KR950011719B1 - 비바이러스성 생물체의 검출 및(또는) 정량화를 위한 핵산 탐침 - Google Patents

비바이러스성 생물체의 검출 및(또는) 정량화를 위한 핵산 탐침 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
비바이러스성 생물체의 검출 및(또는) 정량화를 위한 핵산 탐침
[도면의 간단한 설명]
제1도는 염기에 대해 표준 참고 번호를 기재한, 대장균(Escherichia coli)에 대한 세균선 16S rRNA의 일차 구조의 도면이다.
제2도는 염기에 대해 표준 참고 번호를 기재한, 대장균에 대한 세균성 23S rRNA의 일차 구조의 도면이다.
제3도는 염기에 대해 표준 참고 번호를 기재한, 대장균에 대한 세균성 5S r RNA의 일차 구조의 도면이다.
제4도는 염기에 대해 표준 참고 번호를 기재한, 맥주 효모균(Saccharmoyces cerevisiae)에 대한 18S r RNA의 일차 구조의 도면이다.
제5도는 염기에 대해 표준 참고 번호를 기재한, 맥주 효모균에 대한 28S r RNA의 일차 구조의 도면이다.
제6도는 관련된 생물체의 12개의 상이한 군 사이에서, 상이한 16S r RNA의 위치(대장균이 참고 번호를 사용함)를 나타내는 도면이다. 실시예 1에서, 예를 들면, 99.7은 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botuliniumg)과 클로스트리듐 섭테르미날레(Clostridium subterminale)간의 16S r RNA의 상이도를 의미한다.
제7도는 관련된 생물체의 12개의 상이한 군 사이에서, 상이한 23S r RNA의 처음 1500개의 염기의 위치(대장균의 참고 번호를 사용함)를 나타내는 도면이다.
제8도는 관련된 생물체의 12개의 상이한 군 사이에서, 상이한 23S r RNA의 말단 염기의 위치(대장균의 참고 번호를 사용함)를 나타내는 도면이다.
제9도는 16S r RNA에 혼성화할 수 있는 탐침의 위치를 나타내는 도면이다.
제10도는 23S r RNA의 처음 1500개의 염기에 혼성화 할 수 있는 탐침의 위치를 나타내는 도면이다.
제11도는 23S r RNA의 말단 염기에 혼성화할 수 있는 탐침의 위치를 나타내는 도면이다.
[발명의 상세한 설명]
호간(Hogan) 등의 1986년 11월 24일자 특허 출원 제934,244호의 부분 계속 출원인 호간 등의 1987년 8월 7일자 특허 출원 제083,542호의 부분 계속 출원.
[발명의 배경]
[발명의 분야]
본 명세서에서 기재되고 청구된 본 발명은 RAN와 같은 유전 물질의 사용에 기초한 탐침 및 평가 분석에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 핵산 탐침의 고안과 구성 및 시험 및 시료(예, 객담, 요, 혈액 및 조직 절편, 식품, 흙 및 물) 중의 표적인 비바이러스성 생물체를 검출 및(또는) 정량화하기 위한 평가분석에서, 이와 같은 탐침을 상기 비바이러스성 생물체의 유전 물질에 혼성화(hybridization)시키는 것에 관한 것이다.
[개요]
뉴클레오티드로 되는 핵산의 두 단일 가닥은 결합(이후 "혼성화"라 한다). 하여 이중 나선 구조를 형성할 수 있고, 이 구조에서, 반대 방향으로 위치된 두 개의 폴리뉴클레오티드 사슬은 "염기"라고 알려진 짝을 이룬, 중심에 위치한 화합물의 쌍 사이에서 수소 결합(약한 화학 결합의 형태)에 의해 서로 유지된다. 일반적으로, 핵산의 이중 나선 구조에서, 예를 들면 염기 아데닌(A)는 염기 티민(T) 또는 우라실(U)에 수소 결합되는 반면, 염기 구아닌(G)는 염기 시토신(C)에 수소 결합된다. 그러므로, 사슬을 따라 임의의 위치에서, 염기쌍 AT 또는 AU, TA 또는 UA, GC, 또는 CG를 발견할 수 있다. 또한 전형적("정규적")인 염기쌍 외에 AG 및 GU 염기쌍을 발견할 수도 있다. 핵산의 첫 번째 단일 가닥이 두번째 가닥에 충분히 상보적이고, 이 두가닥들이 이들의 혼성화를 촉진시키는 조건하에 함께 존재하게 되면, 이중 가닥의 핵산이 형성된다. 적합한 조건 하에서, DNA/DNA, RNA/DNA, 또는 RNA/RNA 하이브리드(hybrid)가 형성될 수 있다.
대체로, 핵산의 잡종 형성을 위한 기본적인 2가지 방법이 있다. "용액내"혼성화로 공지된 한 방법에 있어서, "탐침" 핵산 서열 및 피검 시료에서 얻은 핵산 분자 모두는 용액 중에 유리되어 있다. 다른 방법에서, 시료인 핵산은 일반적으로 고상의 지지체 상에 고정되고 탐침 서열은 용액 중에 유리된다.
탐침은 검출하고자 하는 핵산 서열("표적 서열")에 대하여 다소 특정한 정도로 상보적인 단일 가닥의 핵산 서열일 수 있다. 또한 이 탐침에 표지를 붙일수도 있다. 특정한 핵산 서열의 검출을 위한 방법으로서 핵산 혼성화법의 사용에 대한 배경 설명은, 1983년 1월 10일자로 출원된 비바이러스성 생물체의 검출, 동정 및 정량화 방법[Method for Detection, Identification and Quantitation of Non-Viral Organisms]이라는 제하의 미합중국 특허 출원 제456,729호[코네 I(Kohne I)], 및 1984년 9월 4일자로 출원된 생물체 및 바이러스의 검출, 동정 및 정량화 방법[Method for Detecting, Identifying and Quantitating Organisms and Viruses]이라는 제하의 미합중국 특허 출원 제655,365[코네 II(Kohne II)]에 기재되어 있고, 이 특허 출원들은 기타 특허 출원과 함께 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용하였다.
또한 이들 특허 출원서들에는, 시료에서 얻은 임의의 핵산을, 이것이 유도된 r RNA 서브유닛(subunit)의 서열보다 짧고 하나 이상의 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체의 군의 r RNA와 혼성하되기에 충분히 상보적인 핵산 분자로 이루어진 탐침과 함께 제조하고, 명기한 혼성화 조건 하에서 이 혼합물을 인큐베이션시킨 후, 탐침 및 임의의 피검 시료 r RNA에 혼성화에 대하여 결과의 혼합물을 평가분석하는 단계로 이루어진, RN A-함유 생물체가 포함된 것으로 여겨지는 시료 중에서 상기 함유 생물체의 존재를 검출하기 위한 방법이 기재되어 있다.
이 발명은, 특정한 생물체 또는 생물체의 군 중에서 동일하거나 또는 충분히 유사한 r RNA 서브유닛 서열만을 검출하는 탐침의 사용을 포함하며, 시료 중에서 심지어는 다수의 무관한 생물체 존재 중에서도 임의의 하나 이상의 특정 생물체의 존재 또는 부재를 탐지하는 것으로 기술되어 있다.
본 발명자들은, 임의의 바이러스성 생물체를 검출하고 (또는) 정량하기 위하여, 평가 분석에서 고유한 r RNA 서열을 검출하는데 사용하기 위한, DNA 탐침을 고안 및 구성하는 신규 방법 및 수단을 발견하고, 본 명세서에 기재하였다. 본 명세서에서 기재된 독창적인 일부의 탐침은 단일 종 또는 비-바이러스성 생물체의 균주를 검출 및(또는) 정량화를 위해 사용할 수 있고, 기타 탐침은 전체 속(屬)의 구성원 또는 목적하는 계통발생적 군을 검출 및(또는) 정량화하기 위하여 사용할 수 있다.
[발명의 요약]
탐침의 제조 방법 및 용도에 있어서, 특정한 서열 및 한정된 길이의 단일 가닥 데옥시올리고뉴클레오티드를 혼성화의 평가분석에 사용하여 특정 표정 비바이러스성 생물체로부터 그의 공지된 계통 발생적 근친종과 구별하기 위해 비바이러스 균에서 얻은 r RNA의 존재 또는 양을 측정함으로서 각각 마이코박테리움 아비움(Mycogbacterium avium),마이코박테리움 인트라셀룰레어 (Mycobacterium intracellulare) 및 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis-complexbacteria) 16S r RNA의 변이 아(亞)서열에 대해 특이하고, 적절한 긴축도 하에서 상호 간으로 부터의 핵산 또는 기타 임의의 세균 종 또는 호흡기 감염원과 교차 반응하지 않는 탐침 서열을 기재 및 청구 한다. 또한, 결핵균군 세균에서 얻은 세가지 235s r RNA의 변이 영역의 아서열에 대해 특이적인 탐침을 기재 및 청구하고, 그외에는 하기 균에 대한 혼성화 평가분석에 유용한 rRNA의 변이 영역의 탐침을 기재 및 청구한다. 마이코박테리움속(the genus Mycobacterum)(16S 23S r RNA-특이성), 마이코플라즈마 뉴모니에 (Mycoplasma pneumoniae)(5S 및 16S r RNA-특이성), 클라미디아 트라코 마티스(Chlamydia trachomatis) (16S 및 23S r RNA 특이성), 엔테로박터클로아캐(Enterobacter colacae)(23S r RNA 특이성), 대장균 (Escherichia coli)(16S r RNA 특이성), 레기오넬라(Legionella)(16S 및 23S r RNA 특이성), 살모넬라속(Salmonella)(16S 및 23S r RNA 특이성), 장내구균속(Enterococci) (16S r RNA 특이성), 임균(Neisseria gonorrhoeae)(16W r RNA 특이성), 캄필로박터(Campylobacter)(16S r RNA 특이성) 기괴변형균(Proteus mirabilis) (23S r RNA 특이성), 슈도모나스속(Pseudomonas) (23S r RNA 특이성), 진균류(18S 및 28S r RNA 특이성), 및 세균(16s 및 23S r RNA 특이성).
평가분석법의 한가지 실시형태에서, 먼저 피검 시료를 시료 중에 존재하는 임의의 비바이러스성 생물체에서 r RNA가 방출되는 조건하에 둔다. r RNA는 단일 가닥이므로, 이와같이 일단 방출되면 충분히 상보적인 유전물질과 혼성화되도록 위해 사용할 수 있다. 표지를 붙일 수 있는 탐침과 표적 r RNA와의 접촉은, 두가닥들의 혼성화를 축진시키는 조건의 용액 내에서 행할 수 있다. 이어서 반응 혼합물을 혼성화된 탐침의 존재에 대해 평가분석한다. 정확성, 경제성 및 속도를 포함하여, 비바이러스성 생물체를 검출하기 위한 선행 기술을 능가하는 본 발명의 많은 잇점들을 후술하는 상세한 설명에서 보다 충분히 알 수 있을 것이다.
실시예 1에서, 예를 들면, 99. 7은 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botuliniumg)과 클로스트리듐 섭테르미날레(Clostridium subterminale)간의 16S r RNA의 상이도를 의미한다.
[정의]
본 명세서와 특허 청구의 범위에 사용된 하기 용어들은 다음과 같이 정의된다.
클레오티디드 : 포스페이트기, 5'탄당과 질소 함유 염기로 구성된 헥산의 서브유닛, RNA에서 5'탄당은 리보오즈이다. DNA에서 5'탄당은 2-데옥시리보오즈이다. 또한 이 용어는 이와 같은 서브유닛의 유사체도 포함한다.
뉴클레오티드 중합체 : 포스토디에스테르 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드.
올리고뉴클레오티드 : 일반적으로 길이가 약 10 내지 약 100개의 뉴클레오티드이나, 100 뉴클레오티드보다 훨씬 길 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
핵산 탐침 : 상보적인 단일 가닥의 표적 핵산 서열과 결합하여 이중-가닥 분자(하이브리드)를 형성하는 단일 가닥의 핵산 서열, 핵산 탐침은 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체일 수 있다.
하이브리드 : 상보적인 염기 사이에서 와트슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 결합 또는 비-정규적 염기 쌍 결합에 의해 두 개의 단일 가닥 핵산 서열 간에 형성되는 복합체.
혼성화 : 두 개의 상보적인 핵산 가닥이 결합하여 이중 가닥 분자(하이브리드)를 형성하는 방법.
상보성 : 각 가닥 상의 와트슨-크릭 염기쌍 사이에서 수소 결합을 통해 하이브리드 또는 이중 가닥의 DNA : DNA, RNA : RNA 또는 DNA : RNA를 형성할 수 있는, DNA 또는 RNA 단일 가닥 염기 서열에 의해 추론되는 특성, 일반적으로, 아데닌(A)는 티민(T) 또는 우라실(U)에 상보적인 반면, 구아닌(G)는 시토신(C)에 상보적이다.
긴축도 : 혼성화 및 후속 반응 단계 도중에 존재하는 온도 및 용매 조성물을 기재하기 위해 사용하는 용어, 고 긴축 조건하에서는, 고도로 상동적인 핵산 하이브리드만이 형성되고, 충분한 정도의 상보성이 없는 하이브리드는 형성되지 않는다. 그리하여 평가 분석 조건의 긴축도에 의해, 하이브리드를 형성하는 두 핵산가닥 간에 필요한 상보성의 정도가 결정된다. 긴축도는 표적과 비표적 핵산으로 형성 되는 하이브리드간의 안정성의 차이를 최대화하도록 선택된다.
탐침 특이성 : 표적과 비-표적 서열을 구별하기 위한 탐침의 능력을 의미하는 탐침의 특성, 서열 및 평가 분석의 조건에 좌우됨. 탐침 특이성 절대적(예, 표적 생물체와 임의의 비표적 생물체를 구별할 수 있는 탐침)일 수 있거나, 또는 기능적(예, 특정 시료중에 일반적으로 존재하는 표적 생물체 및 기타 임의의 생물체를 구별할 수 있는 탐침)일 수 있다. 많은 탐침 서열을 사용하는 조건에 따라 광범위 하거나 또는 제한된 특이성에 대하여 사용할 수 있다.
변이 영역(variable region) : 시료 중에 함유된 표적 생물체와 비표적 생물체 사이에서 적어도 1개의 염기에 의해 상이한 뉴클레오티드 중합체.
보존 영역(conserved region) : 변하지 않는 부위.
서열 분기 : 진화 과정에서 뉴클레오티드 중합체의 유사성 점점 감소되는 과정.
서열 상사 : 진화 과정에서 뉴클레오티드 중합체의 유사성 점점 증가되는 과정.
세균 : 3개의 기본 계(界)중 하나로서 여겨지는 계통발생적 진정세균 군의 원(元).
Tm : 탐침의 50%가 혼성화된 형에서 비혼성화된 형으로 전환되는 시점에서의 온도.
열 안정성 : 탐침 : 표적 하이브리드의 50%가 단일 가닥 형으로 전환된 시점에서의 온도, 열 안정성에 영향을 미치는 인자는 탐침 특이성에 영향을 미칠 수 있으므로 조절되어야 한다. 탐침 서열이 생물체의 특정형태 만을 검출하는데 유용한가의 여부는, 대개 탐침 : 표적 하이브리드("P : T") 및 탐침 : 비표적 하이브리드("P : NT")간의 열 안정성 차이에 좌우된다. 탐침 고안에 있어서, Tm P : T서 P : NT 값을 제한 차이가 가능한 커야 한다.
탐침서열을 선택하기 위한 신규 방법 이외에 본 발명자들은, 단일형의 표적 미생물에서 얻은 특정 r RNA 서열에 상보적인 DNA 탐침의 참작이 가능하고 또 이 단일 미생물의 검출을 위하여, 그의 공지되고, 가장 밀접하게 관련된 분류학적 또는 계통 발생적 근친들의 존재 하에서 조차 비-교차 결합 분석평가에서의 이 탐침의 성공적인 사용이 가능함을 발견하였다. 바이러스를 제외하고는, 모든 원핵 생물체는 5S r RNA, 16S r RAN 및 17S r RNA로서 공지된 비교적 큰 r RNA 분자를 포함하는 r RAN 분자들을 갖는다. 진핵 생물체는 5.0S, 5.8S, 18S 및 23S r RNA 분자 또는 유사 구조물을 갖는 것으로 공지되어 있다.(때때로 "16S 유사"라는 용어는 18S 및 23S r RNA를 포함하는 리보좀의 작은 서브유닛에서 발견되는 r RNA를 언급하기 위하여 사용된다. 이와 마찬가지로 "23S 유사"라는 용어는 때때로 리보좀의 큰 서브유닛에서 발견되는 r RNA를 언급하기 위하여 사용된다. S r RNA는 23S 유사 r RNA의 5' 말단과 동일하다). 이들 r RNA 분자들은 모든 생물에서 매우 보존되어 있고 따라서 널리연구되고 있는 뉴클레이티드 서열을 갖는다. 이 r RNA 서열의 중요 부분을 결정하는 공지된 방법이 있다. 예를 들면, 길이가 약 20-30 염기인 상보성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5S, 16S, 도는 23S 서브유닛에 특이성을 갖는 정제된 r RNA의 보편적으로 보존된 부위에 혼성화될 수 있고, 효소, 역 전사 효소(reverse transcriptase)로 신장될 수 있다. 화학적 분해 또는 디데옥시뉴클레오티드-말단화 서열 화어떠 반응(dideoxynucleotide-terminated sequencing reaction)을 신장된 생성물의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위하여 사용할 수 있다[Lane, D.J. 등 Proc. Nat'l Acad, Sci. USA 제82호, 제6955-제6959 페이지(1985년)참조].
본 발명에서, 표적 생물체의 r RNA에 고유한 서열을 선별하기 위하여, 표적 미생물에서 얻은 하나 이상의 서열화된 r RNA 의 변이 영역과 근친 세균 종에서 얻은 하나 이상의 r RNA의 변이 영역의 서열을 비교한다. r RNA는 세표 내에서 비교적 풍부하고 안정하며 계통 발생적으로 보존된 패턴을 가지므로 탐침 표적으로 DNA보다 바람직하다.
r RNA의 고도로 보존된 특성에도 불구하고, 본 발명자들은 서열이 다양할 수 있고, 근친 종 간에서도 다양할 수 있는 r RNA 분자 중 많은 영역이 이와 같은 생물체를 구별하는데 사용될 수 있음을 발견하였다. r RNA 분자에서 상이함은 분자 전체에 무작위로 분산되어 있지 않고, 특정 영역에 다소 밀집되어 있다. 또한 보존의 정도도 다양하여 리보좀의 RNA 서브유닛 간에 특이한 고유한 보존 패턴을 형성한다. 이와 같은 다양성 및 분산 정도를 분석하여 진단용 탐침에 대한 표적 위치를 찾을 수 있다. 이와 같은 탐침 선별법은 표적 생물체의 r RNA 에 독특한 하나 이상의 서열을 선별하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명자들은, 문헌에 공개된 r RNA 서열 및 본 발명자들이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정한 서열을 비교 분석하여 변이 영역을 동정하였다. 본 발명자들은 비교 분석용 Sun Microsystems(TM) 컴퓨터를 사용하였다. 이 콤파일러(compiler)는 많은 서열 데이터를 동시에 처리할 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여 사용될 수 있거나 또는 적합한 이와 같은 형의 컴퓨터 및 컴퓨터프로그램은 시판품으로 입수할 수 있다.
일반적으로, 계통 발생적으로 보존된 속의 근친 종을 구별하기 위하여, 단지 약간의(예, 16S, r RNA 분자의 5' 말단에서 얻은 400-500 염기 영역)가 유용하다. 근친 생물체를 분석(제6, 7 및 8도)함으로써 근친 생물체간에 다양한 특이 부분(변이 영역)을 찾아내었다. r RNA분자의 분자의 이와 같은 변이 영역은 탐침 고안용으로 유력하다.
제6, 7 및 8도는 상호 유사성이 감소되는 상이한 두 세균간의 16S 및 23S r RNA에서의 변이를 나타낸다. 이 도면을 정밀 분석하여 이와 같은 근친 세균간의 다소 미묘한 패턴을 찾아내었다. 본 발명자들은 연구한 모든 경우에 있어서, 표적 생물체 및 당면 탐침을 고안하기 위한 동일 시료 중에서 발견되는 계통발생적 근친 간에 충분한 변이가 있음을 발견하였다. 또한 본 발명자들은, 현재까지 연구된 모든 경우에 있어서, 표적 생물체(들) 및 동일 시료에서 발견되는 계통 발생적으로 가장 근친인 생물체 간의 유사성 백분율이 90% 내지 99%임을 발견하였다. 흥미롭게도, 임균 및 수막염균(실시예 21참조)의 r RNA들 사이에는, DNA : DNA 상동성 연구에 의해 이 두 종이 실질적으로 하나이고 동일할 수 있다는 사실에도 불구하고, 탐침을 고안하기에 충분한 변이성이 있다.
또한 이 도면에 의해, 전체의 16S 및 23S r RNA에 이러한 상이성이 분산되어 있음을 알 수 있다. 그럼에도 불구하고, 많은 상이성은 몇 부위에 밀집되어 있다. r RNA의 이와 같은 위치들은 본 발명의 현행 분석 평가 조건을 사용하여 탐침 고안용으로 유력하다. 또한 본 발명자들은 이와 같이 증가된 변이 밀도의 위치가, 일반적으로 16S 및 23S r RNA의 동일 부위에서 상당한 유사성 백분율치를 가지고 존재함을 발견하였다. 이와 같은 방식으로, 본 발명자들은 16S 및 23S r RNA의 특정 영역이 시료 중에서 발견되는 표적 생물체 및 가장 가까운 계통발생적 근친 간에 현저한 변이가 존재할 수 있는 가장 유력한 위치임를 발견하였다. 본 발명자들은 시료 중에서 발견되는 표적 생물체 및 가장 가까운 계통 발생적 근친간의 이와 같은 중요한 변이 영역에서 혼성화되는 종 특이성 탐침을 기재하고, 특허 청구한다.
제9, 10 및 11도는 본 명세서에 기재되고 청구된 탐침의 위치를 나타내는 도면이다. 대체로, 16S 와 23S RNA는 약 6 뉴클레오티드 길이보다 긴 중복서열을 갖지않으므로, 이와 같은 방법에 의해 고안된 탐침은 표적 핵산 상의 하나 또는 몇몇 위치에 대해 특이하다.
각 변이 영역(예를 들면, 최소 10 뉴클레오티드의 길이)에서의 서열 진화는 대부분의 분기에 대하여 비상사적이다. 따라서 본 발명자들은 표적 생물체와 그의 계통발생적 근친 간 상이한 소수의 r RNA 서열에 기초한 탐침을 지신있게 고안할 수 있다. 당면 연구의 목적은, 진화를 통한 상동성 일차, 이차 및 삼차 구조를 유지하는 r RNA 분자상의 생물학적 및, 구조적 제한 및 탐침 간단학에 대한 이와 같은 제한의 응용이다. 생물체 간의 진화적 거리가 클수록 생물체를 구별하기 위해 사용할 수 있는 변이 영역의 수도 많아진다.
일단 변이 영역이 동정되면, 최대 상동 부위 또는 "짝"을 찾기 위하여 서열들을 선열(線列)시킨다. 이때, 서열을 조사하여 잠재적인 탐침 영역을 동정한다. 탐침을 고안하는 두가지 중요한 목적은, 표적 서열(들)에 대한 상동성이 최대화(90%이상의 상동성이 요구됨), 및 비-표적 서열(들)에 대한 상동성의 최소화(비표적 물에 대하여 90% 미만의 상동성이 요구됨)에 있다. 본 발명자들은 목적하는 특징들을 갖는 탐침을 고안하기 위하여 다음과 같이 유용한 지침을 동정하였다.
먼저, 탐침 : 비표적 핵산 하이브리드의 안정성을 최소화하도록 탐침을 위치시켜야 한다. 이것은 비-표적 생물체에 대하여 완전히 상보적인 길이를 최소화하고, 비-표적 서열에 대한 G 와 C 풍부 상동성 영역을 피하고, 가능한 한 많은 불안정한 착오결합(mismatch)에 걸치도록 탐침을 위치시킴으로써(예를 들면, dG : rU 염기쌍은 일부 기타 염기쌍 보다 덜 불안정함) 성취할 수 있다.
