WO2005118882A2 - Verfahren zur taxonspezifischen zellidentifizierung und zellsortierung auf grampositive bakterien und vorrichtungen hierfür - Google Patents

Verfahren zur taxonspezifischen zellidentifizierung und zellsortierung auf grampositive bakterien und vorrichtungen hierfür Download PDF

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for taxon-specific cell identification and / or cell sorting on gram-positive bacteria.
  • the present invention provides a kit and devices therefor.
  • microorganisms can be classified based on morphological and physiological criteria.
  • a classification sometimes leads to an incorrect phylogenetic classification.
  • genetic data for the classification of microorganisms can be obtained by sequencing methods, which methods allow a more precise phylogenetic classification.
  • a separation between target cells and non-target cells then takes place via a magnetic column, the target cells which had bound paramagnetic beads remain fixed in the column and the unmarked non-target cells which had not bound paramagnetic beads seep through the column and then be washed out. After switching off the magnetic field, the target cells can then be determined.
  • Gram-positive bacteria are known to cause difficulties in detection methods that involve hybridization steps, since their cell wall, which is thick compared to the gram-negative bacteria (approximately 30-80 ⁇ m), is problematic in hybridization with oligonucleotide probes and polynucleotide probes because the penetration of a sufficient amount The amount of oligonucleotide probes and polynucleotide probes in the gram-positive cells is prevented or made difficult by the thick murein layer.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method which enables taxon-specific identification of gram-positive bacteria, the identification should be able to be carried out to a high degree reliably and for use in modern analysis methods, for example for fluorescence spectroscopic detection, and in examination methods which unite enable high throughput of samples to be examined, should be suitable.
  • Such a method should also be feasible in the presence of other bacteria, both gram-positive and gram-negative bacteria, and should be compatible with steps for taxon-specific bacterial enrichment.
  • complete lysis of the cells should not occur in a method according to the invention.
  • the present invention solves this problem by providing a method for taxon-specific cell sorting and / or cell identification on gram-positive bacteria, which comprises: fixing bacteria of a bacterial mixture to be investigated, pemieabilizing the cell wall of the gram-positive bacteria contained in the bacterial mixture, and contacting the bacterial mixture with one nucleotide probe specific for one or more gram-positive bacteria, the one or more gram-positive bacteria belonging to a taxon and a hybridization reaction taking place between the one or more gram-positive, taxon-belonging bacteria and the specific nucleotide probe, and sorting and / or identifying the bacteria in which a hybridization reaction has taken place with the nucleotide probe specific for one or more gram-positive bacteria.
  • FIG. 1 shows an agarose gel electrophoresis of the polynucleotide probes used.
  • FIG 3 shows a phase contrast recording and an epifluorescence recording of a Standard hybridization with Staphylococcus aureus (after 10 min lysozyme and then 5 min lysostaphin treatment).
  • FIG. 5 shows a phase contrast recording and an epifluorescence recording of a standard hybridization of Staphylococcus haemolyticus with the probe of Staphylococcus epidermidis (after 10 min lysozyme treatment and subsequent incubation: 7 min at 200 ° C.).
  • FIG. 6 shows a phase contrast recording and an epifluorescence recording of a standard hybridization of Staphylococcus saprophyticus (after 10 min lysozyme treatment) in a mixture with Enterobacter aerogenes.
  • the present invention provides a reliable method for taxon-specific cell identification and / or cell sorting of gram-positive bacteria, which enables simple evaluation and can optionally be coupled with steps for cell enrichment.
  • the method according to the invention is also suitable for adaptation to a wide variety of detection methods of the prior art and can be used in applications which enable a high throughput of samples, for example for reactions to Microtiter plates.
  • taxa denotes summaries of families such as, for example, Streptococcaceae or Enterococcaceae, as well as subfamilies, genera and species.
  • the present invention therefore enables cell sorting and / or cell identification to be carried out, which can be directed both to different families of gram-positive bacteria and to certain types of bacteria and, if appropriate, for higher taxa, in particular when using probe mixtures.
  • a first step of the method according to the invention for taxon-specific cell sorting and / or cell identification on gram-positive bacteria the bacteria of a bacterial mixture to be examined, which can include different families, subfamilies, genera and types of bacteria, are fixed. Depending on specific tasks, cell fixation with aqueous paraformaldehyde solution or ethanol can be used for this purpose.
  • the cell wall of the gram-positive bacteria is permeabilized, which enables the nucleotide probes to penetrate reliably. such that a reliable identification and / or sorting of the cells can take place. Permeabilization can take place, for example, by using enzymes.
  • the bacteria are then sorted and / or identified in which a hybridization reaction with the nucleotide probe specific for one or more gram-positive bacteria has taken place.
  • Any of the prior art methods known to those skilled in the art for sorting and / or identifying the bacteria can be used here, for example sorting: immobilization, flow cytometer, micromanipulator; Identify: fluorescence, laser scanning microscopy, flow cytometer.
  • the gram-positive bacteria can, for example, be selected from the group consisting of staphylococci and enterococci.
  • the present invention provides method steps for the development and optimization of common treatment methods for sufficient permeabilization of the cell wall of Staphylococcus saprohyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus epidermidis, for the development and optimization of common treatment methods for sufficient permeabilocociation of the enteric cell wall faecalis, Enterococcus durans and Enterococcus gallinarum, and furthermore for the development and optimization of common treatment methods for sufficient permeabilization of the cell wall of Staphylococcus saprohyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Enterocococ faoccus, Enterocococcus faocecum, Enter ,
  • the present invention provides in particular various methods which made it possible to cell wall of staphylococci (Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis) and Enterococci (Enterococcus faecium, Enterocococcus peculiarum, Enterocococcus peculiarum, Enterocococcus peculiarum, Enterococcus peculiarum, Enterolococcus peculiarus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecalisab halos are formed after hybridization as described below.
  • both gram-positive and gram-negative bacteria can be contained in the bacterial mixture, with the gram-positive bacteria being able to be clearly identified despite the presence of the gram-negative bacteria.
  • the cell wall of gram-positive bacteria has a multi-layered mureirr network that is sometimes linked to polysaccharides, often to polyolphosphates. Without these cells being pretreated according to the invention, the cell wall is not permeable to the possibly labeled probes. Pemieabilization of the cell wall of the gram-positive bacteria can take place enzymatically, lytic enzymes known to the person skilled in the art, such as, for example, lysozyme or lysostaphin, being able to be used as enzymes. In particular, treatment with lysozyme, treatment with lysostaphin, or combinations thereof, and / or treatment by heating can take place.
  • the duration and temperature of a treatment by heating can be chosen according to the knowledge of the person skilled in the art.
  • the temperature can be at least 70 ° C.
  • the temperature is 150 ° C to 220 ° C, more preferably 195 ° C to 205 ° C.
  • nucleotide probe encompasses both oligonucleotide and polynucleotide probes. Oligonucleotide probes comprise at least 15 nucleotides. Depending on the desired detection method, polynucleotide probes with a length of 100 to 500 nucleotides, preferably 200 to 300 nucleotides, can be used in the method according to the invention.
  • the nucleotide probe specific for one or more gram positive bacteria can be a transcript polynucleotide probe.
  • ribosomal RNA molecules in particular ribosomal RNA molecules 16S and 23S, are suitable, for example. Ribosomal RNA molecules can be used to reconstruct the course of evolution, since they show functional homology in all organisms, their sequences consist of variable and highly conservative areas and because of their length they contain enough sequence information to make a statistically sufficient comparison guarantee.
  • Transcript polynucleotide probes which are directed towards a DNA segment which codes for a region within bacterial 16S rRNA or 23S rRNA are therefore preferably considered.
  • the transcript polynucleotide probe can be a transcript polynucleotide probe that targets a portion of DNA that encodes a highly variable region within domain III of bacterial 23 S RNA.
  • Such probes can be produced by in vitro transcription of amplified rDNA of this highly variable region within domain III with biotin-labeled UTP and enable group-specific detection of microorganisms. If specific sequences are used in a targeted manner, the cultivation-independent detection of either superordinate genera or specific species to subspecies can be made possible.
  • bacterial rRNA it can be of particular advantage that the ribosomes to which the transcript probe is bound are located in the peripheral areas of the cell wall.
  • Specific rRNA-directed oligonucleotide probes can be developed, for example, with the "Probe Design” function implemented in the ARB program package (Stnrnk, O. and Ludwig, W., (2001) ARB - a software environment for sequence data, Kunststoff; http: // www.arb-home.de)
  • the specificity of the probes towards other organisms can be checked, for example, by means of the "Probe Match" function of the ARB program package.
  • the probes partially protrude from the cell. If, for example, fluorescence in situ hybridization is aimed for as a detection method, these labeled polynucleotide probes bind to the target rRNA and part of the probes protrude from the cell, a kind of network being formed by intermolecular partial hybrid formation and forming a so-called halo (English halo) comes around the cell.
  • fluorescence in situ hybridization is aimed for as a detection method
  • these labeled polynucleotide probes bind to the target rRNA and part of the probes protrude from the cell, a kind of network being formed by intermolecular partial hybrid formation and forming a so-called halo (English halo) comes around the cell.
  • this halo permits detection of the cells in the epifluorescence microscope with the streptavidin-fluorescein system, and on the other hand enrichment by pairing the protruding parts of the polynucleotide probes with immobilized single-stranded DNA sections which are complementary to the polynucleotide probes.
  • Other systems known to the person skilled in the art, such as, for example, direct labeling of the probes, can also be used for detection.
  • hybridization reactions can be used in accordance with the knowledge of the person skilled in the art and can be adapted as desired for the respective application.
  • hybridization reactions can be used in situ.
  • the present invention provides hybridization protocols used to form typical halos after in situ hybridizations from the gram positive organisms used Polynucleotide transcript probes resulted in the cell wall of gram-positive bacteria being enzymatically and / or physically treated or permeabilized before the hybridizations, in such a way that sufficient penetration of the polynucleotide transcript probes into the cells is made possible.
  • the HYCOMP method (“hybridization in coated microtiter plates”) proved to be suitable for a combination with the method according to the invention, the efficiency of the depletion with respect to the staphylococci, for example, being able to be influenced by the preceding treatment of the cells used.
  • the method according to the invention can in particular be carried out on microtiter plates or on slides. This enables the use of various devices and measuring devices that have been developed for commercially available microtiter plates or slides.
  • the method according to the invention can be supplemented with method steps which enable the target microorganisms to be enriched.
  • hybridization can take place in coated microtiter plates, for example.
  • the present invention provides a method in which a combination of in situ hybridization and subsequent depletion in microtiter plate format can be successfully used as a means for taxon-specific cell sorting on gram-positive selected staphylococci and enterococci. It is particularly advantageous that, based on the present invention, the use of polynucleotide probes, the sequence of which consists of repetitive sequences of species-specific oligo probes, enables species-specific identification and depletion of cells.
  • the method according to the invention also includes the fact that several polynucleotide transcript probes with different target organisms can be used for the simultaneous separation of multiple organisms. Furthermore, composite polynucleotide probes can be developed that simultaneously detect different phylogenetic levels.
  • the present invention provides species-specific polynucleotide probes which are directed against variable regions of the 1 ⁇ S rRNA and the 23S rRNA, each of the organisms examined being able to be hybridized and identified specifically.
  • the present invention provides isolated DNA molecules which comprise a DNA sequence selected from the group consisting of SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2, SEQ. LD. NO: 3, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. DD. NO: 7, or DNA sequences with at least 85%, preferably at least 90% identity to one of the DNA sequences with SEQ. LD. NO: 1-7.
  • These isolated DNA molecules can have one or more nucleotides which are linked to a marker known in the prior art, for example biotin.
  • the labeling can be carried out by incorporating biotin-16-UTP during the transcription reaction.
  • the present invention further provides a kit for identifying or sorting gram-positive bacteria, which comprises: agent for polemicilizing the cell wall of gram-positive bacteria, and / or one or more chemical compounds which comprise a DNA molecule according to one of claims 10 or 11 ,
  • the present invention also includes devices, preferably microtiter plates or slides, which have a chemical compound which comprises a DNA section which is complementary to a transcript polynucleotide probe, the transcript polynucleotide probe being directed to a DNA section which is intended for a variable region within domain III encoded by bacterial 23 S rRNA.
  • the method according to the invention thus provides a simple, fast and reliable method which makes work significantly easier for researchers and for employees of medical and microbiological laboratories, and in particular for identifying and / or enriching pathogenic microorganisms, in particular taxa, which are known to include pathogenic representatives, from clinical sample material, such as blood, tissue samples, bowel movements, saliva, urine, etc.
