rigurosa, con el ácido nucleico de una
especie de organismo de un género y no es capaz de hibridarse, en
dichas condiciones, con el ácido nucleico de otras especies de
dicho género, o en el que dicha sonda se hibrida, en condiciones de
hibridación rigurosa, con el ácido nucleico de uno o más miembros
de dicho grupo de organismos y no es capaz de hibridarse con el
ácido nucleico de organismos que no son miembros de dicho grupo,
donde dicha región variable corresponde a una región seleccionada
del grupo que consiste en:
bases 60-100,
120-150, 600-670,
820-860, 980-1050 y
1250-1290 de rARN de E. coli 16S;
270-390, 535-560,
1150-1200, 1440-1600,
1710-1750 y 2190-2330 de rARN de
E. coli 23S;
bases 330-365 de rARN de E.
coli 16S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de las bacterias del grupo
filogenético;
bases 675-715 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de las bacterias del grupo
filogenético;
bases1080-1110 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de las bacterias del grupo
filogenético;
bases 460-490 de rARN de E.
coli 23S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de las bacterias del grupo
filogenético;
bases1050-1080 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de las bacterias del grupo
filogenético;
bases 1900-1960 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de las bacterias del grupo
filogenético;
bases 845-880 de rARN de S.
cerevisiae 18 donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de los hongos del grupo
filogenético;
bases 1960-2000 de rARN de S.
cerevisiae 28S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de los hongos del grupo
filogenético
bases 1225-1270 de rARN de S.
cerevisiae 28S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de los hongos del grupo
filogenético;
bases 185-225 de rARN de E.
coli 16S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Mycobacterium avium;
bases 185-225 de rARN de E.
coli 16S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Mycobacterium intracellulare;
bases 185-225 de rARN de E.
coli 16S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a la especie de la bacteria compleja
Mycobacterium tuberculosis;
bases 540-575 de rARN de E.
coli 23S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de la bacteria compleja
Mycobacterium tuberculosis;
bases 1155-1190 de rARN de E.
coli 23S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de la bacteria compleja
Mycobacterium tuberculosis;
bases 2195-2235 de rARN de E.
coli 23S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies de la bacteria compleja
Mycobacterium tuberculosis;
bases 1025-1060 de rARN de E.
coli 16S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género
Mycobacterium;
bases 1440-1475 de rARN de E.
coli 23S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género
Mycobacterium;
bases 1515-1555 de rARN de E.
coli 23S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género
Mycobacterium;
bases 1570-1610 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género
Mycobacterium;
bases 190-230 de rARN de E.
coli 16S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Mycoplasma pneumoniae:
bases 450-490 de rARN de E.
coli 16S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Mycoplasma pneumoniae;
bases 820-860 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Mycoplasma pneumoniae:
bases 1255-1290 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Mycoplasma pneumoniae;
bases 65-120 de E. coli
5S rARN donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en condiciones
rigurosas a Mycoplasma pneumoniae;
bases 630-675 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género Legionella:
bases 975-1020 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género Legionella;
bases 350-395 de rARN de E.
coli 23S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género Legionella
bases 1585-1620 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género Legionella;
bases 2280-2330 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género Legionella;
bases 60-105, de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Chlamydia trachomatis;
bases 600-635 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Chlamydia trachomatis;
bases 830-870 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Chlamydia trachomatis;
bases 275-320 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Chlamydia trachomatis;
330-365 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Chlamydia trachomatis;
1160-1190 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Chlamydia trachomatis;
1450-1490, de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Chlamydia trachomatis;
1510-1545 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Chlamydia trachomatis;
1710-1750 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Chlamydia trachomatis;
bases 980-1010 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género
Campylobacter;
bases 825-860 de rARN de E.
coli 16S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del grupo subgenérico
Streptococci conocido como Enterococci;
bases 365-405 de rARN de E.
coli 23S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del grupo subgenérico conocido
como Pseudomonas grupo 1;
bases 305-340 de rARN de E.
coli 16S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Enterobacter cloacae;
bases 270-305 de rARN de E.
coli 23S, donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Proteus mirabilis;
bases 1125-1155 de rARN de E.
coli 16S donde el grupo de organismos pertenece al género
Salmonella;
bases 335-375 de rARN de E.
coli 23S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a especies del género Salmonella;
bases 995-1030 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Escherichia coli;
bases 125-150 de rARN de E.
coli 16S donde el organismo es Neisseria gonorrhoeae,
bases 455-485 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Neisseria gonorrhoeae;
bases 980-1015 de rARN de E.
coli 16S donde dicho polímero nucleotídico se hibrida en
condiciones rigurosas a Neisseria gonorrhoeae;
o el complemento de la misma.
