DE102004025710A1 - Verfahren zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und Zellsortierung auf grampositive Bakterien und Vorrichtungen hierfür - Google Patents

Verfahren zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und Zellsortierung auf grampositive Bakterien und Vorrichtungen hierfür Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und/oder Zellsortierung auf grampositive Bakterien. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zum Identifizieren und Sortieren von grampositiven Bakterien und Vorrichtungen zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und/oder Zellsortierung auf grampositive Bakterien, beispielsweise Mikrotiterplatten und Objektträger, bereit.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und/oder Zellsortierung auf grampositive Bakterien. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung einen Kit und Vorrichtungen hierfür bereit.
  • Verschiedene Verfahren zur Einordnung von Mikroorganismen sind derzeit bekannt. So können beispielsweise Mikroorganismen anhand von morphologischen und physiologischen Kriterien eingeordnet werden. Eine derartige Einordnung führt jedoch teilweise zu einer falschen phylogenetischen Klassifikation. Weiterhin können genetische Daten zur Einordnung von Mikroorganismen durch Sequenzierverfahren gewonnen werden, wobei diese Verfahren eine exaktere phylogenetische Einteilung ermöglichen.
  • Ein kultivierungsunabhängiges Verfahren zur Anreicherung von Bakterien anhand von rRNS gerichteten Biotin-UTP markierten Transkript-Polynukleotidsonden wurde erstmals 1999 von Stoffels et al. entwickelt (Stoffels, M., Ludwig, W., Schleifer, K.H., (1999) rRNA probe-based cell fishing of bacteria. Environ. Microbiol. 1(3), 259–271.) Bei diesem Verfahren werden die Sonden mit den Bakterien hybridisiert und die so hybridisierten Zellen mit paramagnetischen Streptavidin beschichteten Partikeln inkubiert. Über eine magnetische Säule erfolgt anschließend eine Separation zwischen Zielzellen und Nicht-Zielzellen, wobei die Zielzellen, die paramagnetischen Kügelchen gebunden hatten, in der Säule fixiert bleiben und die unmarkierten Nicht-Zielzellen, die keine paramagnetischen Kügelchen gebunden hatten, durch die Säule durchsickern und anschließend ausgewaschen werden. Nach Ausschalten des magnetischen Feldes können dann die Zielzellen eluiert werden.
  • Bei Nachweisverfahren, die Hybridisierungsschritte umfassen, führen bekanntermaßen grampositive Bakterien zu Schwierigkeiten, da sie durch ihre, im Vergleich mit den gramnegativen Bakterien dicke Zellwand (etwa 30–80 nm), problematisch bei einer Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden und Polynukleotidsonden sind, da das Eindringen einer ausreichenden Menge von Oligonukleotidsonden und Polynukleotidsonden in die grampositiven Zellen durch die dicke Mureinschicht verhindert oder erschwert wird.
  • Darüber hinaus sind verschiedene Verfahren zur Identifizierung von grampositiven Bakterien bekannt, bei denen eine Lysis der Zellen erfolgt. Dies ist jedoch von Nachteil, da die Zellen dabei zerstört werden.
  • Neben einer zuverlässigen taxonspezifischen Identifizierung, ist weiterhin eine sichere und schnelle taxonspezifische Anreicherung von Bakterien, ein zentrales Erfordernis in der Mikrobiologie.
    •
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung eines Verfahrens, das eine taxonspezifische Identifizierung von grampositiven Bakterien ermöglicht, wobei die Identifizierung in hohem Maße zuverlässig durchführbar sein sollte und für einen Einsatz bei modernen Analyseverfahren, beispielsweise für eine fluoreszenzspektroskopische Detektion, und bei Untersuchungsverfahren, die einen hohen Durchsatz an zu untersuchenden Proben ermöglichen, geeignet sein sollte. Ein derartiges Verfahren sollte auch in Gegenwart anderer Bakterien, sowohl grampositiver, als auch gramnegativer Bakterien, durchführbar sein und mit Schritten zur taxonspezifischen Anreicherung von Bakterien vereinbar sein. Darüber hinaus sollte bei einem erfindungsgemäßen Verfahren keine vollständige Lysis der Zellen eintreten.
  • Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur taxonspezifischen Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung auf grampositive Bakterien, welches umfasst: Fixieren von Bakterien eines zu untersuchenden Bakteriengemisches, Permeabilisieren der Zellwand der in dem Bakteriengemisch enthaltenen grampositiven Bakterien, und Kontaktieren des Bakteriengemisches mit einer für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Nukleotidsonde, wobei das eine oder die mehreren grampositiven Bakterien einem Taxon angehören und wobei eine Hybridisierungsreaktion zwischen dem einen oder den mehreren grampositiven, einem Taxon angehörenden Bakterien und der spezifischen Nukleotidsonde erfolgt, und Sortieren und/oder Identifizieren der Bakterien, bei welchen eine Hybridisierungsreaktion mit der für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Nukleotidsonde erfolgt ist.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt eine Agarosegelelektrophorese der verwendeten Polynukleotidsonden.
  • 2 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit Staphylococcus saprophyticus (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung).
  • 3 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit Staphylococcus aureus (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung).
  • 4 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit PFA-fixierten Staphylococcus haemolyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 7 min bei 200°C).
  • 5 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung von Staphylococcus haemolyticus mit der Sonde von Staphylococcus epidermidis (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 7 min bei 200°C).
  • 6 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung von Staphylococcus saprophyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung) in Mischung mit Enterobacter aerogenes.
  • 7 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus faecium (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 7 min bei 200°C).
  • 8 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus durans (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C).
  • 9 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Staphylococcus epidermidis (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C).
  • 10 zeigt die Abreicherungen von Staphylokokken nach Behandlung ihrer Zellwand nach verschiedenen Methoden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein zuverlässiges Verfahren zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und/oder Zellsortierung von grampositiven Bakterien bereit, das eine einfache Auswertung ermöglicht und optional mit Schritten zur Zellanreicherung gekoppelt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zudem für eine Anpassung an verschiedenste Detektionsverfahren des Stands der Technik und kann bei Anwendungen eingesetzt werden, die einen hohen Durchsatz an Proben ermöglichen, beispielsweise für Reaktionen auf Mikrotiterplatten.
  • Während der zahlreichen Versuche, die zu der vorliegenden Erfindung führten, zeigte es sich überraschenderweise, dass eine zuverlässige und eindeutige taxonspezifische Identifizierung von grampositiven Bakterien auf Basis von Polynukleotid-Sonden möglich ist, wobei die Sonden durch die Zellwand in die Zelle eindringen und dort an eine Zielsequenz binden, während ein Teil der Sonde aus der Zelle herausragt. Aufgrund des Aufbaus der Zellwand und/oder der Zellhülle von grampositiven Bakterien wurde bislang nicht angenommen, dass ein Eindringen von Polynukleotid-Sonden in die Zellen von grampositiven Bakterien in ausreichender Menge möglich wäre, um eine zuverlässige und klar auswertbare Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung zu ermöglichen.
  • Eine derartige zuverlässige und klar auswertbare Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung wird nunmehr durch das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet, das insbesondere eine schnelle und gegebenenfalls gemeinsame Behandlung zur optimalen Permeabilisierung der Zellwand und Zellmembran unterschiedlicher grampositiver Bakterien vor der Hybridisierung bereitstellt. Bei Hybridisierungen in Mischungen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren aus grampositiven und gramnegativen Organismen, war die Spezifität der Polynukleotidsonde für den Organismus, von dessen DNS sie generiert wurde, gegeben.
  • Der Begriff "Taxon", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezeichnet sowohl Zusammenfassungen von Familien, wie beispielsweise Streptococcaceae oder Enterococcaceae, als auch von Unterfamilien, Gattungen und Arten. Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher, dass eine Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung durchgeführt wird, die sowohl auf verschiedene Familien von grampositiven Bakterien gerichtet sein kann, als auch auf bestimmte Bakterienarten und ggf. für höhere Taxa, insbesondere bei Einsatz von Sondengemischen.
  • In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens zur taxonspezifischen Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung auf grampositive Bakterien werden die Bakterien eines zu untersuchenden Bakteriengemisches, das unterschiedliche Familien, Unterfamilien, Gattungen und Arten von Bakterien umfassen kann, fixiert. Hierzu kann in Abhängigkeit von spezifischen Aufgaben beispielsweise eine Zellfixierung mit wässriger Paraformaldehydlösung oder Ethanol erfolgen.
  • In einem weiteren Verfahrensschritt findet eine Permeabilisierung der Zellwand der grampositiven Bakterien statt, was ein zuverlässiges Eindringen der Nukleotidsonden ermöglicht, derart dass eine zuverlässige Identifizierung und/oder Sortierung der Zellen stattfinden kann. Die Permeabilisierung kann hierbei beispielsweise durch Einsatz von Enzymen erfolgen. Anschließend erfolgt ein Kontaktieren des Bakteriengemisches mit einer für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Nukleotidsonde, wobei das eine oder die mehreren grampositiven Bakterien einem Taxon angehören und wobei eine positive Hybridisierungsreaktion zwischen dem einen oder den mehreren grampositiven, einem Taxon angehörenden Bakterien und der hierfür spezifischen Nukleotidsonde erfolgt.