  • A adenine, amps; Amp .: Atnpicillin; ATP: adenosine triphosphate; b: bases; BWI: Brain Heart Infusion; dist. : double distilled; bp: base pairs; C: cytosine; ° C: degrees Celsius; cm: centimeter; d: day (s), diameter; D: Germany; There: Dalton; dATP: deoxyadenosine triphosphate; dCTP: deoxycytosine triphosphate; least.
  • dGTP deoxyguanidine triphosphate
  • DNase deoxyribonuclease
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • ddNTP dideoxyribonucleoside 5'-triphosphate
  • dNTP deoxyribonucleoside 5'-triphosphate
  • ds double-stranded
  • dTTP deoxy ymidine triphosphate
  • E extinction
  • EDTA emylene diamine ink raacetat
  • ERG Eppendorf reaction vessel
  • EtOHabs E: Eppendorf reaction vessel
  • rDNA ribosomal deoxyribonucleic acid, DNA encoding rRNA
  • RNS ribonucleic acid
  • RNase ribonuclease
  • rpm revolutions per minute, revolutions per minute
  • rRNA ribosomal nucleic acid
  • RT room temperature
  • SA streptavidin solution flu
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • sec second
  • sp. Species
  • ss single stranded, single-stranded
  • SSC standard saline citrate solution
  • T thymine
  • TAE tris / acetate / EDTA
  • Taq DNS - dependent DNA polymerase from Thermus aquaticus
  • staphylococci and enterococci are gram-positive microorganisms, while Serratia marcescens and Enterobacter aerogenes are gram-negative bacteria.
  • the culture media specified in the table are used as culture media for the microorganisms used. These nutrient media have the following compositions:
  • the microorganisms used were inoculated with 5 ml liquid medium or from a 5 ml overnight culture in 100 ml Erlenmeyer flasks at 30 ml, on a rotary shaker (Infors, Basel, CH) or at the optimum growth temperature grown on nutrient media solidified with agarose in petri dishes (Greiner, Nürtingen, D).
  • strains were streaked on the solidified media listed in Table 1 with a sterile inoculation loop, incubated overnight at the respective optimal growth temperature and then stored at 4 ° C. In order to keep the strains, these strains were inoculated into fresh medium every two weeks. The purity was checked by dilution smears and by microscopic control in phase contrast. For long-term stock keeping, glycerol cultures were set up from all strains, 800 ⁇ l of a 5 ml culture overnight being mixed with 800 ⁇ l of a 50% glycerol solution in cryotubes (2 ml, Sarstedt, Nümbrecht, D) and stored at -80 ° C.
  • PBS stock solution PBS: phosphate-buffered saline: solution 1: 8 M Na2HP ⁇ 4, 1, 5 M KH2PO4 solution 2: 137 mM NaCl, 2.7 mM KC1 (both solutions were titrated with each other up to pH 7.2)
  • EtOHabs denotes ethanol 96%.
  • the cells were grown and harvested as in the PFA fixation.
  • the harvested cells were washed with 1 ⁇ PBS, centrifuged, the precipitate was resuspended in 1 ⁇ PBS, 1 vol ice-cold EtOHabs were added and the mixture was stored at ⁇ 20 ° C.
  • Example 2
  • Lysozyme (Serva, Germany) 10 mg / ml in 50 mM Tris / HCl, pH 8.0
  • ethanol-fixed immobilized cells were treated in a first ascending ethanol series (50%, 80%, 98% for 3 min each). The cells were then treated with lysozyme on ice for 10 min and then at 200 ° C. for 7 min. Lysozm was removed after 10 minutes of action by rinsing with H2 ⁇ bidest. This was followed by a second series of ascending ethanol (50%, 80%, 98% for 3 min each). The hybridization was then carried out as described in Example 4.3.
  • the EtOH-fixed immobilized cells were dehydrated by a first ethanol treatment (3 min 50%, 80%, 98% each) so that they were treated after the lysozyme treatment Slides stick.
  • the cells were treated with lysozyme on ice for 10 min.
  • the lysozyme was then removed by rinsing the slide with H2 ⁇ bidest and the slide was incubated at 200 ° C. for 15 minutes. This was followed by a second series of ascending ethanol (50%, 80%, 98% for 3 min each).
  • the hybridization was then carried out as described in B. 3. 8. 2. / B. 3. 8. 3.
  • Labeled RNA probes of high specific activity can be produced by in vitro transcription of PCR products. What these PCR products have in common is that they contain a promoter sequence for the bacteriophage RNA polymerases SP6, T3 or T7. A T3 promoter sequence was attached to the reverse primer (317R). An RNase inhibitor was used to ensure the integrity of the RNA produced. This inhibitor has a high affinity for RNase and blocks its activity. Following the in vitro synthesis of labeled RNA molecules, the reaction mixture was treated with DNase I (RNase-free). As a result, the PCR products were hydrolyzed, which made it possible to avoid disruptive influences from unlabeled sequences during hybridization. The labeling of the RNA molecules was carried out by incorporating Biotin-16-UTP into these molecules during the transcription reaction.
  • Ammonium acetate solution (NH4 acetate 10 M), EDTA (0.2 M, pH 8.0), TE buffer (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM, pH 8.0), ethanolabs (ethanol 96%).
  • NTP mix (ATP lOOmM 2 ⁇ l, CTP lOOmM 2 ⁇ l, GTP lOOmM 2 ⁇ l, UTP lOOmM 0.7 ⁇ l, Biotin-16-UTP lOmM 13 ⁇ l, where as a reporter molecule Biotin-16-UTP (Biotin- ⁇ -aminocaproyl- ⁇ - aminobutyryl- [5- (3-aminoallyl) uridine-5 , -triphosphate]) is used)
  • the transcription reaction mixture contains 3 ⁇ l NTP mix, 3 ⁇ l transcription buffer, 3 ⁇ l T3 RNA polymerase, 1.5 ⁇ l RNase inhibitor (Röche), 0.5-2 ⁇ g template DNA and ad 30 ⁇ l
  • RNA transcripts • To precipitate the RNA transcripts, add 16 ⁇ l NH4 acetate and 156 ⁇ l EtOHabs and incubate for 2 h at -80 ° C or overnight at -20 ° C;
  • RNA probe To sediment the RNA probe, centrifuge for 15 min in a table centrifuge (Hettich Mikro 22R, Tuttlingen) at 4 ° C and 14000 rpm;
  • the melting temperature (Tm) plays an important role here; at this temperature half of the molecules are double-stranded. Tm is influenced by various parameters. So the melting temperature by z. B. monovalent cations (mostly Na +) can be increased. Mismatches reduce the thermal stability of the duplex DNA molecules. Helix-destabilizing agents such as formamide also reduce the melting temperature.
  • the table below shows an overview of properties and target organisms and target rRNA of the probes according to the invention. •: Formamide content in the hybridization target, which leads to an age-specific hybridization of the target organism.
  • the melting temperature can be calculated using the following formula:
  • Tm 4 (G + C) + 2 (A + T) G, C, A and T represent the number of bases.
  • wash buffer 5 M NaCl (see above), 1 M Tris / HCl pH 8.0 1 ml, 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetate) (see above), H 2 Ordnst ad 50 ml, 10% (w / v) SDS 50 ⁇ l.
  • the 0.5 M EDTA solution was only used from 20% formamide in the hybridization buffer.
  • the melting temperature value of polynucleotides with a length of up to 500 bp can be calculated using the following empirically determined formula:
  • NaCl stock solution NaCl 5 M
  • SDS solution sodium dodecyl sulfate, 10%, sterile filtered
  • Tris-HCl solution Tris 1 M, pH 8.0
  • Hybridization buffer NaCl 75 mM, Tris-HCl 20 mM, SDS 0.01%, FA 80%. • slides, 10 recesses (Marienfeld, D)
  • HYCOMP stands for "Hybridization in coated microplates". During hybridization, biotin-labeled polynucleotide probes do not penetrate completely into the cell. A portion of the probe protrudes from the cell and enables immobilization and thereby separation of the labeled hybridized cells from the unlabeled ones. The polynucleotide probes form a kind of network in the area of the cell wall through secondary structure formation. To sort labeled hybridized cells, the microtiter plates were coated with DNA, which is complementary to the polynucleotide probe. The part of the probe protruding from the cell hybridizes with the DNA in the microtiter plate.
  • Hybridization buffer 75 mM NaCl, 20 M Tris pH 8.0, 0.01% SDS, 80% FA
  • microtiter plates were coated with DNA complementary to the RNA transcript probe.
  • sequence of domain III of the 23S rDNA was plicated by the standard PCR with the primers 1900VN and 317RT3 a.
  • Blocking buffer PBS / 0.1% blocking reagent
  • Genomic DNA was isolated and purified from pure cultures of the microorganisms used.
  • the highly variable region within domain III of the 23 S rRNA was amplified, starting from the isolated genomic DNA of the microorganisms used, via a PCR (polymerase chain reaction) with the modified primers 317 RT3 and 1900 VN. These modified primers hybridize with conserved regions at the beginning and at the end of domain III of the 23 S rDNA.
  • the primer 317 RT3 contains the promoter sequence for the T3 polymerase, which is necessary for the construction of polynucleotide transcript probes.
  • the nucleic acid isolation was carried out as described below.
  • RNase A Quiagen, D; 0.5 mg / ml in 2x SSC (from 20x SSC)
  • Horizontal agarose gel electrophoresis was performed to determine the quality of nucleic acids and PCR products.
  • the nucleic acid migrates at different speeds within a gel under the action of an electric field depending on the number of charges and the molecular mass to the respective poles.
  • the gel was used for documentation under UV radiation (302 nm wavelength, Bachofer
  • the PCR products could be precipitated after storage for 2-12 h at -20 ° C. After a centrifuging the precipitated PCR products were HO b ⁇ dest added.
  • the following primers were used for the amplification (PCR) of the highly variable region of the domain of the 23 S rRNA:
  • the underlined area represents the T3 RNA polymerase promoter sequences, necessary for transcription.
  • the following table shows the abbreviations for the wobbles in the primers:
  • the resulting products from the amplification of domain III of the 23 S rDNA represent the template molecules that were used to construct the transcript probes.
  • the template molecules carry a promoter region for the T3 polymerase at the starting point of the transcription.
  • the T3 polymerase produces RNA transcripts that are used directly as a probe. 1 shows the polynucleotide probes used in each case.
  • the symbol _ stands for zero sample, the abbreviation Kbl for kilobase conductor, lkb.
  • Lanes 1 to 10 of Figure 1 show polynucleotide probes with respect to the microorganisms:
  • Staphylococcus saprophyticus 6 Enterococcus faecalis
  • Staphylococcus aureus 7 Enterococcus durans
  • Staphylococcus haemolyticus 8 Enterococcus gallinarum
  • Staphylococcus epidermidis 9 Enterobacter aerogenes Enterococcus faecium 10: Serratia marcescens
  • the cell wall of gram-positive organisms is the biggest problem in in situ hybridizations.
  • the cell wall of gram-positive bacteria was enzymatically and / or physically treated or permeabilized before the hybridizations, that sufficient penetration of the polynucleotide transcript probes into the cells is made possible.
  • FIG. 3 shows a phase contrast recording and an epifluorescence recording of a standard hybridization with Staphylococcus aureus (after 10 min lysozyme and then 5 min lysostaphin treatment). Comparable results were obtained with a standard hybridization with Staphylococcus haemolyticus (after 10 min lysozyme and then 5 min lysostaphin treatment) and a standard hybridization with Staphylococcus epidermidis (after 10 min lysozyme and then 5 min lysostaphin treatment).
  • the group specificity of the polynucleotide transcript probes could be confirmed after in situ hybridizations of each of the staphylococci used with the probe of a different Staphylococcus (see FIG. 5).
  • Fig. 5 shows an example of the formation of typical halos in the hybridization of Staphylococcus haemolyticus with the probe of Staphylococcus epidermidis, what is there suggests that the hybridization with the grapple-specific probe has taken place, with a standard hybridization of Staphylococcus haemolyticus (after 10 min lysozyme treatment and subsequent incubation: 7 min at 200 ° C.) using the probe from Staphylococcus epidermidis.
  • FIG. 6 shows a phase contrast recording and an epifluorescence recording of a standard hybridization of Staphylococcus saprophyticus (after 10 min lysozyme treatment) in a mixture with Enterobacter aerogenes.
  • a comparable result was obtained under the specified conditions even with a standard hybridization of Staphylococcus aureus (after 10 min lysozyme treatment) in a mixture with Serratia marcescens.
  • Example 11 In situ hybridizations with enterococci after treatment with lysozyme and heat
  • Table C. 1 Treatments for permeabilizing the cell wall of staphylococci and enterococci before fluorescence in situ hybridization with the polynucleotide probe generated by the respective organism DNA 8 shows a phase contrast recording and an epifluorescence recording of a standard hybridization with EtOH-fixed Enterococcus durans (after 10 min lysozyme treatment and subsequent incubation: 15 min at 200 ° C.).
