DE69636118T2

DE69636118T2 - Verfahren und mittel für die bestimmung der relativen heufigkeit von mikroorganismen in gemischten populationen

Info

Publication number: DE69636118T2
Application number: DE69636118T
Authority: DE
Inventors: Wietze Gjalt WELLING; Frederik Schut; Simone Petra LANGENDIJK; Johan Gijsbert JANSEN; Hendrik Michael WILKINSON; Peter Elffrich
Original assignee: Rijksuniversiteit Groningen; Microscreen BV
Current assignee: Rijksuniversiteit Groningen Groningen Nl; Nutricia NV
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1996-07-29
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2016-07-30
Also published as: US6107033A; WO1997005282A2; DE69636118D1; EP0842298B1; JP2000504922A; WO1997005282A3; AU6631696A; EP0842298A2

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Materialien zur Bestimmung der relativen Häufigkeit von einzelnen Mikroorganismen in gemischten Populationen von Mikroorganismen, insbesondere Verfahren zur Bestimmung der relativen Häufigkeit einzelner Mikroorganismus-Spezies in der angeborenen Darmflora, insbesondere von Menschen.
Solche Verfahren haben bis zur vorliegenden Erfindung nicht zur Verfügung gestanden. Bis zur vorliegenden Erfindung war die Bestimmung nur des Vorhandenseins einzelner Spezies von Mikroorganismen in einer gemischten Population von einzelnen Mikroorganismen wie der Darmflora möglich.
Bei herkömmlichen Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung der Darmflora ist eine Kultivierung der Mikroorganismen in der Population auf sowohl selektiven als auch unselektiven Medien erforderlich. Diese Verfahren sind arbeitsaufwändig und zeitaufwändig, wodurch es an sich kaum möglich ist, abgesehen von der Identifizierung der in der gemischten Population vorhandenen Mikroorganismen irgendetwas zu tun. Weiterhin sind diese Verfahren für methodologische und statistische Fehler anfällig. Ein weiteres Hindernis für die Bestimmung der Häufigkeit eines Mikroorganismus gegenüber anderen (relative Häufigkeit) besteht darin, dass die Kultivierung eine Vermehrung der Mikroorganismen einschließt, die sich natürlich nicht alle mit derselben Geschwindigkeit teilen. Daher ist eine Bestimmung der relativen Häufigkeit unter Verwendung dieser Verfahren praktisch nicht möglich, ganz zu schweigen davon, dass die Dynamik einer solchen Population im Laufe der Zeit verfolgt werden könnte.
Die Zusammensetzung und Aktivität der angeborenen Darmflora ist für die Immunologie, Ernährung, Pathogenese des Menschen und somit für die Gesundheit jedes Einzelnen von allergrößter Bedeutung (Van der Waaij et al., 1971). Beispielsweise stellt eine Besiedlungsresistenz oder ein Bakterienantagonismus der angeborenen Darm-Mikroflora eine erste Verteidigungslinie gegen die Ansiedlung von pathogenen Mikroorganismen im Darmtrakt dar (Van der Waaij et al., 1971; 1989).
Der Darmtrakt des Menschen (von Säugetieren) ist nicht die einzige gemischte Population von Mikroorganismen, bei der eine Messung der relativen Häufigkeit einzelner Spezies oder anderer Untergruppen von Mikroorganismen nützlich oder wichtig ist.
In der Industrie, insbesondere im Nahrungsmittelsektor und in der Fermentationsindustrie, ist eine Überwachung des bakterien- oder hefeabhängigen Fermentationsverfahrens zur Gewährleistung der Qualität hinsichtlich der Hygiene und der Produktstabilität von wesentlicher Bedeutung. Aus ökologischen Gründen ist eine Überwachung von komplexen, gemischten Bakterienpopulationen zur Vorhersage der Wirksamkeit der biologischen Sanierung bei der Behandlung von Erdboden, Gasen und Abwässern von elementarer Bedeutung. Umwelt-Mikrobiologen benötigen Werkzeuge, die Potentiale der Nährstoffregenerierung hinsichtlich der Biomasse einzelner metabolischer Bakteriencluster erklären.
