DE102020103961B4 - Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, korrespondierende Verwendung und Probenträger - Google Patents

Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, korrespondierende Verwendung und Probenträger Download PDF

Info

Publication number
DE102020103961B4
DE102020103961B4 DE102020103961.1A DE102020103961A DE102020103961B4 DE 102020103961 B4 DE102020103961 B4 DE 102020103961B4 DE 102020103961 A DE102020103961 A DE 102020103961A DE 102020103961 B4 DE102020103961 B4 DE 102020103961B4
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
seq
nucleic acid
group
acid probe
acid probes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
DE102020103961.1A
Other languages
English (en)
Other versions
DE102020103961A1 (de
Inventor
Paul Quehl
Zinaida Vasileuskaya-Schulz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Testo Bioanalytics GmbH
Original Assignee
Testo Bioanalytics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Testo Bioanalytics GmbH filed Critical Testo Bioanalytics GmbH
Priority to DE102020103961.1A priority Critical patent/DE102020103961B4/de
Priority to US17/175,042 priority patent/US20210301327A1/en
Priority to EP21157249.0A priority patent/EP3865589A3/de
Publication of DE102020103961A1 publication Critical patent/DE102020103961A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE102020103961B4 publication Critical patent/DE102020103961B4/de
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen, in einer Probe mittels Einschleusen identitätsbestimmender Nukleinsäuresonden in die einzelnen Zellkörper, wobei die Nukleinsäuresonden mit den Nukleinsäuren der Mikroorganismen eine Hybridisierung eingehen, und anschließendem optischen Detektieren der in den einzelnen Zellkörpern erzeugten Hybridisierungen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung aus wenigstens einer ersten Nukleinsäuresonde und einer zweiten Nukleinsäuresonde verwendet wird, und dass die erste Nukleinsäuresonde und die zweite Nukleinsäuresonde jeweils in einem von zwei miteinander nicht überlappenden Bereichen der Zielnukleinsäure anbinden.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen, in einer Probe mittels Einschleusen identitätsbestimmender Nukleinsäuresonden in die einzelnen Zellkörper, wobei die Nukleinsäuresonden mit den Nukleinsäuren der Mikroorganismen eine Hybridisierung eingehen, und anschließendem optischen Detektieren der in den einzelnen Zellkörpern erzeugten Hybridisierungen, wobei eine Mischung aus wenigstens einer ersten Nukleinsäuresonde und einer zweiten Nukleinsäuresonde verwendet wird, und dass die erste Nukleinsäuresonde und die zweite Nukleinsäuresonde jeweils in einem von zwei miteinander nicht überlappenden Bereichen der Zielnukleinsäure anbinden.
  • Enterobacteriaceae sind eine Gruppe der gramnegativen, fakultativ anaeroben Stäbchen-Bakterien, die in der Regel auf einfachen Nährböden wachsen können. Derzeit umfasst diese sehr heterogene, phylogenetische Familie etwa 53 Gattungen und über 170 Arten. Viele Enterobacteriaceae sind humanpathogen und sind daher Indikatorkeime in der Hygienekontrolle.
  • Traditionell werden Enterobacteriaceae über spezifische Kultivierung auf Selektionsnährböden sowie biochemische Sekundärnachweise identifiziert. Die Zugehörigkeit zu einer bestimmten Familie kann auch anhand identitätsbestimmender Nukleinsäure-Sequenzen des zu untersuchenden Mikroorganismus nachgewiesen werden. Solche Nachweise können mittels PCR oder Microarray durchgeführt werden. Zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren, d.h. DNA und/oder RNA Molekülen in einzelnen Zellen sind beispielsweise auch Verfahren wie In-Situ-Hybridisierung (ISH) bekannt. Dabei werden kurze synthetische Nukleinsäuresonden eingesetzt, welche über Basenpaarungen an die nachzuweisende Zielsequenz binden. Eine Variante der ISH-Technologie, bei welcher die Nukleinsäuresonden fluoreszent markiert sind, ist die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH).