  • Anschließend erfolgt ein Sortieren und/oder Identifizieren der Bakterien, bei welchen eine Hybridisierungsreaktion mit der für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Nukleotidsonde erfolgt ist. Hierbei können beliebige dem Fachmann bekannte Verfahren des Stands der Technik zum Sortieren und/oder Identifizieren der Bakterien eingesetzt werden, beispielsweise Sortieren: Immobiliserung, Durchflusszytometer, Mikromanipulator; Identifizieren: Fluoreszenz-, Laserscannigmikroskopie, Durchflusszytometer.
  • Die grampositiven Bakterien können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Staphylokokken und Enterokokken. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahrensschritte zur Entwicklung und Optimierung von gemeinsamen Behandlungsmethoden für eine ausreichenden Permeabilisierung der Zellwand von Staphylococcus saprohyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus und Staphylococcus epidermidis, zur Entwicklung und Optimierung von gemeinsamen Behandlungsmethoden für eine ausreichende Permeabilisierung der Zellwand von Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans und Enterococcus gallinarum, und darüber hinaus zur Entwicklung und Optimierung von gemeinsamen Behandlungsmethoden für eine ausreichende Permeabilisierung der Zellwand von Staphylococcus saprohyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, Enterococcus gallinarum, bereit.
  • Hierzu stellt die vorliegende Erfindung insbesondere verschiedene Verfahren bereit, die es ermöglichten, die Zellwand von Staphylokokken (Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis) und Enterokokken (Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, Enterococcus gallinarum) derart zu permeabilisieren, dass es nach der Hybridisierung zur Bildung von Halos, wie nachstehend beschrieben, kommt. Hybridisierungen des Stands der Technik mit Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, und Enterococcus gallinarum ohne vorrausgehende Behandlung ihrer Zellwand führten zu keinem detektierbaren Signal.
  • Vorteilhaft ist, dass bei einem erfindungsgemäßen Verfahren in dem Bakteriengemisch sowohl grampositive, als auch gramnegative Bakterien enthalten sein können, wobei eine eindeutige Detektion der grampositven Bakterien trotz Anwesenheit der gramnegativen Bakterien erfolgen kann.
  • Die Zellwand von grampositiven Bakterien besitzt ein vielschichtiges Mureinnetz, das manchmal mit Polysacchariden, häufig mit Polyolphosphaten verknüpft ist. Ohne eine erfindungsgemäße Vorbehandlung dieser Zellen ist die Zellwand für die ggf. markierten Sonden nicht durchlässig. Das Permeabilisieren der Zellwand der grampositiven Bakterien kann enzymatisch erfolgen, wobei dem Fachmann bekannte lytische Enzyme, wie beispielsweise Lysozym oder Lysostaphin, als Enzyme verwendet werden können. Insbesondere kann eine Behandlung mit Lysozym, eine Behandlung mit Lysostaphin, oder Kombinationen hiervon, und/oder eine Behandlung durch Erhitzen erfolgen. Die Zeitdauer und Temperatur einer Behandlung durch Erhitzen (insbesondere einer Inkubation bei erhöhter Temperatur) kann gemäß dem Wissen des Fachmanns gewählt werden. Beispielsweise kann die Temperatur mindestens 70 °C betragen. Vorzugsweise beträgt die Temperatur 150 °C bis 220°C, mehr bevorzugt 195°C bis 205 °C.
  • Der Begriff "Nukleotidsonde", wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, umfasst sowohl Oligo-, als auch Polynukleotidsonden. Oligonukleotidsonden umfassen hierbei mindestens 15 Nukleotide. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können in Abhängigkeit von dem angestrebten Detektionsverfahren insbesondere Polynukleotidsonden mit einer Länge von 100 bis 500 Nukleotiden, vorzugsweise von 200 bis 300 Nukleotiden verwendet werden.
  • Die für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifische Nukleotidsonde kann eine Transkript-Polynukleotidsonde sein. Für eine erfindungsgemäße phylogenetische Aufklärung kommen beispielsweise ribosomale RNS-Moleküle, insbesondere die ribosomalen RNS-Moleküle 16S und 235, in Betracht. Ribosomale RNS-Moleküle können dazu dienen den Verlauf der Evolution zu rekonstruieren, da sie eine funktionelle Homologie in allen Organismen zeigen, ihre Sequenzen aus variablen und stark konservativen Bereichen bestehen und sie aufgrund ihrer Länge genügend Sequenz-Informationen enthalten, um einen statistisch ausreichenden Vergleich zu gewährleisten. Vorzugsweise kommen daher Transkript-Polynukleotidsonden in Betracht, die auf einen DNA-Abschnitt gerichtet sind, der für eine Region innerhalb von bakterieller 16S rRNS oder 23S rRNS kodiert.
  • Insbesondere kann die Transkript-Polynukleotidsonde eine Transkript-Polynukleotidsonde sein, die auf einen DNA-Abschnitt gerichtet ist, der für eine hoch variable Region innerhalb der Domäne III von bakterieller 23S rRNS kodiert. Derartige Sonden können durch in vitro Transkription amplifizierter rDNA dieser hoch variablen Region innerhalb der Domäne III mit Biotin-markierten UTP hergestellt werden und ermöglichen eine gruppenspezifische Erfassung von Mikroorganismen. Bei einer gezielten Verwendung bestimmter Sequenzen kann die kultivierungsunabhängige Erfassung entweder übergeordneter Gattungen oder spezifischer Arten bis Unterarten ermöglicht werden. Im Falle von bakterieller rRNS kann insbesondere von Vorteil sein, dass die Ribosomen an denen es zu einer Bindung der Transkriptsonde kommt, in den peripheren Bereichen der Zellwand lokalisiert sind.
  • Spezifische rRNS-gerichtete Oligonukleotidsonden können beispielsweise mit der im Programmpaket ARB implementierten Funktion „Probe-Design" entwickelt werden (Strunk, 0. und Ludwig, W., (2001) ARB- a software environment for sequence data, München; http://www.arb-home.de). Die Spezifität der Sonden anderen Organismen gegenüber kann beispielsweise mittels der Funktion „Probe-Match" des Programmpaketes ARB überprüft werden.
  • Für verschiedene Sortierungs- und Identifizierungsverfahren ist es vorteilhaft, wenn die Sonden zum Teil aus der Zelle herausragen. Falls beispielsweise eine Fluoreszenz in situ Hybridisierung als Detektionsverfahren angestrebt wird, binden diese markierten Polynukleotidsonden an die Ziel-rRNS und ein Teil der Sonden ragt aus der Zelle heraus, wobei durch intermolekulare partielle Hybridbildung eine Art Netzwerk gebildet wird und es zur Bildung eines sog. Halos (engl. Heiligenschein) um die Zelle herum kommt. Dieser Halo erlaubt zum einen eine Detektion der Zellen im Epifluoreszenzmikroskop mit dem Streptavidin-Fluorescein System, zum anderen eine Anreicherung durch Paarung der herausragenden Teile der Polynukleotidsonden mit immobilisierten einzelsträngigen DNA-Abschnitten, die komplementär zu den Polynukleotidsonden sind. Weitere dem Fachmann bekannte Systeme, wie beispielsweise Direktmarkierung der Sonden, können ebenso zur Detektion eingesetzt werden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können verschiedene Hybridisierungsreaktionen gemäß dem Wissen des Fachmanns verwendet und wunschgemäß für die jeweilige Anwendung angepasst werden. Insbesondere können in situ Hybridisierungsreaktionen zur Anwendung kommen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Hybridisierungsprotokolle bereit, die zur Bildung von typischen Halos nach in situ Hybridisierungen von den verwendeten grampositiven Organismen mit Polynukleotidtranskriptsonden führten, wobei die Zellwand grampositiver Bakterien vor den Hybridisierungen enzymatisch und/oder physikalisch behandelt beziehungsweise permeablisiert wird, und zwar derart, dass ein ausreichendes Eindringen der Polynukleotidtranskriptsonden in die Zellen ermöglicht wird.
  • Die HYCOMP-Methode („Hybridisierung in beschichteten Mikrotiterplatten") erwies sich für eine Kombination mit dem erfindungsgemäßen Verfahren als geeignet, wobei beispielsweise die Effizienz der Abreicherung bezüglich der Staphylokokken durch die angewendete vorausgehende Behandlung der Zellen beeinflusst werden kann.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann insbesondere auf Mikrotiterplatten oder auf Objektträgern durchgeführt werden. Dies ermöglicht die Nutzung verschiedener Vorrichtungen und Messgeräte, die für handelsübliche Mikrotiterplatten oder Objektträger entwickelt worden sind.
  • Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren mit Verfahrensschritten ergänzt werden, die eine Anreicherung der Zielmikroorganismen ermöglichen. Hierzu kann beispielsweise eine Hybridisierung in beschichteten Mikrotiterplatten erfolgen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem eine Kombination von in situ Hybridisierung und darauffolgender Abreicherung im Mikrotiterplattenformat als Mittel zur taxonspezifischen Zellsortierung auf grampositive ausgewählte Staphylokokken und Enterokokken erfolgreich anwendbar ist. Von besonderem Vorteil ist, dass auf Basis der vorliegenden Erfindung durch die Anwendung von Polynukleotidsonden, deren Sequenz aus repetitiven Sequenzen artspezifischer Oligosonden besteht, eine artspezifische Identifizierung und Abreicherung von Zellen ermöglicht werden kann.