Obwohl viel über die Physiologie der meisten einzelnen Bakterienspezies und der metabolischen Aktivitäten von gemischten Bakterienkonsortien als Ganzes bekannt ist, sind Faktoren, die ihre Häufigkeit bestimmen, und diejenigen, die subtile sowie drastische Änderungen der Populationszusammensetzung bewirken, aufgrund der technischen Einschränkungen der klassischen Kultivierungs- und Identifizierungstechniken größtenteils unbekannt. Daher sind schnelle Überwachungstechniken, die die Populationszusammensetzungen von komplexen, gemischten Bakterienkonsortien aufklären, von großer wissenschaftlicher Bedeutung.
Die Erfindung macht somit ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung der relativen Häufigkeit niederer phylogenetischer Gruppen von Mikroorganismen in einer gemischten Population von mehreren Mikroorganismen verfügbar, umfassend die Schritte des:

1) Bereitstellens einer Menge von markierten in-situ-Hybridisierungs-Cluster-Oligonucleotidsonden, wobei die Clustersonde eine Sonde auf dem Gattungsniveau ist;
2) Hybridisierens der Sonden mit einer Probe der gemischten Population; und
3) der quantitativen Analyse der Anzahl an markierten Mikroorganismen.

Eine In-situ-Hybridisierung an sich ist eine wohlbekannte Technik, wie aus EP-A-0 497 464 zu entnehmen ist, das In-situ-Hybridisierungstechniken unter Verwendung von festen, permeabilisierten, aber nicht eingebetteten Zellen betrifft. Das Verfahren wird zur Bestimmung des Vorhandenseins von einzelnen Mikroorganismen verwendet. Bisher ist eine In-situ-Hybridisierung jedoch nicht zur Bestimmung der relativen Häufigkeit von niederen phylogenetischen Unterklassen, geschweige denn zur Verfolgung der Dynamik einer gemischten Population von Mikroorganismen angewandt worden. Markierte Proben sind bei der In-situ-Hybridisierung ein wesentlicher Teil. Die vorliegende Erfindung macht einen Satz von Clustersonden verfügbar, die auf eine unerwartete, neue Weise, d.h. nicht auf den normalen taxonomischen Prinzipien bestehend, ausgewählt worden sind. Ein Satz von Clustersonden für die Zwecke dieser Erfindung ist als Satz von Oligonucleotiden definiert, die dazu fähig sind, Mikroorganismen wie eine Spezies, eine Gattung oder eine andere niedere phylogenetische Untergruppe aus einem Cluster zu identifizieren. Vorzugsweise basieren diese Sonden alle auf einer vergleichbaren Ziel-Nucleinsäure der verschiedenen Mikroorganismen in der gemischten Population, in diesem Fall beispielsweise der 16S rRNA.
Clustersonden haben in der Wasser- und der Boden-Mikrobiologie die meiste Aufmerksamkeit erregt. Die Einschränkungen aus der Verwendung von kulturabhängigen Methoden zur Untersuchung der Diversität und Ökologie von natürlichen Mikrobengemeinschaften auf diesen Gebieten sind wohlbekannt, weil die meisten (> 99%) der in diesen Habitaten vorhandenen Bakterien nicht kultivierbar und von einer unbekannten taxonomischen Identität sind. Als Folge ist die Verwendung von direkteren molekularen Charakterisierungen auf diesem Gebiet üblicher geworden. Eine kürzlich erschienene Übersicht (Amann et al., 1995) fasst viele der bisher auf der unteren Gruppenebene/Gattungsebene entwickelten Sonden zusammen. Diese Sonden finden ihre Anwendung ausnahmslos in den ökologischen Gebieten der Abwasser- und der Sediment-Mikrobiologie. Sonden der höheren Gruppenniveaus (wie Sonden der Unterklasse der Proteobakterien) und Sonden auf Domänenebene (die zur Unterscheidung zwischen Archaea, Bakterien und Eukaria verwendet werden) weisen einen eingeschränkten beschreibenden Wert auf, weil sie zu viele verschiedene evolutionäre Abstammungslinien "abdecken". Die Anwendung von Sonden auf der Ebene von Spezies auf die Analyse der Gemeinschaftsstruktur komplexer, gemischter Bakterienansammlungen macht das Verfahren wahrscheinlich genauso zeitaufwändig wie traditionelle Kultivierungstechniken.
Daher sind diese Typen von Clustersonden für die vorliegende Erfindung nicht geeignet. Auf dem Gebiet der regelmäßigen Verwendung von Clustersonden hat niemand die Verwendung niederer phylogenetischer Clustersonden in Betracht gezogen, ganz zu schweigen davon, dass irgendjemand solche Sonden auf dem Gebiet der Bestimmung der relativen Häufigkeit von Mikroorganismen in der Darmflora des Menschen angewandt hätte.