  • Die bekannten Nukleinsäuresonden, die bei dem FISH-Verfahren zum Nachweis der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen verwendet werden, weisen allerdings oft ungenügende Spezifität zwischen Enterobacteriaceaen und anderen Bakterien-Familien auf. Häufig treten deshalb Falsch-Positive-Ergebnisse auf, da die Nukleinsäuresonden nicht nur mit den Nukleinsäuren der Enterobacteriaceaen hybridisieren.
  • Innerhalb der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen weisen die herkömmlichen Nukleinsäuresonden außerdem eine ungenügende Sensitivität auf, so dass auch Falsch-Negative-Ergebnisse auftreten können. Mit den einzelnen herkömmlichen Nukleinsäuresonden kann oft eine Fluoreszenzintensität erzielt werden, die für eine Detektion der nachzuweisenden Bakterienfamilie unzureichend ist. Die Verwendung mehrerer Nukleinsäuresonden gleichzeitig wird in der Regel dadurch erschwert, dass die herkömmlichen Nukleinsäuresonden für Enterobacteriaceaen nicht miteinander kombinierbar sind, weil sie überlappende Zielsequenzen aufweisen.
  • Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren bereitzustellen, das einen spezifischen Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen, in einer Probe anhand identitätsspezifischer Nukleinsäuresonden ermöglicht.
  • Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale von Anspruch 1 gelöst. Insbesondere wird somit erfindungsgemäß zur Lösung der genannten Aufgabe bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art vorgeschlagen, dass eine Mischung aus wenigstens einer ersten Nukleinsäuresonde und einer zweiten Nukleinsäuresonde verwendet wird, und dass die erste Nukleinsäuresonde und die zweite Nukleinsäuresonde jeweils in einem von zwei miteinander nicht überlappenden Bereichen der Zielnukleinsäure anbinden. Somit ist einfach erreichbar, dass die erste Nukleinsäuresonde und die zweite Nukleinsäuresonde (und gegebenenfalls weitere Nukleinsäuresonden) gleichzeitig an derselben Zielnukleinsäure anbinden können. Dadurch kann sich die Detektierbarkeit von Enterobacteriaceaen erheblich verbessern, da mit der Kombination mehrerer Nukleinsäuresonden eine höhere Fluoreszenzintensität pro Bakterium erreichbar ist, indem mehrere Zielsequenzen gleichzeitig nachgewiesen werden können.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die Mischung so gebildet ist, dass aus der vorliegenden Kombinatorik der Gruppen 1 bis 12 jeweils aus jeder Gruppe ein Vertreter oder aus wenigstens zwei Gruppen ein Vertreter ausgewählt werden, insbesondere wobei die Gruppe 1 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 19 umfasst, die Gruppe 2 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 20 bis SEQ ID NO: 40 umfasst, die Gruppe 3 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 41 bis SEQ ID NO: 59 umfasst, die Gruppe 4 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 60 bis SEQ ID NO: 78 umfasst, die Gruppe 5 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 79 bis SEQ ID NO: 99 umfasst, die Gruppe 6 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 100 bis SEQ ID NO: 118 umfasst, die Gruppe 7 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 119 bis SEQ ID NO: 137 umfasst, die Gruppe 8 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 138 bis SEQ ID NO: 156 umfasst, die Gruppe 9 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 157 bis SEQ ID NO: 175 umfasst, die Gruppe 10 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 176 bis SEQ ID NO: 196 umfasst, die Gruppe 11 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 197 bis SEQ ID NO: 217 umfasst und die Gruppe 12 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 218 bis SEQ ID NO: 236 umfasst.