  • Darüber hinaus umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch, dass mehrere Polynukleotidtranskriptsonden mit unterschiedlichen Zielorganismen zur gleichzeitigen Separierung multipler Organismen verwendet werden können. Weiterhin können zusammengesetzter Polynukleotidsonden entwickelt werden, die verschiedene phylogenetischen Stufen gleichzeitig erfassen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt artspezifische Polynukleotidsonden bereit, die gegen variable Bereiche der 16S-rRNS und der 23S-rRNS gerichtet sind, wobei jeder untersuchte Organismus spezifisch hybridisiert und identifiziert werden konnte.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung isolierte DNA-Moleküle bereit, welche umfassen eine DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, oder DNA-Sequenzen mit mindestens 85%, vorzugsweise mindestens 90% Identität zu einer der DNA-Sequenzen mit SEQ. ID. NO: 1–7. Diese isolierten DNA-Moleküle können ein oder mehrere Nukleotide aufweisen, die mit einem im Stand der Technik bekannten Marker, beispielsweise Biotin verknüpft sind. Insbesondere kann die Markierung durch Einbau von Biotin-16-UTP während der Transkriptionsreaktion erfolgen.
  • Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zum Identifizieren oder Sortieren von grampositive Bakterien bereit, welcher umfasst: Agens zum Permeabilisieren der Zellwand von grampositiven Bakterien, und/oder eine oder mehrere chemische Verbindungen, welche ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 10 oder 11 umfassen.
  • Auch umfasst die vorliegende Erfindung Vorrichtungen, vorzugsweise Mikrotiterplatten oder Objektträger, welche eine chemische Verbindung aufweisen, die einen DNS-Abschnitt umfasst, der zu einer Transkript-Polynukleotidsonde komplementär ist, wobei die Transkript-Polynukleotidsonde auf einen DNS-Abschnitt gerichtet ist, der für eine variable Region innerhalb der Domäne III von bakterieller 23 S rRNS kodiert.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit ein einfaches, schnelles und zuverlässiges Verfahren bereit, das eine signifikante Arbeitserleichterung für Forscher und für Angestellte von medizinischen und mikrobiologischen Laboratorien bereitstellt, und insbesondere zum Identifizieren und/oder Anreichern von pathogenen Mikroorganismen, insbesondere Taxa die bekanntermaßen pathogene Vertreter umfassen, aus klinischem Probenmaterial, wie Blut, Gewebeproben, Stuhlgang, Speichel, Urin, etc. dient.
    •
  • Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der nachstehend angegebenen, nicht-einschränkenden Beispiele nun näher erläutert.
  • Folgende Abkürzungen werden verwendet:
    A: Adenin, Ampere; Amp.: Ampicillin; ATP: Adenosintriphosphat; b: Basen; BHI: Brain Heart Infusion; bidest. bidestilliert; bp: Basenpaare; C: Cytosin; °C: Grad Celsius; cm: Zentimeter; d: Tag(e), Durchmesser; D: Deutschland; Da: Dalton; dATP: Desoxyadenosintriphosphat; dCTP: Desoxycytosintriphosphat; dest.: destilliert; dGTP: Desoxyguanidintriphosphat; DNase: Desoxyribonuklease; DNS: Desoxyribonukleinsäure; ddNTP: Didesoxyribonukleosid- 5'- Triphosphat; dNTP: Desoxyribonukleosid- 5'- Triphosphat; ds: doppelsträngig; dTTP: Desoxythymidintriphosphat; E: Extinktion; EDTA: Ethylendiamintetraacetat; ERG: Eppendorf- Reaktionsgefäß; EtOHabs:. Ethanol 96%; FA: Formamid; FISH: Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung; FLUOS: 5,(6)- Carboxyfluorescein- N- hydroxysuccinimidester; g: Gramm, Fallbeschleunigung; G: Guanin; GC: mol% Guanin und Cytosin; h: Stunde(n), Hekto- (102); HD: Hefe- Dextrose; H2Obidest: MILIQ, Reinstwasser; H2Odest:destilliertes Wasser; HP: Hybridisierungspuffer; HYCOMP: Hybridization in coated microplate wells; k: kilo; kb: Kilobasenpaare; 1: Liter; LB: Luria-Bertani; m: Meter, Milli- (10–3); M: molar, mol/l; min: Minute(n) ; mRNS: Messenger- Ribonukleinsäure, Boten- Ribonukleinsäure; μ: Mikro- (10–6) ; n: nano- (10–9) ; NaAc: Natriumacetat; NS: Nukleinsäure; OD: Optische Dichte; OT: Objektträger; p.a.: pro analysi; Pa: Pascal; PBS: Phosphat gepufferte Kochsalzlösung; PCR: Polymerase chain reaction, Polymerase Kettenreaktion; PFA: Paraformaldehyd; rDNS: ribosomale Desoxyribonukleinsäure, für rRNS codierende DNS; RNS: Ribonukleinsäure; RNase: Ribonuklease; rpm: revolutions per minute, Umdrehungen pro Minute; rRNS: ribosomale Nukleinsäure; RT: Raumtemperatur; SA: Streptavidin- Fluorescein- Arbeitslösung; SDS: Natrium- Dodecyl- Sulfat; sec: Sekunde; sp.: species; ss: single stranded, einzelsträngig; SSC: Standard- Saline- Citrat- Lösung; T: Thymin; TAE: Tris/Acetat/ EDTA; Taq: DNSabhängige DNS-Polymerase aus Thermus aquaticus; TE: Tris/EDTA; TM: Schmelztemperatur; Tris: Tris-(hydroxymethyl-) aminomethan; U: Unit, Uracil; U/m: Umdrehungen pro Minute; üN: über Nacht; UV: Ultraviolett; V: Volt; % v/v: Volumen/Volumen; % w/v: Masse/Volumen; vol: Volumen
  • Beispiel 1
  • Zellanzucht und Zellfixierung
  • 1.1 Verwendete Mikroorganismen und Medien Folgende Mikroorganismen wurden verwendet:
  • Tabelle 1
    Figure 00100001
  • Bei den vorstehend angegebenen Staphylokokken und Enterokokken handelt es sich um grampositive Mikroorganismen, während es sich bei Serratia marcescens und Enterobacter aerogenes um gramnegative Bakterien handelt.
  • Als Nährmedien für die verwendeten Mikroorganismen werden die in der Tabelle angegebenen Nährmedien verwendet. Diese Nährmedien weisen dabei folgende Zusammensetzungen auf:
  • Corynebacterium Agar:
  • 10 g Caseinpepton, tryptischer Verdau (casein peptone, tryptic digest), 5 g Hefeextrakt (yeast extract), 5 g Glucose, 5 g NaCl, 15 g Agar, ad 1000 ml H2Odest, pH to 7.2 – 7.4, optional 15 g Agar.
  • Nutrient Medium:
  • 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt, ad 1000 ml H2O, pH 7, optional 15 g Agar.
  • BHI:
  • 37 g Fertigmedium (Sigma Chemicals, USA), ad 1000 ml H2O.
  • HD Medium:
  • 12 g Pepton, 5 g Glucose, 5 g Hefe, 8 g NaCl, ad 1000 ml H2O; pH 7,2, optional 15 g Agar.
  • LB Medium (Luria- Bertani- Medium
  • 15 g Trypton, 5 g Hefe, 9 g NaCl, ad 1000 ml H2O; pH 7,2, optional 15 g Agar.
  • 1.2 Zellanzucht und Stammhaltung
  • Zur Zellanzucht wurden die verwendeten Mikroorganismen bei der jeweiligen optimalen Wachstumstemperatur in Reagenzgläsern mit 5 ml Flüssigmedium bzw. aus einer 5 ml über Nacht Kultur in 100 ml Erlenmeyerkolben mit 30 ml überimpft, auf einem Rundschüttler (Infors, Basel, CH) oder auf mit Agarose verfestigten Nährmedien in Petrischalen (Greiner, Nürtingen, D) angezogen.
  • Alle Stämme wurden auf den in Tabelle 1 angegebenen verfestigten Medien mit einer sterilen Impföse ausgestrichen, über Nacht bei der jeweiligen optimalen Wachstumstemperatur bebrütet und anschließend bei 4°C gelagert. Zur Stammhaltung wurden diese Stämme alle zwei Wochen auf frisches Medium überimpft. Die Reinheitsüberprüfung erfolgte durch Verdünnungsausstriche und durch mikroskopische Kontrolle im Phasenkontrast. Zur längerfristigen Stammhaltung wurden von allen Stämmen Glycerinkulturen angelegt, wobei 800 μl einer 5ml über Nacht Kultur mit 800 μl einer 50% Glycerinlösung in Kryoröhrchen (2 ml, Sarstedt, Nümbrecht, D) versetzt und bei –80°C gelagert wurde.