\newpage
39. Una sonda de polímero nucleotídico para un
ensayo de hibridación, para un organismo no viral o un grupo de
organismos no virales, en forma sustancialmente aislada, que
comprende un oligonucleótido de 10 a 100 nucleótidos, capaz de
hibridarse, en condiciones de hibridación rigurosa, con, al menos,
10 nucleótidos de una región variable de rARN o rADN, seleccionada
para que sea singular para dicho organismo no viral o grupo de
organismos no virales; en el que dicha sonda se hibrida, en
condiciones de hibridación rigurosa, con el ácido nucleico de una
especie de organismo de un género y no es capaz de hibridarse, en
dichas condiciones, con el ácido nucleico de otras especies de
dicho género, o en el que dicha sonda se hibrida, en condiciones de
hibridación rigurosa, con el ácido nucleico de uno o más miembros
de dicho grupo de organismos y no es capaz de hibridarse con el
ácido nucleico de organismos que no son miembros de dicho grupo,
donde dicho oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada
del grupo que consiste en:
cuando dicho grupo de organismos es el de las
bacterias del grupo filogenético, las secuencias:
-
80
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho grupo de organismos no
virales es el de los hongos del grupo filogenético, las
secuencias:
-
81
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho organismo es
Mycobacterium avium, la
secuencia:
- ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG;
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho organismo es Mycobacterium
intracellulare, la secuencia:
- ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG;
\newpage
cuando el grupo de organismos no virales es el
de las bacterias complejas Mycobacterium tuberculosis, las
secuencias:
-
82
\vskip1.000000\baselineskip
cuando el grupo de organismos no
virales es el género Mycobacterium, las
secuencias:
-
83
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho organismo es
Mycoplasma pneumoniae, las
secuencias:
-
84
\newpage
cuando dicho grupo de organismos es
el género Legionella, las
secuencias:
-
85
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho organismo es
Chlamydia trachomatis, las
secuencias:
\vskip1.000000\baselineskip
-
86
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho grupo de organismos es
el género Campylobacter, la
secuencia:
- GGTTCTTAGGATATCAAGCCCAGG;
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando dicho grupo de organismos es el grupo
subgenérico Streptococci conocido como Enterococci, la
secuencia:
- TGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTA;
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho grupo de organismos es el grupo
subgenérico conocido como Pseudomonas grupo 1, la
secuencia:
- CAGACAAAGTTTCTCGTGCTCCGTCCTACTCGATT;
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho organismo es Enterobacter
cloacae, la secuencia:
- GTGTGTTTTCGTGTACGGGAGTTTCACCC;
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho organismo es Proteus
mirabilis, la secuencia:
- CCGTTCTCCTGACACTGCTATTGATTAAGACTC;
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho grupo de organismos es el género
Salmonella, las secuencias:
- CTCCTTTGAGTTCCCGACCTAATCGCTGGC;
- CTCATCGAGCTCACAGCACATGCGCTTTTGTGTA;
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho organismo es Escherichia
coli, la secuencia:
- GCACATTCTCATCTCTGAAAACTTCCGTGG;
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho organismo es Neisseria
gonorrhoeae, las secuencias:
-
88
-
89
40. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la secuencia
CCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCC.
41. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la secuencia
CCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGG.
42. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la secuencia
GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT.
43. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la secuencia
GGGGTTCTTTTCGCCTTTCCCTCACGG.
44. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la secuencia
GGC TGCTTCTAAGCCAACATCCTG.
45. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la secuencia
GGA CCGTTATAGTTACGGCCGCC.
46. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la secuencia
GGTCGGAACTTACCCGACAAGGAATTTCGCTACC.
47. Una sonda según la reivindicación 38, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicha región variable corresponde a las bases
330-365 de rARN de E. coli 16S, o el
complemento de la misma.
48. Una sonda según la reivindicación 38, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicha región variable corresponde a las bases
675-715 de rARN de E. coli 16S, o el
complemento de la misma.