  • a target organism was depleted using the HYCOMP method.
  • the extent of depletion with respect to an organism can be obtained by evaluating the absorbance measured at a wavelength of 450 nm against a reference wavelength of 650 nm.
  • an optical evaluation of the depletion of a target organism in a mixture of different physiologically different organisms can be carried out by analyzing the "positive supernatant” and "negative supernatant” in the microscope.
  • the following formula can be used for this purpose:
  • Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus aureus
  • Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus epidermidis
  • Enterobacter aerogenes Serratia marcescens were performed as described below.
  • Microtiter plate buffer 5x SSC, 0.02% SDS, 2% (Röche), 0.1% N-lauryl sarcosine, 33% formamide
  • the 7th cavity serves as a negative control and is coated with a DNA that is complementary to that of the probe
  • Staphylococcus aureus and Staphylococcus saprophyticus were significantly depleted after treatment of their cell wall before hybridization in solution with either lysozyme (10 min on ice) or with lysozyme (10 min at 30 ° C) and lysostaphin (5 min at 30 ° C).
  • the pretreatment of the cell wall of Staphylococcus aureus and Staphylococcus saprophyticus with lysozyme and lysostaphin allowed the penetration of a larger amount of polynucleotide probes into the cells compared to the pretreatment with lysozyme only. This led to the formation of larger polynucleotide probe networks and thus to an increased proportion of biotin molecules.
  • the measured extinctions depend directly on the biotin portion of the polynucleotide probe network, in that the detection is carried out via the biotin streptavidin peroxidase-BM Blue system.
  • Fig. 10 shows the range of staphylococci after treatment of their cell wall by various methods.
  • Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus epidermidis could only be significantly reduced after treatment of their cell wall before hybridization in solution, with lysozyme (10 min at 30 ° C) and then lysostaphin (5 min at 30 ° C). Enterobacter aerogenes and Serratia marcescens cells could be successfully depleted without prior treatment of their cell wall. The depletion ranges of Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter aerogenes and Serratia marcescens in a mixture of a gram-positive and a gram-negative organism were successful.
  • Formamide concentrations of 0-50% were systematically tested for each probe in the hybridizations. There were optimal formamide concentrations for each probe, which prevented unspecific binding and further strengthened specific binding.
  • In situ hybridizations with the designed species-specific oligonucleotide probes were successfully carried out with the cells of Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus epidermidis, Enterobacter aerogenes and Serratia marcescens. In some cases, specific hybridizations occurred at 0% formamide.
  • the PFA-fixed cells were treated with lysozyme on ice for 10 min. Before and after the lysozyme treatment, the PFA-fixed cells of Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus epidermidis were subjected to an EtOH series treatment. Enterobacter aerogenes and Serratia marcescens cells were also PFA-fixed before hybridization.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und/oder Zellsortierung auf grampositive Bakterien. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zum Identifizieren und Sortieren von grampositiven Bakterien und Vorrichtungen zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und/oder Zellsortierung auf grampositive Bakterien, beispielsweise Mikrotiterplatten und Objektträger, bereit.

Description

Verfahren zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und Zellsortierung auf grampositive Bakterien und Vorrichtungen hierfür
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und/oder Zellsortierung auf grampositive Bakterien. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung einen Kit und Norrichtungen hierfür bereit.
Verschiedene Verfahren zur Einordnung von Mikroorganismen sind derzeit bekannt. So können beispielsweise Mikroorganismen anhand von morphologischen und physiologischen Kriterien eingeordnet werden. Eine derartige Einordnung führt jedoch teilweise zu einer falschen phylogenetischen Klassifikation. Weiterhin können genetische Daten zur Einordnung von Mikroorganismen durch Sequenzierverfahren gewonnen werden, wobei diese Verfahren eine exaktere phylogenetische Einteilung ermöglichen.
Ein kultivierungsunabhängiges Verfahren zur Anreicherung von Bakterien anhand von rR S gerichteten Biotin-UTP markierten Transkript-Polynukleotidsonden wurde erstmals 1999 von Stoffels et al. entwickelt (Stoffels, M., Ludwig, W., Schleifer, K.H., (1999) rRΝA probe-based cell fishing of bacteria. Environ. Microbiol. 1(3), 259-271.) Bei diesem Verfahren werden die Sonden mit den Bakterien hybridisiert und die so hybridisierten Zellen mit paramagnetischen Streptavidin beschichteten Partikeln inkubiert. Über eine magnetische Säule erfolgt anschließend eine Separation zwischen Zielzellen und Νicht-Zielzellen, wobei die Zielzellen, die paramagnetischen Kügelchen gebunden hatten, in der Säule fixiert bleiben und die unmarkierten Νicht-Zielzellen, die keine paramagnetischen Kügelchen gebunden hatten, durch die Säule durchsickern und anschließend ausgewaschen werden. Nach Ausschalten des magnetischen Feldes können dann die Zielzellen eruiert werden.
Bei Nachweisverfahren, die Hybridisierungsschritte umfassen, führen bekanntermaßen grampositive Bakterien zu Schwierigkeiten, da sie durch ihre, im Vergleich mit den gramnegativen Bakterien dicke Zellwand (etwa 30-80 um), problematisch bei einer Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden und Polynukleotidsonden sind, da das Eindringen einer ausreichenden Menge von Oligonukleotidsonden und Polynukleotidsonden in die grampositiven Zellen durch die dicke Mureinschicht verhindert oder erschwert wird.
Darüber hinaus sind verschiedene Verfahren zur Identifizierung von grampositiven Bakterien bekannt, bei denen eine Lysis der Zellen erfolgt. Dies ist jedoch von Nachteil, da die Zellen dabei zerstört werden.
Neben einer zuverlässigen taxonspezifischen Identifizierung, ist weiterhin eine sichere und schnelle taxonspezifϊsche Anreicherung von Bakterien, ein zentrales Erfordernis in der Mikrobiologie.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung eines Verfahrens, das eine taxonspezifϊsche Identifizierung von grampositiven Bakterien ermöglicht, wobei die Identifizierung in hohem Maße zuverlässig durcliführbar sein sollte und für einen Einsatz bei modernen Analyseverfahren, beispielsweise für eine fluoreszenzspektroskopische Detektion, und bei Untersuchungsverfahren, die einen hohen Durchsatz an zu untersuchenden Proben ermöglichen, geeignet sein sollte. Ein derartiges Verfahren sollte auch in Gegenwart anderer Bakterien, sowohl grampositiver, als auch gramnegativer Bakterien, durchführbar sein und mit Schritten zur taxonspezifischen Anreicherung von Bakterien vereinbar sein. Darüber hinaus sollte bei einem erfindungsgemäßen Verfahren keine vollständige Lysis der Zellen eintreten.
Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur taxonspezifischen Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung auf grampositive Bakterien, welches umfasst: Fixieren von Bakterien eines zu untersuchenden Bakteriengemisches, Pemieabilisieren der Zellwand der in dem Bakteriengemisch enthaltenen grampositiven Bakterien, und Kontaktieren des Bakteriengemisches mit einer für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Nukleotidsonde, wobei das eine oder die mehreren grampositiven Bakterien einem Taxon angehören und wobei eine Hybridisierungsreaktion zwischen dem einen oder den mehreren grampositiven, einem Taxon angehörenden Bakterien und der spezifischen Nukleotidsonde erfolgt, und Sortieren und/oder Identifizieren der Bakterien, bei welchen eine Hybridisierungsreaktion mit der für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Nukleotidsonde erfolgt ist.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt eine Agarosegelelektrophorese der verwendeten Polynukleotidsonden.
Fig. 2 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer
Standardhybridisierung mit Staphylococcus saprophyticus (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung).
Fig. 3 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung mit Staphylococcus aureus (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung).
Fig. 4 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung mit PFA-fixierten Staphylococcus haemolyticus (nach 10 min Lysozym- Behandlung und anschließender Inkubation: 7 min bei 200°C).
Fig. 5 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung von Staphylococcus haemolyticus mit der Sonde von Staphylococcus epidermidis (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 7 min bei 200°C).
Fig. 6 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung von Staphylococcus saprophyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung) in Mischung mit Enterobacter aerogenes.
Fig. 7 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus faecium (nach 10 min Lysozym- Behandlung und anschließender Inkubation: 7 min bei 200°C).
Fig. 8 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus durans (nach 10 min Lysozym- Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C).
Fig. 9 zeigt eine Phasenkontrastaufiiahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Staphylococcus epidermidis (nach 10 min Lysozym- Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C).
Fig. 10 zeigt die Abreicherungen von Staphylokokken nach Behandlung ihrer Zellwand nach verschiedenen Methoden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein zuverlässiges Verfahren zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und/oder Zellsortierung von grampositiven Bakterien bereit, das eine einfache Auswertung eπnöglicht und optional mit Schritten zur Zellanreicherung gekoppelt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zudem für eine Anpassung an verschiedenste Detektionsverfahren des Stands der Technik und kann bei Anwendungen eingesetzt werden, die einen hohen Durchsatz an Proben ermöglichen, beispielsweise für Reaktionen auf Mikrotiterplatten.
Während der zahlreichen Versuche, die zu der vorliegenden Erfindung führten, zeigte es sich überraschenderweise, dass eine zuverlässige und eindeutige taxonspezifische Identifizierung von grampositiven Bakterien auf Basis von Polynukleotid-Sonden möglich ist, wobei die Sonden durch die Zellwand in die Zelle eindringen und dort an eine Zielsequenz binden, während ein Teil der Sonde aus der Zelle herausragt. Aufgrund des Aufbaus der Zellwand und/oder der Zellhülle von grampositiven Bakterien wurde bislang nicht angenommen, dass ein Eindringen von Polynukleotid-Sonden in die Zellen von grampositiven Bakterien in ausreichender Menge möglich wäre, um eine zuverlässige und klar auswertbare Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung zu ermöglichen.
Eine derartige zuverlässige und klar auswertbare Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung wird nunmehr durch das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet, das insbesondere eine schnelle und gegebenenfalls gemeinsame Behandlung zur optimalen PermeabiHsierung der Zellwand und Zellmembran unterschiedlicher grampositiver Bakterien vor der Hybridisierung bereitstellt. Bei Hybridisierungen in Mischungen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren aus grampositiven und gramnegativen Organismen, war die Spezifität der Polynukleotidsonde für den Organismus, von dessen DNS sie generiert wurde, gegeben.
Der Begriff "Taxon", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezeichnet sowohl Zusammenfassungen von Familien, wie beispielsweise Streptococcaceae oder Enterococcaceae, als auch von Unterfamilien, Gattungen und Arten. Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher, dass eine Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung durchgeführt wird, die sowohl auf verschiedene Familien von grampositiven Bakterien gerichtet sein kann, als auch auf bestimmte Bakterienarten und ggf. für höhere Taxa, insbesondere bei Einsatz von Sondengemischen..
In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens zur taxonspezifischen Zellsortierung und/oder Zellidentifizierung auf grampositive Bakterien werden die Bakterien eines zu untersuchenden Bakteriengemisches, das unterschiedliche Familien, Unterfamilien, Gattungen und Arten von Bakterien umfassen kann, fixiert. Hierzu kann in Abhängigkeit von spezifischen Aufgaben beispielsweise eine Zellfixierung mit wässriger Paraformaldehydlösung oder Ethanol erfolgen.
In einem weiteren Verfahrensschritt findet eine Permeabilisierung der Zellwand der grampositiven Bakterien statt, was ein zuverlässiges Eindringen der Nukleotidsonden ermöglicht, derart dass eine zuverlässige Identifizierung und/oder Sortierung der Zellen stattfinden kann. Die Permeabilisierung kann hierbei beispielsweise durch Einsatz von Enzymen erfolgen.
Anschließend erfolgt ein Kontaktieren des Bakteriengemisches mit einer für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Nukleotidsonde, wobei das eine oder die mehreren grampositiven Bakterien einem Taxon angehören und wobei eine positive Hybridisierungsreaktion zwischen dem einen oder den mehreren grampositiven, einem Taxon angehörenden Bakterien und der hierfür spezifischen Nukleotidsonde erfolgt.
Anschließend erfolgt ein Sortieren und/oder Identifizieren der Bakterien, bei welchen eine Hybridisierungsreaktion mit der für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Nukleotidsonde erfolgt ist. Hierbei können beliebige dem Fachmann bekannte Verfahren des Stands der Technik zum Sortieren und/oder Identifizieren der Bakterien eingesetzt werden, beispielsweise Sortieren: Lrrmobiliserung, Durchflusszytometer, Mikromanipulator; Identifizieren: Fluoreszenz-, Laserscamiigmikroskopie, Durchflusszytometer.