Diese 16S-rRNA-Sonden sind eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Mit steigender Häufigkeit werden auf 16S-rRNA abzielende Hybridisierungssonden in Kombination mit der PCR-Amplifizierung von Ziel-DNA zum Nachweis von spezifischen Bakterientaxa in gemischten Bakterienpopulationen eingesetzt. Gegenwärtig kann durch die Anwendung von PCR-Techniken das qualitative Vorhandensein einer einzigen Zelle vor einem Hintergrund von 10⁹ Nicht-Zielzellen bestätigt werden. Die Technik als solche ist extrem empfindlich. Die Technik ergibt jedoch nur eine geringe oder gar keine quantitative Information über absolute Zellzahlen. Eine In-situ-Fluoreszenzhybridisierung mit einem Satz von phylogenetischen Clustersonden ist der PCR hinsichtlich der Auszählung individueller Zellen, die zu einer bestimmten Bakteriengruppe gehören, überlegen. Diese Technik ist zur Analyse von gemischten Populationen auch der DGGE-Technik, bei der die PCR einen integralen Teil bildet, überlegen.
Etwa 100 Bakterienspezies von ± 400 dominieren die kultivierbare (und somit identifizierte) Population. Gegenwärtig sind die 16S-rRNA-Sequenzen der meisten dieser Bakterien bekannt. Es gibt mehr als genug Sequenzdaten zur Konstruktion spezifischer Sonden für herausragende Gruppen von Fäkalbakterien. Wir berichten über die Entwicklung eines Satzes von 15 auf 16S-rRNA abzielenden Oligonucleotid-Sonden, mit denen die vorherrschenden Bakteriengruppen der humanen intestinalen Mikroflora in situ ausgezählt werden können.
Die Sonden werden vorzugsweise mit Fluoreszenzmaterialien markiert. Dies ermöglicht eine mikroskopische Analyse in Kombination mit einer vorzugsweise automatisierten Bildanalyse.
Zum Nachweis der fluoreszierenden Oligonucleotid-Sonden, die auf Objektträgern an Bakterien hybridisiert sind, kann die Photographie angewandt werden. Eine Quantifizierung durch dieses Verfahren wird jedoch durch das Fehlen von objektiven Ansprechwert-Kriterien für die Unterscheidung zwischen hybridisierten und nichthybridisierten Zellen behindert. Daher wird für eine objektive Auswertung der Sondenspezifität ein Bildanalysensystem verwendet, das eine fluorometrische Messung einzelner Zellen ermöglicht. Alle Einzelheiten zur Hardware und Software dieses Systems sind an anderer Stelle veröffentlicht worden (siehe die Literaturstellen 32–34 im Papier "Bifidobacterium" von Langendijk et al., Aug. 1995).
Auch bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der Sonden, die bestimmte Spezies identifizieren, mit einer anderen Markierung als andere, andere Spezies identifizierende Sonden versehen sind. Dadurch wird die Anzahl der zu nehmenden Assays und/oder Proben vermindert.
Die Erfindung macht auch Sonden und Kits zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verfügbar.
Die Kits umfassen üblicherweise auch Sonden und andere Reagenzien zur in situ erfolgenden Hybridisierung sowie andere Reagenzien zur Vorbehandlung von Proben und/oder zur Nachbehandlung von Proben.
Anwendungen der Erfindung
Bei einem solchen Kit können die Sonden mit Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) am 5'-Ende markiert sein. Andere Markierungen können entweder am 3'- oder am 5'-Ende dieser Sonden, an beiden Enden oder intern gebunden sein.
Unter diesen Markierungen können sich die folgenden befinden:

1) direktfluoreszierende Markierungen: – FLUOS (5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester) – TRITC (Tetramethylrhodanin-5-isothiocyanat) – AMCA (7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure) – Texas-Rot – Indocarbocyanin-Farbstoffe wie CY3, CY5 oder CY7 – jede beliebige andere fluoreszierende Markierung.
