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Die
Erfindung betrifft Verfahren und Materialien zur Bestimmung der
relativen Häufigkeit
von einzelnen Mikroorganismen in gemischten Populationen von Mikroorganismen,
insbesondere Verfahren zur Bestimmung der relativen Häufigkeit
einzelner Mikroorganismus-Spezies in der angeborenen Darmflora,
insbesondere von Menschen.
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Solche
Verfahren haben bis zur vorliegenden Erfindung nicht zur Verfügung gestanden.
Bis zur vorliegenden Erfindung war die Bestimmung nur des Vorhandenseins
einzelner Spezies von Mikroorganismen in einer gemischten Population
von einzelnen Mikroorganismen wie der Darmflora möglich.
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Bei
herkömmlichen
Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung der Darmflora ist eine
Kultivierung der Mikroorganismen in der Population auf sowohl selektiven
als auch unselektiven Medien erforderlich. Diese Verfahren sind
arbeitsaufwändig
und zeitaufwändig,
wodurch es an sich kaum möglich
ist, abgesehen von der Identifizierung der in der gemischten Population
vorhandenen Mikroorganismen irgendetwas zu tun. Weiterhin sind diese
Verfahren für
methodologische und statistische Fehler anfällig. Ein weiteres Hindernis
für die
Bestimmung der Häufigkeit
eines Mikroorganismus gegenüber
anderen (relative Häufigkeit)
besteht darin, dass die Kultivierung eine Vermehrung der Mikroorganismen
einschließt,
die sich natürlich
nicht alle mit derselben Geschwindigkeit teilen. Daher ist eine
Bestimmung der relativen Häufigkeit
unter Verwendung dieser Verfahren praktisch nicht möglich, ganz
zu schweigen davon, dass die Dynamik einer solchen Population im Laufe
der Zeit verfolgt werden könnte.
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Die
Zusammensetzung und Aktivität
der angeborenen Darmflora ist für
die Immunologie, Ernährung, Pathogenese
des Menschen und somit für
die Gesundheit jedes Einzelnen von allergrößter Bedeutung (Van der Waaij
et al., 1971). Beispielsweise stellt eine Besiedlungsresistenz oder
ein Bakterienantagonismus der angeborenen Darm-Mikroflora eine erste
Verteidigungslinie gegen die Ansiedlung von pathogenen Mikroorganismen
im Darmtrakt dar (Van der Waaij et al., 1971; 1989).
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Der
Darmtrakt des Menschen (von Säugetieren)
ist nicht die einzige gemischte Population von Mikroorganismen,
bei der eine Messung der relativen Häufigkeit einzelner Spezies
oder anderer Untergruppen von Mikroorganismen nützlich oder wichtig ist.
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In
der Industrie, insbesondere im Nahrungsmittelsektor und in der Fermentationsindustrie,
ist eine Überwachung
des bakterien- oder hefeabhängigen
Fermentationsverfahrens zur Gewährleistung
der Qualität hinsichtlich
der Hygiene und der Produktstabilität von wesentlicher Bedeutung.
Aus ökologischen
Gründen
ist eine Überwachung
von komplexen, gemischten Bakterienpopulationen zur Vorhersage der
Wirksamkeit der biologischen Sanierung bei der Behandlung von Erdboden,
Gasen und Abwässern
von elementarer Bedeutung. Umwelt-Mikrobiologen benötigen Werkzeuge,
die Potentiale der Nährstoffregenerierung
hinsichtlich der Biomasse einzelner metabolischer Bakteriencluster
erklären.
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Obwohl
viel über
die Physiologie der meisten einzelnen Bakterienspezies und der metabolischen
Aktivitäten
von gemischten Bakterienkonsortien als Ganzes bekannt ist, sind
Faktoren, die ihre Häufigkeit
bestimmen, und diejenigen, die subtile sowie drastische Änderungen
der Populationszusammensetzung bewirken, aufgrund der technischen
Einschränkungen
der klassischen Kultivierungs- und Identifizierungstechniken größtenteils
unbekannt. Daher sind schnelle Überwachungstechniken,
die die Populationszusammensetzungen von komplexen, gemischten Bakterienkonsortien
aufklären,
von großer
wissenschaftlicher Bedeutung.
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Die
Erfindung macht somit ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung
der relativen Häufigkeit
niederer phylogenetischer Gruppen von Mikroorganismen in einer gemischten
Population von mehreren Mikroorganismen verfügbar, umfassend die Schritte
des:
- 1) Bereitstellens einer Menge von markierten
in-situ-Hybridisierungs-Cluster-Oligonucleotidsonden,
wobei die Clustersonde eine Sonde auf dem Gattungsniveau ist;
- 2) Hybridisierens der Sonden mit einer Probe der gemischten
Population; und
- 3) der quantitativen Analyse der Anzahl an markierten Mikroorganismen.
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Eine
In-situ-Hybridisierung an sich ist eine wohlbekannte Technik, wie
aus EP-A-0 497 464
zu entnehmen ist, das In-situ-Hybridisierungstechniken unter Verwendung
von festen, permeabilisierten, aber nicht eingebetteten Zellen betrifft.
Das Verfahren wird zur Bestimmung des Vorhandenseins von einzelnen
Mikroorganismen verwendet. Bisher ist eine In-situ-Hybridisierung
jedoch nicht zur Bestimmung der relativen Häufigkeit von niederen phylogenetischen
Unterklassen, geschweige denn zur Verfolgung der Dynamik einer gemischten Population
von Mikroorganismen angewandt worden. Markierte Proben sind bei
der In-situ-Hybridisierung ein wesentlicher Teil. Die vorliegende
Erfindung macht einen Satz von Clustersonden verfügbar, die
auf eine unerwartete, neue Weise, d.h. nicht auf den normalen taxonomischen
Prinzipien bestehend, ausgewählt
worden sind. Ein Satz von Clustersonden für die Zwecke dieser Erfindung
ist als Satz von Oligonucleotiden definiert, die dazu fähig sind,
Mikroorganismen wie eine Spezies, eine Gattung oder eine andere
niedere phylogenetische Untergruppe aus einem Cluster zu identifizieren.