  • 1.3 Zellfixierungen
  • 1.3.1. Zellfixierung mit Paraformaldehyd (PFAD
  • Folgende Lösungen werden hierzu eingesetzt:
  • 4% ige Paraformaldehydlösung
  • Herstellung von 50 ml einer 4% PFA-Lösung:
  • 2–3 g Paraformaldehyd wurden unter Rühren zu 30 ml 60–65°C heißem H2Oreinst gegeben und durch Zugabe von einigen Tropfen 1 M NaOH gelöst. Anschließend wurden 16,6 ml 3 × PBS zugegeben, die Lösung auf ca. 20°C abgekühlt und der pH Wert auf 7,2 eingestellt. Nach Sterilfiltration wurde die fertige PFA – Lösung im Dunkeln bei 4°C nicht länger als 24 h aufbewahrt.
  • PBS-Stammlösung (PBS: phosphat-gepufferte Kochsalzlösung):
  • Lösung 1: 8 M Na2HPO4,1,5 M KH2PO4 Lösung 2: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl (beide Lösungen wurden bis pH 7,2 miteinander titriert) EtOHabs bezeichnet Ethanol 96%.
  • Durchführung:
  • 30 ml Medium im 250 ml Erlenmeyerkolben wurde mit 5 ml der über Nacht Vorkultur (mit den zu fixierenden Bakterienzellen) beimpft. Die optische Dichte der wachsenden Zellen wurde regelmäßig bei 600 nm gemessen (1 ml in einer Quarzküvette, Ultraspec Plus Photometer) bis zu einem Wert von 0,9 – 1 (exponentielle Wachstumsphase). Nach Erreichen dieser Dichte wurden die Zellen 15 min lang bei 5000 rpm/min abzentrifugiert (SIGMA 3K15, Osterode am Harz). Dann wurde der Niederschlag in 1 ml 1 × PBS resuspendiert und mit 3 vol Fixierungslösung 5–12 h bei 4°C zur Zellfixierung inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und mit 1 × PBS gewaschen, dann erneut zentrifugiert und der Niederschlag in 0,5 ml 1 × PBS nach Zugabe von 0,5 ml EtOHabs aufgenommen.
  • 1.3.2 Zellfixierung mit Ethanol
  • Die Zellen wurden angezogen und geerntet wie bei der PFA – Fixierung. Die geernteten Zellen wurden mit 1 × PBS gewaschen, zentrifugiert, der Niederschlag in 1 × PBS resuspendiert, mit 1 vol eiskalten EtOHabs versetzt und bei –20°C gelagert.
  • Beispiel 2
  • Vorbehandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand und Membran verwendeter grampositiver Bakterien gegenüber den Polynukleotidsonden
  • 2.1 Verwendete Enzyme
  • Folgende Enzyme wurden verwendet:
    • • Lysozym (Serva, Deutschland) 10 mg/ml in 50 mM Tris/HCl, pH 8,0
    • • Lysostaphin (Sigma Aldrich, Schnelldorf), 1 U/ml in H2Obidest
  • 2.2 Vorbehandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand und Membran verwendeter Staphylokokken gegenüber den Polynukleotidsonden
  • Zur Hybridisierung der 4 verwendeten Staphylokokken mit markierten Polynukleotidtranskript-Sonden wurden PFA-fixierte immobilisierte Zellen in einer ersten aufsteigenden Ethanol-Reihe behandelt (dadurch bleiben die Zellen nach Abspülen des Enzyms an den Aussparungen haften, und es erfolgt zugleich eine erste Dehydratisierung). Anschließend wurden die Zellen entweder 10 min bei 30°C mit Lysozym und danach 5 min bei 30°C mit Lysostaphin oder 10 min auf Eis mit Lysozym und danach Inkubation 7 min bei 200°C behandelt, wobei jedes Enzym durch Abspülen mit H2Obidest nach der entsprechenden Wirkungszeit entfernt wurde. Dann folgte eine zweite aufsteigende Ethanol-Reihe (je 3 min 50%, 80%, 98%). Die Hybridisierung wurde dann wie im Beispiel 4.3 beschrieben, durchgeführt.
  • 2.3 Vorbehandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand und Membran verwendeter Enterokokken gegenüber den Polynukleotidsonden
  • Zur Hybridisierung der 4 verwendeten Enterokokken mit markierten Polynukleotidtranskript-Sonden wurden Ethanol-fixierte immobilisierte Zellen in einer ersten aufsteigenden Ethanol-Reihe (je 3 min 50%, 80%, 98%) behandelt. Danach wurden die Zellen 10 min auf Eis mit Lysozym und anschließend 7 min bei 200°C behandelt. Lysozm wurde nach 10 min Wirkungszeit durch Abspülen mit H2Obidest entfernt. Dann folgte eine zweite aufsteigende Ethanol-Reihe (je 3 min 50%, 80%, 98%). Die Hybridisierung wurde dann wie in Beispiel 4.3 beschrieben, durchgeführt.
  • 2.4 Gemeinsame Vorbehandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand und Membran verwendeter Enterokokken und Staphylokokken gegenüber den Polynukleotidsonden
  • Hierbei wurden die EtOH-fixierten immobilisierten Zellen durch eine erste Ethanolbehandlung (je 3 min 50%, 80%, 98%) dehydratisiert damit sie nach der Lysozym- Behandlung am Objekträger haften bleiben. Die Zellen wurden 10 min auf Eis mit Lysozym behandelt. Anschließend wurde das Lysozym durch Abspülen des Objekträgers mit H2Obidest entfernt und der Objekträger 15 min bei 200°C inkubiert. Dann folgte eine zweite aufsteigende Ethanol-Reihe (je 3 min 50%, 80%, 98%). Die Hybridisierung wurde dann wie im Punkt B. 3. B. 2./B. 3. B. 3. beschrieben durchgeführt.
  • Beispiel 3
  • In Vitro Transkription
  • Markierte RNA-Sonden hoher spezifischer Aktivität können durch In-vitro Transkription von PCR-Produkten hergestellt werden. Gemeinsam ist diesen PCR-Produkten, dass sie eine Promotorsequenz für die Bakteriophagen-RNA-Polymerasen SP6, T3 oder T7 enthalten. An den Rückwärtsprimer (317R) wurde eine T3-Promotorsequenz angehängt. Um die Integrität der produzierten RNA zu gewährleisten, wurde ein RNase-Inhibitor eingesetzt. Dieser Inhibitor besitzt eine große Affinität für RNase und blockiert deren Aktivität. Im Anschluss an die Invitro-Synthese markierter RNA-Moleküle wurde eine Behandlung des Reaktionsansatzes mit DNase I (RNase-frei) durchgeführt. Hierdurch wurden die PCR-Produkte hydrolysiert, wodurch eine Vermeidung störender Einflüsse nicht markierter Sequenzen während einer Hybridisierung erreicht werden konnte. Die Markierung der RNA-Moleküle erfolgte durch Einbau von Biotin-16-UTP in diese Moleküle während der Transkriptionsreaktion.
  • 3.1 Verwendete Ragenzien
  • Ammoniumacetatlösung (NHa4 Acetat 10 M), EDTA (0,2 M, pH 8,0), TE-Puffer (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0), Ethanolabs (Ethanol 96%).
  • NTP-Mix (ATP 100mM 2 μl, CTP 100 mM 2 μl, GTP 100 mM 2 ul, UTP 100 mM 0,7 μl, Biotin-16-UTP 10 mM 13 μl, wobei als Reportermolekül Biotip-l6-UTP (Biotip-ε-aminocaproyl-x-aminobutyryl-[5-(3-aminoallyl)-uridin-5'-triphosphat]) verwendet wird) Der Transkriptionsreaktionsansatz enthält 3 μl NTP-Mix, 3 μl Transkriptionspuffer, 3 μl T3-RNS-Polymerase, 1,5 μl RNase-Inhibitor (Roche), 0,5-2 μg Matrizen-DNS und ad 30 μl H2Obidest.
  • 3.2 Durchführung:
    • • Transkriptionsansatz 3 h bei 37°C in einem Heizblock (Hybaid Omnigene, MWG-Biotech, Ebersberg) inkubieren;
    • • 3 μl DNase I (Rnase-frei) zugeben und weitere 15 min bei 37 °C inkubieren;
    • • 3 μl EDTA 0,2 M zum Abstoppen der Reaktion zugeben;
    • • Zur Fällung der RNA-Transkripte, 16 μl NHa4 Acetat und 156 μl EtOHabs zugeben und 2 h bei –80°C oder über Nacht bei –20°C inkubieren;
    • • Zum Sedimentieren der RNA-Sonde 15 min in einer Tischzentrifuge (Hettich Mikro 22R, Tuttlingen) bei 4 °C und 14000 rpm zentrifugieren;
    • • Das Sediment mit 150 μl 70% (v/v) Ethanol waschen;
    • • erneut wie zuvor sedimentieren, trocknen in der Vakuumzentrifuge (Savant Speed Vac Concentrator, Bachofer, Reutlingen), in 50 μl TE-Puffer resuspendieren und zum Schutz der RNA-Probe vor Abbau 1 μl RNase-Inhibitor zugeben (Roche).