2) indirekte Markierungen: – Enzyme wie alkalische Phosphatase (AP) oder Meerrettich-Peroxidase (HRP) entweder direkt oder über einen C6-Thiol-Linker gebunden und in Kombination mit chemilumineszierenden Substraten wie AMPPD (3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3'-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxethan) oder fluoreszenzerzeugenden Substraten verwendet. – Digoxigenin in Kombination mit anti-DIG-Antikörpern, die markiert sind mit: – Goldteilchen – Fluoreszenzmarkierungen wie Carboxyfluorescein oder Carboxyrhodamin 101 – Enzymen wie alkalischer Phosphatase (AP) oder Meerrettich-Peroxidase (HRP) in Kombination mit chemilumineszierenden Substraten wie AMPPD (3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3'-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxethan) oder fluoreszenzerzeugenden Substraten. – Biotin in Kombination mit Avidin oder Streptavidin und als Anti-DIG-Antikörper markiert – Dinitrophenyl (DNP) als Hapten in Kombination mit zweckmäßigen Antikörpern und als Anti-DIG-Antikörper markiert – oder jede beliebige indirekte Markierung.

Ein Verfahren der Erfindung kann wie folgt verwendet werden:

– zur Untersuchung der Auswirkung neuer Nahrungsmittel (Präbiotika), Probiotika und funktioneller Nahrungsmittel auf die Darm-Mikroflora sowohl des Menschen als auch von Tieren;
– zur Untersuchung der Auswirkung von Antibiotika auf die Darm-Mikroflora sowohl des Menschen als auch von Tieren;
– zur Überwachung der Entwicklung von gemischten mikrobiellen Populationen, die an industriellen Fermentationsverfahren beteiligt sind (Käse und andere (Molkerei-)Fermentationsprodukte, Bier, Wein etc.);
– zum schnellen Nachweis einer mikrobiellen Verunreinigung in Produkten oder Produktionswerkzeugen vom Ausgangsstoff bis zum Endprodukt (Hygienekontrolle);
– zur Identifizierung und Quantifizierung des Vorhandenseins und der Aktivität von Mikroorganismen in Abwasserbehandlungssystemen;
– zur Identifizierung und Quantifizierung des Vorhandenseins und der Aktivität von Mikroorganismen in Verfahren zur biologischen Sanierung;
– zur Identifizierung und Quantifizierung des Vorhandenseins und der Aktivität von Mikroorganismen in marinen Systemen;
– zur Bestimmung des mikrobiellen Zustands von (verunreinigten) Böden, Wässern, Gasen etc.;
– zur Bestimmung des Zustands von Trinkwasser, Schwimmbadwasser und Oberflächenwasser in Bezug auf pathogene Bakterien und die Gesundheit des Menschen;
– zur Untersuchung der Auswirkung von registrierten und neuen Medikamenten auf die Darm-Mikroflora sowohl des Menschen als auch von Tieren;
– zur Durchführung einer Diagnose/schnellen Bestimmung von pathogenen Infektionen des Menschen und von Tieren einschließlich Nutzvieh;
– zum Nachweis einer Bakterienresistenz gegenüber Antibiotika;
– zur Untersuchung der Auswirkung von homöopathischen Präparaten und Reformhausprodukten auf die Darm-Mikroflora sowohl des Menschen als auch von Tieren;
– zum Nachweis spezifischer, Zahnzersetzung generierender, oraler Streptococcen für die Zahnpasta-Industrie;
– zum Nachweis von Pathogenen und Konsortien von Mikroorganismen, die für die Entwicklung, Ausbeute oder Qualität während der Herstellung, Ernte, Lagerung und des Transports (von Erntegut) entweder nachteilig oder vorteilhaft sind.

Die Erfindung wird durch die folgende, ausführliche Beschreibung weiter veranschaulicht.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Entwicklung des Satzes von Darmflora-Clustersonden
Um die Populationszusammensetzung von komplexen, gemischten Bakterienpopulationen zu ermitteln, werden routinemäßig aerobe und anaerobe Kultivierungstechniken auf verfestigten Medien eingesetzt. Anschließend werden standardmäßige Identifizierungsprotokolle oder kommerziell erhältliche Testsysteme zur Identifizierung der isolierten Stämme verwendet. Obwohl es relativ leicht ist, eine brauchbare Gesamtzählung zu erhalten, ist die Zählung von einzelnen, identifizierbaren Bakterienspezies mühsam und zeitaufwändig. Brauchbare Zählungen der verschiedenen aeroben und fakultativ anaeroben Spezies können durch die Verwendung von selektiven Medien erhalten werden. Solche Medien sind für die meisten streng anaeroben Spezies der Darmflora aber nicht verfügbar. Weil etwa 30–40 Spezies 99% der humanen Darmflora ausmachen, müssen mehrere hundert Isolate aus jeder einzelnen Probe identifiziert werden, um zuverlässige Populationsstatistiken zu erhalten. Weiterhin ist eine Fermentations-Endproduktanalyse in isolierten, reinen Kulturen oft für eine zuverlässige Identifizierung von wesentlicher Bedeutung. Folglich sind Untersuchungen der Populationsdynamik der Darmflora oft hinsichtlich der Anzahl der Patienten oder der Anzahl der untersuchten Spezies begrenzt, und folglich sind die beobachteten Änderungen der Zusammensetzung oft nicht statistisch signifikant. Der in jüngster Zeit erfolgte Anstieg der Produktion von Designer Food (funktionelle Nahrungsmittel, Prä- und Probiotika) hat zu einem Bedarf an Werkzeugen zur Untersuchung der Auswirkung dieser Produkte auf die Darm-Mikroflora des Menschen geführt. Wir haben ein solches Werkzeug entwickelt, indem wir mehrere innovative mikrobiologische Techniken wie die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung und die Bildzytometrie kombiniert haben.