Vorzugsweise basieren diese Sonden alle auf einer vergleichbaren
Ziel-Nucleinsäure der
verschiedenen Mikroorganismen in der gemischten Population, in diesem Fall
beispielsweise der 16S rRNA.
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Clustersonden
haben in der Wasser- und der Boden-Mikrobiologie die meiste Aufmerksamkeit
erregt. Die Einschränkungen
aus der Verwendung von kulturabhängigen
Methoden zur Untersuchung der Diversität und Ökologie von natürlichen
Mikrobengemeinschaften auf diesen Gebieten sind wohlbekannt, weil
die meisten (> 99%)
der in diesen Habitaten vorhandenen Bakterien nicht kultivierbar
und von einer unbekannten taxonomischen Identität sind. Als Folge ist die Verwendung
von direkteren molekularen Charakterisierungen auf diesem Gebiet üblicher
geworden. Eine kürzlich
erschienene Übersicht
(Amann et al., 1995) fasst viele der bisher auf der unteren Gruppenebene/Gattungsebene
entwickelten Sonden zusammen. Diese Sonden finden ihre Anwendung
ausnahmslos in den ökologischen
Gebieten der Abwasser- und der Sediment-Mikrobiologie. Sonden der
höheren
Gruppenniveaus (wie Sonden der Unterklasse der Proteobakterien)
und Sonden auf Domänenebene
(die zur Unterscheidung zwischen Archaea, Bakterien und Eukaria
verwendet werden) weisen einen eingeschränkten beschreibenden Wert auf,
weil sie zu viele verschiedene evolutionäre Abstammungslinien "abdecken". Die Anwendung von
Sonden auf der Ebene von Spezies auf die Analyse der Gemeinschaftsstruktur
komplexer, gemischter Bakterienansammlungen macht das Verfahren
wahrscheinlich genauso zeitaufwändig
wie traditionelle Kultivierungstechniken.
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Daher
sind diese Typen von Clustersonden für die vorliegende Erfindung
nicht geeignet. Auf dem Gebiet der regelmäßigen Verwendung von Clustersonden
hat niemand die Verwendung niederer phylogenetischer Clustersonden
in Betracht gezogen, ganz zu schweigen davon, dass irgendjemand
solche Sonden auf dem Gebiet der Bestimmung der relativen Häufigkeit
von Mikroorganismen in der Darmflora des Menschen angewandt hätte.
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Diese
16S-rRNA-Sonden sind eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung.
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Mit
steigender Häufigkeit
werden auf 16S-rRNA abzielende Hybridisierungssonden in Kombination
mit der PCR-Amplifizierung von Ziel-DNA zum Nachweis von spezifischen
Bakterientaxa in gemischten Bakterienpopulationen eingesetzt. Gegenwärtig kann
durch die Anwendung von PCR-Techniken das qualitative Vorhandensein
einer einzigen Zelle vor einem Hintergrund von 109 Nicht-Zielzellen
bestätigt
werden. Die Technik als solche ist extrem empfindlich. Die Technik
ergibt jedoch nur eine geringe oder gar keine quantitative Information über absolute
Zellzahlen. Eine In-situ-Fluoreszenzhybridisierung mit einem Satz
von phylogenetischen Clustersonden ist der PCR hinsichtlich der
Auszählung
individueller Zellen, die zu einer bestimmten Bakteriengruppe gehören, überlegen.
Diese Technik ist zur Analyse von gemischten Populationen auch der
DGGE-Technik, bei der die PCR einen integralen Teil bildet, überlegen.
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Etwa
100 Bakterienspezies von ± 400
dominieren die kultivierbare (und somit identifizierte) Population. Gegenwärtig sind
die 16S-rRNA-Sequenzen der meisten dieser Bakterien bekannt. Es
gibt mehr als genug Sequenzdaten zur Konstruktion spezifischer Sonden
für herausragende
Gruppen von Fäkalbakterien.
Wir berichten über
die Entwicklung eines Satzes von 15 auf 16S-rRNA abzielenden Oligonucleotid-Sonden,
mit denen die vorherrschenden Bakteriengruppen der humanen intestinalen
Mikroflora in situ ausgezählt
werden können.
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Die
Sonden werden vorzugsweise mit Fluoreszenzmaterialien markiert.
Dies ermöglicht
eine mikroskopische Analyse in Kombination mit einer vorzugsweise
automatisierten Bildanalyse.
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Zum
Nachweis der fluoreszierenden Oligonucleotid-Sonden, die auf Objektträgern an
Bakterien hybridisiert sind, kann die Photographie angewandt werden.
Eine Quantifizierung durch dieses Verfahren wird jedoch durch das
Fehlen von objektiven Ansprechwert-Kriterien für die Unterscheidung zwischen
hybridisierten und nichthybridisierten Zellen behindert. Daher wird
für eine
objektive Auswertung der Sondenspezifität ein Bildanalysensystem verwendet,
das eine fluorometrische Messung einzelner Zellen ermöglicht.
Alle Einzelheiten zur Hardware und Software dieses Systems sind
an anderer Stelle veröffentlicht
worden (siehe die Literaturstellen 32–34 im Papier "Bifidobacterium" von Langendijk et
al., Aug. 1995).
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Auch
bevorzugt ist eine Ausführungsform,
bei der Sonden, die bestimmte Spezies identifizieren, mit einer
anderen Markierung als andere, andere Spezies identifizierende Sonden
versehen sind. Dadurch wird die Anzahl der zu nehmenden Assays und/oder
Proben vermindert.
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Die
Erfindung macht auch Sonden und Kits zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren
verfügbar.
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Die
Kits umfassen üblicherweise
auch Sonden und andere Reagenzien zur in situ erfolgenden Hybridisierung
sowie andere Reagenzien zur Vorbehandlung von Proben und/oder zur
Nachbehandlung von Proben.