  • Beispiel 4
  • In situ Hybridisierungen auf Objektträgern mit Oligo- und Polynukleotidsonden
  • Die Reassoziation von einzelsträngigen Nukleinsäuren zu einem Doppelstrang wird als Hybridisierung bezeichnet. Hierbei spielt die Schmelztemperatur (Tm) eine wichtige Rolle; bei dieser Temperatur liegt die Hälfte der Moleküle als Doppelstrang vor. Tm wird durch verschiedene Parameter beeinflußt. So kann die Schmelztemperatur durch z. B. monovalente Kationen (meist Na+) erhöht werden. Mismatches reduzieren die thermische Stabilität der DNS-Duplexmoleküle. Ebenfalls verringern helixdestabilisierende Agentien wie Formamid die Schmelztemperatur.
  • 4.1 In situ Hybridisierungen auf Objektträgern mit Oligonukleotidsonden
  • Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende gegen die rRNS gerichtete Oligonukleotidsonden verwendet:
    Ssa 165: 5'-CAC TTT AGA ACC ATG CGG-3' SEQ. ID. NO: 1
    Ssa 235: 5'-CAC CAC AAT TCT AGC TAG-3' SEQ. ID. NO: 2
    Sau 165: 5'-CAC TTT TGA ACC ATG CGG-3' SEQ. ID. NO: 3
    Sau 23S: 5'-CAC CTA TTT TCT ATC TAG-3' SEQ. ID. NO: 4
    Sha 165: 5'-GCT CCT TGT CTG TTC GCT-3' SEQ. ID. NO: 5
    Sha 23S: 5'-CAC CTA TTA TCT ATC TAG-3' SEQ. ID. NO: 6
    Sep 235: 5'-CAC CTG TTA TCT ATC TAG-3' SEQ. ID. NO: 7
    Eae 16S a: 5'-CGA GTA ACG TCA ATC GCC-3' SEQ. ID. NO: 8
    Sma 165: 5'-TTA AGC TCA CCA CCT TCC-3' SEQ. ID. NO: 9
  • Die nachstehende Tabelle zeigt einen Überblick über Eigenschaften und Ziel-Organismen und Ziel-rRNS der erfindungsgemäßen Sonden.
  • Tabelle Verwendete artspezifische Oligonuklentidsonden
    Figure 00160001
  • Für Oligonukleotide mit weniger als 50 bp kann der Schmelztemperatur-Wert nach folgender Formel berechnet werden: Tm = 4(G + C) + 2(A + T)G, C, A und T stellen die Anzahl der Basen dar.
  • Für Standard-Hybrisisierungen wurden folgende Lösungen verwendet:
    • • 5 M NaCl
    • • 1 M Tris (Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan)/HCl pH 8,0
    • • 0,5 M EDTA pH 8,0
    • • Formamid
    • • 10% (w/v) SDS (Natrium-dodecylsulfat)
    • • Hybridisierungspuffer: 5 M NaCl 360 μl, 1 M Tris/HCl pH 8,0 40 μl, Formamid μl (siehe Tabelle Beispiel 4, 4.1), H2Oreinst ad 2 ml, 10% (w/v) SDS 2 μl.
    • • Waschpuffer:5 M NaCl (siehe oben), 1 M Tris/HCl pH 8,0 1 ml, 0,5 M EDTA (Ethylendiamintetraacetat) (siehe oben), H2Oreinst ad 50 ml, 10% (w/v) SDS 50 μl. Erst ab 20% Formamid im Hybridisierungspuffer wurde die 0,5 M EDTA-Lösung eingesetzt.
  • Durchführung:
    • • Die fixierten Zellen auf den Objektträger (Teflon beschichtet, Marienfeld, D) aufbringen
    • • Dehydratisierung der Zellen vor der Hybridisierung durch eine Behandlung in einer aufsteigenden Ethanolreihe (je 3 min 50%, 80%, 98% EtOH)
    • • 9 μl Hybridisierungspuffer und 1 μl markierte Sonde in die Aussparungen des Objekträgers mit den fixierten und vorbehandelten Zellen auftropfen und gut vermischen
    • • Objekträger in ein Probengefäß (Greiner, Nürtingen, D), in dem ein mit 2 ml Hybridisierungspuffer befeuchtetes Stück Zellstoff eingebracht wurde, überführen und 1–1,5 h bei 46 °C in einem Hybridisierungsofen (Bachofer, Reutlingen, D) hybridisieren
    • • Objektträger 15 min in einem mit 50 ml Waschpuffer gefüllten Probengefäß waschen und in einem Luftstrom trocknen.
  • 4.2 Hybridisierungen auf Objektträgern mit Zellen, die enzymatisch vorbehandelt wurden
  • Hierbei werden die fixierten grampositiven Zellen, die auf den Objektträger aufgebracht wurden, vor der Behandlung mit Lysozym (10 min auf Eis) einer aufsteigenden Ethanol- Reihe (je 3 min 50%, 80%, 98% EtOH) unterzogen. Dadurch kann man erreichen, dass die Zellen nach der Vorbehandlung mit Lysozym bei der Entfernung des Enzyms nicht mit entfernt werden, sondern an dem Objektträger haften bleiben. Dann wurde eine Standard-Hybridisierung mit den behandelten Zellen durchgeführt.
  • 4.3 In situ Hybridisierungen auf Objektträgern mit Polynukleotidsonden
  • Der Schmelztemperatur-Wert von Polynukleotiden mit einer Länge bis 500 bp kann nach folgender empirisch ermittelten Formel berechnet werden:
  • RNA-RNA-Hybridisierung
  • Figure 00170001
  • Standard-Hybridisierungen:
  • Für Standard-Hybridisierungen wurden verwendet:
    • • NaCl-Stammlösung (NaCl 5 M)
    • • SDS-Lösung (Natriumdodecylsulfat, 10%, sterilfiltriert)
    • • Tris-HCl-Lösung (Tris 1 M, pH 8,0)
    • • HClconc.
    • • Hybridisierungspuffer: NaCl 75 mM, Tris-HCl 20 mM, SDS 0,01%, FA 80%.
    • • Objektträger, 10 Aussparungen (Marienfeld, D)
    • • Fixierte Zellen
  • Durchführung:
    • • 4 μl von fixierten Zellen in die Aussparungen der beschichteten OT (Objektträger) einpipettieren und bei 60°C für 5–10 min trocknen (Hitzefixierung);
    • • Zur Dehydratisierung und Nachfixierung der Zellen, die OT für jeweils 3 min in 50%, 80%, 98% igen Ethanol tauchen;
    • • Zur Hybridisierung, 12 μl Hybridisierungspuffer mit 1 μl (150–250 μg/μl) des markierten Polynukleotids pipettieren und gründlich mischen;
    • • OT in ein 50 ml Probegefäß (Greiner, Nürtingen) überführen, welches mit, mit 2 ml Hybridisierungspuffer befeuchtetem Zellstoff ausgelegt wurde;
    • • Probegefäß (Greiner, Nürtingen)mit einem Schraubdeckel verschließen und Hybridisierung in horizontaler Lage 30 min bei 80°C (Bachofer, Reutlingen) durchführen;
    • • Anschließend Hybridisierung 5–10 h bei 53°C (Bachofer, Reutlingen);
    • • OT vorsichtig mit H2Odest spülen und lufttrocknen.
  • Zur Detektion der mit Biotin-16 UTP markierten Polynukleotidsonden hybridisierten Zellen, wells der gewaschenen und getrockneten OT mit 40 μl Streptavidin-Fluorescein- Lösung, (1:200 in DPBS) überschichten und in einem Probegefäß (Greiner, Nürtingen), welches mit, mit 2 ml DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) getränkten Zellstoff ausgelegt wurde, 1 h im Dunkeln bei RT inkubieren. Fluoreszenzfarbstofflösung mit H2Obidest abspülen und OT 20 min in DPBS waschen. Anschließend OT lufttrocknen, in Citifluor (CITIFLUOR; Mounting medium) einbetten und unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachten.
  • Beispiel 5
  • Mikroskopische Auswertung von Hybridisierungen
  • Zur Auswertung von Hybridisierungen wurde ein Axioplan-Mikroskop (Fa. Zeiss, Oberkochen) verwendet. Mit Hilfe von einer CCD Camera (Princeton Instruments, Modell RTE/CCD-1317tc/2) wurden die hybridisierten Zellen photographiert. Phasenkontrast- und zugehörige Epifluoreszenzaufnahmen erfolgten über die Bildverarbeitungssoftware Winview. Eingesetzt wurde das Objektiv: Plan-Neofluar, Filtersatz 09 (Bandpaßfilter 450–490, Objektiv 100x).
  • Beispiel 6
  • HYCOMP - Hybridisierung in beschichteten Mikrotiterplatten
  • HYCOMP steht für „Hybridization in coated microplates". Bei der Hybridisierung dringen
  • Biotin markierte Polynukleotidsonden nicht vollständig in die Zelle. Ein Teil der Sonde ragt aus der Zelle heraus und ermöglicht eine Immobilisierung und dadurch eine Abtrennung der markierten hybridisierten Zellen von den unmarkierten. Die Polynukleotidsonden bilden im Bereich der Zellwand durch Sekundärstrukturausbildung eine Art Netzwerk aus. Zur Sortierung markierter hybridisierter Zellen wurden die Mikrotiterplatten mit DNS, die komplementär zu der Polynukleotidsonde ist, beschichtet. Es kommt zur Hybridisierung des aus der Zelle herausragenden Teils der Sonde mit der DNS in der Mikrotiterplatte.