두 번째로, 탐침 : 표적 핵산 하이브리드의 안정성을 최대화하여야 한다. 이것은 긴 A 와 T 풍부 서열을 피하고, 하이브리드를 G : C 염기쌍으로 말단화시키고, 적당한 Tm을 갖는 탐침을 고안함으로써 성취할 수 있다. 탐침의 개시 및 종결점은, 길이 및 %G 및 %C가 Tm에 있어서 최종 평가 분석을 행하는 온도보다 약 2-10℃정도 높게 되도록 선택되어야 한다. 여러 가지 평가 분석 조건의 중요성과 효과는 본 명세서에서 후술할 것이다. 세 번째로, 혼성화에 대해 억제적인 강한 구조를 형성하는 것으로 공지된 r RNA영역은 다소 부적합하다. 최종적으로, 광범위한 자기-상보성을 갖는 탐침은 피해야 한다.
경우에 따라서, 목적하는 잡종 혼성화 특성을 갖는 탐침을 생성하는 특성 영역으로부터의 몇가지 서열이 존재할 수 있다. 기타 경우에, 어떤 서열은 단 하나의 염기가 상이한 다른 서열보다 훨씬 유리 할 수 있다.
하기 표는, 근친 핵산 서열 존재 하에서 핵산의 검출을 유용한 본 발명의 한가지 실시 형태에 대해서 특이한 서열을 선택할 수 있는 방법을 나타낸 것이다. 이 실시예에서, 생물체 A-E에 대한 r RNA의 서열을 분석하였고, 숫자로 표시한 그의 서열을 표에 기재된 비와 같이 선열하였다. 서열 1은 생물체 A-E에 대해 공통적임을 알 수 있다. 서열 2-6은 생물체 A, B 및 C에서만 발견되는 반면, 서열 8, 9 및 10은 생물체 A에 특이하다. 그러므로, 서열 8, 9 또는 10에 대해 상보적인 탐침은 생물체 A에 특이적으로 혼성화 될 것이다.
Figure kpo00001
거대분자의 변이 패턴이 공지된 경우, 예를 들면 r RNA에 경우에, 탐침 고안용으로 유력한 특이 영역에 주의를 기울일 수 있다.
그러나, 탐침 서열을 얻기 위하여 항상 핵산 서열 전부를 결정할 필요는 없다. 임의의단일 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 연장시켜 최대로 300-400 염기의 서열을 얻을 수 있다. 표적 생물체 및 표적에 근친인 생물체인 r RNA의 서열을 부분적으로 서열화하기 위하여 단일 프라이머를 사용하는 경우, 상기한 바와 같이 선열시킬 수 있다. 명백하게, 유용한 탐침 서열을 발견할 경우, 기타 프라이머를 사용하여 r RNA 분석을 계속할 필요는 없다. 반면에, 첫 번째 프라이머를 사용한 서열화에서 유용한 탐침 서열을 얻지 못할 경우 또는 더 높은 감수성이 요구되는 경우에는 서열을 더 얻기 위하여 기타 프라이머를 사용할 수 있다.
분자에 대한 변이 패턴이 잘 이해되지 않는 경우에, 탐침 고안에 앞서 보다 많은 서열 데이터가 필요할 수 있다.
따라서, 하기 실시예 1-3에서는 두 개의 16S-유도 프라이머를 사용하였다. 첫 번째 프라이머는 본 명세서에 기재된 기준을 충족시키는 탐침 서열을 생성하지 않았다. 두 번째 프라이머는 상기한 바와 같은 특이성에 대한 하기 특성화 및 시험에 유용한 것으로 밝혀진 탐침 서열을 생성하였다. 실시예 4에서는 탐침 서열을 적소에 두기 전에 6개의 23S 프라이머를 사용하였다.
일단 추정되는 특이 서열을 동정하고, 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 DNA/r RNA 평가 분석 혼성화 반응에서 탐침으로 사용된다. 정의된 올리고뉴클레오티드는, 시아노에틸포스포라미디트 전구체를 사용한 자동 고체상 화학 합성법(automated soilid-phase chemical synthesis)을 포함한, 널리 공지된 다수의 방법 중 하나에 의해 합성할 수 있다. [Barone, A. D. 등 Nucleic Acids Research, 제12호, 제4051-제4060 페이지(1984년) 참조]. 이 방법에서는, 데옥시올리고 뉴클레오티드를 고체상 중합체 지지체 상에서 합성한다.
지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 방출은 60℃에서 수산화암모늄으로 16시간 동안 처리하여 행한다. 용액을 건조시키고, 조 생성물을 물에 용해시키고, 단편의 길이에 따라 일반적으로 10-20% 다양할 수 있는 폴리아크릴아미드겔 상에서 분리시킨다. 자외선 후광에 의해 가시화되는 주 밴드(band)를 면도칼로 겔이서 절단하고, pH가 7.0인 0.1M 암모늄 아세테이트로 실온에서 8-12시간 동안 추출한다. 원심 분리 후, 0.4미크론 필터를 통해 상징액을 여과하고 P-10 칼럼[Pharmacia 사 제품]상에서 탈염시킨다. 물론, 합성 올리고뉴클레오티드 구성을 위한 기타 널리 공지된 방법도 사용할 수 있다.
현행 DNA 합성기에 의해 다량의 합성 DNA를 제조할 수 있다.
합성 후, 새로이 제조된 DNA의 사이즈를 겔 여과에 의해 조사하고, 다양한 사이즈의 분자를 전체적으로 검출한다. 이와 같은 분자의 일부는 합성 공정 도중 합생하는 미성숙 합성 현상을 나타낸다.
합성 후 정제 과정의 일부로서, 일반적으로 합성 DNA를 크기 분획하고, 적당한 길이의 분자만을 유지시켰다. 따라서, 균일한 크기의 합성 DNA 분자 집단을 얻을 수 있다.
그러나, 합성 DNA는 모두 본질적으로 동일한 크기와 염기 서열의 균일한 분자집단으로 구성되고, 제조되는 모든 분자의 혼성화 특성은 동일해야 한다는 것이 일반적인 가정이었다. 실제로, 합성 DNA 분자의 제조물은 불균일하고, 크기는 동일하나, 다소 서로 상이하고 혼성화 특성이 다른 상당수의 분자로 구성된다. 때때로 동일한 서열의 상이한 제조물이 상이한 혼성화 특성을 가질 수 있다.
따라서, 동일한 합성 탐침 서열의 제조물이 상이한 혼성화 특성을 가질 수 있다. 이와 같은 사실 때문에 상이한 제조물에서 형성된 탐침 분자의 특이성이 상이할 수 있다. 목적하는 탐침 특이성을 얻기 위하여 사용되어야 하는 혼성화 조건을 결정하기 위하여, 각 제조물의 혼성화 특성을 조사해야 한다. 예를 들면, 하기 실시예 4에 기재된 합성 탐침은 표14에 기재한 특이성 프로필을 갖는다. 이 데이터는 상기의 혼성화 및 평가분석 조건을 사용하여 얻었다. 상이한 혼성화 특성을 갖는 이와 같은 탐침의 별도의 제조는, 실시예 4에 제시한 조건하에서 평가분석할 경우 정확하게 동일한 특이성 프로필을 가질 수는 없다. 이와 같은 탐침을 제조하여 왔다. 이들 탐침을 목적하는 특이성을 얻기 위하여, 염의 농도 및(또는) 온도를 포함하는 상이한 조건하에서, 혼성화시키고 평가분석할 수 있다. DNA 합성 기술은 다소 미비하므로, 각 팀침 배치에 대하여, 탐침이 사용되는 실제적인 조건을 결정하거나 또는 당장의 요구를 충족시켜야 한다.
특정 올리고뉴클레오티드 서열의 합성 및 정제에 이어서, 최종 생성물의 만족도를 결정하기 위하여 몇가지 방법을 사용할 수 있다.
먼저, 크기를 결정하기 위하여 폴리아크릴아미드겔 전기 영동법을 사용한다. 예를들면32P-ATP와 T4폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 올리고뉴클레오티드에 표지를 붙인다. 표지된 탐침을 에탄올 중에 침전시키고, 원심 분리하고, 건조시킨 펠릿트를 로딩 완충액(loading buffer)(80% 폴리아미드, 20mM NaOH, 1mM EDTA, 0.1% 브로모페놀 블루 및 0.1% 크실렌 시아놀) 중에서 현탁시킨다.
시료를 90℃에서 5분 동안 가열하고 변성 폴리아크릴아미드겔 상에 로딩한다. 전기 영동은 TBE 완충액(pH 8.3인 0.1M 트리스 HCl 0.08M 붕산, 0.002M EDTA)중에서 1,000볼트에서 1-2시간 동안 행한다. 올리고뉴클레오티드를 전기 영동한 후, 겔은 X-선 필름에 노출시킨다. 이어서 올리고뉴클레오티드의 크기를, 동시에 진행시킨 표준 올리고뉴클레오티드의 이동으로부터 계산한다.
또한 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은, 이 서열의 5' 종단에32P-ATP와 T4폴리뉴클레오티드 키나아제로 표지시키고, 표준 화학적 분해 기술[Maxam, A.M. 및 Gilbert, W 의 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 제74호, 제560-제564 페이지 참조]을 사용한 후, 생성물을 폴리아크릴 아미드겔 상에서 분석하여 검지할 수 있다. 바람직하기로는 탐침의 뉴클레오티드 서열은, 그럴 필요까지는 없으나, 이전에 동정된 특이한 r RNA 서열에 완전히 상보적인 것이다.
또한 올리고뉴클레오티드/r RNA 하이브리드의 용해 온도(Tm)를 포함한 용해 프로필을 작성하여야 한다. Tm을 결정하는 한가지 방법은, 50℃에서32P 표지된 올리고뉴클레오티드를 0.1M 인산염 완충액(pH 6.8) 중에서 그 상보적인 표적 핵산과 혼성화시키는 것이다. 혼성화 혼합물은 희석하고, 50℃에서 2cm 히드록시아파티트 컬럼을 통과시킨다. 이 컬럼을 0.1M 인산염 완충액, 0.02% SDS로 세척하여 비혼성화된, 단일-가닥의 탐침을 모두 용츌시킨다. 이어서 컬럼의 온도를 15℃ 감소시키고, 탐침이 모두 단일-가닥으로 될 때까지 5℃증분으로 온도를 증가시킨다. 각 온도에서 비혼성화된 탐침을 용출시키고, 각 분획물에서 분당 계수(cpm)를 측정한다. 히록시아파티트에 결합된 것으로 보이는 cpm수를 칼럼에 첨가된 전체 cpm으로 나눈 수는 표적 핵산에 대한 탐침의 혼성화 백분율과 동일하다.
하이브리드의 열 안정성을 측정하기 위한 별법은 다음과 같다. 하이브리드 핵산의 부분 표본을 0.12M 인산염 완충액, 0.2% SDS,1mM EDTA, 1mM EGTA 또는 적당한 혼성화 완충액 1ml에 희석시킨다. 이용액 1ml를 45℃까지 5분 동안 가열하고 실온에서 수조 중에 방치하여 5분 동안 냉각시킨다. 이 하이브리드 함유 용액 1ml를 히드록시아파티트 컬럼을 통해 평가 분석하고, 하이브리드를 추출하고 비결합 탐침은 세척하여 제거한다. 0.12M 인산염 완충액 이외의 혼성화 용액을 사용할 경우, 결합을 위하여 이어서 혼성화 용액을 0.12M 인산염 완충액 중에 희석할 필요가 있다. 하이브리드 부분 표본을 채취하고, 혼성화 용액 1ml 또는 상기한 0.12M 인산염 완충액 중에 희석시키면서 가열온도를 한번에 5℃씩 상승시켰다. 모든 하이브리드가 해리될 때까지 이 과정을 계속한다. 하이브리드의 절반이 해리 형태로 전환하는 시점의 온도를 Tm으로 본다. 주어진 하이브리드 Tm은 열 안정성이 상이한 염의 농도, 세정제, 및 열변성 도중 상대적 하이브리드의 안정성에 영향을 미치는 기타 용질에 좌우되므로, 혼성화 용액에 따라 다양할 것이다.
본 명세서에 기재한 바와 같은 혼성화 반응의 정도와 특이성은 여러 가지 요인에 의해 영향을 받으므로, 하나 이상의 이 요인들의 조작에 의해 그의 표적에 대해 완전히 상보적이건 아니건 특정 탐침의 정확한 민감도 및 특이성이 결정될 것이다. 예를 들면, G-C 염기쌍은 A-T 염기쌍과 비교하여 볼 때 추가 수소 결합에 의해 열안정성이 더 크므로, 탐침의 염기 조성이 중요할 수 있다. 따라서, 보다 높은 G-C 함량의 상보적인 핵산을 포함하는 혼성화는 고온에서 안정할 것이다.
본 발명자들은 표적 핵산 서열의 길이 및 이에 따른 탐침 서열이 길이가 또한 중요할 수 있음을 발견하였다. 완전히 상보적인 아닌 핵산이 혼성화되는 것이 가능하긴 하나 일반적으로, 완전히 상동성인 염기 서열의 최장 신장에 의해 우선적으로 하이브리드의 안정성이 결정될 것이다. 상이한 길이와 염기 조성의 올리고뉴클레오티드의 탐침을 사용할 수 있는 반면, 본 발명에 바람직한 올리고뉴클레오티드 탐침은 길이가 약 15내지 약 50 염기이고, 표적 핵산에 대하여 적어도 약 75-100%의 상동성을 갖는 것이다. 대부분의 응용을 위하여 표적 핵산에 대해 95-100%의 상동성을 갖는 것이 바람직하다.
또한 탐침 구성에 있어서 이온 강도와 인큐베이션 온도도 고려해야 한다. 혼성화율은 반응 혼합물의 이온 강도가 증가함에 따라 증가하고, 하이브리드의 열 안정성은 이온 강도가 증가함에 따라 증가한다는 사실이 공지되어 있다. 일반적으로, 길이가 약 15-50 염기인 합성 올리고뉴클레오티드 탐침의 최적 혼성화는 주어진 이중 가닥에 대한 용해 온도 보다 대략 5℃ 낮은 온도에서 일어난다. 최적 온도 아래에서 인큐베이션시키면 착오 결합 염기 서열이 혼성화되어 특이성이 감소할 수 있다.
핵산 농도에 대하여, 혼성화율은 반응하는 두 핵산 종의 농도에 비례함이 공지되어 있다. 따라서, 덱스트란 및 덱스트란 술페이트와 같은 화합물의 존재에 의해 핵산 종의 부분적인 농도가 증가되고, 따라서 혼성화율이 증가되는 것으로 여겨진다. 혼성화율을 증가시키는 기타 요인들이, 1984년 7월 5일자 출원된 미합중국 특허 출원 제627,795호에 "Accelerated Nucleic Acid Reassociation Method"라는 제목으로, 1987년 6월 4일자 출원된 그의 부분 계속 출원(번호, 아직 미정임), 및 1986년 1월 7일자 출원된 미합중국 특허 출원 제816,711호에서 "Accelerated Nucleic Acid Reassociation Method"라는 제목으로 기재되어 있고, 이들 모두는 본 명세서에서 참고로 인용한다. 한편, 수소 결합을 파괴하는 화학적 시약, 예를들면 포름아미드, 우레아, DM SO, 및 알코올류는 혼성화의 긴축도를 증가시킨다. 선별된 올리고뉴클레오티드 탐침은 널리 공지된 임의의 몇가지 방법에 의해 표지를 붙일 수 있다. 유용한 표지는 방사성 동위 원소 뿐만 아니라 비-방사성 전달기도 포함한다.
동위원소 표지는3H,35S,32P,125I, 코발트 및14C를 포함한다. 대부분의 동위 원소 표지 방법은 효소사용을 수반하여, 공지된 방법은, 예를 들면 닉 트랜스레이션(nick translation), 말단 표지화, 두 번째 가닥합성(second strand synthesis), 및 역 전사를 포함한다. 방사성-표지된 탐침을 사용할 경우, 혼성화는 자기방사선분석(autoradiography), 신틸레이션 계수(scintillation counting), 또는 감마 계수법(gamma counting)에 의해 검출할 수 있다. 선택된 검출 방법은 혼성화 조건 및 표지에 사용되는 특정 방사성 동위 원소에 좌우될 것이다.
비-동위원소 물질 또한 표지화에 사용할 수 있고, 효소 사용 또는 예를 들면, 비-뉴클레오티드 연결기의 사용과 같은 탐침의 화학적 변형에 의해 변형된 뉴클레오티드를 조입시켜 삽입시킬 수 있다. 비-동위원소 물질은 형광 분자, 화학발광 분자, 효소, 조인자, 효소 기질, 합텐 또는 기타 리간드를 포함한다. 본 발명자들은 아크리디늄 에스테르의 사용을 선호한다.
DNA/rDNA 혼성화 평가 분석 실험의 한 실시 형태에 있어서, 표지된 탐침과 세균의 표적 핵산을 용액중에서 반응시킨다. rDNA는 음파 파괴법에 의해 세균의 세포에서 방출될 수 있다[본 명세서에서 참고로 기재한 Murphy, K.A. 등에 의해 "Method for Releasing RNA and DNA From Cells"라는 제목으로 1986년 3월 20일자로 출원된 미합중국 특허 출원 제841,860호 참조], 세포 파괴를 위한 기타 공지된 방법은 효소 사용, 삼투 쇽, 화학적 처리, 및 유리 구슬을 사용한 와동 처리를 포함한다. r RNA 방출 이후 또는 그와 동시에, 표지된 탐침을 가속제 존재 중에서 첨가하고, 상당한 반응이 이루어지는데 필요한 시간 동안 최적 혼성화 온도에서 인큐베이션 시킬 수 있다. 인큐베이션 후, 히드록시아파티트를 반응 혼합물에 첨가하여 비-혼성화된 탐침 분자로부터 탐침/r RNA 하이브리드를 분리할 수 있다. 히드록시아파티트 펠릿트를 세척하고, 재원심분리한 후, 사용된 표지에 의해 하이브리드를 검출하였다.
청구된 발명을 구체적으로 설명하는 21가지 실시형태를 후술하며 이 방법에 의해 표적 생물체, 또는 생물체 군에서 얻은 특이한 r RNA 서열에 상보적인 합성 탐침 또는 탐침들을 결정하고, 구성하고, 혼성화 평가분석에 사용하였다.
[구체적인 실시형태의 설명]
마이코박테리움속(Mycobacterium)은 항산성, 항알코올성, 호기성, 비-운동성 간균이다. 이 균은 지질함량이 높고 생장이 느리다. 마이코박테리움 아비윰(Mycobacterium avium)과 마이코박테리움 인트라셀룰레어(Mycobacterium intracellulare)는 구별하기 어려우므로 함께 마이코박테리움 아비움-인트라셀룰레어(M.avium-intracellulare)로 언급한다. 최근에, 마이코박테리움 인트라셀룰레어를 포함하는 마이코박테리움 아비움 복합체는 두 번째로 흔히 단리되는 임상적으로 중요한 마이코박테리움으로 증명되었다. [Good, R.C. 등의 J. Infect, Dis, 제146호, 제829-제833페이지(1982년) 참조]. 보다 최근에 증거에 의하면, 이들 생물체는 AIDS(후천성 면역 결핍증) 환자의 통상적인 기회 감염원으로 밝혀졌다([Gill, V. J. 등의 J. Clin, Microbio, 제22호, 제543-제546 페이지(1985년)참조]. AIDS 환자에서 이러한 감염증의 치료는, 이들 생물체가 대부분의 항결핵 약품에 내성이 있으므로 어렵다. 종종 치료에서 5가지 약품을 배합하여 사용한다. 또한 이들 감염증의 심도는 본 발명 이전에는 가능하지 못했던 신속한 진단을 필요로 한다.
결핵균 복합체(Mycobacterium tuberculosis complex)(Mtb)의 원(元)은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리윰 아프리카늄(Mycobacterium africanum), 마이코박테리움 미크로티(Mycobacterium microti)를 포함한다. 처음 세 종류는 인체에 병원성인 반면, 마지막의 것은 동물에 병원성이다. 이 생물체들은 피부에 서서히 육아종을 생성하거나 또는 내부 기관에 잠입할 수 있다. 폐결핵은 순환계, 림프계, 또는 장관에 의하여 기타 신체 부위로 전염될 수 있다. 공중 보건의 개선 및 효과적인 화학요법의 출현에도 불구하고, 마이코박테리움에 의한 질환, 특히 결핵은 아직도 전세계적으로 건강 문제의 주를 이루고 있다.
피검 시료 중의 세균 검출을 위한 종래의 방법은, 존재하는 세균 세포의 수를, 동정 및 계수할 수 있는 측정가능한 콜로니 생장물로 증대시키기 위한 시료의 배양을 포함한다. 필요에 따라서, 또한 배양물을 더 시험하여 항미생물 민감도를 측정할 수도 있다. 현재 마이코박테리움 종을 검출, 단리 및 동정하기 위하여 가장 널리 사용되는 방법은 항산성 간균(AFB) 도말[지일-닐슨(Ziehl-Neelsen)법 또는 형광색소 기술을 사용함], 로벤쉬타인-엔센 배지(Lowenstein-Jensen media) 및 미들부룩 배지(Middlebrook media)를 사용한 배양법, 및 생화학적 시험이다. AFB는 산-알코올에 노출된 후 염료를 보유하기 위해 마이코박테리움의 고지질 함양에 의존한다. AFB 도말 시험이 수행하기에 상대적으로 신속하고 간단한 반면, 마이코박테리아를 항상 검출하지는 못하고, 마이코박테리움 아비움과 비-결핵균종, 마이코박테리움 인트라셀룰레어와 비-결핵균중, 또는 마이코박테리움 결핵-복합 간균과 비-결핵균종을 구별하지 못한다. 감염성 마이코박테리아 종의 정확한 동정을 위하여, 임상의는 3 내지 8주 생장에, 이어서 광범위한 생화학적 시험이 요구될 수 있는 배양 결과에 의존하여야 한다. 기타 시험은 탄소-14 표지된 기질을 사용하여 마이코박테리움에서 얻은 대사 생성물의 검출에 기초하여 진전되어 왔다. 특히 Bactec(TM) 기기는 접종 시간 6 내지 10일 이내에 마이코박테리움의 존재를 검출할 수 있다[상기 Gill, V.J., 의 논문 참조]. 그러나, 이 시험에 의해 마이코박테리움 종를 구별할 수 없다. 종종 이와 같은 측정을 행함으로써 생물체가 민감한 특정 약품을 처방할 수 있는 것이 중요하다. 전통적인 배양법에 있어서, 이와 같은 측정은 2 내지 3주일이 더 필요하고, 박텍법(Bactec method)에 있어서 6 내지 10일이 더 필요하다.
또한, 다음과 같은 세균에 대한 구체적인 실시 형태를 다음의 실시예에 기재한다. 폐렴 마이코플라즈마, 마이코박테리움 속, 레기오넬라, 살모넬라속, 클라미디아 트라코마티스, 칼필로박터, 기괴변형균, 장내구균속, 엔테로박터 클로아캐, 대장균, 슈도모나스속 제I군(Pseudomonas Group I), 세균, 균류 및 임균.
하기 실시예에 나타낸 바와 같이 본 발명은 증가된 정확도, 특이성 및 시험의 간단함 뿐만 아니라 진단을 성취하기 위한 시간의 현저한 감소의 면에서 선행 기술의 각 방법을 능가하는 상당한 잇점을 갖는다. 본 발명에 의해 한정된 진단 및 시험한 날과 동일한 날에서 효과적인 치료가 가능하다.