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Anwendungen
der Erfindung
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Bei
einem solchen Kit können
die Sonden mit Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) am 5'-Ende markiert sein.
Andere Markierungen können
entweder am 3'-
oder am 5'-Ende
dieser Sonden, an beiden Enden oder intern gebunden sein.
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Unter
diesen Markierungen können
sich die folgenden befinden:
- 1) direktfluoreszierende
Markierungen:
– FLUOS
(5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester)
– TRITC
(Tetramethylrhodanin-5-isothiocyanat)
– AMCA (7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure)
– Texas-Rot
– Indocarbocyanin-Farbstoffe
wie CY3, CY5 oder CY7
– jede
beliebige andere fluoreszierende Markierung.
- 2) indirekte Markierungen:
– Enzyme wie alkalische Phosphatase
(AP) oder Meerrettich-Peroxidase
(HRP) entweder direkt oder über einen
C6-Thiol-Linker
gebunden und in Kombination mit chemilumineszierenden Substraten
wie AMPPD (3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3'-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxethan)
oder fluoreszenzerzeugenden Substraten verwendet.
– Digoxigenin
in
Kombination mit anti-DIG-Antikörpern,
die markiert sind mit:
– Goldteilchen
– Fluoreszenzmarkierungen
wie Carboxyfluorescein oder Carboxyrhodamin 101
– Enzymen
wie alkalischer Phosphatase (AP) oder Meerrettich-Peroxidase (HRP)
in Kombination mit chemilumineszierenden Substraten wie AMPPD (3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3'-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxethan)
oder fluoreszenzerzeugenden Substraten.
– Biotin
in Kombination
mit Avidin oder Streptavidin und als Anti-DIG-Antikörper markiert
– Dinitrophenyl
(DNP) als Hapten
in Kombination mit zweckmäßigen Antikörpern und als Anti-DIG-Antikörper markiert
– oder jede
beliebige indirekte Markierung.
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Ein
Verfahren der Erfindung kann wie folgt verwendet werden:
- – zur
Untersuchung der Auswirkung neuer Nahrungsmittel (Präbiotika),
Probiotika und funktioneller Nahrungsmittel auf die Darm-Mikroflora
sowohl des Menschen als auch von Tieren;
- – zur
Untersuchung der Auswirkung von Antibiotika auf die Darm-Mikroflora sowohl
des Menschen als auch von Tieren;
- – zur Überwachung
der Entwicklung von gemischten mikrobiellen Populationen, die an
industriellen Fermentationsverfahren beteiligt sind (Käse und andere
(Molkerei-)Fermentationsprodukte, Bier, Wein etc.);
- – zum
schnellen Nachweis einer mikrobiellen Verunreinigung in Produkten
oder Produktionswerkzeugen vom Ausgangsstoff bis zum Endprodukt
(Hygienekontrolle);
- – zur
Identifizierung und Quantifizierung des Vorhandenseins und der Aktivität von Mikroorganismen
in Abwasserbehandlungssystemen;
- – zur
Identifizierung und Quantifizierung des Vorhandenseins und der Aktivität von Mikroorganismen
in Verfahren zur biologischen Sanierung;
- – zur
Identifizierung und Quantifizierung des Vorhandenseins und der Aktivität von Mikroorganismen
in marinen Systemen;
- – zur
Bestimmung des mikrobiellen Zustands von (verunreinigten) Böden, Wässern, Gasen
etc.;
- – zur
Bestimmung des Zustands von Trinkwasser, Schwimmbadwasser und Oberflächenwasser
in Bezug auf pathogene Bakterien und die Gesundheit des Menschen;
- – zur
Untersuchung der Auswirkung von registrierten und neuen Medikamenten
auf die Darm-Mikroflora sowohl des Menschen als auch von Tieren;
- – zur
Durchführung
einer Diagnose/schnellen Bestimmung von pathogenen Infektionen des
Menschen und von Tieren einschließlich Nutzvieh;
- – zum
Nachweis einer Bakterienresistenz gegenüber Antibiotika;
- – zur
Untersuchung der Auswirkung von homöopathischen Präparaten
und Reformhausprodukten auf die Darm-Mikroflora sowohl des Menschen
als auch von Tieren;
- – zum
Nachweis spezifischer, Zahnzersetzung generierender, oraler Streptococcen
für die
Zahnpasta-Industrie;
- – zum
Nachweis von Pathogenen und Konsortien von Mikroorganismen, die
für die
Entwicklung, Ausbeute oder Qualität während der Herstellung, Ernte,
Lagerung und des Transports (von Erntegut) entweder nachteilig oder
vorteilhaft sind.
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Die
Erfindung wird durch die folgende, ausführliche Beschreibung weiter
veranschaulicht.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Entwicklung
des Satzes von Darmflora-Clustersonden
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Um
die Populationszusammensetzung von komplexen, gemischten Bakterienpopulationen
zu ermitteln, werden routinemäßig aerobe
und anaerobe Kultivierungstechniken auf verfestigten Medien eingesetzt. Anschließend werden
standardmäßige Identifizierungsprotokolle
oder kommerziell erhältliche
Testsysteme zur Identifizierung der isolierten Stämme verwendet.
Obwohl es relativ leicht ist, eine brauchbare Gesamtzählung zu
erhalten, ist die Zählung
von einzelnen, identifizierbaren Bakterienspezies mühsam und
zeitaufwändig. Brauchbare
Zählungen
der verschiedenen aeroben und fakultativ anaeroben Spezies können durch
die Verwendung von selektiven Medien erhalten werden. Solche Medien
sind für
die meisten streng anaeroben Spezies der Darmflora aber nicht verfügbar. Weil
etwa 30–40
Spezies 99% der humanen Darmflora ausmachen, müssen mehrere hundert Isolate
aus jeder einzelnen Probe identifiziert werden, um zuverlässige Populationsstatistiken
zu erhalten. Weiterhin ist eine Fermentations-Endproduktanalyse
in isolierten, reinen Kulturen oft für eine zuverlässige Identifizierung
von wesentlicher Bedeutung. Folglich sind Untersuchungen der Populationsdynamik
der Darmflora oft hinsichtlich der Anzahl der Patienten oder der
Anzahl der untersuchten Spezies begrenzt, und folglich sind die
beobachteten Änderungen
der Zusammensetzung oft nicht statistisch signifikant. Der in jüngster Zeit
erfolgte Anstieg der Produktion von Designer Food (funktionelle
Nahrungsmittel, Prä- und
Probiotika) hat zu einem Bedarf an Werkzeugen zur Untersuchung der
Auswirkung dieser Produkte auf die Darm-Mikroflora des Menschen
geführt.