Die grampositiven Bakterien können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Staphylokokken und Enterokokken. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Nerfahrensschritte zur Entwicklung und Optimierung von gemeinsamen Behandlungsmethoden für eine ausreichenden Permeabilisierung der Zellwand von Staphylococcus saprohyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus und Staphylococcus epidermidis, zur Entwicklung und Optimierung von gemeinsamen Behandlungsmethoden für eine ausreichende Permeabilisierung der Zellwand von Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans und Enterococcus gallinarum, und darüber hinaus zur Entwicklung und Optimierung von gemeinsamen Behandlungsmethoden für eine ausreichende Permeabilisierung der Zellwand von Staphylococcus saprohyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, Enterococcus gallinarum, bereit.
Hierzu stellt die vorliegende Erfindung insbesondere verschiedene Verfahren bereit, die es ermöglichten, die Zellwand von Staphylokokken (Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis) und Enterokokken (Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, Enterococcus gallinarum) derart zu pemieabilisieren, dass es nach der Hybridisierung zur Bildung von Halos, wie nachstehend beschrieben, kommt. Hybridisierungen des Stands der Technik mit Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, und Enterococcus gallinarum ohne vorrausgehende Behandlung ihrer Zellwand führten zu keinem detektierbaren Signal.
Vorteilhaf ist, dass bei einem erfindungsgemäßen Verfahren in dem Bakteriengemisch sowohl grampositive, als auch gramnegative Bakterien enthalten sein können, wobei eine eindeutige Detektion der grampositven Bakterien trotz Anwesenheit der gramnegativen Bakterien erfolgen kann.
Die Zellwand von grampositiven Bakterien besitzt ein vielschichtiges Mureirrnetz, das manchmal mit Polysacchariden, häufig mit Polyolphosphaten verknüpft ist. Ohne eine erfindungsgemäße Vorbehandlung dieser Zellen ist die Zellwand für die ggf. markierten Sonden nicht durchlässig. Das Pemieabilisieren der Zellwand der grampositiven Bakterien kann enzymatisch erfolgen, wobei dem Fachmann bekannte lytische Enzyme, wie beispielsweise Lysozym oder Lysostaphin, als Enzyme verwendet werden können. Insbesondere kann eine Behandlung mit Lysozym, eine Behandlung mit Lysostaphin, oder Kombinationen hiervon, und/oder eine Behandlung durch Erhitzen erfolgen. Die Zeitdauer und Temperatur einer Behandlung durch Erhitzen (insbesondere einer Inkubation bei erhöhter Temperatur) kann gemäß dem Wissen des Fachmanns gewählt werden. Beispielsweise kann die Temperatur mindestens 70 °C betragen. Vorzugsweise beträgt die Temperatur 150 °C bis 220°C, mehr bevorzugt 195°C bis 205 °C.
Der Begriff "Nukleotidsonde", wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, umfasst sowohl Oligo-, als auch Polynukleotidsonden. Oligonukleotidsonden umfassen hierbei mindestens 15 Nukleotide. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können in Abhängigkeit von dem angestrebten Detektionsverfahren insbesondere Polynukleotidsonden mit einer Länge von 100 bis 500 Nukleotiden, vorzugsweise von 200 bis 300 Nukleotiden verwendet werden.
Die für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifische Nukleotidsonde kann eine Transkript-Polynukleotidsonde sein. Für eine erfindungsgemäße phylogenetische Aufklärung kommen beispielsweise ribosomale RNS-Moleküle, insbesondere die ribosomalen RNS- Moleküle 16S und 23S, in Betracht. Ribosomale RNS-Moleküle können dazu dienen den Verlauf der Evolution zu rekonstruieren, da sie eine funktionelle Homologie in allen Organismen zeigen, ihre Sequenzen aus variablen und stark konservativen Bereichen bestehen und sie aufgrund ihrer Länge genügend Sequenz-Informationen enthalten, um einen statistisch ausreichenden Vergleich zu gewährleisten. Vorzugsweise kommen daher Transkript-Polynukleotidsonden in Betracht, die auf einen DNA- Abschnitt gerichtet sind, der für eine Region innerhalb von bakterieller 16S rRNS oder 23S rRNS kodiert. Insbesondere kann die Transkript-Polynukleotidsonde eine Transkript-Polynukleotidsonde sein, die auf einen DNA-Abschnitt gerichtet ist, der für eine hoch variable Region innerhalb der Domäne III von bakterieller 23 S rRNS kodiert. Derartige Sonden können durch in vitro Transkription amplifizierter rDNA dieser hoch variablen Region innerhalb der Domäne III mit Biotin-markierten UTP hergestellt werden und ermöglichen eine gruppenspezifische Erfassung von Mikroorganismen. Bei einer gezielten Verwendung bestimmter Sequenzen kann die kultivierungsunabhängige Erfassung entweder übergeordneter Gattungen oder spezifischer Arten bis Unterarten ermöglicht werden. Im Falle von bakterieller rRNS kann insbesondere von Vorteil sein, dass die Ribosomen an denen es zu einer Bindung der Transkriptsonde kommt, in den peripheren Bereichen der Zellwand lokalisiert sind.
Spezifische rRNS-gerichtete Oligonukleotidsonden können beispielsweise mit der im Programmpaket ARB implementierten Funktion „Probe-Design" entwickelt werden (Stnrnk, O. und Ludwig, W., (2001) ARB- a Software environment for sequence data, München; http://www.arb-home.de). Die Spezifität der Sonden anderen Organismen gegenüber kann beispielsweise mittels der Funktion „Probe-Match" des Programmpaketes ARB überprüft werden.
Für verschiedene Sortierungs- und Identifizierungsverfahren ist es vorteilhaft, wenn die Sonden zum Teil aus der Zelle herausragen. Falls beispielsweise eine Fluoreszenz in situ Hybridisierung als Detektionsverfahren angestrebt wird, binden diese markierten Polynukleotidsonden an die Ziel-rRNS und ein Teil der Sonden ragt aus der Zelle heraus, wobei durch intermolekulare partielle Hybridbildung eine Art Netzwerk gebildet wird und es zur Bildung eines sog. Halos (engl. Heiligenschein) um die Zelle herum kommt. Dieser Halo erlaubt zum einen eine Detektion der Zellen im Epifluoreszenzmikroskop mit dem Streptavidin-Fluorescein System, zum anderen eine Anreicherung durch Paarung der herausragenden Teile der Polynukleotidsonden mit immobilisierten einzelsträngigen DNA-Abschnitten, die komplementär zu den Polynukleotidsonden sind. Weitere dem Fachmann bekannte Systeme, wie beispielsweise Direktmarkierung der Sonden, können ebenso zur Detektion eingesetzt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können verschiedene Hybridisierungsreaktionen gemäß dem Wissen des Fachmanns verwendet und wunschgemäß für die jeweilige Anwendung angepasst werden. Insbesondere können in situ Hybridisierungsreaktionen zur Anwendung kommen.
Die vorliegende Erfindung stellt Hybridisierungsprotokolle bereit, die zur Bildung von typischen Halos nach in situ Hybridisierungen von den verwendeten grampositiven Organismen mit Polynukleotidtranskriptsonden führten, wobei die Zellwand grampositiver Bakterien vor den Hybridisierungen enzymatisch und/oder physikalisch behandelt beziehungsweise permeablisiert wird, und zwar derart, dass ein ausreichendes Eindringen der Polynukleotidtranskriptsonden in die Zellen ermöglicht wird.
Die HYCOMP-Methode („Hybridisierung in beschichteten Mikrotiterplatten") erwies sich für eine Kombination mit dem erfindungsgemäßen Verfahren als geeignet, wobei beispielsweise die Effizienz der Abreicherung bezüglich der Staphylokokken durch die angewendete vorausgehende Behandlung der Zellen beeinflusst werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann insbesondere auf Mikrotiterplatten oder auf Objektträgem durchgeführt werden. Dies ermöglicht die Nutzung verschiedener Vorrichtungen und Messgeräte, die für handelsübliche Mikrotiterplatten oder Objektträger entwickelt worden sind.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren mit Verfahrensschritten ergänzt werden, die eine Anreicherung der Zielmikroorganismen ermöglichen. Hierzu kann beispielsweise eine Hybridisierung in beschichteten Mikrotiterplatten erfolgen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem eine Kombination von in situ Hybridisierung und darauffolgender Abreicherung im Mikrotiterplattenformat als Mittel zur taxonspezifischen Zellsortierung auf grampositive ausgewählte Staphylokokken und Enterokokken erfolgreich anwendbar ist. Von besonderem Vorteil ist, dass auf Basis der vorliegenden Erfindung durch die Anwendung von Polynukleotidsonden, deren Sequenz aus repetitiven Sequenzen artspezifischer Oligosonden besteht, eine artspezifische Identifizierung und Abreicherung von Zellen ermöglicht werden kann.
Darüber hinaus umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch, dass mehrere Polynukleotidtranskriptsonden mit unterschiedlichen Zielorganismen zur gleichzeitigen Separierung multipler Organismen verwendet werden können. Weiterhin können zusammengesetzter Polynukleotid- sonden entwickelt werden, die verschiedene phylogenetischen Stufen gleichzeitig erfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt artspezifische Polynukleotidsonden bereit, die gegen variable Bereiche der lβS-rRNS und der 23S-rRNS gerichtet sind, wobei jeder untersuchte Organismus spezifisch hybridisiert und identifiziert werden konnte.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung isolierte DNA-Moleküle bereit, welche umfassen eine DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2, SEQ. LD. NO: 3, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. DD. NO: 7, oder DNA- Sequenzen mit mindestens 85 %, vorzugsweise mindestens 90 % Identität zu einer der DNA- Sequenzen mit SEQ. LD. NO: 1-7. Diese isolierten DNA-Moleküle können ein oder mehrere Nukleotide aufweisen, die mit einem im Stand der Technik bekannten Marker, beispielsweise Biotin verknüpft sind. Insbesondere kann die Markierung durch Einbau von Biotin-16-UTP während der Transkriptionsreaktion erfolgen.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zum Identifizieren oder Sortieren von grampositive Bakterien bereit, welcher umfasst: Agens zum Pemieabilisieren der Zellwand von grampositiven Bakterien, und/oder eine oder mehrere chemische Verbindungen, welche ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 10 oder 11 umfassen.
Auch umfasst die vorliegende Erfindung Vorrichtungen, vorzugsweise Mikrotiterplatten oder Objektträger, welche eine chemische Verbindung aufweisen, die einen DNS- Abschnitt umfasst, der zu einer Transkript-Polynukleotidsonde komplementär ist, wobei die Transkript- Polynukleotidsonde auf einen DNS -Abschnitt gerichtet ist, der für eine variable Region innerhalb der Domäne III von bakterieller 23 S rRNS kodiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit ein einfaches, schnelles und zuverlässiges Verfahren bereit, das eine signifikante Arbeitserleichterung für Forscher und für Angestellte von medizinischen und mikrobiologischen Laboratorien bereitstellt, und insbesondere zum Identifizieren und/oder Anreichem von pathogenen Mikroorganismen, insbesondere Taxa die bekanntermaßen pathogene Vertreter umfassen, aus klinischem Probenmaterial, wie Blut, Gewebeproben, Stuhlgang, Speichel, Urin, etc. dient.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der nachstehend angegebenen, nicht-einschränkenden Beispiele nun näher erläutert.