  • Hierzu macht sich die Erfindung zunutze, dass sich die Sensitivität (Richtig-Positiv-Rate) und Spezifität (Richtig-Negativ-Rate) im Hinblick auf Enterobacteriaceaen erheblich verbessern lassen können, indem die Kombination mehrerer Nukleinsäuresonden aus der erfindungsgemäßen Kombinatorik der Gruppen 1 bis 12 verwendet wird. Insbesondere kann durch die Verwendung von mehr als nur einer Nukleinsäuresonde verhindert werden, dass es in den hoch variablen Nukleinsäuresonden-Zielregionen zu Fehlpaarungen kommen kann, wodurch Falsch-Negative Ergebnisse entstehen können.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass die Nachweisreaktion unter Verwendung von Nukleinsäuresonden mittels Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH), Nukleinsäuren-Amplifikationsreaktion und/oder Mikroarray erfolgt. Eine Amplifikationsreaktion kann beispielsweise Polymerasekettenreaktion („PCR“) sein. Von Vorteil ist dabei, dass ein spezifischer Nachweis von Enterobacteriaceaen mittels unterschiedlicher Nachweistechniken ermöglicht werden kann.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die Nukleinsäuresonden jeweils als lineare Sonden ausgebildet sind. Alternativ oder zusätzlich können die Nukleinsäuresonden Sekundärstruktur aufweisen, beispielsweise als Molecular Beacons und/oder als Scorpion Probes ausgebildet sein. Dadurch sind eine höhere Fluoreszenzintensität sowie ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis erreichbar, was insbesondere für eine automatisierte Anwendung vorteilhaftsein kann.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass eine optische Sensitivität so eingestellt ist, dass nur solche Mikroorganismen detektiert werden, die wenigstens zwei Anbindungen aufweisen. Somit kann sichergestellt werden, dass in der nachzuweisenden Bakterienfamilie immer wenigstens zwei Nukleinsäuresonden anbinden. Vorteilhaft ist dabei, dass eine höhere diagnostische Sensitivität erreichbar ist.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die erste und/oder zweite Nukleinsäuresonde wenigstens einen ersten Farbstoff konjugiert mit dem 5'-Ende und/oder wenigstens einen zweiten Farbstoff konjugiert mit dem 3'-Ende aufweist. Vorteilhaft ist dabei, dass durch den Einsatz verschiedener Farbstoffe den Nachweis einer bestimmten Farbkombination ermöglicht werden kann.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass die Nukleinsäuresonde am 5'-Ende und/oder 3'-Ende weitere Nukleotide als Stammsequenz und/oder wenigstens einen Funktionsteil aufweist. Es kann insbesondere vorgesehen sein, dass die Stammsequenzen und/oder Funktionsteile so zueinander ausgestaltet sind, dass sie nicht gegenseitig miteinander wechselwirken. Die Erfindung macht sich hierzu zunutze, dass die Stamm-bildenden Nukleotide in Abwesenheit von Zielsequenzen eine „Haarnadel“-Struktur bilden können, wodurch die Fluoreszenz des Farbstoffs unterdrückt wird. Nach der Bindung des Funktionsteils an die Zielsequenz löst sich diese „Haarnadel“-Struktur wieder auf, wobei die Fluoreszenz des Farbstoffs, die nicht mehr unterdrückt wird, detektiert werden kann.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die Auswahl der nicht überlappenden Bereiche so gewählt ist, dass ein ausreichend großer räumlicher Abstand vorliegt und sich die Nukleinsäuresonden in ihrem Abstrahlverhalten nicht gegenseitig stören. Somit kann verhindert werden, dass bei der Signalerfassung Fehlmessungen auftreten.