Wir haben ein solches Werkzeug entwickelt, indem wir mehrere innovative
mikrobiologische Techniken wie die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung und
die Bildzytometrie kombiniert haben.
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Insbesondere
haben wir auf 16S rRNA abzielende Oligonucleotid-Sonden zur Auszählung verschiedener
phylogenetischer Gruppen von Darmbakterien entwickelt. Diese Sonden
werden bei Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsuntersuchungen der
Populationsdynamik eingesetzt. Wir haben diese Sonden entwickelt, nachdem
wir das Vorhandensein von 15 größeren phylogenetischen
Subpopulationen innerhalb der Darm-Mikroflora demonstriert haben
(1).
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Bildanalyse
und FISH
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Eine
Whole-Cell-in-situ-Hybridisierung mit auf 16S rRNA abzielenden,
fluoreszenzmarkierten, synthetischen Oligonucleotiden erleichtert
eine schnelle Bestimmung der taxonomischen Position einzelner, sogar nicht kultivierbarer
Zellen und ermöglicht
mittels einer automatisierten mikroskopischen Bildanalyse eine genaue
Beschreibung von Bakterienpopulationen auf quantitativer Basis.
Durch die Kombination dieser beiden Techniken ist es möglich, die
Fluoreszenz spezifischer Zelltypen quantitativ zu messen. Die Verwendung
der Bildanalyse ermöglicht
die Quantifizierung sogar sehr kleiner Fluoreszenzsignale und gewährleistet
objektive (forscherunabhängige)
Auswertungs-Hybridisierungsergebnisse.
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Eine
automatisierte Erkennung und Auszählung von hybridisierten Zellen
wird durch die Verwendung der in unserer Abteilung entwickelten
Bildanalyse-Software
(Meijer et al., 1991; Wilkinson, 1994; Wilkinson et al., 1993, 1994)
erleichtert.
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Bei
einer umfangreichen Untersuchung, bei der Kultivierungsverfahren
zur Auszählung
verwendet wurden, sind etwa 200 Bakterienspezies aus humanen Kotproben
isoliert worden (Finegold et al., 1974). Etwa 30 von diesen sind
zahlenmäßig wichtig
und stellen 10 getrennte Gattungen dar. Gattungsspezifische Sonden könnten sich
daher im Großen
bei der Beschreibung von Gemeinschaftsstrukturen als zweckmäßig erweisen. Es
ist bekannt, dass das natürliche
Klassifizierungssystem für
Bakterien auf der Grundlage von phänetischen Merkmalen mit Verfahren
auf der Grundlage der Genetik nicht vollständig übereinstimmt; nicht alle taxonomen Gattungen
sind auf der Grundlage ihrer 16S-rRNA-Sequenz monophyletisch, wobei
beispielsweise Eubacterium spp. mit mehreren Clostridium und Peptostreptococcus
spp. einen Cluster bilden und Peptostreptococcen selbst über verschiedene
getrennte phylogenetische Cluster verteilt sind (1),
wobei aber innerhalb dieser phylogenetischen Cluster konservierte
Regionen identifiziert werden können
und für
solche Regionen entworfene 165-rRNA-Sonden zur Identifizierung der überwiegenden
Anzahl der Population bis zu einem wohldefinierten taxonomen Grad
verwendet werden können.
Somit ist nur eine beschränkte
Anzahl von Sonden zur Auszählung
der verschiedenen phylogenetischen Gruppen der Darmflora erforderlich
(1).
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Obwohl
viele Ribosomkopien ein ausreichendes Signal gewährleisten sollten, weicht die
Realität
oft weit vom Ideal ab. Die Zugänglichkeit
der Zielregion und die Art der an die Sonde gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe,
die Hybridisierungstemperatur, der metabolische Zustand der Zellen
und der Grad der Eigenfluoreszenz der Nicht-Zielzellen sind wichtige
Faktoren beim Erhalt eines ausreichenden spezifischen Fluoreszenzsignals.
Oft ist bei kleinen und langsam wachsenden Zellen mit wenig rRNA
eine optische Unterstützung
in Form von CCD-Kameras erforderlich. Eine Bildanalyse kann zur
Unterscheidung zwischen einer nicht nachlassenden Eigenfluoreszenz
und einer schnell nachlassenden Fluoreszenz eines Fluoreszenzfarbstoffs
sehr hilfreich sein. Unter Verwendung solcher Lebenszeit-Bilderzeugungstechniken
können
auf dem mikroskopischen Gebiet nur einige wenige positiv hybridisierte
Zellen von mehreren tausend Nicht-Zielzellen unterschieden werden (Manuskript
in Vorbereitung). Dies ist notwendig, um diejenigen Bakteriencluster,
die eine Minderheit der Population bilden (z.B. Streptococci), auszuzählen.
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MATERIALIEN
UND VERFAHREN
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Haltung von
Kulturen
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Bakterienkulturen
wurden in anoxischem Hackfleisch-Kohlenhydrat-Medium (CMC) (Holdeman
et al., 1977) bei Raumtemperatur mit zweimonatlichen Übertragungen
und in anoxischer entrahmter Milch bei –20°C gehalten. Vor der Hybridisierung
wurden frische Kulturen in anoxischem Pepton/Hefeextrakt/Glucose-Medium (PYG)
(Holdeman et al., 1977) bei 37°C
gezogen.