Folgende Abkürzungen werden verwendet:
A: Adenin, Ampere; Amp. : Atnpicillin; ATP: Adenosintriphosphat; b: Basen; BHI: Brain Heart Infusion; bidest. : bidestilliert; bp: Basenpaare; C: Cytosin; °C: Grad Celsius; cm: Zentimeter; d: Tag(e), Durchmesser; D: Deutschland; Da: Dalton; dATP: Desoxyadenosintriphosphat; dCTP: Desoxycytosintriphosphat; dest. : destilliert; dGTP: Desoxyguanidintriphosphat; DNase: Desoxyribonuklease; DNS: Desoxyribonukleinsäure; ddNTP: Didesoxyribonukleosid- 5'- Triphosphat; dNTP: Desoxyribonukleosid- 5'- Triphosphat; ds: doppelsträngig; dTTP: Desoxy ymidintriphosphat; E: Extinktion; EDTA: Emylendiarninte raacetat; ERG: Eppendorf- Reaktionsgefäß; EtOHabs:. Ethanol 96%; FA: Formamid; FISH: Fluoreszenz-Λi-si'tM-Hybridisierung; FLUOS: 5,(6)- Carboxyfluorescein- N- hydroxysuccinimidester; g: Gramm, Fallbeschleunigung; G: Guanin; GC: mol% Guanin und Cytosin; h: Stunde(n), Hekto- (102) ; HD: Hefe- Dextrose; H20bidest: MILIQ, Reinstwasser; H20dest -.destilliertes Wasser; HP: Hybridisierungspuffer; HYCOMP: Hybridization in coated microplate ells; k: kilo; kb: Kilobasenpaare; 1: Liter; LB: Luria-Bertani; m: Meter, Milli- (10"3); M: molar, mol/1; min: Minute(n) ; mRNS: Messenger- Ribonukleinsäure, Boten- Ribonukleinsäure; μ: Mikro- (10"5) ; n: nano- (10"9) ; NaAc: Natriumacetat; NS-. Nukleinsäure; OD: Optische Dichte; OT: Objektträger; p.a. : pro analysi; Pa: Pascal; PBS: Phosphat gepufferte Kochsalzlösung; PCR: Polymerase chain reaction, Polymerase Kettenreaktion; PFA: Paraformaldehyd; rDNS: ribosomale Desoxyribonukleinsäure, für rRNS codierende DNS; RNS: Ribonukleinsäure; RNase: Ribonuklease; rpm: revolutions per minute, Umdrehungen pro Minute; rRNS: ribosomale Nukleinsäure; RT: Raumtemperatur; SA: Streptavidin- Fluorescein- Arbeitslösung; SDS: Natrium- Dodecyl- Sulfat; sec: Sekunde; sp. : species; ss: single stranded, einzelsträngig; SSC: Standard- Saline- Citrat- Lösung; T: Thymin; TAE: Tris/Acetat/ EDTA; Taq: DNS- abhängige DNS-Polymerase aus Thermus aquaticus; TE: Tris/EDTA; TM: Schmelztemperatur; Tris: Tris- (hydroxymethyl-) aminomethan; U: Unit, Uracil; U/m: Umdrehungen pro Minute; üN: über Nacht; UV: Ultraviolett; V: Volt; % v/v: Volumen/Volumen; % w/v: Masse/Volumen; vol: Volumen
Beispiel 1
Zellanzucht und Zellfixierung
1.1 Verwendete Mikroorganismen und Medien Folgende Mikroorganismen wurden verwendet: Tabelle 1
Figure imgf000012_0001
Bei den vorstehend angegebenen Staphylokokken und Enterokokken handelt es sich um grampositive Mikroorganismen, während es sich bei Serratia marcescens und Enterobacter aerogenes um gramnegative Bakterien handelt.
Als Nährmedien für die verwendeten Mikroorganismen werden die in der Tabelle angegebenen Nährmedien verwendet. Diese Nährmedien weisen dabei folgende Zusammensetzungen auf:
Corynebacterium Agar:
10 g Caseinpepton, tryptischer Verdau (casein peptone, tryptic digest), 5 g Hefeextrakt (yeast extract), 5 g Glucose, 5 g NaCl, 15 g Agar, ad 1000 ml H2θdest,pH to 7.2 - 7.4, optional 15 g
Agar. Nutrient Medium:
5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt, ad 1000 ml H2O, pH 7, optional 15 g Agar.
BHI:
37 g Fertigmedium (Sigma Chemicals, USA), ad 1000 ml H2O.
HD Medium:
12 g Pepton, 5 g Glucose, 5 g Hefe, 8 g NaCl, ad 1000 ml H2O; pH 7,2, optional 15 g Agar.
LB Medium (Luria- Bertani- Medium):
15 g Trypton, 5 g Hefe, 9 g NaCl, ad 1000 ml H2O; pH 7,2, optional 15 g Agar.
1.2 Zellanzucht und Stammhaltung Zur Zellanzucht wurden die verwendeten Mikroorganismen bei der jeweiligen optimalen Wachstumstemperatur in Reagenzgläsern mit 5 ml Flüssigmedium bzw. aus einer 5 ml über Nacht Kultur in 100 ml Erlenmeyerkolben mit 30 ml überimpft, auf einem Rundschüttler (Infors, Basel, CH) oder auf mit Agarose verfestigten Nährmedien in Petrischalen (Greiner, Nürtingen, D) angezogen.
Alle Stämme wurden auf den in Tabelle 1 angegebenen verfestigten Medien mit einer sterilen Impföse ausgestrichen, über Nacht bei der jeweiligen optimalen Wachstumstemperatur bebrütet und anschließend bei 4°C gelagert. Zur Stammhaltung wurden diese Stämme alle zwei Wochen auf frisches Medium überimpft. Die Reinheitsüberprüfung erfolgte durch Verdünnungsausstriche und durch mikroskopische Kontrolle im Phasenkontrast. Zur längerfristigen Stammhaltung wurden von allen Stämmen Glycerinkulturen angelegt, wobei 800 μl einer 5ml über Nacht Kultur mit 800 μl einer 50% Glycerinlösung in Kryoröhrchen (2 ml, Sarstedt, Nümbrecht, D) versetzt und bei -80°C gelagert wurde.
1.3 Zellfixierungen
1.3.1. Zellfixierung mit Paraformaldehyd (PFA)
Folgende Lösungen werden hierzu eingesetzt: 4% ige Paraformaldehydlösung:
Herstellung von 50 ml einer 4% PFA-Lösung:
2-3 g Paraformaldehyd wurden unter Rühren zu 30 ml 60-65 °C heißem H2θreinst gegeben und durch Zugabe von einigen Tropfen 1 M NaOH gelöst. Anschließend wurden 16,6 ml 3 x PBS zugegeben, die Lösung auf ca. 20°C abgekühlt und der pH Wert auf 7,2 eingestellt. Nach Sterilfiltration wurde die fertige PFA - Lösung im Dunkeln bei 4°C nicht länger als 24 h aufbewahrt.
PBS-Stammlösung (PBS: phosphat-gepufferte Kochsalzlösung): Lösung 1 : 8 M Na2HPθ4, 1 ,5 M KH2PO4 Lösung 2: 137 mM NaCl, 2,7 mM KC1 (beide Lösungen wurden bis pH 7,2 miteinander titriert)
EtOHabs bezeichnet Ethanol 96%.
Durchfuhrung: 30 ml Medium im 250 ml Erlenmeyerkolben wurde mit 5 ml der über Nacht Vorkultur (mit den zu fixierenden Bakterienzellen) beimpft. Die optische Dichte der wachsenden Zellen wurde regelmäßig bei 600 nm gemessen (1 ml in einer Quarzküvette, Ultraspec Plus Photometer) bis zu einem Wert von 0,9 - 1 (exponentielle Wachstumsphase). Nach Erreichen dieser Dichte wurden die Zellen 15 min lang bei 5000 rpm/min abzentrifugiert (SIGMA 3K15, Osterode am Harz). Dann wurde der Niederschlag in 1 ml IxPBS resuspendiert und mit 3 vol Fixierungslösung 5- 12 h bei 4°C zur Zellfixierung inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und mit 1 x PBS gewaschen, dann erneut zentrifugiert und der Niederschlag in 0,5 ml lx PBS nach Zugabe von 0,5 ml EtOHabs aufgenommen.
1.3.2 Zellfixierung mit Ethanol
Die Zellen wurden angezogen und geemtet wie bei der PFA - Fixierung. Die geemteten Zellen wurden mit 1 x PBS gewaschen, zentrifugiert, der Niederschlag in 1 x PBS resuspendiert, mit 1 vol eiskalten EtOHabs versetzt und bei -20°C gelagert. Beispiel 2
Vorbehandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand und Membran verwendeter grampositiver Bakterien gegenüber den Polynukleotidsonden
2.1 Verwendete Enzyme
Folgende Enzyme wurden verwendet:
• Lysozym (Serva, Deutschland) 10 mg/ml in 50 mM Tris/HCl, pH 8,0
• Lysostaphin (Sigma Aldrich, Schnelldorf), 1 U/ml in H2θbidest
2.2 Vorbehandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand und Membran verwendeter Staphylokokken gegenüber den Polynukleotidsonden
Zur Hybridisierung der 4 verwendeten Staphylokokken mit markierten Polynukleotidtranskript- Sonden wurden PFA-fixierte immobilisierte Zellen in einer ersten aufsteigenden Ethanol-Reihe behandelt (dadurch bleiben die Zellen nach Abspülen des Enzyms an den Aussparungen haften, und es erfolgt zugleich eine erste Dehydratisierung). Anschließend wurden die Zellen entweder 10 min bei 30°C mit Lysozym und danach 5 min bei 30°C mit Lysostaphin oder 10 min auf Eis mit Lysozym und danach Inkubation 7 min bei 200°C behandelt, wobei jedes Enzym durch Abspülen mit H2θbidest nach der entsprechenden Wirkungszeit entfernt wurde. Dann folgte eine zweite aufsteigende Ethanol-Reihe (je 3 min 50%, 80%, 98%). Die Hybridisierung wurde dann wie im Beispiel 4.3 beschrieben, durchgeführt.
2.3 Vorbehandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand und Membran verwendeter Enterokokken gegenüber den Polynukleotidsonden
Zur Hybridisierung der 4 verwendeten Enterokokken mit markierten Polynukleotidtranskriptsonden wurden Ethanol-fixierte immobilisierte Zellen in einer ersten aufsteigenden Ethanol- Reihe (je 3 min 50%, 80%, 98%) behandelt. Danach wurden die Zellen 10 min auf Eis mit Lysozym und anschließend 7 min bei 200°C behandelt. Lysozm wurde nach 10 min Wirkungszeit durch Abspülen mit H2θbidest entfernt. Dann folgte eine zweite aufsteigende Ethanol-Reihe (je 3 min 50%, 80%, 98%). Die Hybridisierung wurde dann wie in Beispiel 4.3 beschrieben, durchgeführt.
2.4 Gemeinsame Vorbehandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand und Membran verwendeter Enterokokken und Staphylokokken gegenüber den Polynukleotidsonden
Hierbei wurden die EtOH-fixierten immobilisierten Zellen durch eine erste Ethanolbehandlung (je 3 min 50%, 80%, 98%) dehydratisiert damit sie nach der Lysozym- Behandlung am Objekträger haften bleiben. Die Zellen wurden 10 min auf Eis mit Lysozym behandelt. Anschließend wurde das Lysozym durch Abspülen des Objekträgers mit H2θbidest entfernt und der Objekträger 15 min bei 200°C inkubiert. Dann folgte eine zweite aufsteigende Ethanol-Reihe (je 3 min 50%, 80%, 98%). Die Hybridisierung wurde dann wie im Punkt B. 3. 8. 2. / B. 3. 8. 3. beschrieben durchgeführt.
Beispiel 3
In Vitro Transkription
Markierte RNA-Sonden hoher spezifischer Aktivität können durch In- vitro Transkription von PCR-Produkten hergestellt werden. Gemeinsam ist diesen PCR-Produkten, dass sie eine Promotorsequenz für die Bakteriophagen-RNA-Polymerasen SP6, T3 oder T7 enthalten. An den Rückwärtsprimer (317R) wurde eine T3 -Promotorsequenz angehängt. Um die Integrität der produzierten RNA zu gewährleisten, wurde ein RNase-Inhibitor eingesetzt. Dieser Inhibitor besitzt eine große Affinität für RNase und blockiert deren Aktivität. Im Anschluss an die In- vztro-Synthese markierter RNA-Moleküle wurde eine Behandlung des Reaktionsansatzes mit DNase I (RNase-frei) durchgeführt. Hierdurch wurden die PCR-Produkte hydrolysiert, wodurch eine Vermeidung störender Einflüsse nicht markierter Sequenzen während einer Hybridisierung erreicht werden konnte. Die Markierung der RNA-Moleküle erfolgte durch Einbau von Biotin- 16-UTP in diese Moleküle während der Transkriptionsreaktion.
3.1 Verwendete Ragenzien
Ammoniumacetatlösung (NH4- Acetat 10 M), EDTA (0,2 M, pH 8,0), TE-Puffer (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0), Ethanolabs (Ethanol 96%).
NTP-Mix (ATP lOOmM 2 μl, CTP lOOmM 2 μl, GTP lOOmM 2 μl, UTP lOOmM 0,7 μl, Biotin- 16-UTP lOmM 13 μl, wobei als Reportermolekül Biotin-16-UTP (Biotin-ε-aminocaproyl-χ- aminobutyryl-[5-(3-aminoallyl)-uridin-5, -triphosphat]) verwendet wird)
Der Transkriptionsreaktionsansatz enthält 3 μl NTP-Mix, 3 μl Transkriptionspuffer, 3 μl T3- RNS-Polymerase, 1,5 μl RNase-Inhibitor (Röche), 0,5-2 μg Matrizen-DNS und ad 30 μl
H2θbidest.