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass die Nukleinsäuresonden so ausgestaltet sind, dass eine bestimmte Farbkombination detektierbar ist. Beispielsweise kann hierfür die oder eine erste Nukleinsäuresonde einen ersten Farbstoff und die oder eine zweite Nukleinsäuresonde einen zweiten Farbstoff aufweisen. Vorteilhaft ist dabei, dass durch den Nachweis einer bestimmten Farbkombination eine Alternative zur Messempfindlichkeit für eine spezifische Detektierbarkeit von Enterobacteriaceaen ermöglicht werden kann.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die Nukleinsäuresonde wenigstens einen optisch detektierbaren Marker aufweist. Der detektierbare Marker kann beispielsweise eine enzymatisch aktive Gruppe, ein Affinitätsmarker oder ein Farbstoff sein. Der Affinitätsmarker kann beispielsweise Affinitätsbindungspaare Biotin-Streptavidin oder Antigen-Antikörper umfassen. Der enzymatisch aktive Marker kann beispielsweise Peroxidase oder Phosphatase sein. Der Farbstoff kann beispielsweise ein Fluoreszenzmarker sein. Somit ist eine optische Detektion erreichbar.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass jede Nukleinsäuresonde an mindestens 80% der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen anbindet. Alternativ oder zusätzlich kann vorgesehen sein, dass jede Nukleinsäuresonde nachweisbar nur an die Nukleinsäuren der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen und nicht an die Nukleinsäuren eines Organismus, der zu einer anderen Bakterienfamilie gehört, anbindet. Somit ist eine hoch spezifische Nachweisbarkeit der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen erreichbar.
  • Eine bevorzugte Anwendung sieht eine Verwendung wenigstens einer Nukleinsäuresonde oder wenigstens zwei Nukleinsäuresonden vor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 218 und/oder weiteren Sequenzen aus der vorliegenden Kombinatorik der Gruppen 1 bis 12 zum Nachweis der Enterobacteriaceaen und/oder zur Immobilisierung auf einem Trägermaterial, insbesondere einem fluidischen Kanalsystem.
  • Eine bevorzugte Anwendung sieht ein fluidisches Kanalsystem vor, mit Mitteln zum Durchführen des Verfahrens, insbesondere wie zuvor beschrieben und/oder nach einem der auf ein Verfahren gerichteten Ansprüche. Beispielsweise können in dem fluidischen Kanalsystem zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Detektionsbereich und ein Vorbereitungsbereich ausgebildet sein. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Querschnitte der Kanäle des fluidischen Kanalsystems auf Abmessungen der Mikroorganismen angepasst sein können.
  • Das fluidische Kanalsystem kann beispielsweise in Form eines Probenträgers ausgebildet sein. Der erfindungsgemäße Probenträger umfasst insbesondere mindestens eine Kavität mit wenigstens einer Nukleinsäuresonde oder wenigstens zwei Nukleinsäuresonden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 218 und/oder weiteren Sequenzen aus der vorliegenden Kombinatorik der Gruppen 1 bis 12. Alternativ oder zusätzlich kann der Probenträger Mittel zum optischen Detektieren von markierten Mikroorganismen umfassen.
  • Der erfindungsgemäße Probenträger kann als ein scheibenförmiger Probenträger ausgebildet sein. Beispielsweise kann der Probenträger als ein flacher Probenträger ausgebildet sein. Von Vorteil ist dabei, dass durch die Scheibenform des Probenträgers die Zentrifugalkraft für die Fluidförderung ausgenutzt werden kann. Die Fluidförderung ist auch über Druck oder auf eine andere Weise erreichbar. Der Probenträger kann alternativ eine dreidimensionale Erstreckung, beispielsweise in Form eines Zylinders oder küvettenartig, aufweisen.