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Entwicklunq von Sonden
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Die
16S-rRNA-Sequenzen von 113 Spezies von Fäkalbakterien wurde aus der
RDP-Datenbankversion vom 18. Juni 1994 (Larsen et al., 1993) erhalten.
Zusammen stellen diese Spezies die meisten Bakterien dar, von denen
bekannt ist, dass sie in humanen Fäkalien vorkommen (Drasar und
Barrow, 1985). Eine Kimura-2-Parameter-Distanzanalyse der ausgerichteten
Sequenzen dieser Bakterien wurde mittels des Programms Molecular
Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) von Kumar et al. (1993), Version
1.02, durchgeführt.
Der erhaltene Distanzbaum (Nachbarverbindung) der verschiedenen
Spezies in phylogenetischen Clustern wurde mit der phylogenetischen
Gruppierung der RDP-Datenbank (Larsen et al., 1993) verglichen.
Es wurden keine signifikanten Clusterunterschiede gefunden. Somit
wurden 15 Cluster identifiziert (1). Es wurden
einzigartige Sequenzen für
jeden der separaten Cluster identifiziert, und es wurde ein Schätzwert der
Anzahl von Zellen in einer mittleren Fäkalprobe, die mit einer Sonde
für diesen
Cluster hybridisieren würde,
erhalten. Die Sondenspezifität
wurde als brauchbar betrachtet, wenn der positiv hybridisierende
Teil der Population zwischen 1% und 25% betrug. In demjenigen Fall,
in dem erwartet wurde, dass eine einzige Spezies einen Hauptteil
der gesamten Darmflora-Population ausmachte, wurde eine speziesspezifische
Sonde für
diese Spezies entwickelt.
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Tests der
Sondenspezifität
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Die
Spezifität
der Sonden wurde mittels des Befehls "Check Probe" (Larsen et al., 1993) gegen die komplette
RDP-Datenbank getestet und als ausreichend betrachtet, wenn mindestens
zwei fehlende Übereinstimmungen
zwischen Bakterien von allen phylogenetischen Clustern von Fäkalbakterien
bestätigt
wurden. Weiterhin wurde eine Bezugssammlung von 86 Bakterien (Tabelle
1), die eine Untergruppe der 113 im Zielidentifizierungsverfahren
eingeschlossenen Spezies (1) darstellte,
kultiviert, und es wurden Whole-Cell-in-situ-Hybridisierungen mit diesen 86 Spezies
durchgeführt.
Dazu wurden exponentiell wachsende Zellen mit 3% (Vol./Vol.) Formaldehyd
fixiert. Nach einer 10-minütigen Aufbewahrung
bei 4°C
wurden 10 μl
einer Suspension von fixierten Zellen auf einen Objektträger aufgetragen,
der zur Gewährleistung
einer richtigen Haftung der Zellen mit VectabondTM (Vector
Laboratories, Burlingame, CA) vorbehandelt war. Nach einem 20-minütigen Trocknen
bei 45°C
wurden die getrockneten Zellausstriche in einer abgestuften Ethanolreihe (50%,
75% und 98% Ethanol, Vol./Vol., 2 min) dehydratisiert. 12 μl eines durch
eine Porengröße von 0,2 μm filtrierten
Hybridisierungspuffers wurden zu den Zellausstrichen gegeben. Der
Hybridisierungspuffer bestand aus 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert
7,5) und 0,1% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat. Nach der Zugabe von
8 ng·μl–1 einer
mit FITC markierten Sonde wurden die Ausstriche mit einem Deckglas
bedeckt. Die Träger wurden
in einer mit Puffer gesättigten
Hybridisierungskammer 15–20
h lang bei 45°C
hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Träger 15 min
lang bei 45°C
in 50 ml Hybridisierungspuffer gewaschen, an der Luft getrocknet,
und die Zellausstriche wurden in einer Einbettungsflüssigkeit
eingebettet, die aus einer 1:1-Mischung aus Glycerin und PBS (8
g·l–1 NaCl,
0,2 g·l–1 KCl,
1,44 g·l–1 Na2HPO4, 0,24 g·l–1 KH2PO4) bestand, die um
2,5% (Gew./Vol.) NaI ergänzt
war.
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Die
Träger
wurden mittels eines OrthoplanTM Auflichtfluoreszenzmikroskops
(Leitz, Deutschland), das mit einer Quecksilber-Bogenlampe (HBO
100W, Osram, Deutschland), einem 50x-PL-Fluotar-Objektiv (Leitz), einem
I2/3-(blaue Anregung)
Filterblock und einer gekühlten
CCD-Videokamera (Loral, Fairchield CCD 5000/L, Sunnyvale, CA) ausgestattet
war, untersucht. Ein Belichtungsverlängerungssystem für diese
Kamera wurde zuvor beschrieben (Wilkinson et al., 1993). Bei der
eingesetzten Bildanalyse-Software handelte es sich um das System "Groningen Reduction
of Image Data" (GRID)
(Meijer et al., 1991; Wilkinson et al., 1994). Die Fluoreszenzmessungen
wurden unter Verwendung des zuvor beschriebenen Immunofluoreszenz-Pakets (Jansen
et al., 1993) durchgeführt.
Oberflächen-Fluoreszenzsignale
wurden unter Verwendung einer nicht ausbleichenden Uranylglas-Bezugssubstanz
(16) kalibriert. Es wurden ein Phasenkontrast- und ein Fluoreszenzbild
eines jeden Gesichtsfeldes erhalten. Die Form eines jeden Bakteriums
wurde aus dem Phasenkontrastbild automatisch bestimmt. Die Fluoreszenz
eines jeden Objekts wurde aus der entsprechenden Fläche im Fluoreszenzbild
bestimmt. Dieses Verfahren ermöglicht
einen Ausschluss von Nichtfluoreszenz-Objekten. Die Fluoreszenzbilder
wurden mit einer Kamera-Belichtungszeit von 12 s aufgezeichnet.