3.2 Durchfuhrung: • Transkriptionsansatz 3 h bei 37°C in einem Heizblock (Hybaid Omnigene, MWG-Biotech, Ebersberg) inkubieren; • 3 μl DNase I (Rnase-frei) zugeben und weitere 15 min bei 37 °C inkubieren; • 3 μl EDTA 0,2 M zum Abstoppen der Reaktion zugeben;
• Zur Fällung der RNA-Transkripte, 16 μl NH4- Acetat und 156 μl EtOHabs zugeben und 2 h bei -80°C oder über Nacht bei -20°C inkubieren;
• Zum Sedimentieren der RNA-Sonde 15 min in einer Tischzentrifuge (Hettich Mikro 22R, Tuttlingen) bei 4 °C und 14000 rpm zentrifugieren;
• Das Sediment mit 150 μl 70% (v/v) Ethanol waschen;
• erneut wie zuvor sedimentieren, trocknen in der Vakuumzentrifuge (Savant Speed Vac Concentrator, Bachofer, Reutlingen), in 50 μl TE-Puffer resuspendieren und zum Schutz der RNA-Probe vor Abbau 1 μl RNase-Inl ibitor zugeben (Röche).
Beispiel 4
In situ Hvbridisierungen auf Objektträgern mit Oligo- und Polynukleotidsonden
Die Reassoziation von einzelsträngigen Nukleinsäuren zu einem Doppelstrang wird als Hybridisierung bezeichnet. Hierbei spielt die Schmelztemperatur (Tm) eine wichtige Rolle; bei dieser Temperatur liegt die Hälfte der Moleküle als Doppelstrang vor. Tm wird durch verschiedene Parameter beeinflußt. So kann die Schmelztemperatur durch z. B. monovalente Kationen (meist Na+) erhöht werden. Mismatches reduzieren die thermische Stabilität der DNS- Duplexmoleküle. Ebenfalls verringern helixdestabilisierende Agentien wie Formamid die Schmelztemperatur.
4.1 In situ Hybridisierungen auf Objektträgem mit Oligonukleotidsonden hn Rahmen dieser Arbeit wurden folgende gegen die rRNS gerichtete Oligonukleotidsonden verwendet:
Ssa 16S: 5'-CAC TTT AGA ACC ATG CGG-3' SEQ. LD. NO: l
Ssa 23S: 5'-CAC CAC AAT TCT AGC TAG-3' SEQ. ID. NO: 2
Sau 16S: 5'-CAC TTT TGA ACC ATG CGG-3' SEQ. ID. NO: 3
Sau 23S: 5'-CAC CTA TTT TCT ATC TAG-3 ' SEQ. ID. NO: 4
Sha l6S: 5'-GCT CCT TGT CTG TTC GCT-3' SEQ. LD. NO: 5
Sha 23S: 5'-CAC CTA TTA TCT ATC TAG-3' SEQ. ID. NO: 6
Sep 23S: 5'-CAC CTG TTA TCT ATC TAG-3' SEQ. ID. NO: 7
Eae 16S a: 5'-CGA GTA ACG TCA ATC GCC-3' SEQ. ΓD. NO: 8
Sma 16S : 5 ' -TTA AGC TCA CC A CCT TCC-3 ' SEQ. ID. NO: 9
Die nachstehende Tabelle zeigt einen Überblick über Eigenschaften und Ziel-Organismen und Ziel-rRNS der erfindungsgemäßen Sonden.
Figure imgf000018_0001
• : Formamid-Gehalt imHybridisierangspυffer, der zu einer altspezifischen Hybridisierung des Ziel-Organismus fuhrt.
Für Oligonukleotide mit weniger als 50 bp kann der Schmelztemperatur- ert nach folgender Formel berechnet werden:
Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) G, C, A und T stellen die Anzahl der Basen dar.
Für Standard-Hybrisisierungen wurden folgende Lösungen verwendet:
• 5 M NaCl
• I M Tris (Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan)/HCl pH 8,0 • 0,5 M EDTA pH 8,0
• Formamid
• 10 % (w/v) SDS (Natrium-dodecylsulfat)
• Hybridisierungspuffer:
5 M NaCl 360 μl, 1 M Tris/HCl pH 8,0 40 μl, Fonnamid μl (siehe Tabelle Beispiel 4, 4.1), H2Oreinst ad 2 ml, 10 % (w/v) SDS 2 μl.
• Waschpuffer: 5 M NaCl (siehe oben), 1 M Tris/HCl pH 8,0 1 ml, 0,5 M EDTA (Ethylendiamintetraacetat) (siehe oben), H2Ordnst ad 50 ml, 10 % (w/v) SDS 50 μl. Erst ab 20 % Formamid im Hybridisierungspuffer wurde die 0,5 M EDTA-Lösung eingesetzt. Durchführung:
• Die fixierten Zellen auf den Objektträger (Teflon beschichtet, Marienfeld, D) aufbringen
• Dehydratisierung der Zellen vor der Hybridisierung durch eine Behandlung in einer aufsteigenden Ethanolreihe (je 3 min 50 %, 80 %, 98% EtOH) • 9 μl Hybridisierungspuffer und 1 μl markierte Sonde in die Aussparungen des Objekträgers mit den fixierten und vorbehandelten Zellen auftropfen und gut vermischen
• Objekträger in ein Probengefäß (Greiner, Nürtingen, D), in dem ein mit 2 ml Hybridisierungspuffer befeuchtetes Stück Zellstoff eingebracht wurde, überführen und 1-1,5 h bei 46 °C in einem Hybridisierungsofen (Bachofer, Reutlingen, D) hybridisieren • Objektträger 15 min in einem mit 50 ml Waschpuffer gefüllten Probengefäß waschen und in einem Luftstrom trocknen.
4.2 Hybridisierungen auf Objektträgern mit Zellen, die enzymatisch vorbehandelt wurden Hierbei werden die fixierten grampositiven Zellen, die auf den Objektträger aufgebracht wurden, vor der Behandlung mit Lysozym (10 min auf Eis) einer aufsteigenden Ethanol- Reihe (je 3 min 50 %, 80 %, 98% EtOH) unterzogen. Dadurch kann man erreichen, dass die Zellen nach der Vorbehandlung mit Lysozym bei der Entfernung des Enzyms nicht mit entfernt werden, sondern an dem Objektträger haften bleiben. Dann wurde eine Standard-Hybridisierung mit den behandelten Zellen durchgeführt.
4.3 In situ Hybridisierungen auf Objektträgem mit Polynukleotidsonden
Der Schmelztemperatur- Wert von Polynukleotiden mit einer Länge bis 500 bp kann nach folgender empirisch ermittelten Formel berechnet werden:
RNA-RNA-Hybridisierung
[Na+] 500
Tm= 78 + 16,6 lg + 0,41 x (% GC) P - 0,35 x (% FA) 1,0 + 0,7 x [Na+] D
Standard-Hvbridisierungen:
Für Standard-Hybridisierungen wurden verwendet:
• NaCl-Stammlösung (NaCl 5 M) • SDS-Lösung (Natriumdodecylsulfat, 10 %, sterilfiltriert)
• Tris-HCl-Lösung (Tris 1 M, pH 8,0)
• HC1 conc. • Hybridisierungspuffer: NaCl 75 mM, Tris-HCl 20 mM, SDS 0,01 %, FA 80 %. • Objektträger, 10 Aussparungen (Marienfeld, D)
• Fixierte Zellen
Durchführung:
• 4 μl von fixierten Zellen in die Aussparungen der beschichteten OT (Objektträger) einpipettieren und bei 60°C für 5-10 min trocknen (Hitzefixierung);
• Zur Dehydratisierung und Nachfixierung der Zellen, die OT für jeweils 3 min in 50%, 80%, 98% igen Ethanol tauchen; • Zur Hybridisierung, 12 μl Hybridisierungspuffer mit 1 μl (150-250 μg μl) des markierten Polynukleotids pipettieren und gründlich mischen;
• OT in ein 50 ml Probegefäß (Greiner, Nürtingen) überfuhren, welches mit, mit 2 ml Hybridisierungspuffer befeuchtetem Zellstoff ausgelegt wurde;
• Probegefäß (Greiner, Nürtingen)mit einem Schraubdeckel verschließen und Hybridisierung in horizontaler Lage 30 min bei 80°C (Bachofer, Reutlingen) durchfuhren;
• Anschließend Hybridisierung 5-10 h bei 53 °C (Bachofer, Reutlingen);
• OT vorsichtig mit H2θdest spülen und lufttrocknen.
Zur Detektion der mit Biotin-16 UTP markierten Polynukleotidsonden hybridisierten Zellen, wells der gewaschenen und getrockneten OT mit 40 μl Streptavidin-Fluorescein- Lösung, (1 :200 in DPBS) überschichten und in einem Probegefäß (Greiner, Nürtingen), welches mit, mit 2 ml DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) getränkten Zellstoff ausgelegt wurde, 1 h im Dunkeln bei RT inkubieren. Fluoreszenzfarbstofflösung mit H2θωdest abspülen und OT 20 min in DPBS waschen. Anschließend OT lufttrocknen, in Citifluor (CITIFLUOR; Mounting medium) einbetten und unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachten.
Beispiel 5
Mikroskopische Auswertung von Hybridisierungen
Zur Auswertung von Hybridisierungen wurde ein Axioplan-Mikroskop (Fa. Zeiss, Oberkochen) verwendet. Mit Hilfe von einer CCD Camera (Princeton Instruments, Modell RTE/CCD- 1317tc/2) wurden die hybridisierten Zellen photographiert. Phasenkontrast- und zugehörige Epifluoreszenzaufhahmen erfolgten über die Bildverarbeitungssoftware Winview. Eingesetzt wurde das Objektiv: Plan-Neofluar, Filtersatz 09 (Bandpaßfilter 450-490, Objektiv lOOx). Beispiel 6
HYCQMP - Hvbridisierung in beschichteten Mikrotiterplatten
HYCOMP steht für „Hybridization in coated microplates". Bei der Hybridisierung dringen Biotin markierte Polynukleotidsonden nicht vollständig in die Zelle. Ein Teil der Sonde ragt aus der Zelle heraus und ermöglicht eine Immobilisierung und dadurch eine Abtrennung der markierten hybridisierten Zellen von den unmarkierten. Die Polynukleotidsonden bilden im Bereich der Zellwand durch Sekundä strukturausbildung eine Art Netzwerk aus. Zur Sortierung markierter hybridisierter Zellen wurden die Mikrotiterplatten mit DNS, die komplementär zu der Polynukleotidsonde ist, beschichtet. Es kommt zur Hybridisierung des aus der Zelle herausragenden Teils der Sonde mit der DNS in der Mikrotiterplatte.
6.1 In situ Hybridisierungen in Lösung mit markierten Polynukleotidsonden Folgende Lösungen wurden verwendet: » lx PBS (aus PBS-Stammlösung, siehe Punkt 3.4.1.)
• Hybridisierungspuffer (75 mM NaCl, 20 M Tris pH 8,0, 0,01 % SDS, 80 % FA)
• EtOH abs
Dv chführung: Die Hybridisierung wurde in 0,5 ml ERGs durchgeführt.
• 20 μl der PFA- oder EtOH-fixierten Zellen mit 2 vol EtOHabs versetzen und 3 min bei 25°C inkubieren
• Ansatz 3 min bei 12.000 rpm (Bachofer, Reutlingen) zentrifugieren
• mit lx PBS waschen « 3 min bei 12.000 rpm (Bachofer, Reutlingen) wiederholt äbzentrifugieren
• 30 μl Hybridisierungspuffer zugeben
• 500 ng Sonde (in TE- Puffer) zugeben
• Ansatz 20 min bei 80°C inkubieren
• danach 5-16 h bei 53°C
6.2 Beschichtung der Mikrotiterplatten
Die Mikrotiterplatten wurden mit zur RNA-Transkriptsonde komplementärer DNS beschichtet. Hierfür wurde die Sequenz der Domäne III der 23S rDNA durch die Standard-PCR mit den Primern 1900VN und 317RT3 a plifiziert.
Folgende Materialien und Lösungen wurden verwendet: • Maxisorp Micro Wells (NalgenNunc L T., Naperville, II, USA)
• Standard Klebefolie (Nunc Naperville, IL, USA)
• 1 x PBS (aus PBS-Stammlösung)
• PBS/MgCh (137 mM NaCl, 10 mM Na2HPθ4/ H2Pθ4, 2,7 M KCl, 100 mM MgCbpH 7,2)
Durchführung:
• PCR-Produkt aufreinigen und im Photometer bei 260nm vermessen;
• lμg PCR-Produkt pro Mikrotiterkavität in 50μl PBS/MgCk und 50μl H2θbidest geben;
• Amplifikate 10 min bei 94°C im Heizblock (Hybaid Omnigene, MWG-Biotech, Ebersberg) denaturieren;
• lh bei 37°C im Heizblock (Hybaid Omnigene, MWG-Biotech, Ebersberg) inkubieren
• Platten auf Papier ausklopfen;
• 1-2 h bei 60°C in einem Trockenschrank (Kendro, Hanau) trocknen;
• getrocknete Platten mit Klebefolie verschließen; • Platten bei 4°C 4-5 Wochen haltbar.