  • Beispielsweise kann die Scheibenförmigkeit rotationssymmetrisch ausgebildet sein. Dies kann für ein Zentrifugieren von Vorteil sein. Es sind auch alternativ rechteckförmige Probenträger wie bei einer Chipkarte oder segmentförmige Probenträger wie bei einem Pizzastück bildbar.
  • Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben, ist aber nicht auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt. Weitere Ausführungsbeispiele ergeben sich durch Kombination der Merkmale einzelner oder mehrerer Schutzansprüche untereinander und/oder mit einzelnen oder mehreren Merkmalen der Ausführungsbeispiele.
  • Es zeigt:
    • 1 Gruppe 1 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 19 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 2 Gruppe 2 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 20 bis SEQ ID NO: 40 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 3 Gruppe 3 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 41 bis SEQ ID NO: 59 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 4 Gruppe 4 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 60 bis SEQ ID NO: 78 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 5 Gruppe 5 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 79 bis SEQ ID NO: 99 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 6 Gruppe 6 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 100 bis SEQ ID NO: 118 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 7 Gruppe 7 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 119 bis SEQ ID NO: 137 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 8 Gruppe 8 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 138 bis SEQ ID NO: 156 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 9 Gruppe 9 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 157 bis SEQ ID NO: 175 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 10 Gruppe 10 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 176 bis SEQ ID NO: 196 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 11 Gruppe 11 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 197 bis SEQ ID NO: 217 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 12 Gruppe 12 mit den Sequenzen SEQ ID NO: 218 bis SEQ ID NO: 236 aus einer Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden,
    • 13 ein fluidisches Kanalsystem zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer schematischen Darstellung.
  • 1 bis 12 zeigen eine Kombinatorik der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden, bestehend aus den Gruppen 1 bis 12. Es werden aus jeder Gruppe ein Vertreter oder aus wenigstens zwei Gruppen ein Vertreter für eine Mischung von Nukleinsäuresonden ausgewählt und in einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen, verwendet.
  • Die Nukleinsäuresonden weisen jeweils am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende eine Stammsequenz auf, die in den Beispielen gemäß 1 bis 12 in Kleinbuchstaben dargestellt ist. Zwischen den Stammsequenzen der Nukleinsäuresonden ist jeweils ein Funktionsteil ausgebildet, der in den Beispielen gemäß 1 bis 12 in Großbuchstaben dargestellt ist. Der Funktionsteil ist der komplementärer, d.h. bindender Bereich zur Zielsequenz. Die Stammsequenzen innerhalb jeder Nukleinsäuresonde können in Abwesenheit von Zielsequenzen an einander binden und so eine „Haarnadel“-Struktur bilden, wodurch die Fluoreszenz des Farbstoffs unterdrückt wird. Nach der Bindung des Funktionsteils an die Zielsequenz löst sich diese „Haarnadel“-Struktur wieder auf, wobei die Fluoreszenz des Farbstoffs detektiert werden kann.Zur Realisierung