Pro Objektträger
wurden 250–500
Objekte ausgemessen. Für
jeden Träger
wurde die Negativkontrolle (Eigenfluoreszenz) bestimmt, und das
95. Perzentil ihrer Fluoreszenzverteilung dient als Ansprechwert.
Der Prozentwert der positiv hybridisierten Objekte mit einer Fluoreszenz
oberhalb des Ansprechwerts, bezogen auf die Gesamtzahl von Objekten,
die unter einer Phasenkontrast-Beleuchtung nachgewiesen wurden,
wurde als Hybridisierungs-Prozentwert bezeichnet. Dieser Prozentwert
wurde bestimmt, um die Leistungsfähigkeit der Sonden zu bestimmen, und
erfolgte an reinen Kulturen.
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Whole-Cell-in-situ-Hybridisierung
und Auszählung
von phylogenetischen Clustern in Fäkalproben
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Zur
Quantifizierung von phylogenetischen Clustern und der Gesamtanaerobier
in Fäkalien
wurden Stuhlproben von gesunden humanen Probanden gesammelt und
wie folgt verarbeitet. 1 g einer frisch defäkierten und homogenisierten
Fäkalie
wurden in 9 ml eines an einer Porengröße von 0,2 μm filtrierten PBS suspendiert.
Diese Suspension wurde 10 × in
filtriertem PBS verdünnt
und gründlich
gemischt. Nach der Entfernung von Bruchstücken (350 × g, 1 min) wurde der Überstand
isoliert und über
Nacht bei 4°C
mit 4% (Gew./Vol.) frischer Paraformaldehyd-Lösung fixiert. Zellen von 1
ml der fixierten Zellsuspension wurden zweimal (8000 g, 5 min) in
1 ml filtriertem PBS gewaschen und in 1 ml einer Mischung aus PBS
und Ethanol (1:1) resuspendiert. Nach einer einstündigen Aufbewahrung
bei –20°C wurden
5 μl der
Zellsuspension zu 50 μl
vorgewärmtem (50°C) Hybridisierungspuffer
gegeben, und 5 μl
einer mit FITC markierten Sonde wurden zugegeben. Zellen wurden
16 h lang bei 50°C
hybridisiert. Nach einer Resuspension in 10 ml Hybridisierungspuffer
wurden Zellen an einem IsoporeTM-Polycarbonat-Membranfilter mit
einer Porengröße von 0,2 μm (Millipore
Corporation, USA) filtriert und zweimal mit 10 ml warmem (50°C) Hybridisierungspuffer
gewaschen. Filter wurden mit VectashieldTM auf
Objektträgern
angebracht, und hybridisierte Zellen wurden mit einem Olympus-BH2-Mikroskop
mit einem DPlanApo1000VPL-Objektiv (100 x, N.A., 1,30), einer Hochdruck-Quecksilberdampflampe
HBO100 und einem IB-Blaulicht-Anregungsblock mit einem zusätzlichen
EY455-Anregungsfilter visuell gezählt. Die Gesamtzahl der in
Fäkalien
vorhandenen Bakterien wurde mittels des Verfahrens von Porter und Feig
(1980) bestimmt, wobei 0,5 μg·ml–1 (Gew./Vol.)
4',6-Diamidino-2-phenylindol
(DAPI) als DNA-Färbung
bei einer Beleuchtung mit einem UV-Anregungsfilterblock verwendet wurden.
Alle Mikroskopiezählungen
wurden doppelt durchgeführt,
wobei mindestens 300 Zellen pro Assay gezählt wurden.
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Spezial-Vorbehandlungsverfahren
zur In-situ-Hybridisierung von Lactobacillus Spp.
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Die
meisten Bakterien weisen hohe Fluoreszenzgrade auf, wenn sie mit
Fluoreszenzsonden hybridisiert sind (Langendijk et al., im Druck).
Mitglieder der Gattung Lactobacillus sind aber schwierig zu hybridisieren.
Reine Kulturen dieser Gattung weisen einen sehr niedrigen Fluoreszenzgrad
auf, und gewöhnlich
wiesen weniger als 50% der Zellen eine Fluoreszenz oberhalb der
Hintergrundwerte auf (Langendijk et al., im Druck). Solche Ergebnisse
sind auch für
grampositive Coccen wie Lactococci, Streptococci und Enterococci
berichtet worden (Beimfohr et al., 1993, Salama et al., 1991). Dass
die schlechte Permeabilität
dieser Zellen nicht nur auf ihre grampositive Beschaffenheit zurückzuführen ist,
wird durch die Tatsache demonstriert, dass sowohl Clostridia als
auch Bifidobacteria bei der Anwendung von standardmäßigen Hybridisierungstechniken
mit 16S-Sonden hohe Fluoreszenzsignale aufweisen (Langendijk et
al., im Druck).
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Wir
haben ein Protokoll zur Whole-cell-in-situ-Hybridisierung von Lactobacilli
entwickelt. Bei diesem Protokoll geht standardmäßigen Whole-Cell-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-(FISH-)Protokollen
eine Lysozym/Lipase-Behandlung
wie folgt vorher.
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Bestimmung der Spezifität der Laborsonde:
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1-ml-Zellen
von Kulturen mitten in der logarithmischen Wachstumsphase von 10
Lactobacillus-Stämmen
und insgesamt 26 Bezugsstämmen
(siehe Tabelle 2 und 3) wurden in PBS gewaschen und in 1 ml Prälyse-Puffer
resuspendiert.
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Das
PBS bestand aus 8 g·l–1 NaCl,
0,2 g·l–1 KCl,
1,44 g·l–1 Na2HPO4 und 0,24 g·l–1 KH2PO4. Der Prälyse-Puffer
bestand aus 50 mM Tris (pH-Wert 7,5), 10 mM EDTA, 0,585 M Saccharose,
5 mM CaCl2, 0,3 mg·ml–1 Natriumtaurocholat,
5 mg·ml–1 Lysozym
und 0,031 mg·ml–1 Bauchspeicheldrüsenlipase.