6.3. Detektion in den Mikrotiterplatten
Es wurden folgende Lösungen verwendet: • lx PBS (aus PBS-Stammlösung)
• Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Röche, Mannheim)
• Blocking Reagens (Röche)
• Blocking Puffer (PBS/ 0,1 % Blocking Reagens)
• H2SO4 IM
Durchführung:
• Mikrotiterkavitäten einmal mit IxPBS waschen
• 100 μl Blocking Puffer je Kavität zugeben und 15 min bei RT inkubieren
• danach Platte ausklopfen und 50μl Streptavidin- Peroxidase- Lösung (SA-POD 1:1000 in BP verdünnt) zugeben und 30 min inkubieren
• der Farbumschlag erfolgt von farblos nach blau
• Nach 10 min, Reaktion durch Zugabe von lOOμl H2SO4 1 M abstoppen
• Dabei erfolgt der Farbumschlag von blau zu Gelb
• Die Abreicherungsintensität bei einer Wellenlänge von 450 nm im Photometer (Princeton Instruments, Puchheim) gegenüber einer Referenzwellenlänge von 650 nm messen. Beispiel 7
PCR-Amplifikation der Domäne III der 23 S rDNS und Konstruktion der Polvnukleotidsonden
7.1 Isolierung von DNS aus Reinkulturen Genomische DNS wurde aus Reinkulturen der verwendeten Mikroorganismen isoliert und aufgereinigt.
7.2 PCR-Amplifikation der Domäne III der 23S rDNS
Der hochvariable Bereich innerhalb der Domäne III der 23 S rRNS wurde, ausgehend von der isolierten genomischen DNS der verwendeten Mikroorganismen, über eine PCR (Polymerasekettenreaktion) mit den modifizierten Primern 317 RT3 und 1900 VN amplifiziert. Diese modifizierten Primer hybridisieren mit konservierten Regionen am Anfang und am Ende der Domäne III der 23 S rDNS. Der Primer 317 RT3 enthält die Promotorsequenz für die T3- Polymerase, die für die Konstruktion von Polynukleotidtranskriptsonden nötig ist.
Die Nukleinsäureisolierung erfolgte wie nachstehend beschrieben.
Lösungen:
• Saline- EDTA (0,15 M NaCl, 0,01 M EDTA, pH 8,0) • 20x SSC (Standard-Saline-Citrat; 3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitrat, pH 7,0)
• Tris/HCl (50 mM, pH 8,0)
• Lysozym (Serva, Deutschland; 10 mg/ml in 50mM Tris/HCl)
• RNase A (Quiagen, D; 0,5 mg/ml in 2x SSC (aus 20x SSC))
• Proteinase K (Röche, D; 10 mg/ml in H2Obidest) • Na-Acetat 5 M
• SDS-Lösung (25%o (w/v) Natriumdodecylsulfat (nicht autoklaviert))
• Isopropanol
Durchfülirung: • Bakterien in einer 500 ml über Nacht Kultur durch eine Zentrifugation von 10 min bei 5000 rpm sedimentieren (Sorvall RC 26 Plus, Kendro Products),
• Das Sediment in 10 ml Saline-EDTA suspendieren,
• 100 μl Lysozymlösung zugeben,
• Ansatz 30 min bei 37°C zur Zelllyse inkubieren, • 250 μl RNase A zugeben und Probe 60 min bei 37°C inkubieren,
• 20 μl Proteinase K zugeben und Probe 120 min bei 37°C inkubieren,
• 1 ml SDS 25 % und 2,5 ml NaCl 5M zugeben und Probe 5-10 min bei 65°C inkubieren, • 1 vol Chloroform zugeben, • den Ansatz 15 min bei 5000 rpm Zentrifugieren, • die obere wässrige Phase abnehmen und in ein neues Gefäß überführen, • 0,1 vol Na-Acetat 5M und 0,7 vol Isopropanol zugeben und vorsichtig schwenken, • DNS auf sterile Pasteurpipette aufwickeln und in ein neues Gefäß, das 70 % EtOH (Ethanol) enthält, überführen, • Ethanol nach kurzer Abzentrifugation entfernen, • DNS in H2Obidest lösen,
Agarosegelele trophorese
Zur Bestimmung der Qualität von Nukleinsäuren und PCR-Produkten wurde eine horizontale Agarosegelelektrophorese durchgeführt. Die Nukleinsäure wandern dabei innerhalb eines Gels unter der Wirkung eines elektrischen Feldes in Abhängigkeit von Ladungsanzahl und Molekülmasse unterschiedlich schnell zu den jeweiligen Polen.
Das Gel wurde zur Dokumentation unter UV-Durchstrahlung (302 nm Wellenlänge, Bachofer
Transilluminator) mit einem Videodokumentationssystem (Cybertech CS1 Image Documentation
System) aufgenommen.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Lösungen:
Alle PCR-Reaktionen wurden in einem programmierbaren Heizblock (Primus 96 Plus, Fa. MWG
Biotech, Ebersberg, D) durchgeführt. • Ex Taq™ -Polymerase (5U/μl)
• lOx Ex Taq™ Reaktionspuffer
• dNTP-Mix (je lOmM)
• Vorwärtsprimer (50pmol/μl)
• Rückwärtsprimer (50pmol/μl) • Matrizen-DNA
Einzusetzende Menge der einzelnen Komponenten einer PCR-Reaktion: lOx Ex Taq™ Reaktionspuffer 10 μl dNTP-Mischung (je lOmM) 8 μl Vorwärtsprimer (50pmol/μl) 1 μl Rückwärtsprimer (50pmol/μl) 1 μl ExTaq™ -Polymerase (5U/μl) 0,8 μl Matrizen-DNA 1 μl
ad H2Ob,dest 100 μl
Negativkontrolle: Reaktionsansatz ohne DNS-Matrize
Figure imgf000025_0001
Durch Zugabe von 1-2 vol EtOHabs und 0,1 vol NaAc 3 M konnten die PCR-Produkte nach einer Lagerung von 2-12 h bei -20 °C gefällt werden. Nach einer Abzentrifugation wurden die gefällten PCR-Produkte in H Obιdest aufgenommen.
Verwendete Primer:
Folgende Primer wurden für die Amplifikation (PCR) der hochvariablen Region der Domänelll der 23 S rRNA eingesetzt:
Figure imgf000025_0002
Der unterstrichene Bereich stellt die T3-RNA-Polymerase-Promotorsequenzen dar, notwendig für die Transkription. Die nachstehende Tabelle zeigt die Abkürzungen für die Wobbels in den Primern:
Figure imgf000025_0003
7. 3 Konstruktion der Polynukleotidsonden
Die entstandenen Produkte aus der Amplifikation der Domäne III der 23 S rDNS stellen die Matrizenmoleküle dar, die zur Konstruktion der Transkriptsonden verwendet wurden. Die Matrizenmoleküle tragen am Startpunkt der Transkription eine Promotor-Region für die T3- Polymerase. Unter Verwendung markierter Nukleotide stellt die T3-Polymerase RNSTranskripte her, die direkt als Sonde eingesetzt werden. Fig. 1 zeigt die jeweils verwendeten Polynukleotidsonden. Das Zeichen _ steht für Null-Probe, die Abkürzung Kbl für Kilobasenleiter, lkb.
Spuren 1 bis 10 von Fig. 1 zeigen Polynukleotidsonden bezüglich der Mikroorganismen:
Staphylococcus saprophyticus 6: Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus 7: Enterococcus durans Staphylococcus haemolyticus 8: Enterococcus gallinarum Staphylococcus epidermidis 9: Enterobacter aerogenes Enterococcus faecium 10: Serratia marcescens
Beispiel 8
Anwendung der Polynukleotidsonden bei in Situ Hybridisierungen grampositiver Mikroorganismen
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden mehrere Hybridisierungsprotokolle entwickelt, die zur Bildung von typischen Halos nach in situ Hybridisierungen von den verwendeten grampositiven Organismen mit Polynukleotidtranskriptsonden führten.
8.1 In situ Hybridisierungen in Reinkultur
Wegen ihrer Dicke (30-80 nm), stellt die Zellwand grampositiver Organismen bei in situ Hybridisierungen das größte Problem dar. Um dieses Problem zu lösen wurde die Zellwand grampositiver Bakterien vor den Hybridisierungen enzymatisch und/oder physikalisch behandelt beziehungsweise permeabilisiert, und zwar so, dass ein ausreichendes Eindringen der Polynukleotidtranskriptsonden in die Zellen ermöglicht wird.
8.2 In situ Hybridisierungen ohne vorausgehende Behandlung
Zunächst wurden Standardhybridisierungen PFA- und EtOH fixierter grampositiven Bakterien ohne vorausgehende Behandlung durchgeführt. Bei keinem der verwendeten grampositiven Organismen war ein Signal feststellbar, so dass anzunehmen war, dass die Zellwände dieser Organismen für das Eindringen der Polynukleotidtranskriptsonden in die Zellen nicht ausreichend permeabel waren.
8.3 In situ Hybridisierungen mit Staphylokokken nach einer Behandlung mit Lysozym und anschließend Lysostaphin fVorbehandlungsverfahren I) PFA- fixierte Zellen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis ließen bei in situ Hybridisierungen nach enzymatischer Behandlung der Zellen, 10min Lysozym und anschließend 5 min Lysostaphin, die Bildung von typischen Halos detektieren (Fig. 2 - 3). Fig. 2 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung mit Staphylococcus saprophyticus (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung). Fig. 3 zeigt eine Phasenkontrastaufiiahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung mit Staphylococcus aureus (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung). Vergleichbare Ergebnisse wurden bei einer Standardhybridisierung mit Staphylococcus haemolyticus (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin- Behandlung) und einer Standardhybridisierang mit Staphylococcus epidermidis (nach 10 min Lysozym- und anschließend 5 min Lysostaphin-Behandlung) erhalten.
Durch die Wirkung von Lysozym und anschließend der von Lysostaphin erfolgte eine ausreichende Permeabilisierung der Zellwand der verwendeten Staphylokokken. Es kam zum ausreichenden Eindringen der Polynukleotidtranskriptsonden in die Zellen, was zur Bildung der typischen Halos führte. Praktisch alle Zellen wurden von den Enzymen angegriffen.
8.4 In situ Hybridisierungen mit Staphylokokken nach einer Behandlung mit Lysozym und Hitze fVorbehandlungsverfahren IT) Bei vorausgehender Behandlung von den verwendeten PFA-fixierten Staphylokokken mit Lysozym und anschließend Hitze (siehe Beispiel 2.2) konnte bei allen Zellen eine deutliche Halo-Bildung festgestellt werden.
Fig. 4 zeigt beispielhaft eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierang mit PFA-fixierten Staphylococcus haemolyticus (nach 10 min Lysozym- Behandlung und anschließende Inkubation: 7 min bei 200°C). Vergleichbare Ergebnisse wurden unter den angegebenen Bedingungen auch für Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, und Staphylococcus epidermidis erhalten.
Beispiel 9
Gruppenspezifität der Transkriptsonden für Staphylokokken
Die Gruppenspezifität der Polynukleotidtranskriptsonden ließ sich bestätigen, nach in Situ Hybridisierungen von jedem der verwendeten Staphylokokken mit jeweils der Sonde eines anderen Staphylococcus (siehe Fig. 5).
Fig. 5 zeigt beispielhaft die Bildung von typischen Halos bei der Hybridisierung von Staphylococcus haemolyticus mit der Sonde von Staphylococcus epidermidis, was darauf schließen lässt, dass die Hybridisierung mit der grappenspezifischen Sonde stattgefunden hat, wobei eine Standardhybridisierung von Staphylococcus haemolyticus (nach 10 min Lysozym- Behandlung und anschließende Inkubation: 7 min bei 200°C) mit der Sonde von Staphylococcus epidermidis durchgeführt wurde. Ein vergleichbares Ergebnis wurde unter den angegebenen Bedingungen auch für eine Hybridisierung von Staphylococcus epidermidis mit der Sonde von Staphylococcus aureus erhalten, wobei eine Standardhybridisierung von Staphylococcus epidermidis (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließende Inkubation: 7 min bei 200°C) mit der Sonde von Staphylococcus aureus, durchgeführt werden.
Beispiel 10
In situ Hybridisierungen in Mischung mit anderen Bakterien
Bei in situ Hybridisierungen mit Mischungen aus jeweils einem der verwendeten Staphylokokken und entweder Enterobacter aerogenes oder Serratia marcescens zeigte sich die Spezifität der Polynukleotidtranskriptsonden für die Staphylokokken. Hierbei wurden die Staphylokokken vor der Hybridisierung PFA-fixiert und 10 min mit Lysozym behandelt.