[실시예 1]
마이코박테리움 아비움에서 r RNA의 존재를 검출하기 위하여, 표지를 붙이고 용액내 혼성화 평가 분석에서 탐침으로 사용되는 고유한 서열과 한정된 길이를 갖는 단일 가닥의 데옥시올리고뉴클레오티드의 제조에 대하여 다음에 하기 기재하였다. 이 고유 서열은 마이코박테리움 아비움의 r RNA에 대해 특이하고, 본 실시예의 혼성화 조건하에서 근친 마이코박테리움 인트라셀룰레어를 포함하는 기타 임의의 세균 종 또는 호흡기 감염원에서 생성된 핵산과 눈에 띄게 교차반응하지 않는다. 또한 이 탐침은 두 종간에 대략 98%의 r RNA 상동성이 있음에도 불구하고 두 종을 구별할 수 있다.
이 실시예에서, 실시예 2 및 3에서와 마찬가지로, 16S r RNA에서 고도로 보존된 영역에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 마이코박테리움 아비움, 결핵균군 마이코박테리움 인트라셀룰레어 및 관련 생물체에 대한 서열을 얻었다. 대장균의 r RNA에서 유래된 이 프라이머의 서열은 5'-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA AT-3'이다.
이 프라이머 5ng을 최종 용적 10㎕의 0.1M KCl과 pH 8.3 인 20mM 트리스-HCL 존재 하에서 서열화할 각 r RNA 1㎍과 혼합시켰다. 이 반응물을 45℃에서 10분동안 가열하고, 이어서 얼음 위에 놓았다.
여기에35dATP 2.5㎕와 역 전사효소 0.5㎕를 첨가하였다. 시료를 각각 디데옥시 A, G, T 또는 C중 하나가 함유된 4개의 관에 분할시켰다.
이들 뉴클레오티드의 농도는 상기 레인 등(Lane et al)의 논문에 기재되어 있다. 이 시료를 40℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 에탄올 중에 침전시키고, 원심 분리한 후, 펠릿트를 동결 건조시켰다. 펠릿트를 포름아미드 염료 10㎕(100% 포름아미드, 0.1% 브로모페놀 블루 및 0.1% 크실렌 시아놀)중에 현탁시키고, 80cm의 8% 폴리아크릴아미드 겔 상에 부하하였다. 이 겔을 2000볼트에서 2-4시간 동안 이동시켰다.
따라서, 마이코박테리움 아비움 및 그의 계통 발생적 근친으로 간주되는 마이코박테리움 인트라셀룰레어 및 결핵균의 16S r RNA에 대한 뉴클레오티드 서열을 레인 등[Lane, D. J. et al., Proc, Nat, Acad. Sci. USA, 82 : 6955(1985년)]의 방법에 의해 결정하였다. 상기한 생물체에 대한 r RNA 서열의 결정 이외에, 또한 임상적으로 중요한 마이코박테리움이 스펙트럼을 분석하였다. 마이코박테리움 포르튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 스크로폴리세움(M. scrofulaceum) 및 거북결핵균(M. chelonae)이 여기에 포함된다. 로도코커스 브론키알리스(Rhodococcus bronchialis), 결막건조증 병원균(Corynebacterium xerosis) 및 노카르디아 아스테로이드(Nocardia asteroides)를 포함하여, 마이코박테리움 근친속 중에서 선택된 원도 또한 서열화 하였다. 최대 뉴클레오티드 상동성을 위하여, 상기 생물체에서 얻은 부분적인 r RNA 서열을 시판품으로 입수 할 수 있는 소프트웨어[미합중국 94040-2216 캘리포니아주 마운틴 뷰 E1 카미노 릴 웨스트 1975(1975 E1 Camino Real West, Mountain View, California 94040-2216)소재, 인텔리제네틱스 인크, (Intelligenetics, Inc.) 제품임](IFIND 프로그램)을 사용하여 선열시켰다. 이 서열에서, 미이코박테리움 아비움에 유일한 서열 영역을 결정하였다. 표적 핵산 서열에 완전히 상보적이고, 그의 공지된 계통발생적 근친에서 선열된 r RNA와 10% 또는 그 이상 착오결합 탐침을 선별하였다. 길이가 38 염기인 서열을 선택하였다. 마이코박테리움 아비움 서열에 대하여 착오결합된 염기의 수는 다음과 같다. 결핵균(8), 마이코박테리움 인트라셀룰레어(5), 마이코박테리움, 스크로풀라세움(6), 거북결핵균(Mycobacterium chelonae)(12), 및 마이코박테리움 포르튜이튬(10).
하기 c DNA 서열의 특성을 상기 10-11페이지에 기재된 바와 같이, Tm, 및 서열 분석에 의해 분석하고, 마이코박테리움 아비움의 r RNA에 대해 특이한 것으로 결정하였다.
ACCGCAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG.
이 서열은 마이코박테리움 아비움의 16S r RNA에서 발견되는 유일한 절편에 대하여 상보적이다. 탐침의 사이즈는 38 염기이었다. 탐침의 Tm은 74℃이고, 상기 맥삼과 길버트(1980년)의 서열 분석법에 의하여 이 탐침이 정확하게 합성된 것임을 확인하였다. 이 탐침은 대장균의 16S r RNA의 염기 185-225에 대응하는 영역에서 마이코박테리움 아비움의 r RNA에 혼성화될 수 있다.
마이코박테리움 아비움에 대한 이 서열의 반응성을 증명하기 위하여, 이 서열을 하기 조건하에서 혼성화 반응의 탐침으로서 시험하였다.32P-말단 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 마이코박테리움 아비움으로부터 정제된 r RNA 1㎍(7×10-3몰)과 혼합하고, 65℃에서 0.12M PB 혼성화 완충액(동량의 Na2HPO4와 NaH2PO4), 1mM EDTA와 0.02% SDS(소듐 도데실 슬페이트)중에서 최종용적 50㎕로 60분 동안 반응시켰다. 별도의 튜브에서 탐침을 표적이 존재 및 비존재하는 혼성화 완충 용액과 혼합하였다. 상기한 제3페이지의 특허 출원들에 기재된 바와 같이 히드록시아파티트상에서 분리한 후, 하이브리드를 신레에이션 계수법에 의해 정량하였다. 이들 결과를 표 1에 기재하였고, 이 탐침은 상동 표적에 대해 반응성이 높고 히드록시아파티트에 대한 비-특이성 결합이 매우 낮음을 알 수 있었다.
[표 1]
상동성 표적 rRNA에 대한 마이코박테리움 아비움 탐침의 혼성화
Figure kpo00002
Figure kpo00003
마이코박테리움 아비움에 대한 탐침의 특이성은32P 표지된 탐침을 머피 등의 미합중국 특허 출원 제841, 860호에 기재된 음파파괴 기술에 의해 기타 20종의 마이코박테리아의 세포에서 방출된 r RNA와 혼합시켜 시험하였다. 1×108개의 세포를 5% SDS 0.1ml 중에 현탁시키고, 50=60℃에서 10분 동안 음파 처리하였다. 여기에 혼성화 완충액(45% 소듐 디아소부틸 술포숙시네이트, pH 6.8인 40mM 인산염 완충액 및 1mM EDTA) 1ml를 첨가한 후, 이 혼합물을 72℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 혼합물에 히드록시아파티트 용액(pH가 6.8인 0.14M 인산나트륨 완충 용액, 0.02% SDS 및 용액 50ml당 히드록시아파티트 1.0g)4.0ml를 첨가하고 72℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 시료를 원심분리하고 상징액을 제거하였다. 세척액(pH가 6.8인 0.14M 인산나트륨) 4.0ml를 첨가하고 시료를 와동시키고, 원심분리한 후, 상징액을 제거하였다. 히드록시아파티트에 결합된 방사능을 신틸레이션 계수법에 의해 측정하였다. 결과를 표 2에 기재하였고, 이 탐침은 마이코박테리움 아비움에 대해 특이성을 가지며 마이코박테리움 인트라셀룰레어를 포함하는 기타 어떤 마이코박테리아 종과도 반응하지 않음을 알 수 있었다.
[표 2]
마이코박테리아의 종에 대한 마이코박테리움 아비움 탐침의 혼성화
Figure kpo00004
표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 탐침은 또한 상기한 방법에 의해 시험한 호흡기 병원균에서 얻은 어떠한 r RNA와도 반응하지 않았다. 또한 이 탐침은 이 방법으로 시험한 기타 임의의 근친 또는 계통발생적으로 더 분화된 세균 종과도 반응하지 않았다(표 4).
[표 3]
호흡기 병원균에 대한 마이코박테리움 아비움 탐침의 혼성화
Figure kpo00005
[표 4]
세균 종의 계통발생적 교차부에 대한 마이코박테리움 아비움 탐침의 혼성화
Figure kpo00006
[실시예 2]
실시예 1에 기재된 선열 후, 상기한 길이, Tm 및 서열 분석 기준에 의해 하기 서열을 특성화하고 마이코박테리움 인트라셀루레어에 대해 특이성을 결정하였다. :
ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG
이 서열은 마이코박테리움 인트라셀룰레어의 16S r RNA에서 발견되는 유일한 절편에 상보적이었다. 이 탐침의 크기는 38 염기이었다. 이 탐침의 Tm은 75℃이고, 서열 분석에 의해 이 탐침은 정확하게 합성 되었음을 알 수 있었다. 이 탐침은 16S r RNA의 염기 185-225에 대응하는 영역에서 마이코박테리움 인트라셀룰레어의 RNA에 혼성화되었다.
마이코박테리움 인트라셀룰레어에 대한 이 서열의 반응성을 검증하기 위하여, 탐침을 다음과 같은 조건하의 혼성화 반응으로 시험하였다.32P-말단 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 마이코박테리움 인트라셀룰 레어에서 정제한 r RNA 1㎍(7×10-3moles)과 혼합하고, 65℃에서 0.12 M PB(동량의 Na2HPO4및 NaH2PO4), 1mM EDTA 및 0.2% SDS(소듐 도데실-술페이트)중에서 최종 용적 50㎕로 60분 동안 반응시켰다. 별도의 튜브들에서 탐침을 표적 마이코박테리움 인트라셀룰레어 r RNA 존재 및 부재 혼성화 완충액과 혼합시켰다. 상기한 바와 같이 히드록시아파티트 상에서 분리한 후, 신틸레이션 계수법으로 하이브리드를 정량하였다. 결과를 표 5에 기재하였다.
[표 5]
상동성의 표적 rRNA에 대한 마이코박테리움 인트라셀룰레어 탐침의 혼성화
Figure kpo00007
Figure kpo00008
이들 데이터에 의해 탐침은 그의 상동성 표적에 대해 반응성이 높고, 히드록시아파티트에 대한 비-특이적 결합이 매우 낮음을 알 수 있다.
마이코박테리움 인트라셀룰레어 탐침의 특이성은,32P 표지된 탐침을 29개의 기타 마이코박테리아 종에서 머피 등의 미합중국 특허 제841,860호에 기재된 음파 파괴 기술에 의해 세포에서 분리된 r RNA와 혼합시켜 시험하였다. 모든 혼성화 평가 분석은 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 표 6에 의해 이 탐침은 마이코박테리움 인트라셀룰레어에 의해 특이적이고, 마이코박테리움 아비움을 포함한 기타 임의의 마이코박테리아 종과는 반응하지 않음을 알 수 있었다. 이 결과는 마이코박테리움 아비움에 대한 98%의 r RNA 상동성, 마이코박테리움 칸사시(M. Kansasii)에 대한 98%상동성, 마이코박테리움 이사아티큠(M. asiaticum)에 대한 98%의 상동성 결핵균에 대한 97%의 상동성에 비추어 특징적이다.
[표 6]
마이코박테리아의 종에 대한 마이코박테리움 인트라세룰레어 탐침의 혼성화
Figure kpo00009
표 7에 기재된 바와 같이, 이 탐침은 혼성화 평가 분석에서 조사한 임의의 호흡기 병원균에서 얻은 r RNA와 반응하지 않았다. 또, 이 탐침은 시험한 기타 어떠한 근친 또는 계통 발생적으로 더 분화된 세균 종과도 반응하지 않았다(표 8).
[표 7]
호흡기 병원균에 대한 마이코박테리움 인트라셀룰레어 탐침의 혼성화
Figure kpo00010
[표 8]
세균 종의 계통발생적 교차부에 대한 마이코박테리움 인트라셀룰레어 탐침의 혼성화
Figure kpo00011
[실시예 3]
실시예 1에 기재된 바와 같이 서열한 후, 상기한 세가지 기준, 즉 크기, 서열 및 Tm에 의해 하기 서열을 특성화하고, 생물체(예, 결핵균, 마이코박테리움 아프리카늄, 마이코박테리움 보비스, 및 마이코박테리움 미크로티)이 결핵균군에 대해 특이적인 것으로 결정하였다.
Figure kpo00012
이 서열은 결핵균군 세균의 16S r RNA에서 발견되는 고유한 절편에 대해 상보적이다. 탐침의 크기는 35염기이었다. 탐침의 Tm은 72℃이고, 서열 분석에 의해 이 탐침은 정확하게 합성되었음을 알 수 있었다. 이 탐침은 대장균의 16S r RNA에서 185-225 염기에 대응하는 영역에 혼성화될 수 있었다. 결핵균군에 대한 이 서열의 반응성을 검증하기 위하여 이 탐침을 다음과 같은 조건하에서 혼성화 반응으로 시험하였다.32P-말단 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 결핵균에서 정제된 r RNA 1㎍(7×10-3몰)과 혼합하고, 65℃에서 0.12M PB 혼성화 완충액(동량의 Na2HPO4, 및 NaH2PO4), 1mM EDTA 및 0.2SDS(소듐 도데실 슬페이트)중에서 최종 용적 50㎕로 60분 동안 반응시켰다. 별도의 튜브들에서 탐침을 결핵균에서 얻은 표적 r RNA가 존재 및 부재하는 혼성화 완충액과 혼합하였다. 상기 기재된 바와 같이 히드록시아파티트 상에서 분리한 후, 하이브리드를 신틸 레이션 계수법에 의해 정량하였다. 결과를 표 9에 기재하였다.
[표 9]
상동성 표적 rRNA에 대한 결핵균군 23S rRNA DNA 탐침의 혼성화
Figure kpo00013
Figure kpo00014
이 데이터에 의해, 탐침은 상동성 표적에 대한 반응성이 높고 히드록시아파티트에 대한 비-특이성 결합은 매우 낮음을 알 수 있었다.
결핵균군에 대한 특이성은32P 표지된 탐침을, 머피 등의 미합중국 특허 출원 제841,860호에 기재된 음파파괴 기술에 의해 4종의 결핵균군 복합 간균 및 기타 25종의 마이코박테리아 종의 세포에서 방출된 r RNA와 혼합시켜 시험하였다. 모든 혼성화 평가분석은 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 표 10에 의해 이 탐침은 결핵균군 내의 생물체에 대해 특이적이고 기타 임의의 마이코박테리아 종과 반응하지 않음을 알 수 있었다.
[표 10]
마이코박테리아의 종에 대한 결핵균군 16S rRNA DNA 탐침의 혼성화
Figure kpo00015
표 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 탐침은 혼성화 평가 분석에 시험된 임의의 호흡기 병원균들의 r RNA와 반응하지 않았다. 또, 이 탐침은 시험한 기타 임의의 근친 또는 계통 발생적으로 더 분화된 세균 종과도 반응하지 않았다(표 12).
[표 11]
호흡기 병원균에 대한 결핵균군 16S rRNA 탐침의 혼성화
Figure kpo00016
[표 12]
세균 종의 계통 발생적 교차부에서 대한 결핵균군의 16S rRNA DNA 탐침의 혼성화
Figure kpo00017
실시예 3의 탐침의 두가지 유도체(하기 2,3)를 제조하여 시험하였다.
Figure kpo00018
세가지 탐침은 모두 유사한 Tm(각각 72℃, 73.5℃ 및 72.3℃) 및 유사한 혼성화 특성을 갖는다.
결핵균군 생물체에 대한 혼성화율은 68-75% 이었고, 히드록시아파티트에 대한 비-특이성 혼성화율은 2% 미만이었다. 이들 유도체에 대한 혼성화 평가 분석의 시험 결과는 다음과 같았다.
[표 13]
마이코박테리아 종에 대한 실시예 3의 탐침 및 그의 2개의 유도체의 혼성화
Figure kpo00019
[실시예 4]
결핵균군의 23S r RNA에 대해 특이적인 탐침을 23S r RNA의 고도로 보존된 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 얻었다. 대장균의 r RNA에서 유도한 이 프라이머의 서열은 5'-AGG AAC CCT TGG GCT TTC GG-3' 이었다. 이 프라이머 5ng을 결핵균 및 기타 근친 마이코박테리움에서 얻은 r RNA 1㎍과 혼합하고, 이어서 실시예 1, 2 및 3에 기재된 바와 동일한 방법을 행하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 선열한 후, 다음의 서열이 생물체(예, 결핵균, 마이코박테리움 아프리카늄, 마이코박테리움 보비스, 및 마이코박테리움 미크로티)의 결핵균군 특이적인 것으로 결정하였다.
Figure kpo00020
이 서열은 결핵균군 세균의 23S r RNA에서 발견되는 고유한 절편에 상보적이었다. 이 올리고뉴클레오티드 탐침의 특성을 상술한 바와같이 길이, Tm 및 서열 분석 기준에 의해 분석하였다. 탐침의 길이는 31 염기이었다. 탐침의 Tm은 72.5℃이었고, 서열 분석에 의해 이 탐침은 정확하게 합성되었음을 알 수 있었다. 탐침의 대장균의 23S r RNA에서 1155-1190 염기에 대응하는 영역에 혼성화할 수 있다. Mtb 복합체에 대한 이 서열의 반응성을 입증하기 위하여 이 탐침을 다음과 같은 조건 하의 잡종 형성 반응에 의해 조사하였다.32P-말단-표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 결핵균에서 정제한 r RNA 1㎍(×10-13몰)과 혼합하고, 65℃에서 0.12M PB 혼성화 완충액(동량의 Na2HPO4, 및 NaH2PO4), 1mM EDTA 및 0.2 SDS(소듐 도데실 술페이트)중에서 최종 용적 50㎕로 60분 동안 반응시켰다. 별도의 튜브들에서 관에서 탐침을 결핵균에서 얻은 표적 r RNA 존재 및 부재 혼성화 완충액과 혼합시켰다. 상기한 바와 같이 히드록시아파티트 상에서 분리한 후, 하이브리드를 신틸레이션 계수법에 의해 정량하였다. 결과를 표 14에 기재하였다.
[표 14]
상동성 표적 rRNA에 대한 결합균군 23S rRNA DNA 탐치의 혼성화
Figure kpo00021
상기 데이터에 의해, 이 탐침은 상동성 표적에 대한 반응성이 높고, 히드록시아파티트에 대한 비-특이성 결합은 매우 낮음을 알 수 있었다.
결핵균군에 대한 탐침의 특이성은32P로 표지된 탐침을, 머피 등의 미합중국 특허 제841,860호에 기재된 음파 파괴 기술에 의해 4개의 결핵균군 간균의 세포 및 기타 25종의 마이코박테리아 종의 세포에서 방출된 r RNA와 혼합시켜 시험하였다. 모든 혼성화 평가 분석은 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 표 14로부터 이 탐침은 결핵균군에 함되는 생물체에 대해 특이적이고 기타 임의의 마이코박테리아 종과 반응하지 않음을 알 수 있다.
[표 15]
마이코박테리아 종에 대한 결합균군의 23S rRNA DNA 탐침의 혼성화
Figure kpo00022
[실시예 5]
실시예 5-7에서는 23S r RNA에 대해 상보적인 2개의 프라이머를 사용하여 결핵균군 탐침을 3종 더 동정하였다. 첫 번째 서열은 다음과 같다.
Figure kpo00023
실시예 5의 서열은 서열 5'-GGC CAT TAG TAC ACT CC-3'을 갖는 23S 프아이머를 사용하여 얻었다. 이 서열을 특성화하였으며 결핵균, 마이코박테리움 아프리타늄 및 마이코박테리움 보비스를 포함한 생물체의 결핵균군에 대해 특이적인 것으로 입증하였다. 23S r RNA에서 얻은 이 서열은 길이가 31 염기이고, Tm이 72℃이었다. 이 탐침은 대장균의 23S r RNA의 540-575 염기에 대응하는 영역에서 상기한 생물체의 RNA에 대해 혼성화할 수 있다. 결핵균군에 대한 이 탐침의 반응성 및 특이성을 검증하기 위하여, 이것을 다음과 같은 조건 하의 혼성화 반응의 탐침으로서 조사하였다.32P-말단 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을, 머피 등의 미합중국 특허 출원 제841,860호에 기재된 음파 파괴 기술에 의해 30종의 마이코박테리아 세포에서 방출된 r RNA와 혼합시켰다. 3×107세포를 5% SDS 0.1ml 중에 현탁시키고 50-60℃에서 15분 동안 음파 처리하였다. 여기에 혼성화 형성용 완충액(45% 디이소부틸 술포숙시네이트, pH 6.8인 40mM 인산염 완충액, 1mM EDTA, 1mM EGTA) 1ml를 첨가하고, 혼합물을 72℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 2%(w/v) 히드록시아파티드 4ml, pH 6.8인 0.12M 인산나트륨 완충액, 0.02% SDS, 0.02% 소듐 아지드를 첨가하고, 72℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이 시료를 원심 분리하고 상징액을 제거하였다. 세척액(pH 6.8인 0.12M 인산나트륨 완충액, 0.02% SDS, 0.02% 소듐 아지드) 4ml를 첨가하고, 시료를 와동시키고, 원심분리시킨 후 상징액을 제거하였다. 히드록시아파티트에 결합된 방사능은 신탈레이션 계수법에 의해 측정하였다. 결과를 표 16에 기재하였고, 이 탐침은 생물체의 결핵균군 대해 특이성임을 알 수 있다.
[표 16]
마이코박테리아 종에 대한 실시예 5의 결핵균군 탐침의 혼성화
Figure kpo00024
표 16으로부터, 또한 이탐침은 상기한 방법에 의해 시험한 임의의 근친 생물체로부터의 RNA와 교차 반응하지 않음을 알 수 있었다.
[표 17]
계통발생적 근친 생물체에 대한 실시예 5의 결핵균군 탐침의 혼성화
Figure kpo00025
[실시예 6]
두 번째 결핵균군의 탐침을 서열 5' CCT GAT TGC CGT CCA GGT TGA GGG AAC CTT TGG G-3'를 갖는 23S 프라이머를 사용하여 얻었다.
탐침의 서열은 다음과 같다.
Figure kpo00026
23S r RNA에서 얻은 이 서열의 길이는 38 염기이고, Tm이 75℃이었다. 이 탐침은 대장균의 23S r RNA중 2195-2235 염기에 대응하는 영역에 혼성화되었다.
실시예 5의 복합 탐침과 마찬가지로 이 서열을 특성화하여 결핵균, 마이코박테리움 아프리카늄 및 마이코박테리움 보비스를 포함하는 세균등의 결핵균군에 대해 특이적인 것으로 결정하였다.
결핵균에 대한 실시예 6의 탐침의 반응성과 특이성을 검증하기 위하여, 이 탐침을 실시예 5에서 탐침에 대해 기재한 조건을 사용하여 혼성화 반응이 탐침으로서 시험하였다. 결과를 표 18에 기재하였고, 이 탐침은 인체에 비병원성이고 드물게 단리되는 내열성 마이코박테리움을 제외한 세균들이 결핵균군에 대해 특이적임을 알 수 있었다.
[표 18]
마이코박테리아의 종에 대한 실시예 6의 결핵균군 탐침의 혼성화
Figure kpo00027
또한 표 19로부터 이 탐침은 상기한 방법에 의해 시험한 임의의 계통발생적 근친에서 얻은 RNA와 교차 결합하지 않음을 알 수 있었다.
[표 19]
계통발생적 근친 생물체에 대한 실시예 6의 결핵균군 탐침의 혼성화
Figure kpo00028
[실시예 7]
다음의 추가의 결핵균군 탐침을 또한 실시예 6에 기재된 바와 동일한 서열, 즉 5' CCT GAT TGC CGT CCA GGT TGA GGG AAC CTT TGG G-3'을 갖는 23S 프라이머를 사용하여 동정하였다.