Insbesondere haben wir auf 16S rRNA abzielende Oligonucleotid-Sonden zur Auszählung verschiedener phylogenetischer Gruppen von Darmbakterien entwickelt. Diese Sonden werden bei Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsuntersuchungen der Populationsdynamik eingesetzt. Wir haben diese Sonden entwickelt, nachdem wir das Vorhandensein von 15 größeren phylogenetischen Subpopulationen innerhalb der Darm-Mikroflora demonstriert haben (1).
Bildanalyse und FISH
Eine Whole-Cell-in-situ-Hybridisierung mit auf 16S rRNA abzielenden, fluoreszenzmarkierten, synthetischen Oligonucleotiden erleichtert eine schnelle Bestimmung der taxonomischen Position einzelner, sogar nicht kultivierbarer Zellen und ermöglicht mittels einer automatisierten mikroskopischen Bildanalyse eine genaue Beschreibung von Bakterienpopulationen auf quantitativer Basis. Durch die Kombination dieser beiden Techniken ist es möglich, die Fluoreszenz spezifischer Zelltypen quantitativ zu messen. Die Verwendung der Bildanalyse ermöglicht die Quantifizierung sogar sehr kleiner Fluoreszenzsignale und gewährleistet objektive (forscherunabhängige) Auswertungs-Hybridisierungsergebnisse.
Eine automatisierte Erkennung und Auszählung von hybridisierten Zellen wird durch die Verwendung der in unserer Abteilung entwickelten Bildanalyse-Software (Meijer et al., 1991; Wilkinson, 1994; Wilkinson et al., 1993, 1994) erleichtert.
Bei einer umfangreichen Untersuchung, bei der Kultivierungsverfahren zur Auszählung verwendet wurden, sind etwa 200 Bakterienspezies aus humanen Kotproben isoliert worden (Finegold et al., 1974). Etwa 30 von diesen sind zahlenmäßig wichtig und stellen 10 getrennte Gattungen dar. Gattungsspezifische Sonden könnten sich daher im Großen bei der Beschreibung von Gemeinschaftsstrukturen als zweckmäßig erweisen. Es ist bekannt, dass das natürliche Klassifizierungssystem für Bakterien auf der Grundlage von phänetischen Merkmalen mit Verfahren auf der Grundlage der Genetik nicht vollständig übereinstimmt; nicht alle taxonomen Gattungen sind auf der Grundlage ihrer 16S-rRNA-Sequenz monophyletisch, wobei beispielsweise Eubacterium spp. mit mehreren Clostridium und Peptostreptococcus spp. einen Cluster bilden und Peptostreptococcen selbst über verschiedene getrennte phylogenetische Cluster verteilt sind (1), wobei aber innerhalb dieser phylogenetischen Cluster konservierte Regionen identifiziert werden können und für solche Regionen entworfene 165-rRNA-Sonden zur Identifizierung der überwiegenden Anzahl der Population bis zu einem wohldefinierten taxonomen Grad verwendet werden können. Somit ist nur eine beschränkte Anzahl von Sonden zur Auszählung der verschiedenen phylogenetischen Gruppen der Darmflora erforderlich (1).