  • 6.1 In situ Hybridisierungen in Lösung mit markierten Polynukleotidsonden
  • Folgende Lösungen wurden verwendet:
    • • 1 × PBS (aus PBS-Stammlösung, siehe Punkt 3.4.1.)
    • • Hybridisierungspuffer (75 mM NaCl, 20 M Tris pH 8,0, 0,01% SDS, 80% FA)
    • • EtOH abs
  • Durchführung:
  • Die Hybridisierung wurde in 0,5 ml ERGs durchgeführt.
    • • 20 μl der PFA- oder EtOH-fixierten Zellen mit 2 vol EtOHabs versetzen und 3 min bei 25°C inkubieren
    • • Ansatz 3 min bei 12.000 rpm (Bachofer, Reutlingen) zentrifugieren
    • • mit 1 × PBS waschen
    • • 3 min bei 12.000 rpm (Bachofer, Reutlingen) wiederholt abzentrifugieren
    • • 30 μl Hybridisierungspuffer zugeben
    • • 500 ng Sonde (in TE- Puffer) zugeben
    • • Ansatz 20 min bei 80°C inkubieren
    • • danach 5–16 h bei 53°C
  • 6.2 Beschichtung der Mikrotiterplatten
  • Die Mikrotiterplatten wurden mit zur RNA-Transkriptsonde komplementärer DNS beschichtet. Hierfür wurde die Sequenz der Domäne III der 23S rDNA durch die Standard-PCR mit den Primern 1900VN und 317RT3 amplifiziert.
  • Folgende Materialien und Lösungen wurden verwendet:
    • • Maxisorp MicroWells (NalgenNunc INT., Naperville, Il, USA)
    • • Standard Klebefolie (Nunc Naperville, IL, USA)
    • • 1 × PBS (aus PBS-Stammlösung)
    • • PBS/MgCl2 (137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4/KH2PO4, 2,7 mM KCl, 100 mM MgCl2 pH 7,2)
  • Durchführung:
    • • PCR-Produkt aufreinigen und im Photometer bei 260 nm vermessen;
    • • 1 μg PCR-Produkt pro Mikrotiterkavität in 50 μl PBS/MgCl2 und 50 μl H2Obidest geben;
    • • Amplifikate 10 min bei 94°C im Heizblock (Hybaid Omnigene, MWG-Biotech, Ebersberg) denaturieren;
    • • 1h bei 37°C im Heizblock (Hybaid Omnigene, MWG-Biotech, Ebersberg) inkubieren
    • • Platten auf Papier ausklopfen;
    • • 1–2 h bei 60°C in einem Trockenschrank (Kendro, Hanau) trocknen;
    • • getrocknete Platten mit Klebefolie verschließen;
    • • Platten bei 4°C 4–5 Wochen haltbar.
  • 6.3. Detektion in den Mikrotiterplatten
  • Es wurden folgende Lösungen verwendet:
    • • 1 × PBS (aus PBS-Stammlösung)
    • • Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Roche, Mannheim)
    • • Blocking Reagens (Roche)
    • • Blocking Puffer (PBS/0,1% Blocking Reagens)
    • • H2SO4 1M
  • Durchführung:
    • • Mikrotiterkavitäten einmal mit 1 × PBS waschen
    • • 100 μl Blocking Puffer je Kavität zugeben und 15 min bei RT inkubieren
    • • danach Platte ausklopfen und 50 μl Streptavidin- Peroxidase- Lösung (SA-POD 1:1000 in BP verdünnt) zugeben und 30 min inkubieren
    • • der Farbumschlag erfolgt von farblos nach blau
    • • Nach 10 min, Reaktion durch Zugabe von 100 μl H2SO4 1M abstoppen
    • • Dabei erfolgt der Farbumschlag von blau zu Gelb
    • • Die Abreicherungsintensität bei einer Wellenlänge von 450 nm im Photometer (Princeton Instruments, Puchheim) gegenüber einer Referenzwellenlänge von 650 nm messen.
  • Beispiel 7
  • PCR-Amplifikation der Domäne III der 23S rDNS und Konstruktion der Polynukleotidsonden
  • 7.1 Isolierung von DNS aus Reinkulturen
  • Genomische DNS wurde aus Reinkulturen der verwendeten Mikroorganismen isoliert und aufgereinigt.
  • 7.2 PCR-Amplifikation der Domäne III der 23S rDNS
  • Der hochvariable Bereich innerhalb der Domäne III der 23S rRNS wurde, ausgehend von der isolierten genomischen DNS der verwendeten Mikroorganismen, über eine PCR (Polymerasekettenreaktion) mit den modifizierten Primern 317 RT3 und 1900 VN amplifiziert. Diese modifizierten Primer hybridisieren mit konservierten Regionen am Anfang und am Ende der Domäne III der 23S rDNS. Der Primer 317 RT3 enthält die Promotorsequenz für die T3-Polymerase, die für die Konstruktion von Polynukleotidtranskriptsonden nötig ist.
  • Die Nukleinsäureisolierung erfolgte wie nachstehend beschrieben.
  • Lösungen:
    • • Saline- EDTA (0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA, pH 8,0)
    • • 20 × SSC (Standard-Saline-Citrat; 3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitrat, pH 7,0)
    • • Tris/HCl (50 mM, pH 8,0)
    • • Lysozym (Serva, Deutschland; 10 mg/ml in SOmM Tris/HCl)
    • • RNase A (Quiagen, D; 0,5 mg/ml in 2 × SSC (aus 2 × SSC))
    • • Proteinase K (Roche, D; 10 mg/ml in H2Obidest)
    • • Na-Acetat 5 M
    • • SDS-Lösung (25% (w/v) Natriumdodecylsulfat (nicht autoklaviert))
    • • Isopropanol
  • Durchführung:
    • • Bakterien in einer 500 ml über Nacht Kultur durch eine Zentrifugation von 10 min bei 5000 rpm sedimentieren (Sorvall RC 26 Plus, Kendro Products),
    • • Das Sediment in 10 ml Saline-EDTA suspendieren,
    • • 100 μl Lysozymlösung zugeben,
    • • Ansatz 30 min bei 37°C zur Zelllyse inkubieren,
    • • 250 ul RNase A zugeben und Probe 60 min bei 37°C inkubieren,
    • • 20 μl Proteinase K zugeben und Probe 120 min bei 37°C inkubieren,
    • • 1 ml SDS 25% und 2,5 ml NaCl 5M zugeben und Probe 5–10 min bei 65°C inkubieren,
    • • 1 vol Chloroform zugeben,
    • • den Ansatz 15 min bei 5000 rpm Zentrifugieren,
    • • die obere wässrige Phase abnehmen und in ein neues Gefäß überführen,
    • • 0,1 vol Na-Acetat 5M und 0,7 vol Isopropanol zugeben und vorsichtig schwenken,
    • • DNS auf sterile Pasteurpipette aufwickeln und in ein neues Gefäß, das 70% EtOH (Ethanol) enthält, überführen,
    • • Ethanol nach kurzer Abzentrifugation entfernen,
    • • DNS in H2Obidest lösen,
  • Agaroseelelektrophorese
  • Zur Bestimmung der Qualität von Nukleinsäuren und PCR-Produkten wurde eine horizontale Agarosegelelektrophorese durchgeführt. Die Nukleinsäure wandern dabei innerhalb eines Gels unter der Wirkung eines elektrischen Feldes in Abhängigkeit von Ladungsanzahl und Molekülmasse unterschiedlich schnell zu den jeweiligen Polen.
  • Das Gel wurde zur Dokumentation unter UV-Durchstrahlung (302 nm Wellenlänge, Bachofer Transilluminator) mit einem Videodokumentationssystem (Cybertech CS1 Image Documentation System) aufgenommen.
  • Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
  • Lösungen:
  • Alle PCR-Reaktionen wurden in einem programmierbaren Heizblock (Primus 96 Plus, Fa. MWG Biotech, Ebersberg, D) durchgeführt.
    • • Ex TagTM -Polymerase (SU/μ1)
    • • 10 × Ex TagTM Reaktionspuffer
    • • dNTP-Mix (je 10 mM)
    • • Vorwärtsprimer (52 pmol/μl)
    • • Rückwärtsprimer (50 pmol/μl)
    • • Matrizen-DNA
  • Einzusetzende Menge der einzelnen Komponenten einer PCR-Reaktion:
    • 10 × Ex TagTM Reaktionspuffer 10 μl
    • dNTP-Mischung (je 10 mM) 8 μl
    • Vorwärtsprimer (50 pmol/μl) 1 μl
    • Rückwärtsprimer (50 pmol/μl) 1 μl
    • ExTagTM -Polymerase (5U/μl) 0,8 μl
  • Figure 00230001
  • Negativkontrolle: Reaktionsansatz ohne DNS-Matrize
    Figure 00230002
  • Durch Zugabe von 1–2 vol EtOHabs und 0,1 vol NaAc 3 M konnten die PCR-Produkte nach einer Lagerung von 2–12 h bei –20 °C gefällt werden. Nach einer Abzentrifugation wurden die gefällten PCR-Produkte in H2Obidest aufgenommen.