Figure kpo00029
23S r RNA에서 얻은 이 서열은 길이가 31염기이고, Tm이 71℃이었다. 이 서열을 대장균의 23S r RNA에서 2195-2235 염기에 대응하는 영역과 혼성화시켰다. 본 명세서의 실시예 5와 6에서 결핵균군 탐침의 경우와 마찬가지로, 이 서열을 특성화하여 결핵균, 마이코박테리움 아프리카늄 및 마이코박테리움 보비스를 포함하는 생물체들의 결핵균군에 대하여 특이적임을 알 수 있었다.
결핵균군에 대한 탐침의 반응성과 특이성을 검증하기 위하여, 이 탐침을 실시예 5에서 탐침에 대해 기재한 조건 하에 혼성화 반응의 탐침으로서 조사하였다. 표 20으로부터 이 탐침은 생물체들의 결핵균군 대해 특이적임을 알 수 있다.
[표 20]
마이코박테리아의 종에 대한 실시예 7의 결핵균군 탐침의 혼성화
Figure kpo00030
또한 표 21로부터 이 탐침은 상기한 방법에 의해 시험한 임의의 근친 생물체에서 얻은 RNA와 교차 반응하지 않음을 알 수 있다.
[표 21]
계통발생적 근친 생물체에 대한 실시예 7의 결핵균군 탐침의 혼성화
Figure kpo00031
명백히, 중복탐침은 동일한 특이성을 가질 수도 있다. 예를들면, 다음과 같은 실시예 6과 7의 탐침을 버교하였다.
실시예 6 CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC
실시예 7 AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC
목적하는 혼성화 특성을 갖는 탐침을 형성하는 특정 영역에서 수개의 서열이 존재할 수 있다. 다른 경우에 있어서, 어떤 탐침 서열은 단 하나의 염기에 의해 다른 탐침보다 월등하게 뛰어날 수 있다. 일반적으로, 표적과 비표적 생물체 간의 서열 차이(착오결합율)가 클수록, 구체적인 응용를 위한 탐침의 유용성에 영향을 주지않고 탐침을 변형시키는 것이 더 용이할 수 있다. 이 현상은 또한 실시예 3의 유도체 탐침에 의해 검증되었다.
실시예 7에서, 실시예 6의 탐침의 5' 말단에 5개의 염기를 첨가하고, 3' 말단에서 12개의 염기를 제거하였다. 이 두 탐침은 본절적으로 동일한 혼성화 특성을 나타내었다.
[실시예 8]
마이코박테리움속은 특히 노카르디아속, 코리네박테리움 속 및 로도코커스와 구별하기 어렵다. 이들 속은 공통적인 항원, 침강소 및 G와 C 함량을 갖는다. 또한 이 세균들은 사기한 마이코박테리움 생물체에 대해 92-94%의 r RNA 상동성을 갖는다는 사실에도 불구하고, 본 발명자들은 관련 속에 대한 교차 반응 없이 마이코박테리움 속의 모든 원을 검출하는 탐침들을 고안하였다.
앞서 기재한 마이코박테리움 종의 탐침 이외에, 마이코박테리움 속의 원에 대해 특이한 4가지 탐침을 16S r RNA에 대한 상보적인 1개의 프라이머와 23S r RNA에 대해 상보적인 1개의 프라이머를 사용하여 동정하였다. 서열 5'-TTA CTA GCG ATT CCG ACT TCA-3'을 갖는 16S 프라이머를 사용하여 제1서열을 얻었다. 서열 5'-GTG TCG GTT TTG GGT ACG-3'을 갖는 23S 프라이머를 사용하여 제2, 3 및 4 서열을 얻었다. 서열 1은 대장균의 16S r RNA에서 염기 1025-1060에 대응하는 영역에서 마이코박테리움속의 RNA에 혼성화할 수 있다. 제2-제4 서열은 대장균의 23S r RNA에서 본 출원의 번호 체계(도면 제2도 참조)로 1440-1475, 1515-1555, 1570-1610 의 염기에 대응하는 영역에서 혼성화되었다.
다음과 같은 서열을 특성화하여 마이코박테리움 속에 대하여 특이성임을 알 수 있었다.
Figure kpo00032
16S r RNA에서 얻은 제1서열은 길이가 30염기이고, Tm이 73℃이었다. 23S r RNA에서 얻은 제2서열은, 염기의 길이가 33이고 Tm이 75℃이었다. 23S r RNA에서 얻은 제3서열은 길이가 염기 35이고, Tm이 76℃이었다. 23S r RNA에서 얻은 제4서열은 길이가 33 염기이고, Tm이 73℃이었다.
마이코박테리움 속의 원에 대한 탐침 1의 반응성과 특이성을 검증하기 위하여, 이 탐침 1을 하기 조건 하에서 혼성화 반응의 탐침으로서 시험하였다.124I로 표지한 올리고뉴클레오티트 탐침을 머피 등의 미합중국 특허 출원 제84,860호에 기재된 음파 파괴 기술에 의해 30종의 마이코박테리아의 세포에서 방출된 r RNA와 혼합하였다. 3×107세포를 5% SDS 1ml 중에 현탁시키고, 50-60℃에서 15분 동안 음파 처리하였다. 여기에 혼성화 완충액(45% 디이소부틸 술포숙시네이트, pH 6.8인 40mM인산나트륨, 1mM EDTA, 1mM EGTA) 1ml를 첨가한 후, 이 혼합물을 72℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 분류용 용액(양이온 자기 중심체 2.5g/l., pH 6.8 인 0.17M 인산나트륨 완충액, 7.5% 트리톤 X-100(TM), 0.02% 소듐 아지드를 함유함) 2ml를 첨가하고, 72℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 자기 입자에 결합된 RNA : 탐침 하이브리드를 모으고, 상징액을 제거하였다. 세척액(pH 6.8인 0.12M 인산나트륨 완충액, 14% 디이소부틸 술포숙시네이트, 5% 트리톤 X-100, 0.02% 소듐 아지드) 1ml를 첨가하고, 입자를 모으고, 상징액을 제거하였다. 이 단계를 2회 반복하였다. 자기 입자에 결합된 방사능을 감마 계수기로 결정하였다. 결과를 표 22에 기재하였고, 이 탐침은 마이코박테리움 속의 생물체와 혼성화하며 탐침 조합물은 생물체 속의 모든 원을 검출함을 알 수 있었다. 표 23으로부터 의해 이 탐침은 기타 근친 세균과 반응하지 않음을 알 수 있다.
[표 22]
마이코박테리아의 종에 대한 마이코박테리움 탐침 1-4의 혼성화
Figure kpo00033
[표 23]
계통발생적 근친 생물체에 대한 마이코박테리움 탐침 1-4의 혼성화
Figure kpo00034
[실시예 9]
마이코플라즈마(mycoplasmas)는 세포벽이 없는 작은 호기성 세균이다. 마이코플라즈마 뉴모니애는 년간 8백만-1500백만의 감염자를 유발하는 것으로 추정된다. 이 감염증의 심도는 무증후성이거나 또는 약한 것에서부터 심각한 기관지염 및 폐렴 정도이다. 이 생물체는 일반 대중에 있어서 약 10% 폐렴 및 대학생 및 군인과 같이 지속적이고 밀접하게 접촉하는 집단의 일원에 있어서 10-50%의 폐렴을 유발시키는 것으로 믿어진다.
현재까지의 진단은 배양물 중의 생물체의 단리 또는 항체 역가(力價)에 있어서 증가의 검증을 필요로 하였다. 생물체의 배양은 세균 생장 억제제를 함유하는 한천 또는 이중상 배지에 기도 피검물의 접종을 수반한다. 3-4 및 7-10일의 생장을 조사하여 임의의 마이코플라즈마의 존재 또는 부재를 입증하였다. 이어서, 혈액흡착성(마이코플라즈마 뉴모니애가 양 또는 기니아 픽의 적혈구에 부착할 수 있는 능력), 용혈(마이코플라즈마 뉴모니애가 혈액 한천 중에서 양 또는 기나아 픽의 적열구를베타 용혈시킬 수 있는 능력), 특이적 항체에 의한 생장 억제, 또는 특이적 항체를 사용한 면역형광(immunofluorescence)에 의해 마이코플라즈마 뉴모니애를 동정하여야 한다. 본 발명은 시험의 간편함 및 진단을 수행하기 위해 필요한 시간의 절약 때문에 선행 기술의 각 방법보다 월등한 있점을 갖는다.
마이코플라즈마 뉴모니애의 5S r RNA에 대해 특이적인 탐침을 공지된 r RNA 서열과 비교하여 얻었다. 선열된 특정 서열들은 마이코플라즈마 뉴모니애, 마이코박태리움 갈리셉티큠(M. allisepticum) 및 우레아 플라즈마 우레알리티큠(Ureaplasma Urealyticum)[Rogers, M. J. 등의 Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 제82호, 제1160-제1164페이저러가지 1985년 참조], 마이코박테리움 카프리콜륨(M. capricolum)[Hori, H. 등의 Nucl. Acids Res. 제9호 제5407-제5410페이지, 1981년 참조] 및 스피로플라즈마 종(Spiroplasmasp.)[walker, R.T. 등의 Nucl. Acids Res. 제10호, 제6363-제6367페이지, 1982년 참조]에서 얻은 것이었다. 선열은 18페이지에서 기재한 바와 같이 행하였다. 5S r RNA는 상기 로저 등의 방법으로 분리 및 서열화할 수 있거나, 또는 5S r RNA에서 보존 영역에 상보적인 프라이머를 제조할 수 있고, 실시예 1-4에 기재된 바와 같이 서열화할 수 있다. 5S r RNA의 보존 영역은 폭스, 쥐. 이(Fox, G. E) 및 우즈. 씨, 아르.(Woese, C.R.)의 Nature 256 : 505-507, (1975)년에 기재되어 있다. 하기 서열을 마이코플라즈마 뉴모니애에 대해 특이적인 것으로 결정하였다.
Figure kpo00035
이 서열은 대장균의 5S r RNA의 염기 65-108에 대응하는 영역에서 마이코플라즈마 뉴모니애의 5S r RNA에서 발견되는 유일한 절편에 대해 상보적이고, 마이코플라즈마 갈리셉티콥, 스피로플라즈마미리움 및 우레아플라즈마 우레알리티큠에서 얻은 5S r RNA의 서열과 비교하여 선별하였다. 상기한 바와 같이 올리고뉴클레오티드 탐침을 특성화하였다. 탐침의 길이는 42 염기이었다. 탐침의 Tm은 1.75℃이었다.
마이코플라즈마 뉴모니애에 대한 이 서열의 반응을 검증하기 위하여, 이 탐침을 다음과 같은 조건하의 혼성화 반응으로 시험하였다.32P 말단 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 마이코플라즈마 뉴모니애에서 정제한 r RNA 1㎍(7×10-3몰)과 혼합시키고, 65℃에서 0.12M PB(동량의 Na2HPO4와 NaH2PO4), 1mM EDTA 및 0.2% SDS(소듐 도데실 술페이트)중에서 최종 용적 50㎕로 60분 동안 반응시켰다. 별개의 튜브들에서 이 탐침을 표적 마이코플라즈마 뉴모니애 r RNA존재 및 부재 혼성화 완충액과 혼합시켰다. 상기한 바와 같이 히드록시아파티트상에서 분리한 후, 하이브리드를 신틸레이션 계수법에 의해 정량하였다. 이 결과를 표 24에 기재하였다.
[표 24]
상동성 표적 rRNA에 대한 마이코플라즈마 뉴모니애 5S rRNA DNA 탐침의 혼성화
Figure kpo00036
Figure kpo00037
이 데이터로부터, 탐침은 그의 상동성 표적에 대한 반응성이 높고 히드록시아파티트에 대한 비-특이 결합이 매우 낮음을 알 수 있다.
마이코플라즈마 뉴모니애 5S 탐침의 특이성을,32P로 표지된 탐침을 기타 마이코플라즈마종에서 얻은 세포에서 방출된 r RNA와 혼합시켜 시험하였다. 모든 혼성화의 평가 분석은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 행하였다. 표 25로부터, 이 탐침은 마이크플라즈마 뉴모니애에 대해 특이성을 가지며, 기타 임의의 마이코플라즈마 종과는 반응하지 않음을 알 수 있다.
[표 25]
기타 마이코플라즈마 종에 대한 마이코플라즈마 뉴모니애 탐침의 혼성화
Figure kpo00038
표 26에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 탐침은 기타 임의의 근친 세균종 또는 계통발생적으로 다양한 세균과 반응하지 않음을 알 수 있다.
[표 26]
세균의 계통발생적 교찰부에 대한 마이코플라즈마 뉴모니애 탐침의 혼성화
Figure kpo00039
16S r RNA의 보존 영역에 상보적인 4개의 특이한 프라이머를 사용하여 마이코플라즈마 뉴모니애에 대해 특이적인 탐침 서열(하기 번호 2-5)을 4개 더 얻었다. 이 영역은 각각 대장균의 16S rRNA의 염기 190-230, 450-490, 820-860 및 1255-1290에 대응하였다. 탐침 서열 #1서열 5'-GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT-3'을 갖는 프라이머를 사용하여 얻었다. 탐침 서열 #2는 서열 5'-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3'을 갖는 프라이머를 사용하여 얻었다. 탐침 서열은 #3은 서열 5'-CCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC-3'을 갖는 프라이머를 사용하여 얻었다.
탐침 서열#4는 서열 5'-CGATTACTAGCGATTCC-3'을 갖는 프라이머를 사용하여 얻었다. 서열 분석 반응은 실시예에서 기재된 바와 같이 행하였다. 마이코플라즈마 뉴모니애의 서열을 마이코플라즈마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium), 마이코플라즈마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum), 마이코플라즈마 갈리셉티큠 및 스피로플라즈마 미륨(Spiroplasma mirum)에서 얻은 서열과 비교하였다.
모 출원의 실시예에 기재된 기준에 의해 하기 탐침 서열을 특성화하였고, 마이코플라즈마 뉴모니애에 대해 특이적인 것으로 밝혀졌다.
Figure kpo00040
탐침 #2의 길이는 35 염기이고 Tm은 67℃이었다.
탐침 #3의 길이는 35 염기이고 Tm은 66℃이었다.
탐팀 #4의 길이는 30 염기이고 Tm은 69℃이었다.
탐침 #5의 길이는 35 염기이고 Tm은 66℃이었다.
이 4가지 탐침을 혼합하고, 선행 실시예와 동일한 방법으로 60℃에서 혼성화 평가 분석에 사용했을 때, 이들은 마이코플라즈마 뉴모니애에 대해 특이적인 것으로 밝혀졌다. 이 탐침은 기타 호흡기 병원균 또는 세균의 계통발생수(phylogenetic tree)에 나타난 임의의 세균과도 교차 반응하지 않았다(표 28 참조).
[표 27]
마이코플라즈마 종에 대한 마이코플라즈마 뉴모니애 탐침 2-5의 혼성화
Figure kpo00041
[표 28]
기타 세균에 대한 마이코플라즈마 뉴모니애 탐침 2-5의 혼성화
Figure kpo00042
[실시예 10]
레기오넬가속은 모두 인체에 대해 잠재적으로 병원성인 22종을 포함한다. 이 세균들은 레기오네어병(Legionnaires' disease), 급성 폐렴, 또는 폰티악열병(Pontiac fever), 또는 비치사성 급성, 비-폐렴성 열병을 유발시킨다. 또한 레기오넬가종은 면역절충된 환자 중에서 우세하게 발생하는 병원성 폐렴의 원인인 것으로 밝혀졌다. 레기오네어병 및 폰티악 열병을 포함한 레기노넬로시스(Legionellosis)를, 직졉 또는 간접적 형광 항체 조사에 의한 임상적 증상에 기재하여, 및 선택적인 향미생물제를 함유하는 완충된 목탄이스트 추출물(BCYE) 한천을 사용한 배양에 의해 진단하였다. 선행 기술에는 단일 한정 속 시험(Single definitive genus test)에 대해 공지된 바와 없다. [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제283페이지(1984년판)참조]. 형광 항체 시험에 의해 레기오넬라의 모든 종을 동정할 수는 없었고 항체가 존재하는 몇몇 중에 대한 동정은 가능하였다. 배양법은 레기노넬라 종에 대하여 한정된 진단법은 아니었다.
하기 기재한 올리고뉴클레노티드 서열을 핵산 혼성화 평가 분석에서 탐침으로 사용할 경우 레기오넬라의 모든 종을 정확히 동정한다. 이 평가분석은 배양법 또는 항체 조사보다 더 민감하고 동정 및 이에 따른 진단 시간을 현저히 감소시켰다. 그러므로 이 평가분석은 선행 진단법을 능가하는 현저히 발전된 것이다.
레기오넬라 속에 대해 특이적인 세가지 탐침 서열을, 16S r RNA와 23S r RNA의 보존 영역에 대해 상보적인 세가지 특이한 프라이머를 사용하여 얻었다. 서열 1은 서열 5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C-3'을 갖는 16S 플라이머를 사용하여 얻었다. 서열 2는 서열 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT3'을 갖는 23S 프라임을 사용하여 얻었다. 서열 3은 5' GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC ACC AT-3'을 갖는 16S 프라이머를 사용하여 얻었다. 이들 프라이머의 서열화는 선행 실시예에 대하여 기재된 바와 같이 행하였다.
실시예 1의 기준에 의해 하기 세가지 서열을 특성화하고 레기오넬라 속에 대해 특이적인 것으로 나타났다. 계통발생적 근친 세균인 대장균, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus)를 레기오넬라 종에서 얻은 서열을 갖는 대조물로서 사용하였다.
Figure kpo00043
16S r RNA에서 얻은 서열 1은 길이가 40염기이고 Tm이 72℃이었다.
23S r RNA에서 얻은 서열 2은 길이가 42염기이고 Tm이 73℃이었다.
16S r RNA에서 얻은 서열 3은 길이가 40염기이고 Tm이 68℃이었다.
이들 서열들은, 각각 대장균의 16S r RNA의 630-675, 대장균의 23S r RNA의 350-395, 대장균의 16S r RNA의 975-1020에 대응하는 영역에서 레기오넬라 속의 RNA에 혼성화할 수 있다. 이 탐침들을 함께 혼합시킬 경우, 혼합물의 평균 Tm은 73℃이었다. 폴리아크릴라미드겔상에서의 분석에 의해 각 탐침은 정확한 길이임을 알 수 있었고, 서열 분석에 의해 각 탐침이 정확한 염기 서열을 가짐을 검증하였다.
세가지 탐침을 혼합하고 혼성화 반응에 사용할 경우, 이 탐침들은 레기오넬라 속에 대해 특이적이었고(표 29와 표 30참조), 기타 호흡기 병원균 또는 계통발생수에서 선택된 임의의 생물체 교차 반응하지 않음(표 31과 표 32 참조)을 발견하였다. 하나 이상의 탐침(예, 탐침 혼합물)을 사용함으로서 증가된 평가분석 민감도 및 (또는) 검출되는 비바이러스성 생물체 수의 증가가 초래되었다.
[표 29]
상동성 표적 rRNA에서 대한 레기오넬라 탐침의 혼성화
Figure kpo00044
[표 30]
레기오넬라 종에 대한 레기오넬라 탐침의 혼성화
Figure kpo00045
* 번호 1-8 및 11은 게리오넬라 뉴모필라의 혈청형이다.
[표 31]
호흡기 병원체에 대한 레기오넬라 탐침의 혼성화
Figure kpo00046
[표 32]
세균 종의 계통발생적 교차부에 대한 레기오넬라 탐침의 혼성화
Figure kpo00047
레기오넬라 속에 대해 특이적인 3가지 추가 탐침 서열(번호 4-6)을 23S r RNA사에서 보존 영역에 대해 상보적인 두가지 프라이머를 사용하여 얻었다. 서열 4는 서열 5'-CCT TCT CCCGAA GTT ACG G-3'을 갖는 프라이머를 사용하여 얻었다. 탐침 서열 5와 6은 서열 5'-AAG CCG GTT ATC CCC GGG GTA ACT TTT-3'을 갖는 23S 프라이머를 사용하여 얻었다. 이들 프라이머의 서열화는 선행 실시예에 대해 기재한 바와 같이 행하였다.
이미 기술한 기준에 의해 하기 세가지 서열을 특성화하여 레기오넬라속에 대하여 특이적인 것으로 밝혀졌다. 계통발생적으로 근친인 대장균, 녹녹균, 비브리오 파라헤모리티쿠스 및 악티네토박터 칼코아세티쿠스를 레기오넬라 종에서 얻은 서열을 갖는 대조물로서 사용하였다.
Figure kpo00048
대장균의 23S r RNA의 염기 1585-1620에 대응하는 영역에서 23S r RNA에 상보적인 탐침 4는 길이가 31염기이고 Tm이 67℃이었다.
대장균의 23S r RNA의 염기 2280-2330에 대응하는 영역에서 23S r RNA에 상보적인 탐침 5는 길이가 염기 22이고 Tm이 66℃이었다. 탐침 5와 동일한 영역에서 23S r RNA에 상보적인 탐침 6은 길이가 염기 22이고 Tm이고 63℃이었다.
세가지 탐침을 상기한 탐침 3과 혼합시키고, 탐침 1-3에 대하여 기재한 바와 같이 혼성화 평가분석에 사용했을 때, 이들은 레기오넬라 속에 대하여 특이적이고(표 33참조). 기타 호흡기 병원균 또는 계통발생수에서 선택한 임의의 생물체와 교차 반응하지 않음(표 34와 표 35 참조)을 알 수 있었다. 하나 이상의 탐침, 예를들면 탐침 혼합물을 사용함으로서 증진된 평가 분석 민감도 및(또는) 검출되는 비-바이러스성 생물체수의 증가가 초래되었다.
[표 33]
레기오넬라 종에 대한 레기오넬라 탐침의 혼성화
Figure kpo00049
* 번호 1-8 및 11은 게르오넬라 뉴모필라의 혈청형이다.
[표 34]
호흡기 병원균에 대한 레기오넬라 탐침의 혼성화
Figure kpo00050
[표 35]
세균 종의 계통발생적 교차부에 대한 레기오넬라 탐침의 혼성화
Figure kpo00051
[실시예 11]
클라미디아(Chlamydia)는 그램-음성, 비 -운도성, 편성(偏性) 세포내 세균이다. 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis)종은 풍토병적 트라코마(실명의 가장 통상적인 예방 가능형), 포입체성결막염 및 성병성임파육아종(LGV)에 관계한다. 이 종은 남성의 비임균성 요도염의 주 원인이고, 여성의 자궁경관염 및 급성 난관염을 유발시킬 수 있다. 안과적 질환 또는 클라미디아 폐렴은 감염된 산도를 통해 신생아에게서 발병할 수 있다.
비뇨생식기로에서의 클람디아 트라코마티스의 동정을 위하여 예를들면 직접적 면역 형광 염색 또는 임상적 피검물의 효소적 면역 분석에 의함과 같은 당업계에 몇가지 공지된 방법이 있다. 그러나 어느 방법을 선택하더라도 시클로헥스이미드로 처리한 맥코이세포(Mccoy cells)중의 생물체의 배양을 수반한다. 세포 배양 후, 생물체의 실체를 식별하기 위하여 형태학적 또는 형광 항체 염색법을 사용한다.
하지만 본 발명의 올리고뉴클레오티드 서열을 핵산의 혼성화 평가 분석에서 탐침으로 사용한 경우, 클라미디아 트라코마티스 단리물을 정확히 동정하였다. 이 평가분석 시험은 민감도의 면에서 배양법 또는 항체조사의 동일하였고, 배양법의 경우 동정 및 이에 따른 진단에 사용되는 시간을 현저히 감소시켰다.
종 간의 원을 동정하고 구별하기 위한 탐침의 사용은 신규하고 독창적인 것이다. 사실상, 킹스베리 등[Kingsbury, D. T., 및 E. Weiss, J. Bacterionl. 제96호, 제1421-제1423페이지(1968년)참조] : 모울더등 [Moulder, J. W, ASM News, 제 50권, 제8번 (1984년) 참조]는 클라미디아 트라코마티스 및 클라미디아 싯타시(C. psittaci) 사이에 10%의 DNA 상동성이 있는 것으로 보고하였다.