Obwohl viele Ribosomkopien ein ausreichendes Signal gewährleisten sollten, weicht die Realität oft weit vom Ideal ab. Die Zugänglichkeit der Zielregion und die Art der an die Sonde gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe, die Hybridisierungstemperatur, der metabolische Zustand der Zellen und der Grad der Eigenfluoreszenz der Nicht-Zielzellen sind wichtige Faktoren beim Erhalt eines ausreichenden spezifischen Fluoreszenzsignals. Oft ist bei kleinen und langsam wachsenden Zellen mit wenig rRNA eine optische Unterstützung in Form von CCD-Kameras erforderlich. Eine Bildanalyse kann zur Unterscheidung zwischen einer nicht nachlassenden Eigenfluoreszenz und einer schnell nachlassenden Fluoreszenz eines Fluoreszenzfarbstoffs sehr hilfreich sein. Unter Verwendung solcher Lebenszeit-Bilderzeugungstechniken können auf dem mikroskopischen Gebiet nur einige wenige positiv hybridisierte Zellen von mehreren tausend Nicht-Zielzellen unterschieden werden (Manuskript in Vorbereitung). Dies ist notwendig, um diejenigen Bakteriencluster, die eine Minderheit der Population bilden (z.B. Streptococci), auszuzählen.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Haltung von Kulturen
Bakterienkulturen wurden in anoxischem Hackfleisch-Kohlenhydrat-Medium (CMC) (Holdeman et al., 1977) bei Raumtemperatur mit zweimonatlichen Übertragungen und in anoxischer entrahmter Milch bei –20°C gehalten. Vor der Hybridisierung wurden frische Kulturen in anoxischem Pepton/Hefeextrakt/Glucose-Medium (PYG) (Holdeman et al., 1977) bei 37°C gezogen.
Entwicklunq von Sonden
Die 16S-rRNA-Sequenzen von 113 Spezies von Fäkalbakterien wurde aus der RDP-Datenbankversion vom 18. Juni 1994 (Larsen et al., 1993) erhalten. Zusammen stellen diese Spezies die meisten Bakterien dar, von denen bekannt ist, dass sie in humanen Fäkalien vorkommen (Drasar und Barrow, 1985). Eine Kimura-2-Parameter-Distanzanalyse der ausgerichteten Sequenzen dieser Bakterien wurde mittels des Programms Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) von Kumar et al. (1993), Version 1.02, durchgeführt. Der erhaltene Distanzbaum (Nachbarverbindung) der verschiedenen Spezies in phylogenetischen Clustern wurde mit der phylogenetischen Gruppierung der RDP-Datenbank (Larsen et al., 1993) verglichen. Es wurden keine signifikanten Clusterunterschiede gefunden. Somit wurden 15 Cluster identifiziert (1). Es wurden einzigartige Sequenzen für jeden der separaten Cluster identifiziert, und es wurde ein Schätzwert der Anzahl von Zellen in einer mittleren Fäkalprobe, die mit einer Sonde für diesen Cluster hybridisieren würde, erhalten. Die Sondenspezifität wurde als brauchbar betrachtet, wenn der positiv hybridisierende Teil der Population zwischen 1% und 25% betrug. In demjenigen Fall, in dem erwartet wurde, dass eine einzige Spezies einen Hauptteil der gesamten Darmflora-Population ausmachte, wurde eine speziesspezifische Sonde für diese Spezies entwickelt.
Tests der Sondenspezifität
Die Spezifität der Sonden wurde mittels des Befehls "Check Probe" (Larsen et al., 1993) gegen die komplette RDP-Datenbank getestet und als ausreichend betrachtet, wenn mindestens zwei fehlende Übereinstimmungen zwischen Bakterien von allen phylogenetischen Clustern von Fäkalbakterien bestätigt wurden. Weiterhin wurde eine Bezugssammlung von 86 Bakterien (Tabelle 1), die eine Untergruppe der 113 im Zielidentifizierungsverfahren eingeschlossenen Spezies (1) darstellte, kultiviert, und es wurden Whole-Cell-in-situ-Hybridisierungen mit diesen 86 Spezies durchgeführt. Dazu wurden exponentiell wachsende Zellen mit 3% (Vol./Vol.) Formaldehyd fixiert. Nach einer 10-minütigen Aufbewahrung bei 4°C wurden 10 μl einer Suspension von fixierten Zellen auf einen Objektträger aufgetragen, der zur Gewährleistung einer richtigen Haftung der Zellen mit Vectabond^TM (Vector Laboratories, Burlingame, CA) vorbehandelt war. Nach einem 20-minütigen Trocknen bei 45°C wurden die getrockneten Zellausstriche in einer abgestuften Ethanolreihe (50%, 75% und 98% Ethanol, Vol./Vol., 2 min) dehydratisiert. 12 μl eines durch eine Porengröße von 0,2 μm filtrierten Hybridisierungspuffers wurden zu den Zellausstrichen gegeben. Der Hybridisierungspuffer bestand aus 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) und 0,1% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat. Nach der Zugabe von 8 ng·μl^–1 einer mit FITC markierten Sonde wurden die Ausstriche mit einem Deckglas bedeckt. Die Träger wurden in einer mit Puffer gesättigten Hybridisierungskammer 15–20 h lang bei 45°C hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Träger 15 min lang bei 45°C in 50 ml Hybridisierungspuffer gewaschen, an der Luft getrocknet, und die Zellausstriche wurden in einer Einbettungsflüssigkeit eingebettet, die aus einer 1:1-Mischung aus Glycerin und PBS (8 g·l^–1 NaCl, 0,2 g·l^–1 KCl, 1,44 g·l^–1 Na₂HPO₄, 0,24 g·l^–1 KH₂PO₄) bestand, die um 2,5% (Gew./Vol.) NaI ergänzt war.