  • Verwendete Primer:
  • Folgende Primer wurden für die Amplifikation (PCR) der hochvariablen Region der DomäneIII der 23 S rRNA eingesetzt:
    Figure 00230003
  • Der unterstrichene Bereich stellt die T3-RNA-Polymerase-Promotorsequenzen dar, notwendig für die Transkription. Die nachstehende Tabelle zeigt die Abkürzungen für die Wobbels in den Primern:
    Figure 00230004
  • 7.3 Konstruktion der Polynukleotidsonden
  • Die entstandenen Produkte aus der Amplifikation der Domäne III der 23S rDNS stellen die Matrizenmoleküle dar, die zur Konstruktion der Transkriptsonden verwendet wurden. Die Matrizenmoleküle tragen am Startpunkt der Transkription eine Promotor-Region für die T3-Polymerase. Unter Verwendung markierter Nukleotide stellt die T3-Polymerase RNSTranskripte her, die direkt als Sonde eingesetzt werden.
  • 1 zeigt die jeweils verwendeten Polynukleotidsonden. Das Zeichen steht für Null-Probe, die Abkürzung Kbl für Kilobasenleiter, 1kb.
  • Spuren 1 bis 10 von 1 zeigen Polynukleotidsonden bezüglich der Mikroorganismen:
    1: Staphylococcus saprophyticus 6: Enterococcus faecalis
    2: Staphylococcus aureus 7: Enterococcus durans
    3: Staphylococcus haemolyticus 8: Enterococcus gallinarum
    4: Staphylococcus epidermidis 9: Enterobacter aerogenes
    5: Enterococcus faecium 10: Serratia marcescens
  • Beispiel 8
  • Anwendung der Polynukleotidsonden bei in Situ Hybridisierungen grampositiver Mikroorganismen
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden mehrere Hybridisierungsprotokolle entwickelt, die zur Bildung von typischen Halos nach in situ Hybridisierungen von den verwendeten grampositiven Organismen mit Polynukleotidtranskriptsonden führten.
  • 8.1 In situ Hybridisierungen in Reinkultur
  • Wegen ihrer Dicke (30–80 nm), stellt die Zellwand grampositiver Organismen bei in situ Hybridisierungen das größte Problem dar. Um dieses Problem zu lösen wurde die Zellwand grampositiver Bakterien vor den Hybridisierungen enzymatisch und/oder physikalisch behandelt beziehungsweise permeabilisiert, und zwar so, dass ein ausreichendes Eindringen der Polynukleotidtranskriptsonden in die Zellen ermöglicht wird.
  • 8.2 In situ Hybridisierungen ohne vorausgehende Behandlung
  • Zunächst wurden Standardhybridisierungen PFA- und EtOH fixierter grampositiven Bakterien ohne vorausgehende Behandlung durchgeführt. Bei keinem der verwendeten grampositiven Organismen war ein Signal feststellbar, so dass anzunehmen war, dass die Zellwände dieser Organismen für das Eindringen der Polynukleotidtranskriptsonden in die Zellen nicht ausreichend permeabel waren.
  • 8.3 In situ Hybridisierungen mit Staphylokokken nach einer Behandlung mit Lysozym und anschließend Lysostaphin (Vorbehandlungsverfahren I)
  • PFA- fixierte Zellen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis ließen bei in situ Hybridisierungen nach enzymatischer Behandlung der Zellen, 10 min Lysozym und anschließend 5 min Lysostaphin, die Bildung von typischen Halos detektieren (2 – 3). 2 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit Staphylococcus saprophyticus (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung). 3 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit Staphylococcus aureus (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung). Vergleichbare Ergebnisse wurden bei einer Standardhybridisierung mit Staphylococcus haemolyticus (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung) und einer Standardhybridisierung mit Staphylococcus epidermidis (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung) erhalten.
  • Durch die Wirkung von Lysozym und anschließend der von Lysostaphin erfolgte eine ausreichende Permeabilisierung der Zellwand der verwendeten Staphylokokken. Es kam zum ausreichenden Eindringen der Polynukleotidtranskriptsonden in die Zellen, was zur Bildung der typischen Halos führte. Praktisch alle Zellen wurden von den Enzymen angegriffen.
  • 8.4 In situ Hybridisierungen mit Staphylokokken nach einer Behandlung mit Lysozym und Hitze Vorbehandlungsverfahren II)
  • Bei vorausgehender Behandlung von den verwendeten PFA-fixierten Staphylokokken mit Lysozym und anschließend Hitze (siehe Beispiel 2.2) konnte bei allen Zellen eine deutliche Halo-Bildung festgestellt werden.
  • 4 zeigt beispielhaft eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit PFA-fixierten Staphylococcus haemolyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließende Inkubation: 7 min bei 200°C). Vergleichbare Ergebnisse wurden unter den angegebenen Bedingungen auch für Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, und Staphylococcus epidermidis erhalten.
  • Beispiel 9
  • Gruppenspezifität der Transkriptsonden für Staphylokokken
  • Die Gruppenspezifität der Polynukleotidtranskriptsonden ließ sich bestätigen, nach in Situ Hybridisierungen von jedem der verwendeten Staphylokokken mit jeweils der Sonde eines anderen Staphylococcus (siehe 5).
  • 5 zeigt beispielhaft die Bildung von typischen Halos bei der Hybridisierung von Staphylococcus haemolyticus mit der Sonde von Staphylococcus epidermidis, was darauf schließen lässt, dass die Hybridisierung mit der gruppenspezifischen Sonde stattgefunden hat, wobei eine Standardhybridisierung von Staphylococcus haemolyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließende Inkubation: 7 min bei 200°C) mit der Sonde von Staphylococcus epidermidis durchgeführt wurde. Ein vergleichbares Ergebnis wurde unter den angegebenen Bedingungen auch für eine Hybridisierung von Staphylococcus epidermidis mit der Sonde von Staphylococcus aureus erhalten, wobei eine Standardhybridisierung von Staphylococcus epidermidis (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließende Inkubation: 7 min bei 200°C) mit der Sonde von Staphylococcus aureus, durchgeführt werden.
  • Beispiel 10
  • In situ Hybridisierungen in Mischung mit anderen Bakterien
  • Bei in situ Hybridisierungen mit Mischungen aus jeweils einem der verwendeten Staphylokokken und entweder Enterobacter aerogenes oder Serratia marcescens zeigte sich die Spezifität der Polynukleotidtranskriptsonden für die Staphylokokken. Hierbei wurden die Staphylokokken vor der Hybridisierung PFA-fixiert und 10 min mit Lysozym behandelt.
  • 6 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung von Staphylococcus saprophyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung) in Mischung mit Enterobacter aerogenes. Ein vergleichbares Ergebnis wurde unter den angegebenen Bedingungen auch bei einer Standardhybridisierung von Staphylococcus aureus (nach 10 min Lysozym-Behandlung) in Mischung mit Serratia marcescens erhalten.
  • Beispiel 11
  • In situ Hybridisierungen mit Enterokokken nach einer Behandlung mit Lysozym und Hitze
  • Bei der Hybridisierung von den verwendeten EtOH-fixierten Enterokokken nach einer Behandlung mit Lysozym und Hitze (7 min bei 200°C), kam es zur Bildung von Halos.
  • 7 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus faecium (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 7 min bei 200°C).
  • Vergleichbare Ergebnisse wurden unter den angegebenen Bedingungen auch für eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus faecalis (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließende Inkubation: 7 min bei 200°C), eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus durans (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 7 min bei 200°C) und eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus gallinarum (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließende Inkubation: 7 min bei 200°C) erhalten.
  • Beispiel 12
  • In situ Hybridisierungen mit Enterokokken und Staphylokokken nach gemeinsamen Behandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand und Membran
  • Bei in situ Hybridisierungen mit den verwendeten Staphylokokken und Enterokokken nach Lysozym- und anschließender Hitze-Behandlung konnte eine gemeinsame Vorbehandlung dieser Organismen erfolgreich ermittelt werden (siehe Beispiel 2.4). Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich waren die Zellen vor der Behandlung und anschließender Hybridisierung EtOH-fixiert. Alle Zellen zeigten bei einer Hybridisierung nach den oben beschriebenen gemeinsamen Behandlungen eine deutliche Halo-Bildung (8, 9).
  • Figure 00280001
  • 8 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus durans (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C). Vergleichbare Ergebnisse wurden unter den angegebenen Bedingungen auch für eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus faecium (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C), eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus faecalis (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C), eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus gallinarum (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C), erhalten.
  • 9 zeigt eine Phasenkontrastaufnahme und eine Epifluoreszenzaufnahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Staphylococcus epidermidis (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C). Vergleichbare Ergebnisse wurden unter den angegebenen Bedingungen auch für eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Staphylococcus saprophyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C), eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Staphylococcus aureus (nach 0,5 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 3 min bei 200°C) und eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Staphylococcus haemolyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C) erhalten.
  • Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse einer gemeinsamen Behandlungen für Staphylokokken und Enterokokken vor der Fluoreszenz in situ Hybridisierung
  • Tabelle
    Figure 00290001
  • Eine detaillierte Übersicht über die Reaktionsbedingungen zeigt die nachstehende Tabelle:
    Figure 00300001
  • Beispiel 13
  • Anwendung der Polynukleotidsonden bei in Situ Hybridisierungen in Lösung und anschließende Abreicherung
  • Die Abreicherung eines Zielorganismus erfolgte durch die Anwendung der HYCOMP- Methode. Hierbei kann das Ausmaß einer Abreicherung bezüglich eines Organismus über die Auswertung der bei einer Wellenlänge von 450 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 650 nm, gemessenen Extinktion erhalten werden. Weiterhin kann eine optische Auswertung der Abreicherung eines Zielorganismus in einer Mischung morphologisch unterschiedlicher Organismen durch die Analyse des „Positiv-Überstandes" und „Negativ-Überstandes" im Mikroskop erfolgen. Für diesen Zweck kann man die folgende Formel anwenden:
    Figure 00310001
    und daraus einen prozentuellen Wert bezüglich des Abreicherungserfolgs ermitteln.
  • Die Abreicherungen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens wurden wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
  • Abreicherung von Zellen in Mikrotiterplatten Folgende Lösungen wurden verwendet:
    • • 1 × PBS (aus PBS-Stammlösung),
    • • 20 × SSC (3,0 M NaCl 0,3 M Trinatriumcitrat, pH 7,0)
    • • Mikrotiterplattenpuffer (MP-Puffer): 5 × SSC, 0,02% SDS, 2% (Roche), 0,1% N-Laurylsarcosin, 33% Formamid
  • Durchführung:
    • • Die mit markierten Polynukleotidsonden hybridisierten fixierten Zellen 2 min bei 12000 rpm abzentrifugieren und 2 mal mit 1 × PBS waschen
    • • Zellen in 350 μl Mikrotiterplattenpuffer aufnehmen
    • • je 50 μl des Ansatzes auf 7 Mikrotiterkavitäten verteilen, was einer eingesetzten Zellmenge von 3μl pro Kavität entspricht
    • • 6 von den Kavitäten sind mit DNS, die komplementär zur Polynukleotidsonde ist, beschichtet.
    • • Die 7. Kavität dient als Negativkontrolle, und ist mit einer anderen als der zur Sonde komplementäre DNS beschichtet
    • • Platte mit Ansätzen 1–2 h bei 53 °C in einem Hybridisierungsofen (Bachofer, Reutlingen) inkubieren
    • • Zur Erhöhung der Abreicherungseffizienz wurde der Überstand auf neue Kavitäten überführt und eine weitere Stunde inkubiert.
  • Ohne vorausgehende enzymatische Behandlung ließen sich PFA- und EtOH-fixierte Zellen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus epidermidis nach Hybridisierungen in Lösung, nicht abreichern.
  • Staphylococcus aureus und Staphylococcus saprophyticus konnten nach einer Behandlung ihrer Zellwand vor der Hybridisierung in Lösung entweder mit Lysozym (10 min auf Eis) oder mit Lysozym (10 min bei 30°C) und Lysostaphin (5 min bei 30°C) deutlich abgereichert werden.
  • Die Vorbehandlung der Zellwand von Staphylococcus aureus und Staphylococcus saprophyticus mit Lysozym und Lysostaphin erlaubte im Vergleich zur Vorbehandlung nur mit Lysozym, das Eindringen einer größeren Menge von Polynukleotidsonden in die Zellen. Dies führte zur Bildung größerer Polynukleotidsonden-Netzwerke und dadurch zu einem erhöhten Anteil an Biotin-Molekülen. Die gemessenen Extinktionen hängen direkt vom Biotin-Anteil Polynukleotidsonden- Netzwerk ab, insofern als dass die Detektion über das Biotin-Streptavidin-Peroxidase-BM Blue System durchgeführt wird.
  • Demzufolge kommt es bei annähernd gleichen Anzahl abgereicherten Zellen, die mit Lysozym oder mit Lysozym und Lysostaphin vorbehandelt wurden, zu einem höheren Durchschnitt der Extinktionswerte bei abgereicherten Zellen die mit Lysozym und Lysostaphin vorbehandelt wurden.
  • 10 zeigt die Abreicherungen von Staphylokokken nach Behandlung ihrer Zellwand nach verschiedenen Methoden.
  • Staphylococcus haemolyticus und Staphylococcus epidermidis ließen sich erst nach einer Behandlung ihrer Zellwand vor der Hybridisierung in Lösung, mit Lysozym (10 min bei 30°C) und anschließend Lysostaphin (5 min bei 30°C) deutlich abreichern. Zellen von Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens ließen sich ohne vorausgehende Behandlung ihrer Zellwand erfolgreich abreichern Die Abreicherungen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens in Mischung aus jeweils einem grampositiven und einem gramnegativen Organismus waren erfolgreich. Eine Verstärkung des Abreicherungserfolgs konnte durch das Wiederholen der Abreicherung auf frischen Kavitäten erreicht werden. Dabei wurden die Bakterien, die auf der saturierten Kavitätsfläche nicht mehr über den Ankereffekt der Polynukleotidsonden immobilisiert werden konnten, in frische Kavitäten überführt und eine zweite Abreicherung durchgeführt.
  • Beispiel 14
  • Artspezifische in situ Hybridisierungen mit den verwendeten Staphylokokken
  • Es wurden bei den Hybridisierungen Formamidkonzentrationen von 0–50% systematisch für jede Sonde ausgetestet. Es ergaben sich für jede Sonde optimale Formamidkonzentrationen, die unspezifische Bindungen verhinderten und spezifische Bindungen noch weiter verstärkten. In situ Hybridisierungen mit den entworfenen artspezifischen Oligonukleotidsonden konnten mit den Zellen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus epidermidis, Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens erfolgreich durchgeführt werden. Zum Teil kamen spezifische Hybridisierungen bei 0% Formamid zustande. Für eine erfolgreiche Hybridisierung von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus und Staphylococcus epidermidis, wurden die PFA-fixierten Zellen 10 min mit Lysozym auf Eis behandelt. Vor und nach der Lysozym-Behandlung waren die PFA-fixierten Zellen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus und Staphylococcus epidermidis einer EtOH-Reihe-Behandlung unterzogen. Auch die Zellen von Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens wurden vor der Hybridisierung PFA-fixiert.

Claims (14)

  1. Verfahren zur taxonspezifischen Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung auf grampositive Bakterien, welches umfasst: Fixieren von Bakterien eines zu untersuchenden Bakteriengemisches, Permeabilisieren der Zellwand der in dem Bakteriengemisch enthaltenen grampositiven Bakterien, und Kontaktieren des Bakteriengemisches mit einer für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Polynukleotidsonde, wobei das eine oder die mehreren grampositiven Bakterien einem Taxon angehören und wobei eine Hybridisierungsreaktion zwischen dem einen oder den mehreren grampositiven, einem Taxon angehörenden Bakterien und der spezifischen Nukleotidsonde erfolgt, Sortieren und/oder Identifizieren der Bakterien, bei welchen eine Hybridisierungsreaktion mit der für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Polynukleotidsonde erfolgt ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die grampositiven Bakterien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Staphylokokken und Enterokokken.
  3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bakteriengemisch sowohl grampositive, als auch gramnegative Bakterien umfasst.
  4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Permeabilisieren der Zellwand der grampositiven Bakterien enzymatisch erfolgt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Permeabilisieren der Zellwand umfasst eine enzymatische Behandlung mit einem lytischen Enzym, vorzugsweise eine Behandlung mit Lysozym, eine Behandlung mit Lysostaphin, oder Kombinationen hiervon, und/oder eine Behandlung durch Erhitzen.
  6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifische Nukleotidsonde eine Transkript-Polynukleotidsonde ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Transkript-Polynukleotidsonde eine Transkript-Polynukleotidsonde ist, die auf einen DNA-Abschnitt gerichtet ist, der für eine variable Region innerhalb der Domäne III von bakterieller 23S rRNS kodiert.
  8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsonde einen Abschnitt außerhalb der Zelle aufweist.
  9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Hybridisierungsreaktion eine in situ Hybridisierungsreaktion ist.
  10. Isolierte DNS-Moleküle, welche eine Nukelotidsequenz umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, oder DNS-Sequenzen mit mindestens 85%, vorzugsweise mindestens 90% Identität zu einer der DNS-Sequenzen mit SEQ. ID. NO: 1–7.
  11. Isolierte DNS-Moleküle nach Anspruch 10, welche ein oder mehrere Nukleotide aufweisen, die mit einem Marker, vorzugsweise Biotin, verknüpft sind.
  12. Kit zum Identifizieren oder Sortieren von grampositive Bakterien, welcher umfasst: ein Agens zum Permeabilisieren der Zellwand von grampositiven Bakterien, und/oder eine oder mehrere chemische Verbindungen, welche ein DNS-Molekül nach einem der Ansprüche 10 oder 11 umfassen.
  13. Vorrichtung, vorzugsweise Mikrotiterplatte oder Objektträger, welche eine chemische Verbindung aufweist, die einen DNS-Abschnitt umfasst, der zu einer Transkript-Polynukleotidsonde komplementär ist, wobei die Transkript-Polynukleotidsonde auf einen DNS-Abschnitt gerichtet ist, der für eine variable Region innerhalb der Domäne III von bakterieller 23S rRNS kodiert.
  14. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 – 9 zum Identifizieren und/oder Anreichern von pathogenen Mikroorganismen aus Probenmaterial, vorzugsweise Blut, Gewebeproben, Stuhlgang, Speichel, Urin.
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