Fig. 6 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung von Staphylococcus saprophyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung) in Mischung mit Enterobacter aerogenes. Ein vergleichbares Ergebnis wurde unter den angegebenen Bedingungen auch bei einer Standardhybridisierung von Staphylococcus aureus (nach 10 min Lysozym-Behandlung) in Mischung mit Serratia marcescens erhalten.
Beispiel 11 In situ Hybridisierungen mit Enterokokken nach einer Behandlung mit Lysozym und Hitze
Bei der Hybridisierung von den verwendeten EtOH-fixierten Enterokokken nach einer Behandlung mit Lysozym und Hitze (7 min bei 200°C), kam es zur Bildung von Halos.
Fig. 7 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus faecium (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 7 min bei 200°C).
Vergleichbare Ergebnisse wurden unter den angegebenen Bedingungen auch für eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus faecalis (nach 10 min Lysozym- Behandlung und anschließende Inkubation: 7 min bei 200°C), eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus durans (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 7 min bei 200°C) und eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus gallinarum (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließende Inkubation: 7 min bei 200°C) erhalten.
Beispiel 12
In situ Hybridisierungen mit Enterokokken und Staphylokokken nach gemeinsamen Behandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand und Membran
Bei in situ Hybridisierungen mit den verwendeten Staphylokokken und Enterokokken nach Lysozym- und anschließender Hitze-Behandlung konnte eine gemeinsame Vorbehandlung dieser Organismen erfolgreich ermittelt werden (siehe Beispiel 2.4). Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich waren die Zellen vor der Behandlung und anschließender Hybridisierung EtOH- fixiert. Alle Zellen zeigten bei einer Hybridisierung nach den oben beschriebenen gemeinsamen Behandlungen eine deutliche Halo-Bildung (Fig. 8, 9).
Figure imgf000030_0001
Tabelle C. 1.: Behandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand von Staphylokokken und Enterokokken vor der Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit der von der jeweiligen Organismus-DNS generierten Polynukleotidsonde Fig. 8 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus durans (nach 10 min Lysozym- Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C). Vergleichbare Ergebnisse wurden unter den angegebenen Bedingungen auch für eine Standardhybridisierung mit EtOH- fixierten Enterococcus faecium (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C), eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus faecalis (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C), eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Enterococcus gallinarum (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C), erhalten.
Fig. 9 zeigt eine Phasenkontrastaufhahme und eine Epifluoreszenzaufhahme einer Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Staphylococcus epidermidis (nach 10 min Lysozym- Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C). Vergleichbare Ergebnisse wurden unter den angegebenen Bedingungen auch für eine Standardhybridisierung mit EtOH- fixierten Staphylococcus saprophyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C), eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Staphylococcus aureus (nach 0,5 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 3 min bei 200°C) und eine Standardhybridisierung mit EtOH-fixierten Staphylococcus haemolyticus (nach 10 min Lysozym-Behandlung und anschließender Inkubation: 15 min bei 200°C) erhalten.
Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse einer gemeinsamen Behandlungen für Staphylokokken und Enterokokken vor der Fluoreszenz in situ Hybridisierung Tabelle
Figure imgf000031_0001
Eine detaillierte Übersicht über die Reaktionsbedingungen zeigt die nachstehende Tabelle:
Figure imgf000032_0001
Tabelle C. 2.: Gemeinsame Behandlungen zur Permeabilisierung der Zellwand von Staphylokokken und Enterokokken vor der Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit der von der jeweiligen Organismus-DNS generierten Polynukleotidsonde Beispiel 13
Anwendung der Polynukleotidsonden bei in Situ Hybridisierungen in Lösung und anschließende Abreicherung
Die Abreicherung eines Zielorganismus erfolgte durch die Anwendung der HYCOMP- Methode. Hierbei kann das Ausmaß einer Abreicherung bezüglich eines Organismus über die Auswertung der bei einer Wellenlänge von 450nm gegen eine Referenzwellenlänge von 650nm, gemessenen Extinktion erhalten werden. Weiterhin kann eine optische Auswertung der Abreicherung eines Zielorganismus in einer Mischung moφhologisch unterschiedlicher Organismen durch die Analyse des „Positiv-Überstandes" und „Negativ-Überstandes" im Mikroskop erfolgen. Für diesen Zweck kann man die folgende Formel anwenden:
% Zielzellen vorher - % Zielzellen nachher % Abreicherung = x 100 % Zielzellen vorher
und daraus einen prozentuellen Wert bezüglich des Abreicherungserfolgs ermitteln.
Die Abreicherangen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens wurden wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
Abreicherung von Zellen in Mikrotiterplatten
Folgende Lösungen wurden verwendet:
• lx PBS (aus PBS-Stammlösung),
• 20 x SSC (3,0 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitrat, pH 7,0)
• Mikrotiteφlattenpuffer (MP-Puffer): 5x SSC, 0,02 % SDS, 2 % (Röche), 0,1 % N-Laurylsarcosin, 33 % Formamid
Durchführung:
• Die mit markierten Polynukleotidsonden hybridisierten fixierten Zellen 2 min bei 12000 φm abzentrifugieren und 2 mal mit lx PBS waschen • Zellen in 350 μl Mikrotiteφlattenpuffer aufnehmen
• je 50 μl des Ansatzes auf 7 Mikrotiterkavitäten verteilen, was einer eingesetzten Zellmenge von 3μl pro Kavität entspricht • 6 von den Kayitäten sind mit DNS, die komplementär zur Polynukleotidsonde ist, beschichtet.
• Die 7. Kavität dient als Negativkontrolle, und ist mit einer anderen als der zur Sonde komplementäre DNS beschichtet
• Platte mit Ansätzen 1-2 h bei 53 °C in einem Hybridisierungsofen (Bachofer, Reutlingen) inkubieren
• Zur Erhöhung der Abreicherungseffizienz wurde der Überstand auf neue Kavitäten überführt und eine weitere Stunde inkubiert.
Ohne vorausgehende enzymatische Behandlung ließen sich PFA- und EtOH-fixierte Zellen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus epidermidis nach Hybridisierungen in Lösung, nicht abreichem.
Staphylococcus aureus und Staphylococcus saprophyticus konnten nach einer Behandlung ihrer Zellwand vor der Hybridisierung in Lösung entweder mit Lysozym (10 min auf Eis) oder mit Lysozym (10 min bei 30°C) und Lysostaphin (5 min bei 30°C) deutlich abgereichert werden.
Die Vorbehandlung der Zellwand von Staphylococcus aureus und Staphylococcus saprophyticus mit Lysozym und Lysostaphin erlaubte im Vergleich zur Vorbehandlung nur mit Lysozym, das Eindringen einer größeren Menge von Polynukleotidsonden in die Zellen. Dies führte zur Bildung größerer Polynukleotidsonden-Netzwerke und dadurch zu einem erhöhten Anteil an Biotin-Molekülen. Die gemessenen Extinktionen hängen direkt vom Biotin-Anteil Polynukleotidsonden- Netzwerk ab, insofern als dass die Detektion über das Biotin-Streptavidin- Peroxidase-BM Blue System durchgeführt wird.
Demzufolge kommt es bei aimähemd gleichen Anzahl abgereicherten Zellen, die mit Lysozym oder mit Lysozym und Lysostaphin vorbehandelt wurden, zu einem höheren Durchschnitt der Extinktionswerte bei abgereicherten Zellen die mit Lysozym und Lysostaphin vorbehandelt wurden.
Fig. 10 zeigt die Abreicherangen von Staphylokokken nach Behandlung ihrer Zellwand nach verschiedenen Methoden.
Staphylococcus haemolyticus und Staphylococcus epidermidis ließen sich erst nach einer Behandlung ihrer Zellwand vor der Hybridisierung in Lösung, mit Lysozym (10 min bei 30°C) und anschließend Lysostaphin (5 min bei 30°C) deutlich abreichem. Zellen von Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens ließen sich ohne vorausgehende Behandlung ihrer Zellwand erfolgreich abreichem Die Abreicherangen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens in Mischung aus jeweils einem grampositiven und einem gramnegativen Organismus waren erfolgreich. Eine Verstärkung des Abreicherungserfolgs konnte durch das Wiederholen der Abreicherung auf frischen Kavitäten eneicht werden. Dabei wurden die Bakterien, die auf der saturierten Kavitätsfläche nicht mehr über den Ankereffekt der Polynukleotidsonden immobilisiert werden konnten, in frische Kavitäten überführt und eine zweite Abreicherung durchgeführt.
Beispiel 14 Artspezifische in situ Hybridisierungen mit den verwendeten Staphylokokken
Es wurden bei den Hybridisierungen Formamidkonzentrationen von 0-50 % systematisch für jede Sonde ausgetestet. Es ergaben sich für jede Sonde optimale Formamidkonzentrationen, die unspezifische Bindungen verhinderten und spezifische Bindungen noch weiter verstärkten. In situ Hybridisierungen mit den entworfenen artspezifischen Oligonukleotidsonden konnten mit den Zellen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus epidermidis, Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens erfolgreich durchgeführt werden. Zum Teil kamen spezifische Hybridisierungen bei 0% Formamid zustande. Für eine erfolgreiche Hybridisierung von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus und Staphylococcus epidermidis, wurden die PFA-fixierten Zellen 10 min mit Lysozym auf Eis behandelt. Vor und nach der Lysozym- Behandlung waren die PFA-fixierten Zellen von Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus und Staphylococcus epidermidis einer EtOH-Reihe- Behandlung unterzogen. Auch die Zellen von Enterobacter aerogenes und Serratia marcescens wurden vor der Hybridisierung PFA-fixiert.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur taxonspezifischen Zellsortierang und/oder Zellidentifizierung auf grampositive Bakterien, welches umfasst: Fixieren von Bakterien eines zu untersuchenden Bakteriengemisches, Pemieabilisieren der Zellwand der in dem Bakteriengemisch enthaltenen grampositiven Bakterien, und Kontaktieren des Bakteriengemisches mit einer für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Polynukleotidsonde, wobei das eine oder die mehreren grampositiven Bakterien einem Taxon angehören und wobei eine Hybridisierungsreaktion zwischen dem einen oder den mehreren grampositiven, einem Taxon angehörenden Bakterien und der spezifischen Nukleotidsonde erfolgt, Sortieren und/oder Identifizieren der Bakterien, bei welchen eine Hybridisierungsreaktion mit der für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifischen Polynukleotidsonde erfolgt ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die grampositiven Bakterien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Staphylokokken und Enterokokken.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bakteriengemisch sowohl grampositive, als auch gramnegative Bakterien umfasst.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Pemieabilisieren der Zellwand der grampositiven Bakterien enzymatisch erfolgt.
5. Verfahren nach Ansprach 4, wobei das Pemieabilisieren der Zellwand umfasst eine enzymatische Behandlung mit einem lytischen Enzym, vorzugsweise eine Behandlung mit Lysozym, eine Behandlung mit Lysostaphin, oder Kombinationen hiervon, und/oder eine Behandlung durch Erhitzen.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die für ein oder mehrere grampositive Bakterien spezifische Nukleotidsonde eine Transkript-Polynukleotidsonde ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Transkript-Polynukleotidsonde eine Transkript- Polynukleotidsonde ist, die auf einen DNA-Abschnitt gerichtet ist, der für eine variable Region innerhalb der Domäne III von bakterieller 23 S rRNS kodiert.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsonde einen Abschnitt außerhalb der Zelle aufweist.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Hybridisierungsreaktion eine in situ Hybridisierungsreaktion ist.
10. Isolierte DNS-Moleküle, welche eine Nukelotidsequenz umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, oder DNS-Sequenzen mit mindestens 85 %, vorzugsweise mindestens 90 % Identität zu einer der DNS-Sequenzen mit SEQ. ID. NO: 1-7.
11. Isolierte DNS-Moleküle nach Ansprach 10, welche ein oder mehrere Nukleotide aufweisen, die mit einem Marker, vorzugsweise Biotin, verknüpft sind.
12. Kit zum Identifizieren oder Sortieren von grampositive Bakterien, welcher umfasst: ein Agens zum Pemieabilisieren der Zellwand von grampositiven Bakterien, und/oder eine oder mehrere chemische Verbindungen, welche ein DNS-Molekül nach einem der Ansprüche 10 oder 11 umfassen.
13. Vorrichtung, vorzugsweise Mikrotiteφlatte oder Objektträger, welche eine chemische Verbindung aufweist, die einen DNS-Abschnitt umfasst, der zu einer Transkript- Polynukleotidsonde komplementär ist, wobei die Transkript-Polynukleotidsonde auf einen DNS-Abschnitt gerichtet ist, der für eine variable Region innerhalb der Domäne III von bakterieller 23 S rRNS kodiert.
14. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 - 9 zum Identifizieren und/oder Anreichem von pathogenen Mikroorganismen aus Probenmaterial, vorzugsweise Blut, Gewebeproben, Stuhlgang, Speichel, Urin.
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