또한 이들 보고에 의하면 상이한 클라미디아 트라코마티스 균주는 DNA상동성이 상이한다. 바이스페르그등[ Weisberg, W. G. et al., J. Bacterion, 제167호, 제570-제574페이지(1986년)참조]은 클라미디아 싯타시의 16S r RNA의 서열을 발표하였으며, 클라미디아 트라코마티스와 클라미디아 싯타시가 95% 이상의 r RNA 상동성을 공유함을 밝혔다. 이들 보고서로부터, (10 클라미디아 트라코마티스의 모든 균주에 혼성화 되는 탐침,및(2) 클라미디아 트라코마티스와 클라미디아 싯타시를 구별할 수 있는 탐침을 발견하는 것이 어렵다는 것을 추론할 수 있었다. 하기 탐침은 두가지 목적을 모두 성취시켰다.
16S r RNA 및 23S r RNA의 보존 영역에 상보적인 7가지 특이한 프라이머를 사용하여 클라미디아 트라코마티스에 대해 특이적인 10개의 탐침 서열을 제조하였다. 탐침 서열 1은 서열 5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C-3'을 갖는 16S 프라이머를 사용하여 얻었다. 탐침 서열 2는 서열 5'-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-3'을 갖는 16S 프라이머를 사용하여 얻었다. 서열 3과 4는 서열 5'-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA AT-3'을 갖는 16S 프라이머를 사용하여 얻었다. 탐침 서열 5와 6은 서열 5'-CTT TCC CTC ACG GTA-3'를 갖는 23S 프라이머를 사용하여 얻었다. 탐침 서열 7과 8은 서열 5'-CCT TCT CCC GAA CTT ACG G-3'을 갖는 23S 프라이머를 사용하여 얻었다.
탐침 서열 9는 서열 5'-TCG GAA CTT ACC CGA CAA GGA ATT TC-3'을 갖는 23S 프라이머를 사용하여 얻었다. 탐침 서열 10은 서열 5'-CTA CTT TCC TGC GTC A-3'을 갖는 프라이머를 사용하여 얻었다.
하기 10개의 서열을 실시예 1에 기재된 기준에 의해 특성화하여 클라미디아 트라코마티스의 r RNA에 대해 특이적임을 알 수 있었다. 계통발생적 근친인 클라미디아 싯타시를, 클라미디아 트라코마티스의 서열을 갖는 대조물로서 사용하였다.
Figure kpo00052
16S r RNA에서 얻은 서열 1은 길이가 30염기이고, Tm이 66℃이었다. 16S r RNA에서 얻은 서열 2는 길이가 32염기이고, Tm이 68℃이었다. 16S r RNA에서 얻은 서열 3은 길이가 39염기이고 Tm이 70℃이었다. 16S r RNA에서 얻은 서열 4는 길이가 33염기이고 Tm이 69℃이었다. 23S r RNA에서 얻은 서열 5는 길이가 41염기이고 Tm이 71℃이었다. 23S r RNA에서 서열 6은 길이 30염기이고 Tm이 72℃이었다. 23S r RNA에서 얻은 서열 7은 길이가 33염기이고 Tm이 72℃이었다. 23S r RNA에서 얻은 서열 8은 길이가 30염기이고 Tm이 71℃이었다. 23S r RNA에서 얻은 서열 9는 길이가 35염기이고 Tm이 74℃이었다. 서열 10은 길이가 28 염기이고 Tm이 72℃이었다.
탐침의 반응성과 특이성은 혼성화의 평가 분석에 의해 조사하였다.32P로 말단 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침 1과 2를, 41% 디이소부틸 술포숙시네이트 0.55ml, 3% 소듐 도데실 술페이트, pH 6.8인 0.03M인산 나트륨, 1mM EDTA, 1mM EGTA 중에서, 정제된 RAN 또는 적어도 107세균에서 방출된 RNA와 60℃(탐침 1)에서 또는 64℃(탐침 2)에서 1시간 동안 혼합시켰다. 하이브리드들을 선행 실시예에 기재된 바와 같이 히드록시아파티트에 결합시켜, 결합된 방사능의 양을 신틸레이션 계수법으로 측정하였다. 표 36은 탐침 1과 2는 시험한 클라미디아 트라코마티스의 모든 혈청형과 잘 혼성화를 나타낸다. 탐침 1은 임의의 피검 클라미디아 싯타시 균주와 반응하지 않았고, 탐침 2는 균주 중 2종과 반응하지 않았다. 탐침 2는 인체를 감염시키지 않는 것으로 알려진 클라미디아 싯타시의 양의 다발관절염 균주와 반응하였다. 표 37은 탐침 3-9를125I로 표지화하여 혼합물로 사용했을 때 이것의 반응성 및 특이성을 나타낸다. 이 경우에, 하이브리드는 1987년 3월 2일자 특허 출원된 아놀드(Arnold)등의 미합중국 특허 출원 제020,866호에 기재된 바와 같은 양이온 자기 입자에 결합하였다. 이 탐침은 피검 클라미디아 트라코마티스의 모든 균주에 잘 혼성화하고 클라미디아 싯타시의 어떤 균주외도 혼성화하지 않았다. 탐침 3-9를, 비뇨생식기로에서 통상적으로 발견되는 세균류에 대해 더 시험 하였고(표 38 참조), 생물체의 계통발생적 교차부에 대해 더 조사 하였다(표 39 참조).
모든 경우에, 이 탐침은 특이적인 것으로 나타냈다. 탐침 10은 클라미디아 싯타시에 대해 25% 비-상동성이고, 또한 클라미디아 트라코마티스에 대해 특이적이어야 한다.
[표 36]
클라미이다 RNA에 대한 클라미디아 트라코마티스 탐침 1과 2의 혼성화
Figure kpo00053
[표 37]
클라미디아 rRNA와 클라미디아 트라코마티스 탐침 3-9의 혼성화 계수율
Figure kpo00054
Figure kpo00055
[표 38]
비뇨생식기로에서 발견되는 생물체에 대한 클라미디아 트라코마티스 탐침 3-9의 혼성화
Figure kpo00056
Figure kpo00057
[표 39]
계통 발생적 분화 생물체에 대한 클라미디아 트라코마티스 탐침 3-9의 혼성화
Figure kpo00058
Figure kpo00059
[실시예 12]
캄필로박터(Campylobacter)는 운동성, 미호기성, 그램 음성 만곡 간상균이다. 이 속은 거의 다양하고, 기타 속과 상이하다. 이 세균 속이 잘 정의되어 있기는 하나, 종 수준에서 다소 수정이 되고 있다 [Romaniuk, P.J. 등의 J. Bacteriol. 제169호, 제2137-제2141페이지(1987년) 참조]. 캄필로박터의 3종, 예를 들면 캄필로박터 제주니, 캄필로박터 콜리(C. coli) 및 캄필로박터 라리디스(C. laridis)는 인체에 장염을 유발시킨다. 이 질병은 설사, 열, 오심(惡心), 복통 및 경우에 따라서 구토를 동반한다. 이 세균은 미국에서 연간 2백만으로 추산되는 감염자를 유발시킨다[살모넬라의 시겔라(Shigella)에 의해 유도된 설사중의 경우에 기초한 추정치]. 세균 속의 기타 원은 사람에 패혈증 및 양과 소의 낙태 및 불임증을 유발시킨다.
일반적으로 캄팔로박터 장염의 진단은 배양액 중의 세균 생장과 단리, 이어서 많은 생화학 시험에 의존하고 있다. 캄필로박터균의 최적 생장은 저산소압 및 고온(42℃)과 같은 특이 조건을 필요로 한다. 모든 캄필로박터 종의 단리를 위해 어떠한 단일 조건이 바람직하지는 않다.
하기한 올리고뉴클레오티드 서열은 혼성화 평가분석에 사용했을 때 목적하는 캄필로박터 종의 16S r RNA에 혼성화되었다. 본 발명은, 한 탐침이 목적하는 모든 캄필로박터를 검출할 수 있고, 다른 두 탐침 이 장내 캄팔로박터균을 검출하고, 하나는 인체의 캄필로박터 단리물을 검출할 수 있으므로 선행 기술의 캄필로박터 검출을 능가하는 상당한 잇점을 갖는다. 뿐만 아니라, 이 탐침들은 평가분석의 용이함 및 동정 및 이에 따른 진단 시간의 현저한 감소되는 점에서 선행 기술을 능가하는 잇점을 갖는다.
목적하는 캄필로박터 종의 16S r RNA에 혼성화되는 4종의 탐침은 16S r RNA에 상보적인 3종의 특이한 프라이머를 사용하여 제조하였다. 서열 1과 2는 서열 5'-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3'을 갖는 16S 프라이머를 사용하여 제조하였다. 서열 3은 서열 5'-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-3'을 갖는 16S 프라이머를 사용하여 제조하였다. 서열 4는 서열 5'-GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT-3'을 갖는 16S 프라이머를 사용하여 제조하였다.
하기 서열들을 특성화하여 캄필로박터 제주니, 캄필로박터 콜리 및 캄필로박터 라리디스에 혼성화됨을 발견하였다. 계통발생적 근친인 비브리오 파라헤모리티쿠스 및 볼리넬라 숙시노게네스(Wollinella succinogenes)를 캄필로박터 서열을 갖는 대조물로서 사용하였다.
Figure kpo00060
16S r RNA에서 얻은 서열 1은 길이가 염기 23이고, Tm이 65℃이었다. 16S r RNA에서 얻은 서열 2은 길이가 염기 26이고, Tm이 64℃이었다. 16S r RNA에서 얻은 서열 3은 길이가 염기 25이고, Tm이 66℃이었다. 16S r RNA에서 얻은 서열 4는 길이가 염기 24이고, Tm이 61℃이었다. 서열 1은 대장균의 16S r RNA의 염기 405-428에 대응하는 영역에 혼성화할 수 있고, 서열 2는 대장균의 16S r RNA의 염기 440-475에 대응하는 영역에 혼성할 수 있고, 서열 3은 대장균의 16S r RNA의 염기 705-735에 대응하는 영역에 혼성화할 수 있고, 서열 4는 대장균의 16S r RNA의 염기 980-1010에 대응하는 영역에 혼성화 할 수 있다.
캄필로박터에 대한 탐침의 반응성과 특이성을 혼성화 평가분석으로 시험하였다.23P로 말종단 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 0.1% 소듐 도데실 술페이트 중의 정제된 RNA 또는 세포에서 방출된 RNA와 혼합시켰다. 여기에, 혼성화 용액(41% 디이소부틸 술포숙시네이트, pH 6.8인 30mM 인산나트륨, 0.7% 소듐 도데실 술페이트, 1mM EDTA, 1mM EGTA) 0.5ml를 첨가한 후, 이 혼합물을 60℃에서 1 내지 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 분류용 용액(2% 히드록시아파티트, pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트) 2 내지 2.5ml를 첨가하고 이 혼합물을 60℃에서 5분 동안 인큐베이션 시켰다. 시료를 원심 분리한 후, 상징액을 제거하였다. 세척액(pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.2% 소듐 도데실 술페이트) 2.5ml를 첨가하고, 시료를 혼합하고, 원십분리한 후, 상징액을 제거하였다. 히드록시 아파티트에 결합된 방사능을 신틸레이션 계수법으로 측정하였다.
표 40으로부터, 이 탐침은 목적하는 캄필로박터 종, 예를 들면 캄필로박터 제주니, 캄필로박터 콜리, 및 캄필로박터 라리디스에 잘 혼성화됨를 알 수 있다. 탐침 1은 피검 캄필로박터 종을 모두 검출하고, 탐침 2와 4는 장내 캄필로박터만을 검출하고, 탐침 3은 소에서 단리한 생물체인 캄필로박터 스푸로룸(C. sputorum)을 제외한 캄팔로박터 종을 모두 검출함을 알 수 있다. 따라서, 이 모든 탐침을 변시료 중에서 캄필로박터를 동정하는데 유용하다. 기타 응용에 사용하기 위한 탐침의 선택은 필요한 특이성(예, 장내 캄필로박터, 또는 모든 캄필로박터 종)에 좌우된다.
[표 40]
캄필로박터 종에 대한 캄필로박터 탐침 1-4의 혼성화
Figure kpo00061
(*) 탐침 결합율=(히드록시아파티트 결합 cpm-RNA 부재시 결합 cpm)/평가분석에 사용된 전체 cpm 표 41로부터 탐침은 근친 생물체 또는 위장관에서 발견되는 생물체에 혼성화하지 않음을 알 수 있다.
[표 41]
근친 생물체 및 위장관에서 발견되는 생물체에 대한 캄필로박터 탐침의 혼성화
Figure kpo00062
(*) 탐침 결합율=(히드록시아파티트 결합 cpm-RNA 부재시 결합 cpm)/평가분석에 사용된 전체 cpm 장내 캄필로박터에 대해 특이적인 탐침, 탐침 2 및 4를 더 시험하였으며 위장관에서 발견되는 기타 생물체의 rRNA와 반응하지 않음을 알 수 있었다.
[표 42]
위장관에서 발견되는 생물체에 대한 캄필로박터 탐침 2와 4의 혼성화
Figure kpo00063
(*) 탐침 결합율=(히드록시아파티트 결합 cpm-RNA 부재시 결합 cpm)/평가분석에 사용된 전체 cpm
[실시예 13]
연쇄상구균(Streptococci)속은 그램 양성, 산화효소 부재 구성 세균이다. 이 세균 속은 군-특이성 탄수화물에 기초하여 18군인 A-R로 분류되어 있다. D군의 연쇄상구균을 장내구균(예, 스트랩토코치페슘(S. faecium), 대변연쇄상구균(S. faecalis), 스트렙토코치 아비움(S. avium) 및 스트렙토코치 갈리나륨(S. gallinarum) 및 비-장내구균(예, 스트렙토코치 보비스)로 더 세분하였고, 스트렙토코치 에퀴너스(s. equinus), 스트렙토코치 폐슘, 대변연쇄상구균 및 스트렙토코치 아비움은 의학적 중요한 장내구균으로 여겨진다. 연쇄상 구균의 일부 종은 인체에 병원성이고, 나머지 종들은 입과 장에서의 정상적인 균상을 나타내나 기타 부위에 유입되었을 경우 질병을 일으킬 수 있다. 두가지 예로서 스트렙토코치 폐슘과 대변연쇄 상구균이 있는데, 이들은 장에서 정상적으로 발견되나 만연되어 균혈증, 창상 감염을 일으킬 수 있고 미국에서 비뇨생식기로 감염의 10% 정도를 차지한다.
장내구균의 검출을 위한 현행 방법은 18-72시간 동안 피검물의 배양에 이은 일단의 생화학적 시험을 필요로 한다. 하기한 서열의 올리고뉴클레오티드를 혼성화 평가분석에 사용했을 때, 대변연쇄상구균, 스트렙토코커스 아비움, 및 스트렙토코커스 페슘을 정확하게 검출하였다. 본 발명의 탐침은 RNA 상동성에 있어서 근친인 기타 연쇄상구균속 또는 포도상구균속과 교차 반응하지 않았다.[Kiepper-Baez, 1981년, 1982년, Schiliefer, 1984년 참조]. 또한 본 발명에 의하면 시료에 대해 방해야할 시험 횟수를 감소시키고, 동정 및 이에 따른 진단에 필요한 시간이 현저히 감소된다. 이는 선행 기술의 방법을 능가하는 현저한 진전을 나타낸다.
탐침의 서열은 서열 5'-CCG CTT GTG CGG GCC GTC AAT TC-3'을 갖는 16S r RNA에 상보적인 프라이머를 사용하여 동정하였다. 하기 서열을 특성화하고, 세가지 장내구균, 예를 들면 스트렙토코커스 폐슘, 대변연쇄상구균 및 스트렙토코커스 아비움에 대해 특이적인 것으로 밝혀졌다. 계통발생학적 근친, 예를 들면 스트렙토코커스 아갈락티에, 스트렙토코커스 보비스, 스트렙토코커스 뉴모니애 및 화농연쇄상구균(S. pyogenes)을 목적 서열을 갖는 대조물로 사용하였다.
Figure kpo00064
이 서열의 길이는 35 염기이고 Tm은 72℃이었다. 이 서열은 대장균의 16S r RNA의 염기 825-860에 대응하는 영역 혼성화할 수 있다. 탐침의 반응성과 특이성을 검증하기 위하여, 이 탐침을 정제된 RNA 또는 세포에서 방출된 RNA와 함께 혼성화 평가분석에 사용하였다. 2% 소듐 도데실 슬페이트 중에 적어도 107세포를 함유하는 현탁액을 유리 구슬 존재 중에서 와동시켰다. 이 현탁액 0.1ml를 혼성화용 완충액(pH 6.8인 0.96M 인산나트륨, 0.002M EDTA, 0.002M EGTA) 0.1ml의 혼합이고, 65℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 2% 히드록시아파티트 5ml, pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트를 첨가하고, 혼합물을 65℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 시료를 원심 분리하고, 상징액을 제거하였다. 세척액(pH 6.8인 0.12M 인산염 완충액, 0.02% 소듐 도데실 술페이트)5ml를 첨가하고, 이 시료를 와동시키고, 원심 분리한 후, 상징액을 제거하였다. 히드록시 아파티트에 결합된 방사능의 양은 신틸레이션 계수법에 의해 측정하였다. 표 43으로부터 이 탐침은 스트렙토코커스 페슘, 대변연쇄상구균, 및 스트렙토코커스 아비움과는 잘 반응하고 기타 근친 생물체와는 반응하지 않음을 알 수 있었다.
[표 43]
근친 생물체에 대한 장내구균 탐침의 혼성화
Figure kpo00065
[실시예 14]
슈도모나스 속(Pseudomonads)은 그램-음성, 비포자형성, 비발효성 간균이다. 슈도모나스속은 통상적으로 토양과 물에 서식하고, 건강한 개체에 거의 전염되지 않는다. 이미 약해진 환자에 이 세균에 접촉할 경우, 창상감염, 외과수술 후 감염, 폐혈증, 유아 설사 및 호흡기와 비뇨생식기로 감염을 포함하는 각종 임상적 증세를 유발 시킬 수 있다. 슈도모나스 속의 원들은 항생제에 대한 생물체의 내성 때문에 임상 시료 중에서 동정하는 것이 특히 중요하다. 핵산의 상동성 연구에 의해 속을 DNA군 I-V로서 공지된 상동성 부류로 분류하였다. 모든 슈도모나스 속의 모든 임상 단리물의 83%는 RNA군 I에서 얻은 것이고, 녹농균은 단열단리된 가장 통상적인 종이다.
슈도모나스의 검출을 위한 현행 방법은, 환자 시료의 24-72시간 동안 배양, 이어서 일단의 생화학적 시험을 필요로 한다. 하기한 서열의 올리고뉴클레오티드를 혼성화 평가분석에 사용했을 때, 임상적으로 중요한 제1군 슈도모나스를 검출하였다. 본 발명에 의해 시료에 대해 행하여야 하는 시험 횟수가 감소되고, 검출 시간이 감소될 수 있었다. 이는 선행 기술의 방법을 능가하는 현저한 진전을 나타낸다.
이 서열은 서열 5'-CTT TCC CTC ACG GTA-3'을 갖는 22S r RNA상의 보존 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 얻었다. 하기 서열이 제1군 슈도모나스를 검출하는 것으로 밝혀졌다.
Figure kpo00066
이 탐침의 길이는 35염기이고 Tm은 70℃이었다. 이 탐침은 대장균의 23S r RNA의 염기 365-405에 대응하는 영역에서 제1군 슈도모나스 속과 혼성화할 수 있다. 이 탐침의 반응성과 특이성을 검증하기 위하여, 혼성화 평가분석에 사용하였다.32P로 말단 표지된 올리고뉴클레오티드를 표준 방법에 의해 적어도 107세균에서 방출된 RNA와 함께 pH 6.8인 0.48M 인산나트륨, 1% 소듐 도데실 술페이트, 1mM EDTA, 1mM EGTA중에 혼합시킨 후, 65℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, RNA : DNA 하이브리드를 실시예에 대하여 기재한 바와 같이 히드록시아파티트에 결합시키고, 결합된 방사능을 신틸레이션 계수법에 의해 측정하였다. 표 44에 의해, 이 탐침은 피검 제1군 슈도모나스의 8종 모두와 반응함을 검증하였다. 이 탐침은 제 II 또는 제V군 생물체에서 방출된 RNA와 반응하지 않았다. 이 탐침은 슈도모나스 아시도보란스(Pseudomonas acidovorans), 즉 임상 시료에서 얻은 모든 비발효성 간균 단리물의(1%를 나타내는 제III군 세균과는 반응성이 낮음을 볼 수 있다.). 표 45로부터 이 탐침은 시험한 기타 근친 생물체와는 반응하지 않음을 알 수 있었다.
[표 44]
슈도모나스 RAN에 대한 제1군 규도모나스 탐침의 혼성화
Figure kpo00067
* 탐침 결합율=(RNA 존재시 결합 계수-RNA 부재시 결합 계수)/평가분석에 사용되는 전체계수
[표 45]
근친 생물체의 RAN에 대한 제1군 슈도모나스 탐침의 혼성화
Figure kpo00068
* 탐침 결합율=(RNA 존재시 결합 계수-RNA 부재시 결합 계수)/평가분석에 사용된 전체 계수
[실시예 15]
실시예 15-18에서, 모두 RNA 수준에서 매우 관계 있는 장내균과(Enterobacteriaceae)에 대해 기재하였다. r RNA 수준에서도 거의 차이가 없었다. 예를 들면, 심상변형균(Proteus vulgaris)의 16S r RNA는 대장균에 대해 93% 의 상동성이 있다. 이 사실로부터, 이 생물체의 군에 대해 특이적인 r RNA 탐침의 제조에 관련된 어려움이 설명된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 엔테로박터 클로아케, 기괴변형균, 살모넬라 및 대장균에 대해 탐침을 제조하였다.
엔테로박터 속(Enterobacter)의 원은 장내균과에 속하는 운동성, 그램-음성, 비-포자 형성 간균이다. 이 속은 대규모의 이종 집단이나 8종이 정의되었으나 단지 5종만이 임상적으로 중요하다. 엔테로박터 클로아케와 엔테로박터 에어로게네스(E. aerogenes)가 가장 통상적인 단리물이고, 사람에 있어서, 성뇨기, 폐동맥, 혈액, 중추 신경계 및 연질조직 감염에 관계한다.
환자의 시료에서 엔테로박터 클로아케를 동정하기 위한 현행 방법은 한천 플레이트 상에서 18-24시간 동안 피검물의 배양, 이어서 일단의 생화학적 시험을 포함한다. 하기한 서열의 올리고 뉴클레오티드를 핵산 혼성화의 평가분석에서 탐침으로 사용했을 때 경우, 엔테로박터 클로아케를 정확히 동정하였다. 본 발명에 의해 시료 상에 행하여야 하는 시험 횟수, 동정 및 이에 따른 진단 시간이 감소되므로, 따라서 선행 기술의 방법을 능가하는 현저한 진전을 나타내었다.
엔테로박터 클로아케에 대해 특이적인 탐침은 서열 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3'을 갖는 23S r RNA의 보존 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 얻었다.
하기 서열을 특성화하여 엔테로박터 클로아케에 대해 특이적임을 증명하였다. 계통발생적 근친, 예를 들면 대장균, 폐렴간균, 심상변형균, 장염균(Salmonella enteritidis), 및 시트로박터 프로인디(Citrobacter freundii)를 엔테로박터 클로아캐의 서열을 갖는 대조물로서 사용하였다.
Figure kpo00069
이 탐침의 길이는 29염기이고, Tm은 68℃이었다. 이 탐침은 대장균의 23S r RNA의 염기 305-340에 대응하는 영역에서 엔테로박터 클로아캐의 RNA에 혼성화할 수 있다. 엔테로박터 클로아캐에 대한 탐침의 반응성과 특이성을 검증하기 위하여, 이것을 혼성화 반응에 사용하였다.33P로 말단 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 적어도 107생물체에서 방출된 RNA와, 1% 소듐 도데실 술페이트, pH 6.8인 0.48M 인산나트륨(최종 용적 0.2ml)중에서 혼합시킨 후, 60℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션후, 2% 히드록시아파티트 5ml, pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트를 첨가하고, 이 혼합물을 60℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 시료를 원심분리하고 상징액을 제거하였다. 세척액(pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트) 5ml를 첨가하고, 시료를 와동시키고, 원심 분리한 후, 상징액을 제거하였다. 히드록시아파티트에 결합된 방사능의 양을 신틸레이션 계수법으로 측정하였다. 결과를 표 46에 기재하였고, 탐침은 엔테로박터 클로아캐와 잘 반응하나 근친 생물체의 RNA와 반응하지 않음을 알 수 있었다.