des Verfahrens kann ein fluidisches Kanalsystem, beispielsweise ein scheibenförmiger Probenträger, der rotationssymetrisch sein kann aber nicht sein muss, mit Mitteln zum Durchführen dieses Verfahrens versehen sein. Insbesondere kann das Kanalsystem eine Kavität mit wenigstens einer Nukleinsäuresonde oder wenigstens zwei Nukleinsäuresonden ausgewählt aus den erwähnten Gruppen und/oder weiteren Sequenzen aus der vorliegenden Kombinatorik der Gruppen 1 bis 12 umfassen und/oder mit Mitteln zum optischen Detektieren von markierten Mikroorganismen versehen sein.
  • 13 zeigt ein fluidisches Kanalsystem 1 zum Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen, mit einem Vorbereitungsbereich 2 und einem Detektionsbereich 3. Das fluidische Kanalsystem hat eine Probenahme-Kammer 4, in die eine Untersuchungsprobe direkt einführbar ist. Die Probenahme-Kammer 4 ist mit einer Reaktionskammer 5 verbunden, die vorgehaltene Reagenzien 6 enthält.
  • Aus 13 ist erkennbar, dass Reaktionskammer 5 mit wenigstens einer Reagenzien-Kammer 7 verbunden ist, die vorgehaltene Reagenzien 6 enthält. In der hier in 13 dargestellten Kanalsystem-Ausführung ist das Kanalsystem 1 mit drei Reagenzien-Kammern 7 ausgebildet, die parallel zueinander geschaltet sind.
  • Bei weiteren Ausführungsbeispielen ist eine andere Anzahl von Reagenzien-Kammern 7 vorhanden, beispielsweise mehr als drei oder weniger als drei. Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel ist ein Kanalsystem 1 frei von Reagenzien-Kammern 7 ausgebildet.
  • Die Reaktionskammer 5 ist über ein Detektionskanal 8 mit einer Detektionskammer 9 verbunden. Das Kanalsystem 1 hat eine Lichtquelle 10 und einen Detektor 11, die in dem Detektionsbereich 3 ausgebildet sind.
  • In einer bevorzugten Anwendung wird zunächst die Untersuchungsprobe in das fluidische Kanalsystem 1 eingeführt. In dem Vorbereitungsbereich 2 wird die Untersuchungsprobe zu der Reaktionskammer 5 geleitet. Gleichzeitig oder anschließend werden die Reagenzien 6 aus den Reagenzien-Kammern 7 zur Reaktionskammer 5 geleitet, wobei dieser Schritt entfallen kann, falls Reagenzien bereits in der Reaktionskammer 5 vorgehalten werden.
  • Nach der Reaktion mit den vorgehaltenen Reagenzien 6 wird die Untersuchungsprobe über das Detektionskanal 8 in die Detektionskammer 9 geleitet. Anschließend wird die Nachweisreaktion durch die optische Signalerfassung mittels Photometrie durchgeführt. Beispielsweise wird die Nachweisreaktion mittels Turbidometrie oder Fluoreszenzmessung durchgeführt.
  • Erfindungsgemäß wird somit vorgeschlagen, ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen, in einer Probe bereitzustellen, mittels Einschleusen identitätsbestimmender Nukleinsäuresonden in die einzelnen Zellkörper, wobei die Nukleinsäuresonden mit den Nukleinsäuren der Mikroorganismen eine Hybridisierung eingehen, und anschließendem optischen Detektieren der in den einzelnen Zellkörpern erzeugten Hybridisierungen, wobei eine Mischung aus wenigstens einer ersten Nukleinsäuresonde und einer zweiten Nukleinsäuresonde verwendet wird, und dass die erste Nukleinsäuresonde und die zweite Nukleinsäuresonde jeweils in einem von zwei miteinander nicht überlappenden Bereichen der Zielnukleinsäure anbinden.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    fluidisches Kanalsystem
    2
    Vorbereitungsbereich
    3
    Detektionsbereich
    4
    Probenahme-Kammer
    5
    Reaktionskammer (mit vorgehaltenen Reagenzien)
    6
    vorgehaltene Reagenzien
    7
    optional wenigstens eine Reagenzien-Kammer (mit vorgehaltenen Reagenzien)
    8
    Detektionskanal
    9
    Detektionskammer
    10
    Lichtquelle
    11
    Detektor