49. Una sonda según la reivindicación 38, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicha región variable corresponde a las bases
1080-1110 de rARN de E. coli 16S, o el
complemento de la misma.
50. Una sonda según la reivindicación 38, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicha región variable corresponde a las bases
460-490 de rARN de E. coli 23S, o el
complemento de la misma.
51. Una sonda según la reivindicación 38, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicha región variable corresponde a las bases
1050-1080 de rARN de E. coli 23S, o el
complemento de la misma.
52. Una sonda según la reivindicación 38, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de bacterias del
grupo filogenético y dicha región variable corresponde a las bases
1900-1960 de rARN de E. coli 23S, o el
complemento de la misma.
53. Una sonda según la reivindicación 38, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de los hongos del
grupo filogenético y dicha región variable corresponde a las bases
845-880 de S. cerevisiae 18S rARN, o el
complemento de la misma.
54. Una sonda según la reivindicación 38, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de los hongos del
grupo filogenético y dicha región variable corresponde a las bases
1960-2000 de rARN de S. cerevisiae 28S, o el
complemento de la misma.
55. Una sonda según la reivindicación 38, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de los hongos del
grupo filogenético y dicha región variable corresponde a las bases
1225-1270 de rARN de S. cerevisiae 28S, o el
complemento de la misma.
56. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de los hongos del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la
secuencia
- CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGG.
57. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de los hongos del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la
secuencia
- CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAAC.
58. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de los hongos del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la
secuencia
- CGACTTGGCATGAAAACTATTCCTTCCTGTGG.
59. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de los hongos del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la
secuencia
- GCTCTTCATTCAATTGTCCACGTTCAATTAAGCAACAAGG.
60. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de los hongos del
grupo filogenético y dicho oligonucleótido comprende la
secuencia
- GCTCTGCATTCAAAGGTCCGCGTTCAATAAAGAAACAGGG.
61. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Mycobacterium avium y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- ACCGCAAAAGCTTTCC
- ACCAGAAGACATGCGTCTTGAG.
62. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Mycobacterium avium y en el que
dicha región variable corresponde a las bases
185-225 de rARN de E. coli 16S, o el
complemento de la misma.
63. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Mycobacterium intracellulare y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG.
64. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Mycobacterium intracellulare y
dicha región variable corresponde a las bases
185-225 de rARN de E. coli 16S, o el
complemento de la misma.
65. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicho oligonucleótido
comprende la secuencia
- TAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTG.
66. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicho oligonucleótido
comprende la secuencia
- TGCCCTACCCACACCCACCACCAGGTGATGT.
67. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicho oligonucleótido
comprende la secuencia
- CCATCACCACCCTCCTCCGGAGAGGAAAAGG.
68. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicho oligonucleótido
comprende la secuencia
- CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC.
69. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicho oligonucleótido
comprende la secuencia
- AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC.
70. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicho oligonucleótido
comprende la secuencia
- CCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCG.
71. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicho oligonucleótido
comprende la secuencia
- ACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATC.
72. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicha región variable
corresponde a las bases 185-225 de rARN de E.
coli 16S, o el complemento de la misma.
73. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicha región variable
corresponde a las bases 540-575 de rARN de E.
coli 23S, o el complemento de la misma.
74. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicha región variable
corresponde a las bases 1155-1190 de rARN de E.
coli 23S, o el complemento de la misma.
\newpage
75. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos no virales es el de las bacterias
complejas Mycobacterium tuberculosis y dicha región variable
corresponde a las bases 2195-2235 de rARN de E.
coli 23S, o el complemento de la misma.
76. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Mycobacterium y
dicho oligonucleótido comprende la secuencia
- CCATGCACCACCTGCACACAGGCCACAAGG.
77. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Mycobacterium y
dicho oligonucleótido comprende la secuencia
- GGCTTGCCCCAGTATTACCACTGACTGGTACGG.
78. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Mycobacterium y
dicho oligonucleótido comprende la secuencia
- CACCGAATTCGCCTCAACCGGCTATGCGTCACCTC.
79. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Mycobacterium y
dicho oligonucleótido comprende la secuencia
- GGGGTACGGCCCGTGTGTGTGCTCGCTAGAGGC.
80. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Mycobacterium y
dicha región variable corresponde a las bases
1025-1060 de rARN de E. coli 16S, o el
complemento de la misma.
81. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Mycobacterium y
dicha región variable corresponde a las bases
1440-1475 de rARN de E. coli 23S, o el
complemento de la misma.
82. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Mycobacterium y
dicha región variable corresponde a las bases
1515-1555 de rARN de E. coli 23S, o el
complemento de la misma.
83. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Mycobacterium y
dicha región variable corresponde a las bases
1570-1610 de rARN de E. coli 23S, o el
complemento de la misma.
84. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Mycoplasma pneumoniae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- GCTTGGTGCTTTCCTATTCTCACTGAAACAGCTACATTCGGC.
85. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Mycoplasma pneumoniae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- AATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT.
86. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Mycoplasma pneumoniae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATT.
87. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Mycoplasma pneumoniae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- TACCGAGGGGATCGCCCCGACAGCTAGTAT.
88. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Mycoplasma pneumoniae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CTTTACAGATTTGCTCACTTTTACAAGCTGGCGAC.
89. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Mycoplasma pneumoniae y dicha
región variable corresponde a las bases 190-230 de
rARN de E. coli 16S, o el complemento de la misma.
\global\parskip0.900000\baselineskip
90. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Mycoplasma pneumoniae y dicha
región variable corresponde a las bases 450-490 de
rARN de E. coli 16S. o el complemento de la misma.
91. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Mycoplasma pneumoniae y dicha
región variable corresponde a las bases 820-860 de
rARN de E. coli 16S, o el complemento de la misma.
92. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38 en
el que dicho organismo es Mycoplasma pneumoniae y dicha
región variable corresponde a las bases 1255-1290
de rARN de E. coli 16S, o el complemento de la misma.
93. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Mycoplasma pneumoniae y dicha
región variable corresponde a las bases 65-120 de
E. coli 5S rARN, o el complemento de la misma.
94. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Legionella y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- TACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACCAGTATTATCTGACC.
95. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Legionella y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- GGATTTCACGTGTCCCGGCCTACTTGTTCGGGTGCGTAGTTC.
96. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Legionella y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CATCTCTGCAAAATTCACTGTATGTCAAGGGTAGGTAAGG.
97. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Legionella y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
GCGGTACGGTTCTCTATAAGTTATGGCTAGC.
98. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Legionella y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- GTACCGAGGGTACCTTTGTGCT.
99. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Legionella y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CACTCTTGGTACGATGTCCGAC.
100. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Legionella y
dicha región variable corresponde a las bases
630-675 de rARN de E. coli 16S, o el
complemento de la misma.
101. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Legionella y
dicha región variable corresponde a las bases
975-1020 de rARN de E. coli 16S, o el
complemento de la misma.
102. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Legionella y
dicha región variable corresponde a las bases
350-395 de rARN de E. coli 23S, o el
complemento de la misma.
103. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Legionella y
dicha región variable corresponde a las bases
1585-1620 de rARN de E. coli 23S, o el
complemento de la misma.
104. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Legionella y
dicha región variable corresponde a las bases
2280-2330 de rARN de E. coli 23S, o el
complemento de la misma.
105. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CCGACTCGGGGTTGAGCCCATCTTTGACAA.
\global\parskip1.000000\baselineskip
106. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- TTACGTCCGACACGGATGGGGTTGAGACCATC.
107. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CCGCCACTAAACAATCGTCGAAACAATTGCTCCGTTCGA.
108. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CGTTACTCGGATGCCCAAATATCGCCACATTCG.
109. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CATCCATCTTTCCAGATGTGTTCAACTAGGAGTCCTGATCC.
110. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- GAGGTCGGTCTTTCTCTCCTTTCGTCTACG.
111. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CCGTTCTCATCGCTCTACGGACTCTTCCAATCG.
112. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CGAAGATTCCCCTTGATCGCGACCTGATCT.
113. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CCGGGGCTCCTATCGTTCCATAGTCACCCTAAAAG.
114. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- TACCGCGTGTCTTATCGACACACCCGCG.
115. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicha
región variable corresponde a las bases 60-105 de
rARN de E. coli 16S, o el complemento de la misma.
116. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicha
región variable corresponde a las bases 600-635 de
rARN de E. coli 16S, o el complemento de la misma.
117. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicha
región variable corresponde a las bases 830-870 de
rARN de E. coli 16S, o el complemento de la misma.
118. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicha
región variable corresponde a las bases 275-320 de
rARN de E. coli 23S, o el complemento de la misma.
119. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicha
región variable corresponde a 330-365 de rARN de
E. coli 23S, o el complemento de la misma.
120. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicha
región variable corresponde a las bases 1160-1190
de rARN de E. coli 23S, o el complemento de la misma.
121. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicha
región variable corresponde a las bases 1450-1490
de rARN de E. coli 23S, o el complemento de la misma.
122. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicha
región variable corresponde a las bases 1510-1545
de rARN de E. coli 23S, o el complemento de la misma.
123. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Chlamydia trachomatis y dicha
región variable corresponde a las bases 1710-1750
de rARN de E. coli 23S, o el complemento de la misma.
124. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Campylobacter y
dicho oligonucleótido comprende la secuencia
- GGTTCTTAGGATATCAAGCCCAGG.
125. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Campylobacter y
dicha región variable corresponde a las bases
980-1010 de rARN de E. coli 16S, o el
complemento de la misma.
126. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el grupo subgenérico de
Streptococci conocido como Enterococci y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- TGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTA.
127. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el grupo subgenérico
Streptococci conocido como Enterococci y dicha región
variable corresponde a las bases 825-860 de rARN de
E. coli 16S, o el complemento de la misma.
128. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el grupo subgenérico conocido como
Pseudomonas Grupo I y dicho oligonucleótido comprende la
secuencia
- CAGACAAAGTTTCTCGTGCTCCGTCCTACTCGATT.
129. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el grupo subgenérico conocido
como Pseudomonas Grupo I y dicha región variable corresponde
a las bases 365-405 de rARN de E. coli 23S, o
el complemento de la misma.
130. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Enterobacter cloacae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- GTGTGTTTTCGTGTACGGGAGTTTCACCC.
131. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Enterobacter cloacae y dicha región
variable corresponde a las bases 305-340 de rARN de
E. coli 23S, o el complemento de la misma.
132. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Proteus mirabilis y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CCGTTCTCCTGACACTGCTATTGATTAAGACTC.
133. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Proteus mirabilis y dicha región
variable corresponde a las bases 270-305 de rARN de
E. coli 23S, o el complemento de la misma.
134. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Salmonella y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CTCCTTTGAGTTCCCGACCTAATCGCTGGC.
135. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho grupo de organismos es el género Salmonella y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- CTCATCGAGCTCACAGCACATGCGCTTTTGTGTA.
\newpage
136. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Salmonella y
dicha región variable corresponde a las bases
1125-1155 de rARN de E. coli 16S, o el
complemento de la misma.
137. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho grupo de organismos es el género Salmonella y
dicha región variable corresponde a las bases
335-375 de rARN de E. coli 23S, o el
complemento de la misma.
138. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Escherichia coli y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
- GCACATTCTCATCTCTGAAAACTTCCGTGG.
139. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Escherichia coli y dicha región
variable corresponde a las bases 995-1030 de rARN
de E. coli 16S, o el complemento de la misma.
140. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Neisseria gonorrhoeae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia CCGCCGCTACCCGGTAC.
141. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Neisseria gonorrhoeae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia TCATCGGCCGCCGATATTGGC.
142. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Neisseria gonorrhoeae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
GAGCATTCCGCACATGTCAAAACCAGGTA.
143. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Neisseria gonorrhoeae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
GAGATTCCGCACATGTCAAAACCAGG.
144. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Neisseria gonorrhoeae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia
GAGGATTCCGCACATGTCAAAACCAGGTAA.
145. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Neisseria gonorrhoeae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia CCCGCTACCCGGTACGTTC.
146. Una sonda según la reivindicación 39, en el
que dicho organismo es Neisseria gonorrhoeae y dicho
oligonucleótido comprende la secuencia CCGCTACCCGGTACGTTC.
147. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Neisseria gonorrhoeae y dicha
región variable corresponde a las bases 125-150 de
rARN de E. coli 16S, o el complemento de la misma.
148. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Neisseria gonorrhoeae y dicha
región variable corresponde a las bases 455-485 de
rARN de E. coli 16S, o el complemento de la misma.
149. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, o una sonda según la reivindicación 38, en
el que dicho organismo es Neisseria gonorrhoeae y dicha
región variable corresponde a las bases 980-1015 de
rARN de E. coli 16S, o el complemento de la misma.