[표 46]
근친 생물체에 대한 엔테로박터 클로아케 탐침의 혼성화
Figure kpo00070
[표 47]
뇨에서 발견되는 생물체에 대한 엔테로박터 클로아케 탐침의 혼성화
Figure kpo00071
[실시예 16]
프로테우스(Proteus)속의 원을 장내균과의 속하는 운동성, 그램 음성, 비 -포자형성 간균이다. 프로테우스의 4종의 기재되어 있고, 그 중 3종, 즉 기괴변형균(Proteus mirabilis), 심상변형균(P. vulgaris), 및 프로테우스 팬너리(P. penneri)는 인체에 질병을 유발시킨다.
가장 통상적인 형태의 프로테우스 감염은 요로 감염을 포함하나, 또한 패혈증, 폐렴 및 창상 감염도 생길 수 있다. 기괴변형균은 가장 흔히 단리되는 중이고, 모든 급성 비합병성 요로 감염의 최대 10%를 유발시킨다. 중간의 특이한 항생물질의 민감도 때문에 원인성 생물체의 속 수준의 동정보다 오히려 종 수준의 동정이 더 바람직하다.
환자의 시료에서 기괴변형균을 동정하기 위한 현행 방법는 한천 플레이트 상에서 18-24시간 동안 피검물의 배양, 이어서 일단의 생화학적 시험을 필요로 하였다. 하기한 서열의 올리고뉴클레오티드를 핵산 혼성화 평가분석에서 탐침으로 사용했을 때, 기괴변형균을 정확히 동정하였다. 본 발명에 의해 시료상에 행해야 하는 시험 횟수, 동정 및 이에 따른 진단 및 치료 시간이 감소되었다. 이는 선행 기술의 방법을 능가하는 현저한 진전을 나타낸다.
기괴변형균에 대하여 특이적인 탐침은 서열 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3'을 갖는 23S r RNA의 보존 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 얻었다.
하기 서열을 특성화하여 기괴변형균에 대하여 특이적임을 증명하였다. 계통발생적으로 근친인 대장균, 폐렴 간균, 심상 변형균 및 장염균을 기괴변형균의 서열을 갖는 대조물로서 사용하였다.
Figure kpo00072
이 탐침은 대장균의 23S r RNA의 염기 270-305에 대응하는 영역에서 기괴변형균의 RNA에 혼성화할 수 있었다. 이 탐침의 길이는 33염기이고, Tm은 66℃이었다. 기괴변형균에 대한 탐침의 반응성과 특이성을 검증하기 위하여, 이것을 혼성화 평가분석에서 사용하였다.32P로 말단 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 적어도 107생물체에서 방출된 RNA와, 1% 소듐 도데실 술페이트, pH 6.8인 0.48M 인산나트륨, 1mM EDTA, 1mM EGTA(최종 용적 0.2ml)중에서 혼합시키고, 64℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 2% 히드록시아파티트 5ml, pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트를 첨가하고, 혼합물을 65℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 시료를 원심 분리하고, 상징액을 제거하였다. 세척액(pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트) 5ml를 첨가하고, 시료를 와동시키고, 원심 분리한 후 상징액을 제거하였다. 히드록시아파티트에 결합된 방사능의 양을 신틸레이션 계수법에 의해 측정하였다. 결과를 표 48에 기록하였고, 이 탐침은 기괴변형균과 잘 반응하고, 기타 27종의 근친 세균과 반응하지 않음을 검증하였다. 표 49로부터 이 탐침은 기타 24종의 계통발생학적 분화 세균 및 표 48에 기재한 바와 동일하게 시험한 2종의 이스트와 반응하지 않음을 알 수 있었다.
[표 48]
근친 생물체에 대한 기괴변형균 탐침의 혼성화
Figure kpo00073
[표 49]
계통발생적으로 다양한 생물체에 대한 기괴변형균 탐침의 혼성화
Figure kpo00074
[실시예 17]
살모넬라 속(Salmonella)의 원은 장내구균에 속하는 운동성, 그램 음성, 비-포자형성 간균이다. 모든 살로넬라균은 매우근친이고 일부 미생물 학자들은 이들 한가지 종으로 여긴다. 핵산 상동성 연구로부터 5가지 아군이 동정되어 있으며, 1400개 이상의 상이한 혈청형이 보고되었다. 모든 혈청형은 가벼운 증세의 자기한정성 위장염에서 균혈증을 동반하는 심한 위장염, 생명에 위협적인잠재적질병인 열성 장티푸스에 이르기까지 사람의 장질환에 관계해왔다. 돈콜레라균(S. cholerasuis), 파라니푸스 A균(S. paratyphi A) 및 티푸스균(S. typhi)은 심한 질병 및 균혈증에 가장 흔히 관계하는 혈청형이다. 살모넬라균에 의해 유발된 장염의 진단은 변 시료 중의 세균 검출에 좌우된다. 감염은 주로 오염된 우유, 식품 및 물의 섭취 때문이므로, 소비자에게 유통되기 전에 이들 식품에서 살모넬라균를 동정하는 방법이 중요하다.
살모넬라 속의 원을 검출하기 위한 현행 방법은, 선별 배지상에서 1-3일 동안 피검물의 배양, 이어서 일단의 생화학적 시험을 포함하였다. 임상 시료 또는 식품 생산품에서 살모넬라균을 단리하기 위하여 증균 단계가 필요하다. 하기한 서열의 올리고뉴클레오티드를 혼성화 평가 분석에 사용했을 때, 살모넬라 속의 원을 정확히 동정하였다. 본 발명의 탐침은 이 속의 모든 원에 대해 특이적이며 기타 장내균과의 근친 속과 반응하지 않았다. 이들 독창적인 발명의 탐침은 시료 상에 행해야 할 시험 횟수를 감소시키고 동정 시간을 현저히 감소시켰다. 이것은 선행 기술의 방법보다 현저한 진전을 나타낸다.
살모넬라 속에 대해 특이적인 탐침은 16S 및 23S r RNA에 상보적인 두 개의 프라이머를 사용하여 얻었다. 서열 1은 5'TTA CTA GCG ATT CCG ACT TCA 3'을 갖는 16S 프라이머를 사용하여 얻었다. 서열 2는 서열 5' CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT 3'을 갖는 23S을 프라이머를 사용하여 얻었다. 하기 서열을 특성화하고 살모넬라 속에 대해 특이적인 것으로 나타났다.
Figure kpo00075
16S r RNA에서 얻은 서열 1의 길이는 30염기이고, Tm은 73℃이었다. 23S r RNA에서 얻은 서열 2의 길이는 34염기이고, Tm은 71℃이었다. 이 탐침은 각각 대장균의 16S r RNA의 염기 1125-1155 및 대장균의 23S r RNA의 염기 335-375에 대응하는 부위에서 혼성화할 수 있다. 살모넬라 속의 원에 대한 탐침 1의 반응성과 특이성을 검증하기 위하여,32P로 말단 표지된 올리고뉴클레오티드를 혼성화 반으의 탐침으로서 조사하였다. 정제된 RNA, 또는 표준 방법에 의해 적어도 107생물체에서 방출된 RNA를 혼성화 완충액(최종 농도 : 43% 디이소부틸 술포숙시네이트 pH 6.8인 60mM 인산나트륨, 1mM EDTA, 1mM EGTA) 1ml와 혼합한 후, 72℃에서 2-12시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 분류용 용액(2% 히드록시 아파티트, pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트) 5ml를 첨가하고 시료를 혼합하고, 72℃에서 5분 동안 인큐베이션 시키고, 원심 분리한 후, 상징액을 제거하였다. 세척액(pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트)4ml를 첨가하고, 시료를 와동시키고, 원심 분리한 후, 상징액을 제거하였다. 히드록시아파티트에 결합된 방사능의 양을 신틸레이션 계수법으로 측정하였다. 표 50에 기재된 결과는 두가지 탐침의 조합이 살모넬라의 5가지 아군 및 피검 모든 31혈청형에 혼성화되었음을 나타낸다.
[표 50]
살모넬라속의 원에 대한 살모넬라 탐침 I과 2의 잡종 형성
Figure kpo00076
살모넬라 속의 원에 대한 탐침의 특이성을 살모넬라 근친 생물체에서 RNA를 함유하는 혼성화 반응을 사용하여 검증하였다. 결과를 표 51에 기재하였다.
[표 51]
근친 생물체의 RNA에 대한 살모넬라 탐침 1과 2의 혼성화
Figure kpo00077
(*) 탐침 결합율=(히드록시아파티트 결합 계수-RNA 부재시 결합 계수)/평가 분석에 사용되는 전체 계수
표 52로부터 살모넬라 탐침 1과 2는 계통발생학적으로 다양한 생물체에 대해 혼성화하지 않음을 알 수 있다.
[표 52]
생물체의 계통발생학적 교차부의 RNA에 대한 살모넬라 탐침 1과 2의 혼성화
Figure kpo00078
* 탐침 결합율=(히드록시아파티트 결합 계수-RNA 부재시 결합 계수)/평가분석에 사용되는 전체 계수
[실시예 18]
대장균(Escherichia coli)은 장내균 과에 속하는 그램 음성, 비포자형성 간균이다. 에세리히아(Escherichia0의 5가지, 종, 예를 들면 대장균(임상 단리물의 >99%), 에세리히아 헤르마니(E. hermanii), 에세리히아 블랫태(E. blattae), 에세리히아 벌네리스(E. vulnris) 및 에세리히아 퍼구소니(E. fergusonii)가 기재되어 왔다. 대장균은 요로 감염, 균혈증 및 신생아 연막염의 주원인이고, 여행자 설사(traveller's diarrhea)로서 알려진 위장염 형태를 유발시킬 수 있다.
환자의 시료에서 대장균을 동정하기 위한 현행 방법은 한천 플레이트 상에서 피검물을 18-72시간 동안 배양, 이어서 단리한 콜로니에 대한 일단의 생화학적 시험을 포함한다. 하기한 서열의 올리고뉴클레오티드를 핵산 혼성화의 평가분석의 탐침으로서 사용했을 때, 기타 세균의 존재하에서도 정확히 대장균을 검출하였다. 본 발명은 시료 상에서 행해야 하는 시험 횟수를 감소시키고 동정 및 이에 따른 진단 및 치료 시간을 감소시킨다. 이는 선행 기술의 방법을 능가하는 현저한 진전을 나타낸다.
대장균에 대해 특이적인 탐침은 심상 변형균[Carbon 등의 Nue, Acids Res. 9 : 2325-2333(1981년)참조], 폐렴 간균, 장염균, 엔터로박터 게고비에(Enterobacter gergoviae) 및 시트로박터 프로인디를 대조물로서 사용하여 공지의 대장균 서열[Brosius 등의 Proc. Natl, Acad. Sci. USA 75 : 4801-4805(1978년) 참조]에서 얻었다. 이 탐침의 서열은 아래와 같다.
Figure kpo00079
이 탐침은 16S r RNA의 995-1030영역에서 대장균의 RNA에 혼성화 하였다. 이 탐침의 길이는 30염기이고, Tm은 66℃이었다. 대장균에 대한 탐침의 반응성과 특이성을 검증하기 위하여, 이것을 혼성화 평가분석에 사용하였다.32P로 말단 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 두 개의 비표지된 올리고뉴클레오티드 서열 5'-TGG ATG TCA AGA CCA GGT AAG GTT CTT CGC GTT GCA TCG-3' 및 5'-CTG ACG ACA GCC ATG CAG CAC CTG TCT CAC GGT TCC CGA AGG CA-3' 및 정제된 RNA, 또는 세정제 및 열을 사용하여 세포에서 방출한 RNA와 함께, 1% 소듐 도데실 술페이트(SDS), pH 6.8인 0.48M 인산나트륨, 1mM EDTA, 1mM EGTA(최종 용적 0.2ml)중에서 혼합시킨 후, 60℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 2% 히드록시아파티트 5ml, pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트를 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이 시료를 원심 분리하고 상징액를 제거하였다. 세척액(pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트) 5ml를 첨가하고, 시료를 와동시키고, 원심분리한 후, 상징액을 제거하였다. 히드록시아파티트에 결합된 방사능의 양을 신틸레이션 계수법에 의해 측정하였다.
이 탐침에 대한 용도의 예로서는 요 시료에서 대장균의 검출이 있다. 표 53에 의해 이 탐침은 피검 대장균의 8균주 중 7개를 검출 함을 알 수 있었다. 또한 이 탐침은 단지 뇨에서 드물게 발견되는 에세리히아 퍼구소니와도 반응하였다.
표 54에 의해 이 탐침은 요에서 드물게 단리되는 다른 생물체인 시겔다 속을 제외한 기타 임의의 피검 속과 반응하지 않음을 알 수 있었다. 이 결과에 의해, 이 탐침은 요 시료에서 대장균의 검출에 유용함을 알 수 있었다.
[표 53]
에세히리아 종에 대한 대장균의 혼성화
Figure kpo00080
[표 54]
근친 생물체에 대한 대장균 탐침의 혼성화
Figure kpo00081
[실시예 19]
세균은 대부분의 자연 환경을 점유하는 단세포 생물체의 형태학적 및 생리학적으로 다양한 집단을 포함한다. 많은 세균들이 그의 환경 또는 숙주에 무해하거나 또는 유익하나, 일부는 유해하고 질병을 유발시킨다. 일부 장소에서 임의의 세균의 존재는 바람직하지 않거나 또는 질병의 건조일 수 있다(예, 배양 배지, 제약 생성물, 혈액, 요 또는 뇌척수액과 같은 체액, 및 조직 부검), 소량의 세균이 음료수 및 식품 생산물과 같은 기타 생성물 중에 수용될 수 잇는 것으로 추측 된다. 그리하여, 시료에서 세균을 검출 및 정량하기 위한 방법이 필요하다.
시료 중의 전체 세균을 검출 및 정량화하기 위한 현행 방법은 상이한 온도 및 분위기 조건하에서 다형 배지상에서의 배양을 필요로 한다. 지금까지 모든 세균을 검출 또는 정량화하기 위한 단일 시험은 존재하지 않았다. 하기한 서열의 올리고뉴클레오티드를 혼성화 평가분석에 사용했을 때, 세균의 광범위한 계통 발생적 교차부를 검출하였다. 본 발명에 의하여 수행하는데 필요한 시험 횟수 및 또한 평가분석에 필요한 시간이 감소되었다. 일련의 표준 시료에 대한 미지시료의 혼성화 결과의 비교에 의해 존재하는 세균수의 일부정량이 가능하였다. 이는 선행 기술의 방법을 능가하는 상당한 진전을 나타낸다.
공지된 서열의 r RNA 및 젠-프로브(Gen-Probe)에서 결정한 서열의 조사에 이어서 세균의 탐침을 고안하였다. 대조물에 사용되는 서열은 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) [Yang 등의 Proc. Natl, Acad, Sci. U.S.A.제82호, 제4443페이즈)1985년) 참조] ; 아나시스티스 니둘란스 (Anacystix nidulans)[Tomioka and Sugiura, Mol. Gen. Genet. 제191호, 제46 페이지(1983년) ; Pouglas와 Doolittle, Nuc. Acids Res. 제12호, 제3373페이지(1985년)참조]; 고초균(Bacillus subtilis)[Green et al. Gene, 제137호, 제261페이지(1985년)참조]; 바실루스 스테라오써모필루스(Bacillus stearothermophilus)[Kop et al., DNA, 제3호, 제347페이지(1984년) 참조] ; 박테로이데스 프라길리스 [Weisbury et al., J. Bacteriol. 제164호, 제230페이지(1985년)참조]; 클라미디아 싯타시[Weisburg et al., J. Bacterio, 제167호, 제570페이지(1986년)참조] ; 데술포비비리오 데술푸리칸스(Desulfovibrio desulfuricaus)[Oyaizu 및 Woese, System. Appl. Micorbiol. 제6호, 제257페이지(1985년)참조]; 대장균[Brosius et al., Proc, Acad. Sei. U.S.A. 제77호, 제201페이지(1980년)참조]; 플라보박테리움 헤파리늄(Flavobacterium heparinum)[Weisburg et al., J. Bacteriol 제164호, 제230페이지(1985년)참조]; 헬리오박테리움 클로륨(Heliobacterium chlorum)[Woese et al., Science. 제229호, 제762페이지(1985년) 참조]; 마이코플라즈마 PG50[Frydenberg 및 Christianser, DNA, 제4호, 제127페이지(1985년)참조] ; 심상변형균(Carbon et al., Nuc. Acids Res 제9호, 제2325페이지(1981년)참조]; 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni)[Yang et al., Proc. Natl. Aca. Sci. U.S.A. 제82호, 제4443페이지(1985년)참조]; 로칼리메아 컨타나(Rochalimea guintana)[Weiburg et al., Science, 제230호, 제556페이지(1985년)참조], 맥주효모균[Rubstov et al., Noc. Acids Res. 제8호, 제5779페이지(1980년) ; Georgiev et al., Nuc. Acids Res. 제9호, 제6953페이지(1981년)참조] 및 사람[Torczynski et al., DNA, 제4호, 제283페이지(1985년) ; Gonzalez et al., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 제82호, 제7666페이지(1985년)참조]를 포함하였다.
하기 서열이 세균의 광범위한 계통 발생학적 교차부에 혼성화하고 이스트 또는 사람의 r RNA에서 혼성화하지 않음을 발견하였다.
Figure kpo00082
탐침 1의 길이는 30염기이고 Tm은 70℃이었다.
탐침 2의 길이는 33염기이고 Tm은 69℃이었다.
탐침 3의 길이는 26염기이고 Tm은 67℃이었다.
탐침 4의 길이는 27염기이고 Tm은 69℃이었다.
탐침 5의 길이는 24염기이고 Tm은 66℃이었다.
탐침 6의 길이는 23염기이고 Tm은 62℃이었다.
탐침 7의 길이는 34염기이고 Tm은 66℃이었다.
탐침 1-3은 각각 다음과 같은 부위, (대장균의 염기에 대응하여) 330-365, 675-715, 및 1080-1110에서 16S r RNA에 혼성화하였다. 탐침 4-7은 각각 다음과 같은 부위, (대장균의 염기에 대응하여) 460-490, 1050-1080, 및 1900-1960(탐침 6과 7)에서 23S r RNA에 혼성화시켰다. 이 올리고뉴클레오티드는 진정 세균중의 고도로 매우 보존된 r RNA상의 영역과 상호 반응하였다. 이 사실은, 이 올리고뉴클레오티드들이 혼성화 평가분석에서 세균성 탐침으로서 사용될 수 있음을 의미한다. 이차적인 용도는 r RNA 서열을 얻기 위한 수단으로서 사용된다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드는 목적 r RNA 에 혼성화할 수 있고 약 전사효소를 사용하여 연장시킬 수 있다. 생성된 DNA 서열은 측정할 수 있고 본 발명의 상세한 설명에서 기재된 바와 같은 상보적인 r RNA 서열을 추론하기 위하여 사용할 수 있다.
본 발명의 한가지 응용은 뇨(세균뇨)에서 세균을 검출하는 것이다. 뇨에서 발견되는 세균에 대한 탐침의 반응성과 특이성을 검증하기 위하여, 이들을 혼성화 평가분석에서 사용하였다.32P 로 말단 표지 또는125I 로 표지한 올리고뉴클레오티드 탐침을 표준 방법(예, 머피 등의 미합중국 특허 출원 제841,860호에 기재된 음파 파괴 기술, 유리 기술을 사용한 세정제, 또는 효소 분해)에 의해 세포에서 방출된 DNA와 혼합시켰다. 탐침을 pH 6.8인 0.48M 인산나트륨, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% 소듐 도데실 술페이트(최종 용적 0.2ml) 중에서 RNA와 혼합하고, 60℃에서 2시간 동안 혼성화시켰다. 여기에 2% 히드록시아파티트 5ml, pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트를 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이 혼합물을 원심 분리한 후, 상징액을 제거하였다. 세척액(pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02% 소듐 도데실 술페이트) 5ml를 첨가하고, 시료를 혼합하고, 원심분리한 후, 상징액을 제거하였다. 히드록시아파티트에 결합된 방사능의 양을 신틸레이션 계수법으로 측정하였다. 표 55-68에 의해 이들 탐침의 특이성을 검증하였고, 탐침의 조합물의 피검 세균 모두를 검출하기 위해 사용될 수 있음을 증명하였다.
표 55에 의해 탐침 1은 요에서 통상적으로 단리되는 세균의 RNA에 혼성화하고 RNA를 검출하지 않음을 알 수 있었다. 표 56으로부터 탐침 1은 계통발생학적 분화 세균을 검출하고 인체의 RNA에 혼성화하지 않음을 알 수 있었다.
[표 55]
요에서 발견되는 생물체의 RNA에 대한 세균성 탐침 1의 혼성화
Figure kpo00083
[표 56]
계통 발생적 분화 생물체의 교차부의 RNA에 대한 세균성 탐침 I의 혼성화
Figure kpo00084
표 57에 의해, 탐침 2는 우레라플라즈마 우레알리티큠을 제외하고 요에서 통상적으로 발견되는 세균의 RNA에 혼성화하고, 이스트의 r RNA에 혼성화하지 않음을 알 수 있었다.
[표 57]
요에서 발견되는 생물체의 RNA에 대한 세균성 탐침 2의 혼성화
Figure kpo00085
표 58에 의해, 탐팀 2가 계통발생학적으로 다양한 세균을 검출하고, 사람의 r RNA는 검출하지 않음을 알 수 있었다.
[표 58]
Figure kpo00086
표 59에 의해 탐침 3은 요에서 통상적으로 발견되는 세균의 RNA에 혼성화하고 이스트의 r RNA를 검출하지 않음을 알 수 있었다.
[표 59]
요에서 발견되는 생물체의 RNA에 대한 세균성 탐침 3의 혼성화
Figure kpo00087
표 60에 의해, 탐침 3가 계통발생학적으로 다양한 세균을 검출하고, 사람의 r RNA는 혼성화하지 않음을 알 수 있었다.
[표 60]
Figure kpo00088
표 61에 의해 탐침 4은 요에서 통상적으로 발견되는 세균의 RNA에 혼성화하고 이스트의 r RNA를 검출하지 않음을 알 수 있었다.
[표 61]
요에서 발견되는 생물체의 RNA에 대한 세균성 탐침 4의 혼성화
Figure kpo00089
표 62에 의해, 탐침 2가 계통발생학적으로 다양한 세균을 검출하고, 사람의 r RNA는 혼성화하지 않음을 알 수 있었다.
[표 62]
Figure kpo00090
표 63에 의해 탐침 5은 요에서 통상적으로 발견되는 세균의 RNA에 혼성화하고 이스트의 r RNA를 검출하지 않음을 알 수 있었다.
[표 63]
요에서 발견되는 생물체의 RNA에 대한 세균성 탐침 5의 혼성화
Figure kpo00091
표 64에 의해, 탐침 5가 계통발생학적으로 다양한 세균을 검출하고, 사람의 r RNA는 혼성화하지 않음을 알 수 있었다.
[표 64]
Figure kpo00092
표 65에 의해 탐침 6은 요에서 통상적으로 발견되는 세균의 RNA에 혼성화하고 이스트의 r RNA를 검출하지 않음을 알 수 있었다.
[표 65]
요에서 발견되는 생물체의 RNA에 대한 세균성 탐침 6의 혼성화
Figure kpo00093
표 66에 의해, 탐침 6가 계통발생학적으로 다양한 세균을 검출하고, 사람의 r RNA는 혼성화하지 않음을 알 수 있었다.