Zellen wurden 1 h lang bei 37°C
inkubiert, in PBS gewaschen und 1 h lang in Ethanol-PBS (1:1) fixiert.
10 μl dieser
Suspension wurden auf einem Objektträger getrocknet und in der Wärme fixiert.
Die Zellausstriche wurden in einer graduierten Ethanolreihe (70%
und 96%, jeweils 3 min) dehydratisiert. 10 ml Hybridisierungspuffer
und 1 μl
einer mit FITC markierten Sonde (50 μl–1)
wurden zu den Ausstrichen gegeben. Der Hybridisierungspuffer bestand
aus 0,9 M NaCl 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) und 0,1% (Gew./Vol.)
Natriumdodecylsulfat. Die Ausstriche wurden mit einem Objektträger abgedeckt,
und die Träger
wurden 16 h lang bei 50°C
in einer mit Puffer gesättigten
Hybridisierungskammer inkubiert. Anschließend wurden die Ausstriche
30 min lang bei 50°C
in 50 ml Hybridisierungspuffer gewaschen, an der Luft getrocknet
und an Vectrashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) angebracht.
Diese Behandlung führte
zu Hybridisierungs-Prozentwerten
von über
90%.
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Tabelle
2 Für Spezifitätstests
der Laborsonden verwendete Refererenzstämme
-
Tabelle
3 Für Spezifitätstests
der Laborsonden verwendete Lactobacillus-Stämme
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Whole-Cell-in-situ-Hybridisierung
und Auszählung
von Lactobacilli in Fäkalproben
-
Zur
Auszählung
von Lactobacilli in Fäkalproben
wurde dasselbe Protokoll befolgt, das unter "Whole-Cell-in-situ-Hybridisierung und
Auszählung
von phylogenetischen Clustern in Fäkalproben" beschrieben ist, außer, dass vor der Verdünnung der
mit Paraformaldehyd fixierten und gewaschenen Zellsuspensionen in 50%igem
Ethanol Zellen im Prälyse-Puffer
resuspendiert und 1 h lang bei 37°C
inkubiert wurden. Zellen wurden zweimal (8000 × g, 5 min) in 1 ml filtriertem
PBS gewaschen und in 1 ml einer Mischung aus PBS und Ethanol (1:1)
resuspendiert und wie oben beschrieben in Lösung hybridisiert.
-
ERGEBNISSE
-
Bei
der phylogenetischen Analyse waren die vorherrschenden Bakterienspezies
der humanen Darmflora über
15 getrennte Cluster verteilt. Einige dieser Cluster bestanden aus
monophyletischen Gattungen wie Bifidobacterium und Fusobacterium.
Andere bestanden aus einer Mischung aus Eubacterium, Clostridium
und Peptostreptococcus spp., wie im Fall der Clostridiumcoccoides-Gruppe
(Larsen et al., 1993). Einzigartige Sequenzen für jeden dieser getrennten Cluster
wurden identifiziert, und der Prozentwert der Gesamtpopulation, den
die Sonde hybridisieren würde,
wurde bestimmt. In demjenigen Fall, in dem erwartet wurde, dass
eine bestimmte Spezies einen Hauptteil der Population bildet, wie
Peptostreptococcus anaerobius, oder wenn eine Spezies nicht in eine
Clustersonde eingeschlossen werden konnte, wie Bacterioides distasonis,
wurden speziespezifische Sonden entwickelt.
-
Die
folgenden Sonden wurden entwickelt:
- 1. Die
Sonde His5 der Untergruppe Clostridium hystolyticum (TTATGCGGTATTAATCT(TC)CCTT),
Td = 56,5 – 58,4°C, wies eine
vollständige Übereinstimmung
mit Clostridium putrificum, C. butyricum, C. barati, C. carnis,
C. botulinum, C. novyi, C. sporogenes, C. putrificum, C. tyrobytyricum,
C. scatologenes, C. scatologenes, C. proteolyticum, C. limosum,
C. Sardiniensis, C. perfringens, C. beijerinckii, C. acebutylicum, C.
puniceum, C. cellulovorans, C. paraputrificum, C. thermobutyricum,
C. thermopalmarium, C. subterminale, C. argentinense, C. estertheticum,
C. pasteurianum, C. histolyticum, Eubacterium budayi, E. delafieldii,
E. moniliforme, E. multiforme, E. nitritogenes, E. tarantellus und
Flexibacter canadensis auf.
- 2. Die Sonde Lit135 der Untergruppe Clostridium lituseburense
(GTTATCCGTGTGTACAGGG), Td = 59,2°C,
wies eine vollständige Übereinstimmung
mit Eubacterium tenue, Clostridium difficile, C. bifermentans, C.
sordellii, C. ghoni, C. lituseburense und C. mangenotti auf.
- 3. Die Peptostreptococcus-Sonde Pep197 (TCTTACACCGATAAACTTTG),
Td = 55,4°C
wies eine vollständige Übereinstimmung
mit Peptostreptococcus micros, P. tetradius, P, vaginalis und dem
Morphotyen Epilopiscium Al auf.
- 4. Die Peptostreptococcus-Sonde Ana134 (ATGTTATCCATGTGTATAGGGC),
Td = 60,2°C,
wies eine vollständige Übereinstimmung
mit Peptostreptococcus anaerobius und Peptostreptococcus sp. C.
auf.
- 5. Die Sonde Fus390 der Gattung Fusobacterium (CACACAGAATTGCTGGATC)
, Td = 60,2°C,
wies eine vollständige Übereinstimmung
mit Fusobacterium simiae, F. nucleatum, F. alocis, F. russii, F.
gonidoformans, F. necrophorum, F, varium, F, mortiferum, F. perfoetens,
Propionigenium modestum, Leptotrichia buccalis und Sebalcella termitidis
auf. Die Sonde kann auch an F, ulcerans, F. periodonticum und F.
necrogenes hybridisieren, weil diese Bakterien eine unbekannte Base
in der Zielregion haben.