150. Un híbrido de ácido nucleico formado entre
un polímero nucleotídico u oligonucleótido según una cualquiera de
las reivindicaciones 47-56, 62, 64,
72-75, 80-83, 89-93,
100-104, 115, 123, 125, 127, 129, 131 133, 136,
137, 139 y 147-149 y un ácido nucleico
complementario para el mismo.
151. Un polímero nucleotídico que se hibrida en
condiciones rigurosas a una sonda según una cualquiera de las
reivindicaciones 40-46, 56-61, 63,
65-71, 76-79, 84-88,
94-99, 105-114, 124, 126, 128, 130,
132, 134, 135, 138 y 140-146, o al complemento de
la misma.
152. Un híbrido de ácido nucleico según la
reivindicación 150 formado entre un oligonucleótido y un ácido
nucleico complementario para el mismo.
153. El complemento del polímero nucleotídico de
la reivindicación151.
154. Un ensayo de hibridación que comprende
hacer reaccionar juntos cualquier rARN o el complemento del mismo
procedente de una muestra que va a ser analizada en busca de un
organismo no viral o un grupo de organismos no virales y una sonda
según una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 149, donde dicha
sonda es al menos aproximadamente 75% complementaria a una región
variable de rARN o rADN seleccionada para que sea singular para
dicho organismo no viral o grupo de organismos no virales, en
condiciones tales que puede ocurrir la hibridación entre la sonda
oligonucleotídica o el polímero nucleotídico y cualquier rARN
suficientemente complementario de la muestra o su complemento, y
observar y/o medir dicha hibridación.
155. El ensayo de la reivindicación 154 en el
que dicha hibridación entre la sonda oligonucleotídica y cualquier
rARN diana de la muestra es de al menos aproximadamente 10% a
aproximadamente 100%.
156. El ensayo de la reivindicación 154 en el
que dicha sonda oligonucleotídica es cADN.
157. El ensayo de la reivindicación 154 en el
que dicha condiciones incluyen una temperatura de aproximadamente
25ºC debajo de Tm a aproximadamente 1ºC debajo de Tm.
158. El ensayo de la reivindicación 154 que
comprende además el ensayo paralelo de un control homólogo positivo,
o un control heterólogo positivo, o ambos.
159. El ensayo de la reivindicación 154 que
comprende además el ensayo paralelo de un control negativo.
160. El ensayo de la reivindicación 154 en el
que dichas condiciones incluyen agentes para tasas incrementadas de
hibridación.
161. El ensayo de la reivindicación 154 en el
que dichas condiciones son tales que potencian la hibridación
máxima entre la sonda oligonucleotídica y cualquier rARN
complementario de la muestra y mínima reactividad cruzada entre la
sonda oligonucleotídica y cualquier rARN no complementario de la
muestra.
162. El ensayo de la reivindicación 154 en el
que dicha sonda oligonucleotídica está marcada.
163. El ensayo de la reivindicación 154 en el
que dicha sonda oligonucleotídica está marcada con un marcador
isotópico, no isotópico o quimioluminiscente.
164. El ensayo de la reivindicación 154 que
comprende además la liberación de rARN de las células de dicho
organismo no viral o grupo de organismos no virales antes de la
etapa de reacción conjunta.
165. El ensayo de la reivindicación 154 en el
que dicho organismo no viral o grupo de organismos no virales son
Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, las
bacterias complejas de Mycobacterium tuberculosis, el género
Mycobacterium, Mycoplasma pneumoniae, Legionella, Neisseria
gonorrhoeae, Salmonella, Chlamydia trachomatis, Campylobacter,
Proteus mirabilis Enterococcus, Enterobacter cloacae, Escherichia
coli, Pseudomonas Grupo 1, bacterias u hongos.
166. El ensayo de la reivindicación 162, donde
dicha sonda oligonucleotídica marcada tiene una longitud de
aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos.
167. El ensayo de la reivindicación 162 donde
dicha sonda oligonucleotídica marcada es al menos aproximadamente
95% complementaria a dicha región variable de rARN.
168. El ensayo de la reivindicación 154 que
comprende además el uso de una o más sondas oligonucleotídicas
adicionales de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud y
que son al menos aproximadamente 75% complementarias a una o más
regiones variables adicionales de rARN seleccionadas para que sean
singulares para dichos organismos no virales.
169. El ensayo de la reivindicación 154 que
comprende además el uso de una o más sondas adicionales que
identifican uno o más organismos no virales adicionales, ampliando
así el grupo de organismos no virales que se analizan.
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