[표 66]
Figure kpo00094
표 67에 의해 탐침 7은 요에서 통상적으로 발견되는 세균의 RNA에 혼성화하고 이스트의 r RNA의 검출하지 않음을 알 수 있었다.
[표 67]
요에서 발견되는 생물체의 RNA에 대한 세균성 탐침 7의 혼성화
Figure kpo00095
표 68에 의해, 탐침 7가 계통발생학적으로 다양한 세균을 검출하고, 사람의 r RNA는 혼성화하지 않음을 알 수 있었다.
[표 68]
Figure kpo00096
[실시예 20]
균류(Fungi)는 간단한 진핵 생물체의 형태학적 및 생물학적으로 다양한 군을 포함한다. 본 발명자들은 세 종의 균류, 뉴로스포파 크랏사(Neurospora crassa), 포도스포라(Podospora), 및 효모균속(Sacchaomyces)의 공개된 서열을 사용하여, 균류의 r RNA가 대장균에 대하여 58-60%의 상동성이 있고, 상호 84-90%의 상동성이 있는 것으로 추정하였다. 일부 균류는 단세포로서 생장하고(이스트), 기타 균류는 다핵 필라멘트로서 생장하고[사상균(molds)], 그외 기타 균류는 단세포 또는 다세포 필라멘트로서 생장한다(동종이형 균류). 다수의 균루는 이들의 환경에 무해한 서식자이나 일부 균류는 유해하고 질병을 유발시킨다. 일부 지역에서의 임의의 균류의 존재는 바람직하지 않거나 또는 질병의 전조이다(예, 배양 배지, 제약 생산품, 혈액, 요 또는 뇌척수액과 같은 체액, 및 조직 부검). 소량의 균류가 음료수와 식품생산품과 같은 기타 생산품에 수용 가능한 것으로 추측되었다. 이에 따라, 시료 중에서 균류를 검출하고 정량화하기 위한 방법이 야기되었다.
균루를 검출 및 정량화하기 위한 현행 방법은 상이한 배지상에서 시료와 배양물의 현미경에 의한 시험을 포함한다. 대부분의 이스트는 대략 수일에 임상 시료에서 생장할 수 있으나, 일부 필라멘트형 균류는 배양시간이 4주일 소모되고, 그 후 특수한 염색 방법, 생화학적 분석 및 항원 검사가 수행된다. 하기한 서열의 올리고뉴클레오티드는 혼성화 평가분석에 사용했을 때, 임상적 실험에서 가장 흔히 단리되는 5종의 이스트, 아구창 칸디다(Candida albicans), 토룰롭시스 글라브라타(Torulopsis glabrata, 칸디나 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 파랍실로실스(Candida parapsilosis) 및 칸디다 크루세이(Candida Krusei)를 검출하였다.
또한 기타 5종의 균류, 트리코스포론(Trichosporon), 분야균속(Blastomyces), 크립토코쿠스(Cryptococcus) 및 효모균속을 검출하였다. 본 발명에 의해 이와 같은 세균들의 1단계 검출이 가능하고, 배양과 관련하여, 감염원으로서 이와 같은 균류의 동정 및 제거시간이 감소되었다. 본 발명은 선행 기술의 방법을 능가하는 현저한 진전을 나타내었다.
목적 생물체에 혼성화하는 4개의 탐침을 18S 또는 28S rRNA상의 보본 부위에 상보적인 3개의 프라이머를 사용하여 동정하였다. 서열 1은 서열 5'-AGA ATT TCA CCT CTG-3'을 갖는 18S 프라이머를 사용하여 얻었다. 서열 2는 서열 5'-CCT TCT CCC GAA ACG C-3'을 갖는 28S 프라이머를 사용하여 얻었다. 서열 3과 4는 서열 5'-TTC CGA CTT CCA TGG CCA CCG TCC-3'을 갖는 28S 프라이머를 사용하여 얻었다. 하기 서열을 특성화하고 균류의 rRNA에 혼성화 형성함을 증명하였다. 목적 서열을 갖는 대조물로서 맥주효모균, 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 대장균 및 사람의 rRNA의 서열을 사용하였다.
Figure kpo00097
18S rRNA에서 얻은 서열 1의 길이는 30염기이고, Tm은 68℃이었다. 23S rRNA에서 얻은 서열 2의 길이는 32염기이고, Tm은 67℃이었다. 23S rRNA에서 얻은 서열 3의 길이는 40염기이고, Tm은 66℃이었다. 23S rRNA에서 얻은 서열 4의 길이는 40 염기이고, Tm은 68℃이었다. 서열 1은 맥주 효모균의 위치 845-880에 대응하는 영역에서 혼성화하였다. 서열 2은 맥주 효모균의 28S rRNA의 위치 1960-2000에 대응하는 영역에서 혼성화하고, 서열 3과 4는 28S rRNA의 1225-1270의 영역에서 혼성화하였다.
균류의 RNA에 대한 이들 탐침의 반응성과 특이성을 검증 하기 위하여 이들을 혼성화 평가분석에 사용하였다.32P 또는125I로 표지한 올리고뉴클레오티드 탐침을, pH 6.8인 0.48M 인산나트륨 0.2ml, 1％ 소듐 도데실 술페이트, 1mM EDTA, 1mM EGTA중에서, 정제된 RNA 또는 표준 용해 기술에 의해 세포에서 방출된 RNA와 혼합시킨 후, 60℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 2％히드록시아파티트 5ml, pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 0.02％ 소듐 도데실 술페이트를 첨가하고 시료를 60℃에서 10분동안 인큐베이션시켰다. 시료를 원심분리하고 상징액을 제거하였다.
pH 6.8인 0.12M 인산나트륨 5ml, 0.02％ 소듐 도데실 술페이트를 첨가학, 시료를 혼합하고, 원심분리한 후, 상징액을 제거하였다.
결과를 표 69에 기재하였다. 탐침 1은 시험한 10종의 균류를 모두 검출하고, 탐침 2는 피검 6종의 이스트를 모두 검출하고, 탐침 3은 6종의 이스트 중 5종을 검출하고, 탐침 4는 칸디다 크루세이만을 검출하였다. 따라서, 탐침 4는 시료 중에서 칸디다 크루세이를 검출 및 동적하기 위하여 사용할 수 있고, 탐침 1, 2 또는 3과 4의 조합물은 이스트를 검출하기 위해 사용할 수 있고, 탐침 1은 표 69에 기재된 임의의 10종 세균을 검출하기 위하여 사용할 수 있다.
이들 탐침의 기능 용도는 요 시료 또는 기타 일반적인 살균 체액 중에서 이스트를 동정하는 것이다. 이 탐침을 요에서 가장 통상적으로 단리되는 일단의 세균에 혼성화시켰으며 반응하지 않는 것으로 밝혀졌다(표 70 참조). 표 71에 의해 이 탐침은 계통발생적으로 다양한 세균 또는 사람의 RNA에 혼성화하지 않음을 알 수 있었다.
[표 69]
이스트 RNA에 대한 이스트 탐침의 혼성화
Figure kpo00098
[표 70]
요에서 발견되는 생물체 RNA에 대한 균류 탐침 1-4의 혼성화
Figure kpo00099
[표 71]
Figure kpo00100
또한 다음과 같은 탐침 1의 두 유도체를 제조하였다.
Figure kpo00101
첫번째 유도체는 65℃에서 잘 작용하고, 두번째 유도체는 60℃에서 잘 작용하였다.
[실시예 21]
임질(Gonorrhea)은, 매년 환자가 이백만 이상으로 보고되는, 미국에서 가장 통상적으로 보고되는 세균 감염중의 하나이다. 이성적으로 전달되는 질병은 남성에게 전부요도염을 유발시키고, 여성의 경(經)을 수반한다. 치료를 받지 않은 개체에 있어서 심각한 합병증 및 불임성까지도 발생하는 반면, 무증후성 감염이 통상적인데, 이로서 무지하게 질병을 만연시키는 보균자가 존재하게 된다.
감염원인 임균(Neisseria gonorrhoeae)은 긴축 생장 요건을 갖는 그램 음성, 산화효소 보유 쌍구균 속(diplococcus)이다. 진단에 사용되는 방법은 감염 부위 및 환자의 증세에 의존하고 있다.
남성의 임균성 요도염은 그램 영역(gram stain)으로 양호한 민감도와 특이성으로 진단된다. 24-72시간을 요하는 배양은 일반적으로 모든 남성 및 무증후성 남성에게 임질의 진단을 확인하기 위해서 수행해야 한다. 배양액 중의 생장물에서 생물체를 검출한 후, 추가 시험, 예를 들면 탄수화물 분해, 공동응집, 형광 항체 스크리닝(fluorescent antibody screens) 또는 색소생성 효소기질 평가분석에 의해 임균을 동정해야 한다.
임균은 수막염균(N. meningitidis)에 매우 근친이므로 핵산 탐침을 사용하여 검출 및 구별하기가 특히 어렵다. 킹스베리[Kingsbury, D. T., J. Bacteriol. 제94호, 제870-제874페이지(1967년)참조]가 기술한 데이타에 의해 두종에 대한 DNA : DNA 상동성이 대략 80-94％임을 알 수 있다. Int'1 J. System. Bacteriol. 제37호, 제463-464페이지(1987년)의 Ad Hoc Committee on Reconciliation of Approaches Bacterial Systematics에 의해 확립된 지침에 따르면, 종의 계통발생적 정의는 일반적으로 70％ 이상의 DNA : DNA 상동성을 의미한다. 이들 생물체들은 확립된 원리 하에서 동일한 종으로 여길 수 있음에도 불구하고, 본 발명자들은 이를 구별할 수 있는 탐침을 제조할 수 있었다.
예상했던 바와 같이, 임균과 수막염균 사이의 상동성을 공지된 보존 영역때문에 훨씬 더 높았다. 본 발명자들은 서열화 데이타를 사용하여, 임균과 수막염균의 16S rRNA 서열간에 1.0％의 차이 및 23S rRNA서열간에 1.1％의 차이를 주목하였다.
임균과 수막염의 상이한 일부 부위에서, 기타 나이세리아(Neisseria) 종은 임균과 유사하다는 사실 때문에, 임균에 대한 탐침의 제조가 까다로왔다. 이들 두 종 사이에 존재하는 약간의 착오결합부는 가장 변이가 심한 영역, 예를 들면 종 간에서 뿐만 아니라 균주 간에서의 변이 영역에 존재하였다. 일부 사람들은 핵산 탐침을 사용하여 종을 전혀 구별할 수 없다고 믿으며, 다른 사람들은 rRNA가 너무 보존되어 있어서 탐침 진단학에는 사용할 수 없는 것으로 믿고 있는 사실에도 불구하고, 본 발명자들은 임균과 수막염균을 구별할 수 있는 탐침을 제조할 수 있었다.
본 발명은 선행 기술의 각 방법을 능가하는 현저한 잇점을 가지며, 탐침은 배양법보다 더 특이성이 있었고 신속하였다. 또한 이 탐침들은 선행 기술의 방법보다 민감한(예컨대, 임상시료에서 더 소수의 생물체를 검출할 수 있음)것으로 믿어진다.
이 탐침 서열을 동정하기 위해 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같았다.
Figure kpo00102
표적에 대해 선택된 각 rRNA 부위는 대장균, 수막염균, 나이세리아 시네리아(N. cinerea), 나이세리아 락타미카(N. lactamica), 나이세리아 뮤코사(N. mucosa) 및 킨젤라 킨개(kingella kingae)에 대해 적어도 2개의 착오결합부를 포함하였다.
탐침 영역에 인접한 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 호간(Hogan)등에 의해 "Means and Method for Enhancing Nucleic Acid Hybridization"라는 제목으로 1987년, 11월 24일자 출원된 미합중국 특허출원 번호 --(아직 미정임)["참고"특허출원(the "helper"patent application)]에 기재된 방법에 의해 혼성화 혼합물 중에 사용하였다.
하기 서열을 특성화하고 임균에 대해 특이적인 것으로 증명되었다. 임균의 서열을 갖는 대조물로서 계통 발생적 근친인 수막염균, 나이세리아 락타미카, 나이세리아 시네리아, 나이세리아 뮤코사, 킨젤라 킨개를 사용하였다.
Figure kpo00103
125-150 영역에서 16S rRNA에서 상보적인 서열 1은 길이가 17염기이고, Tm이 56℃이었다. 455-485영역에서 16S rRNA에 상보적인 서열 2는 길이가 21염기이고, Tm이 63℃이었다. 980-1015영역에서 16S rRNA에 상보적인 서열 3은 길이가 29염기이고 Tm이 57℃이었다.
임균에 대한 탐침의 반응성과 특이성을 혼성화 평가분석에 의해 임균에 대한 탐침의 반응성과 특이성을 검증하였다. 세개의 올리고뉴클레오티드 탐침을 요오드화하고 서열 5'-CCC CTG CTT TCC CTC TCT AGA CGT ATG CGG TAT TAG CTG ATC TTT CG-3', 5'-GCC TTT TCT TCC CTG ACA AAA GTC CTT TAC AAC CCG-3', 5'-GGC ACG TAG TTA GCC GGT GCT TAT TCT TCA GGT AC-3', 및 5'-GGT TCT TCG CGT TGC ATC GAA TTA ATC CAC ATC ATC CAC CGC-3'의 비표지 올리고뉴클레오티드 탐침, 및 정제된 RNA의 함께 pH 6.8인 0.48M 인산나트륨, 0.5％ 소듐도데실 술페이트(SDS) 중에서 혼합시킨 후, 60℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션후, 2％ 히드록시아파티트 4ml, pH 6.8인 0.12M 인산 나트륨, 0.02％ SDS를 첨가하고, 이 혼합물은 60℃에서 5분동안 인큐베이션시켰다. 시료를 원심분리한 후, 상징액을 제거하였다. 세척액(pH 6.8인 0.12M 인산나트륨, 2％ SDS) 5ml를 첨가하고, 시료를 혼합하고, 원심분리한 후, 상징액을 제거하였다. 히드록시아파티트에 결합된 방사능의 양을 감마 계수기로 측정하였다.
표 72에 의해, 탐침은 임균의 RNA에 훌륭히 혼성화되었으나, 기타 피검종에 잡종 형성하지 않음을 알 수 있었다.
[표 72]
나이세티아와 킨젤라의 RNA에 대한 임균 탐침 1-3의 혼성화
Figure kpo00104
또한 다음과 같은 나이세리아 속 탐침의 유도체를 제조하고 사용하였다.
Figure kpo00105
상기와 같이 행한 실시예가 이전에 기재된 표준 평가 분석 형식을 사용하여 측정한 것이나, 특이적인 탐침은 매우 다양한 실험 조건하에서 사용할 수 있다. 예를 들면 첨가제를 반응액에 포함시켜 혼성화를 가속화하기 위한 최적 반응 조건을 제공할 수 있다. 이와 같은 첨가제에는 완충액, 킬레이터, 유기 화합물 및 핵산 침전제(예, 세정제, 디히드록시벤젠, 소듐 도데실 술페이트, 소듐 디이소 부틸 술포숙시네이트, 소듐 테트라데실 술페이트), SO-24, PO-34Cl-1및 HCOO-1의 사코실 및 알칼리금속염 및 암모늄염이 포함될 수 있다. 이와 같은 첨가제는 일어나는 혼성화 반응에 대한 최적 조건을 제공하기 위하여 당업계의 기술자에 의해 활용될 수 있다. 단일 가닥 핵산 분자를 이중 가닥 분자의 혼성화를 가속시키기 위한 조건은, ACCELERATED NUCLEIC ACID REASSOCIATION METHOD라는 제목의 상기한 1984년 7월 5일자 미합중국 특허 출원 제627,795호, 및 1987년 6월 4일자 계속 출원(번호는 아직 미정임), 및 1986년 1월 7일자 출원된 특허 출원 제816,711호의 주제이다.
본 발명은 정제된 시료 또는 비정제된 임상 시료, 예를 들면 객담, 분변, 조직, 혈액, 척수 또는 활액 혈청, 요 또는 기타 체액, 또는 기타 시료, 예를 들면 환경 또는 식품 시료에서 얻은 비바이러스성 생물체 상에서 행할 수 있다.
세포 파괴 및 혼성화에 앞서, 세포를 현탁시키거나 용액 중에 유지시킬 수 있다.
상기한 비정제된 시료의 경우에, 평가 분석에 앞서 세포는 자신의 생물학적 환경 중에서 손상되지 않고 처리되지 않은 상태로 존재할 수 있다.
본 발명의 탐침은 단독으로 또는 상이한 탐침과 조합하여 평가 분석에 사용할 수 있다. 또한 핵산 합성도중 몇가지 개별적인 탐침들을 함께 연결시킬 수도 있다. 이와 같이하여 다수 탐침 서열, 및 이에 다른 다수의 특이성을 갖는 하나의 탐침 분자를 얻는다. 예를 들면, 실시예 1과 2에 기재된 마이코박테리움 아비움 및 마이코박테리움 인트라셀룰레어의 서열을 모두 갖는 단일 핵산분자를 합성할 수 있다. 마이코박테리움 아비움 또는 마이코박테리움 인트라셀룰레어의 탐침 중 하나와 혼성화시킬 경우, 이 탐침은 완전히 혼성화될 것이다. 이 두 탐침 서열이 평가분석에서 개별적으로 결합할 경우, 혼합된 각 탐침의 절반만이 마이코박테리움 아비움 또는 마이코박테리움 인트라셀루레어 중 하나의 rRNA와 혼성화할 것이다. 또한 첨구범위 내에서 기타 구체적인 실시예를 수행할 수도 있다. 예를 들면, 탐침을 기재된 바와 같이 여러가지 표지를 사용하여 표지화시킬 수 있고 진단용 킷트 내로 조입시킬 수도 있다. 일반적으로 종래의 키트들은 젠-프로브사에 의해 제조·판매된 키트들(예 : Legionella Repid Diagnostic System 및 Mycoplasma T. C. Detection Kit)에서 확인되는 바와 같이 탐침 용액, 분리 용액, 세척 용액, 양성 및 음성 대조 용액을 포함하고 있으며 추가로 용해제나 분석할 유기체 종류에 따라 박테리아 용해제 등을 추가로 함유할 수 있다.

Claims (269)

  1. 검출하고자 하는 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군에 고유한 것으로 선별된 rRNA의 영역에 혼성화되기에 충분히 상보적인 올리고뉴클레오티드를 구성하는 것으로 이루어지고, 이 rRNA의 영역은 상기 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군의 하나 이상의 변이 영역 rRNA 서열과, 이것과 구별하고자 하는 하나 이상의 비바이러스성 생물체에서 얻은 하나 이상의 변이 영역 rRNA 서열을 비교하여 선별된 것임을 특징으로 하는 정성 또는 정량적 혼성화 평가분석에서 사용하기 위한 탐침의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 구별하고자 하는 비바이러스성 생물체에서 얻은 변이 영역 rRNA 서열이 상기 검출하고자 하는 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체의 군에 대해 공지된 가장 근친인 생물체에서 얻은 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 rRNA의 영역이 검출하고자 하는 상기 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군에 대해 가장 근친인 생물체의 대응 RNA 서열과 적어도 약 하나의 상기한 염기 서열을 갖도록 선별하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 rRNA의 영역이 검출하고자 하는 상기 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군에 대해 가장 근친인 생물체의 대응 RNA 서열과 적어도 약 10％이상의 상이한 염기 서열을 갖도록 선별된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 rRNA의 영역이 5S, 16S 및 23S rRNA로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 rRNA의 영역이 5.0S, 5.8S, 18S 및 28S rRNA로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 적어도 약 10뉴클레오티드인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 약 15뉴클레오티드 내지 약 50뉴클레오티드인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 적어도 약 10뉴클레오티드인 방법.
  10. 제3항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 약 15뉴클레오티드 내지 약 50뉴클레오티드인 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 적어도 약 10뉴클레오티드인 방법.
  12. 제4항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 약 15뉴클레오티드 내지 약 50뉴클레오티드인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 탐침이 상기 rRNA 영역에 대해 75％ 내지 100％ 상보적인 방법.
  14. 길이가 적어도 약 10튜클레오티드인 올리고뉴클레오티드로 이루어지고, 여기에서 적어도 약 10개의 인접하는 뉴클레오티드가 비바이러스성 생성물 또는 생물체들에 고유한 것으로 선별된 핵산의 적어도 하나의 변이 영역에 실질적으로 상보적인 것임을 특징으로 하는 비바이러스성 생물체 또는 생물체들에 대한 혼성화 평가분석용 탐침.
  15. 비바이러스성 생물체 또는 생물체들에 고유한 것으로 선별된 핵산의 적어도 하나의 변이 영역에 적어도 약 75％ 상보적이고, 길이가 적어도 약 10 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 비바이러스성 생물체 또는 생물체들에 대한 혼성화 평가분석용 탐침.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 핵산이 5S, 16S, 또는 23S rRNA인 탐침.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 핵산이 5S, 5.8S, 18S, 또는 28S rRNA인 탐침.
  18. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium)인 탐침.
  19. 제18항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG로 되는 탐침.
  20. 제19항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  21. 서열 ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG로 되는 올리고뉴클레오티드 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 사이에서 형성되는 핵산 하이브리드.
  22. 구조가 ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG인 뉴클레오티드 중합체 및 그의 보체.
  23. 대장균(E.coli)의 16S rRNA의 염기 185-225에 대응하는 영역에서 마이코박테리움 아비움 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  24. 제23항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 사이에 형성되는 핵산 하이브리드.
  25. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 마이코박테리움 인트라셀루레어(Mycobacterium intracellulare)인 탐침.
  26. 제25항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG로되는 탐침.
  27. 제26항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  28. 서열 ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG로되는 올리고뉴클레오티드 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 사이에서 형성된 핵산 하이브리드.
  29. 구조가 ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG인 뉴클레오티드 중합체 및 그의 보체.
  30. 대장균의 16S rRNA의 염기 185-225에 대응하는 영역에서 마이코박테리움 인트라셀룰레어 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  31. 제30항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 사이에서 형성된 핵산 하이브리드.
  32. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 결핵균군 세균(Mycobacterium tuberculosis-complex bacteria)인 탐침.
  33. 제32항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원으로 되는 탐침.
    Figure kpo00106
  34. 제33항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  35. 하기 서열의 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 구성하는 군의 원(元)으로 되는 올리고뉴클레오티드 및 이들에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 간에 형성되는 핵산 하이브리드.
    Figure kpo00107
  36. 하기 서열의 뉴클레오티드 중합체들 및 이들에 대한 보체들로 이루어진 군의 원으로 되는 뉴클레오티드 중합체.
    Figure kpo00108
  37. 대장균의 16s rRNA의 염기 185-225에 대응하는 영역에서 결핵균군에 포함되는 종의 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  38. 제37항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  39. 대장균의 23S rRNA의 여기 540-575에 대응하는 영역에서 결핵균군에 포함되는 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  40. 제39항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  41. 대장균의 23S rRNA의 염기 1155-1190에 대응하는 영역에서 결핵균군에 포함되는 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  42. 제41항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  43. 대장균의 23S rRNA의 염기 2195-2235에 대응하는 영역에서 결핵균군에 포함되는 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴크레오티드 중합체.
  44. 제43항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  45. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 마이코박테리움 속인 탐침.
  46. 제45항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원으로 되는 탐침.
    Figure kpo00109
  47. 제46항에 의한 탐침 또는 그의 보체 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  48. 하기 서열의 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군의 원(元)으로 올리고뉴클레오티드 및 이들에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 간에 형성되는 핵산 하이브리드.
    Figure kpo00110
  49. 하기 서열의 뉴클레오티드 중합체들 및 이들에 대한 보체들로 이루어진 군의 원으로되는 뉴클레오티드 중합체.
    Figure kpo00111
  50. 대장균의 16S rRNA의 염기 1025-1060에 대응하는 영역에서 마이코박테리움속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  51. 제50항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  52. 대장균의 23S rRNA의 염기 1440-1475에 대응하는 영역에서 마이코박테리룸 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  53. 제52항에 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  54. 대장균의 23S rRNA의 염기 1515-1555에 대응하는 영역에서 마이코박테리움 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  55. 제54항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  56. 대장균의 23S rRNA의 염기 1570-1610에 대응하는 영역에서 마이코박테리움속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  57. 제56항의 뉴클레티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  58. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 마이코플라즈마 뉴모니애(Mycoplasmapneumoniae)인 탐침.