- 6. Die Sonde Lab158 der Lactobacillus-Untergruppe (GGTATTAGCA(TC)CTGTTTCCA),
Td = 56,1 – 58,2°C, wies eine
vollständige Übereinstimmung
mit Lactobacillus acidophilus, L. acidophilus subsp. johnsonii,
L. delbrueckii subsp. lactis, L, delbrueckii subsp. delbrueckii,
L. brevis, L. salivarius subsp. salicinius, L, amylovorus, L. acetotolerans,
L. oris, L. hilgardii, L. kefir, L, mali, L. animalis, L, murinus,
L. ruminis, L. agilis, L, sharpeae, L. gasseri, L, amylophilus,
L. reuteri, L. fermentum, L. sake, L. sanfrancisco, L. fructivorans,
L. plantarum L. bifernentans, L. coryniformis, L, casei subsp. casei,
L. casei subsp. rhamosus, Leuconostoc lactis, Lc. mesenteroides
subsp. mesenteroides, Lc. mesenteroides subsp, cremoris, Lc. oenos, Enterococcus
faecalis, E, columbae, Periococcus pentosaceus, P. acidilactici,
Streptococcus cecorum, Vagococcus fluvialis, V. salmoninarium, Weissella
confusa und W. kandleri auf.
- 7. Die Streptococcus/Lactococcus-Sonde Str493 (GTTAGCCGTCCCTTTCTGG),
Td = 61,3 °C,
wies eine vollständige Übereinstimmung
mit Streptococcus sanguis, S. salivarius, S. bovis, S. pneumoniae,
S. parasanguis, S. acidominimus, S. dysgalactiae, S. anginosus,
S. vestibulariis, S. eguinus, S. alactolytiens, S. downei, S. sobrinus,
S. rattus, S. cricetus, S. hyointestinalis, S. agalactiae, S. suis,
S. porcinus, S. canis, S. pyogenes, Lactococcus lactis subsp. lactis,
L. lactis subsp. cremoris, L. piscium, L. raffinolactis, L. plantarium,
L. garvieae auf. Die Sonde kann auch zum Nachweis von Streptococcus
ora-lis, S. intermedius,
S. macacae, s. mutans, S. anginosus, S. criae und S. equi verwendet
werden, weil diese Bakterien ein oder mehrere unbekannte Basen in
der Zielregion enthalten.
- 8. Die Sonde Fra602 der Bacteroides vulgatus-Gesellschaft (GAGCCGCAAACTTTCACAA),
Td = 57,0°C, weist
eine vollständige Übereinstimmung
mit Bacteroides eggertii, B. thetaiotaomicron, B. ovatus, B. fragilis,
B. uniformis und B. vulgatus auf.
- 9. Die Bacteroides-distasonis-Spezies Dis657 (CCGCCTGCCTCAAACATA),
Td = 58,0°C,
weist eine vollständige Übereinstimmung
mit Bacteroides distasonis auf.
- 10. Die Sonde Cyl387 für
Verwandte der Gruppe II von Mycoplasmen mit Zellwandung (CGCGGCATTGCTCGTTCA)
, Td = 60,2°C,
weist eine vollständige Übereinstimmung
mit Eubacterium cylindroides, E. tortuosum, E. dolichum, E. biforme,
Clostridium innocuum und Streptococcus pleomorphus auf.
- 11. Die Sonde Ato292 der Atopobium-Untergruppe (GGTCGGTCTCTCAACCC),
Td = 59,0°C,
weist eine vollständige Übereinstimmung
mit Atopobium minutum, A. parvulum, A. rimae, Eubacterium lentum
und möglicherweise
E. fosser (eine unbekannte Base in der Zielregion) auf.
- 12. Die Sonde Rec484 für
die Clostridium-coccoides-Gruppe (GCTTCTTAGTCA(AG)GTACCG), Td = 59,2°C, weist
eine vollständige Übereinstimmung
mit Eubacterium contortum, E. formicigenerans, E. rectale, E. ventriosum,
E. cellulosolvens, E. eligens, E. fissicatena, E. hadrum, E. halii,
E. saburreum, E. uniforme, E. ventriosum, E. xylanophilum, Clostridium
aminovalericum, C. clostridiiforme, C. nexile, C. oroticum, C. lentocellum,
C. symbiosum, C. aminophilumn, C. xylanolyticum, C. sphenoides,
C. celarecrescens, Ruminococcus hansenii, Epulopiscium sp.str.,
Morphotypen A2 und B, Acetitomaculum ruminis, Lachnospira pectinoschiza,
L. multiparus, Roseburia cecicola und möglicherweise auch mit Clostridium
coccoides (unbekannte Base) auf.
- 13. Die Ruminiococcus-Sonde Rum186 (TTCACACCAGACCATGCG) , Td
= 58,0°C,
weist eine vollständige Übereinstimmung
mit Ruminococcus products und Ruminococcus hansenii auf.
- 14. Die Sonde Lep der Clostridium-leptum-Untergruppe weist eine
vollständige Übereinstimmung
mit Eubacterium siraeum, E. plautii, E. desmolans, Clostridium sporosphaeroides,
C. leptum und C. cellulosi auf.
- 15. Die Sonde Bif164 der Gattung Bifidobacterium (CATCCGGCATTACCACCC)
, Td = 60,2°C,
weist eine vollständige Übereinstimmung
mit Bifidobacterium longum, B. pseudolongum, B. suis, B. infantis,
B. indicum, B. breve, B. adolescents, B. catenulatum, B. minimum
und möglicherweise
auch mit B. bifidum, B. dentium, B. coryneforme, B. asteroides,
B. globosum, B. magnum und Gardnerella vaginalis auf, weil diese Bakterien
eine oder mehrere unbekannte Basen in der Zielregion haben.
-
Diese
15 Cluster wurden gemäß der Angaben
in 1 ausgewählt.
Schmelztemperaturen (Td) sind theoretische Werte. Eine Hybridisierung
erfolgt gewöhnlich
bei Temperaturen von etwa 1–5°C unter diesen Werten.
-
Sequenzen
sind 5'–3'.
-
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