Claims (14)

  1. Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen, in einer Probe mittels Einschleusen identitätsbestimmender Nukleinsäuresonden in die einzelnen Zellkörper, wobei die Nukleinsäuresonden mit den Nukleinsäuren der Mikroorganismen eine Hybridisierung eingehen, und anschließendem optischen Detektieren der in den einzelnen Zellkörpern erzeugten Hybridisierungen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung aus wenigstens einer ersten Nukleinsäuresonde und einer zweiten Nukleinsäuresonde verwendet wird, und dass die erste Nukleinsäuresonde und die zweite Nukleinsäuresonde jeweils in einem von zwei miteinander nicht überlappenden Bereichen der Zielnukleinsäure anbinden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung so gebildet ist, dass aus der vorliegenden Kombinatorik der Gruppen 1 bis 12 jeweils aus jeder Gruppe ein Vertreter oder aus wenigstens zwei Gruppen ein Vertreter ausgewählt werden, insbesondere wobei die Gruppe 1 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 19 umfasst, die Gruppe 2 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 20 bis SEQ ID NO: 40 umfasst, die Gruppe 3 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 41 bis SEQ ID NO: 59 umfasst, die Gruppe 4 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 60 bis SEQ ID NO: 78 umfasst, die Gruppe 5 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 79 bis SEQ ID NO: 99 umfasst, die Gruppe 6 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 100 bis SEQ ID NO: 118 umfasst, die Gruppe 7 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 119 bis SEQ ID NO: 137 umfasst, die Gruppe 8 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 138 bis SEQ ID NO: 156 umfasst, die Gruppe 9 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 157 bis SEQ ID NO: 175 umfasst, die Gruppe 10 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 176 bis SEQ ID NO: 196 umfasst, die Gruppe 11 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 197 bis SEQ ID NO: 217 umfasst und die Gruppe 12 einzelne oder alle der SEQ ID NO: 218 bis SEQ ID NO: 236 umfasst.
  3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisreaktion unter Verwendung von Nukleinsäuresonden mittels Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH), Nukleinsäuren-Amplifikation und/oder Mikroarray erfolgt.
  4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonden jeweils als lineare Sonden und/oder Sonden mit Sekundärstruktur, vorzugsweise Molecular Beacons, ausgebildet sind.
  5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine optische Sensitivität so eingestellt ist, dass nur solche Mikroorganismen detektiert werden, die wenigstens zwei Anbindungen aufweisen.
  6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und/oder zweite Nukleinsäuresonde wenigstens einen ersten Farbstoff konjugiert mit dem 5'-Ende und/oder wenigstens einen zweiten Farbstoff konjugiert mit dem 3'-Ende und/oder intramolekular gebundene Farbstoffe aufweist.
  7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonde am 5'-Ende und/oder 3'-Ende weitere Nukleotide als Stammsequenz und/oder wenigstens einen Funktionsteil aufweist, insbesondere wobei die Stammsequenzen und/oder Funktionsteile so zueinander ausgestaltet sind, dass sie nicht gegenseitig miteinander wechselwirken.
  8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswahl der nicht überlappenden Bereiche so gewählt ist, dass sich die Nukleinsäuresonden in ihrem Abstrahlverhalten nicht gegenseitig stören.
  9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonden so ausgestaltet sind, dass eine bestimmte Farbkombination detektierbar ist, insbesondere wobei die oder eine erste Nukleinsäuresonde einen ersten Farbstoff und die oder eine zweite Nukleinsäuresonde einen zweiten Farbstoff aufweist.
  10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresonde wenigstens einen optisch detektierbaren Marker aufweist.
  11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der detektierbare Marker ein Enzymmarker, Affinitätsmarker und/oder ein Farbstoff ist, insbesondere wobei der Farbstoff ein Fluoreszenzfarbstoff ist und/oder der Affinitätsmarker Affinitätsbindungspaare Biotin-Streptavidin oder Antigen-Antikörper umfasst.
  12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass jede Nukleinsäuresonde an mindestens 80% der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen anbindet und/oder jede Nukleinsäuresonde nachweisbar nur an die Nukleinsäuren der Bakterienfamilie der Enterobacteriaceaen und nicht an die Nukleinsäuren eines Organismus, der zu einer anderen Bakterienfamilie gehört, anbindet.
  13. Verwendung wenigstens einer Nukleinsäuresonde oder wenigstens zwei Nukleinsäuresonden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 218 und/oder weiteren Sequenzen aus der vorliegenden Kombinatorik der Gruppen 1 bis 12 zum Nachweis der Enterobacteriaceaen und/oder zur Immobilisierung auf einem Trägermaterial, insbesondere einem fluidischen Kanalsystem.
  14. Fluidisches Kanalsystem, vorzugsweise scheibenförmiger Probenträger, mit Mitteln zum Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, insbesondere umfassend mindestens eine Kavität mit wenigstens einer Nukleinsäuresonde oder wenigstens zwei Nukleinsäuresonden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 218 und/oder weiteren Sequenzen aus der vorliegenden Kombinatorik der Gruppen 1 bis 12, und/oder mit Mitteln zum optischen Detektieren von markierten Mikroorganismen.
DE102020103961.1A 2020-02-14 2020-02-14 Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, korrespondierende Verwendung und Probenträger Active DE102020103961B4 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102020103961.1A DE102020103961B4 (de) 2020-02-14 2020-02-14 Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, korrespondierende Verwendung und Probenträger
US17/175,042 US20210301327A1 (en) 2020-02-14 2021-02-12 Method for the detection of microorganisms, corresponding use and sample carrier
EP21157249.0A EP3865589A3 (de) 2020-02-14 2021-02-15 Verfahren zum nachweis von mikroorganismen, korrespondierende verwendung und probenträger