  59. 제58항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원으로 되는 탐침.
    Figure kpo00112
  60. 제59항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  61. 하기 서열의 올리고클레오티드들로 이루어진 군의 원(元)으로되는 올리고뉴클레오티드 및 이들에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 간에 형성되는 핵산 하이브리드.
    Figure kpo00113
  62. 하기 구조의 뉴클레오티드 중합체들 및 이들에 대한 보체들로 이루어진 군의 원으로되는 뉴클레오티드 중합체.
    Figure kpo00114
  63. 대장균의 16S rRNA의 염기 190-230에 대응하는 영역에서 마이코플라즈마 뉴모니에의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  64. 제63항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  65. 대장균의 16S rRNA의 염기 450-490에 대응하는 영역에서 마이코플라즈마 뉴모니에의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  66. 제65항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  67. 대장균의 16S rRNA의 염기 820-860에 대응하는 영역에서 마이코플라즈마 뉴모니에의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  68. 제67항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  69. 대장균의 16S rRNA의 염기 1255-1290에 대응하는 영역에서 마이코플라즈마 뉴모니에 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  70. 제69항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  71. 대장균의 5S rRNA의 염기 65-120에 대응하는 영역에서 마이코플라즈마 뉴모니에 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  72. 제71항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  73. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 레기오넬라속(the genus Legionella)인 탐침.
  74. 제73항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원인으로되는 탐침.
    Figure kpo00115
  75. 제74항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  76. 하기 서열의 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군의 원(元)으로되는 올리고뉴클레오티드 및 이들에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 간에 형성되는 핵산 하이브리드.
    Figure kpo00116
  77. 하기 구조의 뉴클레오티드 중합체들 및 이들에 대한 보체들로 이루어진 군의 원으로 되는 뉴클레오티드 중합체.
    Figure kpo00117
  78. 대장균의 16S rRNA의 염기 630-675에 대응하는 영역에서 레기오넬라 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  79. 제78항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  80. 대장균의 16S rRNA의 염기 975-1020에 대응하는 영역에서 레기오넬라 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  81. 제80항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  82. 대장균의 23S rRNA의 염기 350-395에 대응하는 영역에서 레기오넬라 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  83. 제82항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  84. 대장균의 23S rRNA의 염기 1585-1620에 대응하는 영역에서 레기오넬라 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  85. 제84항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  86. 대장균의 23S rRNA의 염기 2280-2330에 대응하는 영역에서 레기오넬라 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  87. 제86항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  88. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 클라미디아 트라코카티스(Chlamydia trachomatis)인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드기 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원으로 되는 탐침.
    Figure kpo00118
  90. 제89항의 탐침 또는 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  91. 하기 서열의 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군의 원(元)으로 되는 올리고뉴클레오티드 및 이들에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 간에 형성되는 핵산 하이브리드.
    Figure kpo00119
  92. 하기 구조의 뉴클레오티드 중합체들 및 이들에 대한 보체들로 이루어진 군의 원으로 되는 뉴클레오티드 중합체.
    Figure kpo00120
  93. 대장균의 16S rRNA의 염기 60-105에 대응하는 영역에서 클라미디아 트라코마티스 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  94. 제93항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산간에 형성된 핵산 하이브리드.
  95. 대장균의 16S rRNA의 염기 175-210에 대응하는 영역에서 클라미디아 트라코마티스 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  96. 제95항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  97. 대장균의 16S rRNA의 염기 600-635에 대응하는 영역에서 클라미디아 트라코마티스 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  98. 제97항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산간에 형성된 핵산 하이브리드.
  99. 대장균의 16S rRNA의 염기 830-870에 대응하는 영역에서 클라미디아 트라코마티스 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  100. 제99항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  101. 대장균의 23S rRNA의 염기 275-320에 대응하는 영역에서 클라미디아 트라코마티스 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  102. 제101항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  103. 대장균의 23S rRNA의 염기 330-365에 대응하는 영역에서 클라미디아 트라코마티스 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  104. 제103항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  105. 대장균의 23S rRNA의 염기 1160-1190에 대응하는 영역에서 클라미디아 트라코마티스 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  106. 제105항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  107. 대장균의 23S rRNA의 염기 1450-1490에 대응하는 영역에서 클라미디아 트라코마티스 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  108. 제107항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  109. 대장균의 23S rRNA의 염기 1510-1545에 대응하는 영역에서 클라미디아 트라코마티스 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  110. 제109항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  111. 대장균의 23S rRNA의 염기 1710-1750에 대응하는 영역에서 클라미디아 트라코마티스 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  112. 제111항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  113. 제31항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 캄필로박터(Campylobacter)인 탐침.
  114. 제113항에 있어서 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원으로 되는 탐침.
    Figure kpo00121
  115. 제114항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  116. 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원(元)으로되는 올리고뉴클레오티드 및 이들에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성되는 핵산 하이브리드.
    Figure kpo00122
  117. 하기 구조의 뉴클레오티드 중합체들 및 이들에 대한 보체들로 이루어진 군의 원으로 되는 뉴클레오티드 중합체.
    Figure kpo00123
  118. 대장균의 16S rRNA의 염기 405-428에 대응하는 영역에서 캄필로박터 속(the genus campylobacter)의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  119. 제118항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  120. 대장균의 16S rRNA의 염기 440-475에 대응하는 영역에서 캄필로박터 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  121. 제120항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  122. 대장균의 16S rRNA의 염기 705-735에 대응하는 영역에서 캄필로박터 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  123. 제122항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  124. 대장균의 16S rRNA의 염기 980-1010에 대응하는 영역에서 캄필로박터 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  125. 제124항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  126. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 장내구균(enterococci)으로서 공지된 연쇄상구균속(Streptococci)의 아-속군(sub-generic group)인 탐침.
  127. 제126항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA로 탐침.
  128. 제127항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  129. 서열 TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA로 되는 올리고뉴클레오티드 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성되는 핵산 하이브리드.
  130. 구조가 TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA인 뉴클레오티드 및 이것에 대한 보체.
  131. 대장균의 16S rRNA의 염기 825-860에 대응하는 영역에서 장내구균으로서 공지된 인쇄상구균 속의 아속군의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  132. 재131항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  133. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 제1군 슈도모나스속(Group I Psecudomonas)으로서 공지된 아속군인 탐침.
  134. 제133항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 서열 CAG ACA AA TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA로되는 탐침.
  135. 제134항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  136. 서열 CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT로 되는 올리고뉴클레오티드 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  137. 구조가 CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT인 뉴클레오티드 중합체 및 그의 보체.
  138. 대장균의 23S rRNA의 염기 365-405에 대응하는 영역에서 제1군 슈도모나스속으로서 공지된 아-속군의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  139. 제138항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  140. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae)인 탐침.
  141. 제140항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC인 탐침.
  142. 제141항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  143. 서열 GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC로의 올리고뉴클레오티드 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  144. 구조가 GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC인 뉴클레오티드 중합체 및 그의 보체.
  145. 대장균의 23S rRNA의 염기 305-340에 대응하는 영역에서 엔테로박터 클로아캐 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  146. 제145항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  147. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 기괴변형균(Proteus mirabilis)인 탐침.
  148. 제147항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC로되는 탐침.
  149. 제148항의 탐침 또는 그의 보테에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  150. 서열 CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC로되는 올리고뉴클레오티드 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산간에 형성된 핵산 하이브리드.
  151. 구조가 CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC인 뉴클레오티드 중합체 및 그의 보체.
  152. 대장균의 23S rRNA의 염기 270-305에 대응하는 영역에서 기괴변형균 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  153. 제152항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  154. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 살모넬라속(the genus Salmonella)인 탐침.
  155. 제154항에 있어서 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원으로 되는 탐침.
    Figure kpo00124
  156. 제155항의 탐침 또는 이것의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 탐침.
  157. 하기 서열의 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군의 원(元)으로 되는 올리고뉴클레오티드 및 이들에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성되는 핵산 하이브리드.
    Figure kpo00125
  158. 하기 구조의 뉴클레오티드 중합체들 및 이들에 대한 보체들로 이루어지는 군의 원으로되는 뉴클레오티드 중합체.
    Figure kpo00126
  159. 대장균의 16S rRNA의 염기 335-375에 대응하는 영역에서 살모넬라 속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  160. 제159항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  161. 대장균의 23S rRNA의 염기 335-375에 대응하는 영역에서 살모넬라속의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  162. 제161항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실직적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  163. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 대장균(Escherichia coli)인 탐침.
  164. 제163항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 GCA CAT TCT CAT CTC TGA AA CTT CCG TGG로되는 탐침.
  165. 제164항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  166. 서열 GCA CAT TCT CAT CTC TGA AAA CTT CCG TGG로되는 올리고뉴클레오티드 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 간에 형성된 핵산 하이브리드.
  167. 구조가 GCA CAT TCT CAT CTC TGA AAA CTT CCG TGG인 뉴클레오티드 중합체 및 그의 보체.
  168. 16S rRNA의 염기 995-1030에 대응하는 영역에서 대장균 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  169. 제168항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  170. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 이 계통발생군적 군의 세균인 탐침.
  171. 제170항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원으로되는 탐침.
    Figure kpo00127
  172. 제170항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  173. 하기 서열의 올리고뉴클레오티드들로 이루어지는 군의 원(元)으로되는 올리고뉴클레오티드 및 이것에 대해 실질적으로 유사한 핵산 서열간에 형성되는 핵산 하이브리드.
    Figure kpo00128
  174. 하기 구조의 뉴클레오티드 중합체들 및 이들에 대한 보체들로 이루어지는 군의 원으로 되는 뉴클레오티드 중합체.
    Figure kpo00129
  175. 대장균의 16S rRNA의 염기 330-365에 대응하는 영역에서 계통발생적 군의 세균의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  176. 제175항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 간에 형성된 핵산하이브리드.
  177. 대장균의 16S rRNA의 염기 675-715에 대응하는 영역에서 계통발생적 군의 세균의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  178. 제177항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 간에 형성된 핵산하이브리드.
  179. 대장균의 16S rRNA의 염기 1080-1110에 대응하는 영역에서 계통발생적 군의 세균의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  180. 제179항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 간에 형성된 핵산하이브리드.
  181. 대장균의 23S rRNA의 염기 460-490에 대응하는 영역에서 계통발생적 군의 세균의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  182. 제181항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 간에 형성된 핵산하이브리드.
  183. 대장균의 23S rRNA의 염기 1050-1080에 대응하는 영역에서 계통발생적 군의 세균의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  184. 제183항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산하이브리드.
  185. 대장균의 23S rRNA의 염기 1900-1960에 대응하는 영역에서 계통발생적 군의 세균의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  186. 제185항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열 간에 형성된 핵산하이브리드.
  187. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 균류인 탐침.
  188. 제187항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원으로 되는 탐침.
    Figure kpo00130
  189. 제188항의 탐침 또는 그의 보체에 대해 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  190. 하기 서열의 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군의 원(元)으로되는 올리고뉴클레오티드 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성되는 핵산 하이브리드.
    Figure kpo00131
  191. 하기 구조의 뉴클레오티드 중합체들 및 이들에 대한 보체들로 이루어진 군의 원으로 되는 뉴클레오티드 중합체.
    Figure kpo00132
  192. 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae)의 18S rRNA의 위치 845-880에 대응하는 영역에서 계통 발생적 군의 균류(Fungi)의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  193. 제192항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  194. 맥주 효모균의 28S rRNA의 위치 1960-2000에 대응하는 영역에서 계통발생적 군의 균류의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  195. 제194항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  196. 맥주 효모균의 28S rRNA의 위치 1255-1270에 대응하는 영역에서 계통발생적 군의 균류의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체
  197. 제196항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  198. 제14항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체가 임균(Neisseria gonorrhoeae)인 탐침.
  199. 제198항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군의 원으로 되는 탐침.
    Figure kpo00133
  200. 제199항의 탐침 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  201. 하기 서열의 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군의 원(元)으로되는 올리고뉴클레오티드 및 이들에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성되는 핵산 하이브리드.
    Figure kpo00134
  202. 하기 구조의 뉴클레오티드 중합체들 및 이들에 보체들로 이루어지는 군의 원으로 되는 뉴클레오티드 중합체.
    Figure kpo00135
  203. 대장균의 16S rRNA의 염기 125-150에 대응하는 영역에서 임균 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  204. 제203항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  205. 대장균의 16S rRNA의 염기 455-485에 대응하는 영역에서 임균 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  206. 제205항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  207. 대장균의 16S rRNA의 염기 980-1015에 대응하는 영역에서 임균 종의 RNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체.
  208. 제207항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  209. 제14항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 상기 rRNA 영역에 완전히 상보적인 탐침.
  210. 제14항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이가 약 20뉴클레오티드 내지 약 50뉴클레오티드인 탐침.
  211. 제14항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 rRNA의 영역에 적어도 약 95% 상보적인 탐침.
  212. (1) 비바이러스성 생물체 또는 생물체들에 대해 평가 분석하고자 하는(인간을 제외한 생물체의)시료에서 얻은 임의의 rRNA를, 상기 비바이러스성 생물체 또는 생물체들에 대해 고유한 것으로 선별된 rRNA의 변이 영역에 적어도 약 75％상보적인 적어도 약 10뉴클레오티드의 길이의 올리고뉴클레오티드 탐침과 함께 반응시키고, (2) 이 반응을 올리고뉴클레오티드 탐침 및 충분히 상보적인 임의의 시료 rRNA간에 혼성화가 일어날 수 있는 조건하에서 행하고, (3) 상기 혼성화를 관찰 및 (또는) 측정하는 것으로 되는, 혼성화의 평가분석법.
  213. 제212항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 탐침 및 임의의 표적 시료 rRNA간의 혼성화가 적어도 약 10％ 내지 약 100％인 평가분석법.
  214. 제212항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 탐침이 cDNA인 평가분석법.
  215. 제212항에 있어서, 상기 조건이 Tm의 약 25℃ 이하 내지 Tm의 약 1℃ 이하의 온도를 포함하는 평가분석법.
  216. 제212항에 있어서, 추가로, 양성의 이동성 대조군, 또는 양성의 이종성 대조군, 또는 이들 모두의 평행(parallel) 평가분석법으로 이루어지는 평가분석법.
  217. 제212항에 있어서, 추가로 음성의 대조군(egative control)의 평행 평가 분석으로 되는 평가분석법.
  218. 제212항에 있어서, 상기 조건이 혼성화의 속도를 증가시키기 위한 시약을 포함하는 평가분석법.
  219. 제212항에 있어서, 상기 조건이 올리고뉴클레오티드 탐침과 임의의 상보적인 시료 rRNA간에 최대 혼성화 및 올리고뉴클레오티드 탐침과 임의의 비-상보성 시료 rRNA간에 최소의 교차 -반응성을 촉진시키기 위한 것으로 되는 평가분석법.
  220. 제212항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 탐침이 표지화된 것인 평가분석법.
  221. 제220항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 탐침이 동위 원소, 비동위 원소 또는 화학루미네센스 표지로 표지화된 것인 평가분석법.
  222. 제212항에 있어서, 추가로 함께 반응시키는 단계에 앞서 상기 비바이러스성 생물체 또는 상기 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 세포에서 rRNA를 방출시키는것으로 평가분석법.
  223. 제212항에 있어서, 상기 비바이러스성 생물체 또는 생물체들이 마이코박테리움 아비움, 마이코박테리움 인트라셀룰레어, 결핵균군 세균, 마이코박테리움 속, 마이코플라즈마 뉴모니애, 레기오넬라, 살모넬라속, 클라미디아 트라코마티스, 캄필로박터, 기괴변형균, 장내구균 속, 엔테로박터 클로아캐, 대장균, 슈도모나스 속제I군, 세균 또는 균류인 평가분석법.
  224. 제212항에 있어서, 상기 표지된 올리고뉴클레오티드의 길이가 약 20뉴클레오티드 내지 약 50뉴클레오티드인 평가분석법.
  225. 제212항에 있어서, 상기 표지된 올리고뉴클레오티드가 상기 rRNA의 변이 영역에 대해 적어도 약 95％상보적인 평가분석법.
  226. 제212항에 있어서, 추가로, 길이가 적어도 약 10뉴클레오티드이고 상기 비바이러스성 생물체에 대해 고유한 것으로 선별된 rRNA의 하나 이상의 추가 변이 영역에 대해 적어도 약 75％ 상보적인, 하나 이상의 추가의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것으로 되는 평가분석법.
  227. 제212항에 있어서, 추가로 하나 이상의 추가의 비바리어스성 생물체를 동정하는 하나 이상의 추가의 탐침을 사용함으로써, 평가분석되는 비바이러스성 생물체의 군이 확장되는 평가분석법.
  228. 시료 중에 존재할 수 있는 적어도 하나의 비표적 생물체 또는 군 또는 비표적 생물체들로부터, 검출하고자 하는 표적 비바리어스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체의 군을 구별하기 위해 선별된 DNA 또는 rRNA의 영역에 혼성화하기에 충분히 상보적인 뉴클레오티드 중합체르 구성하는 것으로 이루어지며, 상기 선별된 DNA 또는 rRNA의 영역은, 검출하고자 하는 상기 비바리어스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군의 하나 이상의 DNA 또는 rRNA 서열과 비교하고, 상기 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군의 하나 이상의 DNA 또는 rRNA 서열을 상기 비표적 생물체 또는 비표적 생물체들의 군의 하나 이상의 DNA 또는 rRNA 서열을 상기 비표적 생물체 또는 비표적 생물체들의 군의 하나 이상의 DNA 또는 rRNA 서열을 갖는 상동체에 대해 선열함으로써 선별하고, 검출하고자 하는 상기 비바이러스성 생물체 또는 비바리어스성 생물체의 군의 DNA 또는 rRNA의 영역에 대한 상기 탐침 올리고뉴클레오티드의 상동성을 실질적으로 최대화하는 반면, 구별하고자 하는 상기 비표적 생물체 또는 생물체들의 군의 DNA 또는 rRNA 서열에 대한 상기 뉴클레오티드 중합체의 상동성을 실질적으로 최소화함으로써 상기 뉴클레오티드 중합체를 선별함으로써 선별된 것임을 특징으로 하는 정성 또는 정량적 혼성화 평가분석에 사용하기 위한 탐침 또는 탐침 조합물의 제조 방법.
  229. 제228항에 있어서, 상기 비표적 생물체 또는 생물체들의 군이 상기 표적 생물체
    또는 생물체들의 군의 계통발생적 근친인 방법.
  230. 제227항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 중합체가 검출하고자 하는 상기 비바이러스성 생물체 또는 생물체의 군의 DNA 또는 rRNA의 영역에 대해 적어도 약 90％의 상동성을 갖는 것인 방법.
  231. 제227항에 있어서, 상기 탐침 올리고뉴클레오티드가 검출하고자 하는 상기 계통발생적 근친의 DNA 또는 rRNA서열에 대해 약 90％미만의 상동성을 갖는 것인 방법.
  232. 제228항, 제229항, 제230항 또는 제231항에 있어서, 상기 탐침 올리고뉴클레오티드를 상기 탐침에 의해 검출하고자하는 비바이러스성 생물체의 군에 혼성화시킴으로써 상기 탐침의 비-교차 반응성을 검증하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  233. 검출하고자 하는 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군에 대해 고유한 것으로 선별된 DNA 또는 rRNA의 영역에 혼성화하기에 충분히 상보적인 올리고뉴클레오티드를 구성하는 것으로 이루어지며, 상기 DNA 또는 rRNA의 영역은, 검출하고자 하는 상기 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군의 하나 이상의 DNA 또는 rRNA 서열을 그의 계통발생적 근친의 하나 이상의 DNA 또는 rRNA 서열을 갖는 상동체와 비교하고, 상기 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체의 군의 상기 DNA 또는 rRNA의 서열을 상기 계통발생적 근친의 상기 DNA 또는 rRNA 서열을 갖는 상동체에 대해 선별함으로써 종간의 초변이 DNA 또는 rRNA영역을 밝혀내고 검출하고자 하는 상기 비바이러스성 생물체 또는 바이러스성 생물체의 군의 상기 DNA 또는 rRNA 영역에 대한 상기 탐침 올리고뉴클레오티드의 상동성을 실질적으로 최대화하는 반면, 구별하고자 하는 상기 계통발생적 근친의 DAN 또는 rRNA 서열에 대한 상기 탐침 올리고뉴클레오티드의 상동성을 실질적으로 최소화함으로써 상기 종간 초변이 영역에 상기 탐침 올리고뉴클레오티드를 선별함으로써 선별된 것임을 특징으로 하는 정성 또는 정량적 혼성화 평가분석에 사용하기 위한 탐침의 제조 방법.
  234. 제233항에 있어서, 상기 탐침 올리고뉴클레오티드가 검출하고자하는 상기 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군의 상기 DNA 및 rRNA의 영역에 적어도 약 90％의 상동성을 갖는 것인 방법.
  235. 제233항에 있어서, 상기 탐침 올리고뉴클레오티드가 구별하고자 하는 상기 계통발생적 근친의 DNA 또는 rRNA 서열에 대해 약 90％ 미만의 상동성을 갖는 것인 방법.
  236. 제233항, 제234항 또는 제235항에 있어서, 상기 탐침 올리고뉴클레오티드를 상기 탐침에 의해 구별하고자 하는 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군에 혼성화시킴으로써 상기 탐침의 비-교차 반응성을 검증하는 추가 단계로 이루어지는 방법.
  237. 대장균의 16S rRNA의 염기 60-100에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 16S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  238. 제237항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  239. 대장균의 16S rRNA의 염기 120-150에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 16S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 구성된 탐침.
  240. 제239항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  241. 대장균의 16S rRNA의 염기 170-230에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 16S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  242. 제241항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  243. 대장균의 16S rRNA의 염기 405-480에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 16S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  244. 제243항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  245. 대장균의 16S rRNA의 염기 600-670에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 16S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  246. 제245항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  247. 대장균의 16S rRNA의 염기 820-860에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 16S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  248. 제247항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  249. 대장균의 16S rRNA의 염기 980-1050에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 16S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  250. 제249항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  251. 대장균의 16S rRNA의 염기 1250-1290에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 16S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  252. 제251항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  253. 대장균의 23S RNA의 염기 270-390에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 23S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  254. 제253항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  255. 대장균의 23S rRNA의 염기 535-560에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 23S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  256. 제255항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  257. 대장균의 23S rRNA의 염기 1150-1200에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 23S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  258. 제257항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  259. 대장균의 23S rRNA의 염기 1440-1600에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 23S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  260. 제259항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  261. 대장균의 23S rRNA의 염기 1710-1750 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 23S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  262. 제261항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  263. 대장균의 23S rRNA의 염기 2190-2330에 대응하는 영역에서 비바이러스성 생물체 또는 생물체들의 군의 23S 유사 rRNA에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 중합체로 이루어진 탐침.
  264. 제263항의 뉴클레오티드 중합체 및 이것에 대해 실질적으로 상보적인 핵산 서열간에 형성된 핵산 하이브리드.
  265. 제212항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드와 분석하고자는 시료로부터의 rRNA를 용액내에서 반응시키는 것으로 되는 평가분석법.
  266. 제212항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 용액내에, 분석하고자 하는 시료로부터의 rRNA는 고체지지상에 고정화된 상태로 반응시키는 것으로 되는 평가분석법.
  267. 탐침 용액, 분리용액, 세척 용액, 양성 대조 용액 및 음성 대조 용액으로 이루어진 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군을 검출하기 위한 혼성화 평가분석용 키트에 있어서, 제31항의 탐침을 사용하는 것을 특징으로 하는 키트.
  268. 제267항에 있어서, 상기 탐침이 15 내지 50개의 뉴클레오티드로 된 키트.
  269. 제267항에 있어서, 상기 탐침이 비바이러스성 생물체 또는 비바이러스성 생물체들의 군에 고유한 것으로 선별된 핵산의 하나 이상의 변이 영역에 대해 약 75-100％의 상보성을 갖는 키트.
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