Die Träger wurden mittels eines Orthoplan^TM Auflichtfluoreszenzmikroskops (Leitz, Deutschland), das mit einer Quecksilber-Bogenlampe (HBO 100W, Osram, Deutschland), einem 50x-PL-Fluotar-Objektiv (Leitz), einem I2/3-(blaue Anregung) Filterblock und einer gekühlten CCD-Videokamera (Loral, Fairchield CCD 5000/L, Sunnyvale, CA) ausgestattet war, untersucht. Ein Belichtungsverlängerungssystem für diese Kamera wurde zuvor beschrieben (Wilkinson et al., 1993). Bei der eingesetzten Bildanalyse-Software handelte es sich um das System "Groningen Reduction of Image Data" (GRID) (Meijer et al., 1991; Wilkinson et al., 1994). Die Fluoreszenzmessungen wurden unter Verwendung des zuvor beschriebenen Immunofluoreszenz-Pakets (Jansen et al., 1993) durchgeführt. Oberflächen-Fluoreszenzsignale wurden unter Verwendung einer nicht ausbleichenden Uranylglas-Bezugssubstanz (16) kalibriert. Es wurden ein Phasenkontrast- und ein Fluoreszenzbild eines jeden Gesichtsfeldes erhalten. Die Form eines jeden Bakteriums wurde aus dem Phasenkontrastbild automatisch bestimmt. Die Fluoreszenz eines jeden Objekts wurde aus der entsprechenden Fläche im Fluoreszenzbild bestimmt. Dieses Verfahren ermöglicht einen Ausschluss von Nichtfluoreszenz-Objekten. Die Fluoreszenzbilder wurden mit einer Kamera-Belichtungszeit von 12 s aufgezeichnet. Pro Objektträger wurden 250–500 Objekte ausgemessen. Für jeden Träger wurde die Negativkontrolle (Eigenfluoreszenz) bestimmt, und das 95. Perzentil ihrer Fluoreszenzverteilung dient als Ansprechwert. Der Prozentwert der positiv hybridisierten Objekte mit einer Fluoreszenz oberhalb des Ansprechwerts, bezogen auf die Gesamtzahl von Objekten, die unter einer Phasenkontrast-Beleuchtung nachgewiesen wurden, wurde als Hybridisierungs-Prozentwert bezeichnet. Dieser Prozentwert wurde bestimmt, um die Leistungsfähigkeit der Sonden zu bestimmen, und erfolgte an reinen Kulturen.