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102020103961.1A DE102020103961B4 (de) 2020-02-14 2020-02-14 Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, korrespondierende Verwendung und Probenträger

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE102020103961A1 DE102020103961A1 (de) 2021-08-19
DE102020103961B4 true DE102020103961B4 (de) 2021-10-28

Family

ID=77060597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102020103961.1A Active DE102020103961B4 (de) 2020-02-14 2020-02-14 Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, korrespondierende Verwendung und Probenträger

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20210301327A1 (de)
DE (1) DE102020103961B4 (de)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610836B1 (en) * 1999-01-29 2003-08-26 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid amino acid sequences relating to Klebsiella pneumoniae for diagnostics and therapeutics

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BATANI, G. [u.a.]: Fluorescence in situ hybridization (FISH) and cell sorting of living bacteria. Sci. Rep. (09.12.2019) 9 (1) 18618, Druckseiten 1-13

Also Published As

Publication number Publication date
US20210301327A1 (en) 2021-09-30
DE102020103961A1 (de) 2021-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE112013004650T5 (de) Multiplexpyrosequenzierung unter Verwendung nichtinterferierender, rauschbeendender Polynukleotididentifikationstags
DE69937447T2 (de) Verfahren zur erkennung von nukleinsäuren
DE69636118T2 (de) Verfahren und mittel für die bestimmung der relativen heufigkeit von mikroorganismen in gemischten populationen
EP1177319B1 (de) Verfahren zum nachweisen von mikroorganismen in einer probe
EP0846186B1 (de) Extraktion, amplifikation und sequentielle hybridisierung von pilzzellen-dna sowie verfahren zum nachweisen von pilzzellen in klinischem material
DE102020103961B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, korrespondierende Verwendung und Probenträger
DE69735046T2 (de) Zusammensetzungen und Verfahren für den Nachweis von Mycobacterium kansasii
EP3865589A2 (de) Verfahren zum nachweis von mikroorganismen, korrespondierende verwendung und probenträger
DE19616750A1 (de) Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gemischen
WO2001036673A2 (de) Test von mikroorganismen
DE102020103966B4 (de) Sondenkomplex zum spezifischen Nachweis von wenigstens einer Substanz, korrespondierendes Verfahren und Verwendung
DE60038029T2 (de) Methoden und reagenzien zur in situ amplifizierung
DE102020103958B4 (de) Oligonukleotidsonde zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen, korrespondierendes Verfahren und Verwendung
EP1490507B1 (de) Verfahren zum nachweis von mikroorganismen mittels in situ-hybridisierung und durchflusszytometrie
DE102020103968B4 (de) Plattform zur fluidischen Prozessierung eines Probematerials und ein korrespondierendes Verfahren
DE102020103957A1 (de) Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen und ein fluidisches Kanalsystem
DE102020103965B4 (de) Verfahren zum Nachweis einzelner Zelltypen
DE102005029810B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Nukleotidsequenzen, Verwendung des Verfahrens und Testbesteck
EP3865592A2 (de) Oligonukleotidsonde zum spezifischen nachweis von mikroorganismen, korrespondierendes verfahren und verwendung
DE19941359C2 (de) Schneller, hochspezifischer Nachweis von Pseudomonas aeruginosa durch Mehrfachsondendetektion
DE102020103971B4 (de) Verfahren zum Nachweis von lebenden Mikroorganismen und ein fluidisches Kanalsystem
EP1390541A2 (de) Verfahren zum nachweis von gram-positiven bakterien
EP1280603B1 (de) Verfahren zur identifizierung, quantifizierung und visualisierung von mikroorganismen
DE19936875C2 (de) Verfahren zum Nachweisen von Mikroorganismen in einer Probe
EP3865588A2 (de) Verfahren zum nachweis von mikroorganismen und ein fluidisches kanalsystem

Legal Events

Date Code Title Description
R012 Request for examination validly filed
R016 Response to examination communication
R018 Grant decision by examination section/examining division
R020 Patent grant now final