Whole-Cell-in-situ-Hybridisierung und Auszählung von phylogenetischen Clustern in Fäkalproben
Zur Quantifizierung von phylogenetischen Clustern und der Gesamtanaerobier in Fäkalien wurden Stuhlproben von gesunden humanen Probanden gesammelt und wie folgt verarbeitet. 1 g einer frisch defäkierten und homogenisierten Fäkalie wurden in 9 ml eines an einer Porengröße von 0,2 μm filtrierten PBS suspendiert. Diese Suspension wurde 10 × in filtriertem PBS verdünnt und gründlich gemischt. Nach der Entfernung von Bruchstücken (350 × g, 1 min) wurde der Überstand isoliert und über Nacht bei 4°C mit 4% (Gew./Vol.) frischer Paraformaldehyd-Lösung fixiert. Zellen von 1 ml der fixierten Zellsuspension wurden zweimal (8000 g, 5 min) in 1 ml filtriertem PBS gewaschen und in 1 ml einer Mischung aus PBS und Ethanol (1:1) resuspendiert. Nach einer einstündigen Aufbewahrung bei –20°C wurden 5 μl der Zellsuspension zu 50 μl vorgewärmtem (50°C) Hybridisierungspuffer gegeben, und 5 μl einer mit FITC markierten Sonde wurden zugegeben. Zellen wurden 16 h lang bei 50°C hybridisiert. Nach einer Resuspension in 10 ml Hybridisierungspuffer wurden Zellen an einem Isopore^TM-Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm (Millipore Corporation, USA) filtriert und zweimal mit 10 ml warmem (50°C) Hybridisierungspuffer gewaschen. Filter wurden mit Vectashield^TM auf Objektträgern angebracht, und hybridisierte Zellen wurden mit einem Olympus-BH2-Mikroskop mit einem DPlanApo1000VPL-Objektiv (100 x, N.A., 1,30), einer Hochdruck-Quecksilberdampflampe HBO100 und einem IB-Blaulicht-Anregungsblock mit einem zusätzlichen EY455-Anregungsfilter visuell gezählt. Die Gesamtzahl der in Fäkalien vorhandenen Bakterien wurde mittels des Verfahrens von Porter und Feig (1980) bestimmt, wobei 0,5 μg·ml^–1 (Gew./Vol.) 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) als DNA-Färbung bei einer Beleuchtung mit einem UV-Anregungsfilterblock verwendet wurden. Alle Mikroskopiezählungen wurden doppelt durchgeführt, wobei mindestens 300 Zellen pro Assay gezählt wurden.
Spezial-Vorbehandlungsverfahren zur In-situ-Hybridisierung von Lactobacillus Spp.
Die meisten Bakterien weisen hohe Fluoreszenzgrade auf, wenn sie mit Fluoreszenzsonden hybridisiert sind (Langendijk et al., im Druck). Mitglieder der Gattung Lactobacillus sind aber schwierig zu hybridisieren. Reine Kulturen dieser Gattung weisen einen sehr niedrigen Fluoreszenzgrad auf, und gewöhnlich wiesen weniger als 50% der Zellen eine Fluoreszenz oberhalb der Hintergrundwerte auf (Langendijk et al., im Druck). Solche Ergebnisse sind auch für grampositive Coccen wie Lactococci, Streptococci und Enterococci berichtet worden (Beimfohr et al., 1993, Salama et al., 1991). Dass die schlechte Permeabilität dieser Zellen nicht nur auf ihre grampositive Beschaffenheit zurückzuführen ist, wird durch die Tatsache demonstriert, dass sowohl Clostridia als auch Bifidobacteria bei der Anwendung von standardmäßigen Hybridisierungstechniken mit 16S-Sonden hohe Fluoreszenzsignale aufweisen (Langendijk et al., im Druck).
Wir haben ein Protokoll zur Whole-cell-in-situ-Hybridisierung von Lactobacilli entwickelt. Bei diesem Protokoll geht standardmäßigen Whole-Cell-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-(FISH-)Protokollen eine Lysozym/Lipase-Behandlung wie folgt vorher.
Bestimmung der Spezifität der Laborsonde:
1-ml-Zellen von Kulturen mitten in der logarithmischen Wachstumsphase von 10 Lactobacillus-Stämmen und insgesamt 26 Bezugsstämmen (siehe Tabelle 2 und 3) wurden in PBS gewaschen und in 1 ml Prälyse-Puffer resuspendiert.
Das PBS bestand aus 8 g·l^–1 NaCl, 0,2 g·l^–1 KCl, 1,44 g·l^–1 Na₂HPO₄ und 0,24 g·l^–1 KH₂PO₄. Der Prälyse-Puffer bestand aus 50 mM Tris (pH-Wert 7,5), 10 mM EDTA, 0,585 M Saccharose, 5 mM CaCl₂, 0,3 mg·ml^–1 Natriumtaurocholat, 5 mg·ml^–1 Lysozym und 0,031 mg·ml^–1 Bauchspeicheldrüsenlipase. Zellen wurden 1 h lang bei 37°C inkubiert, in PBS gewaschen und 1 h lang in Ethanol-PBS (1:1) fixiert. 10 μl dieser Suspension wurden auf einem Objektträger getrocknet und in der Wärme fixiert. Die Zellausstriche wurden in einer graduierten Ethanolreihe (70% und 96%, jeweils 3 min) dehydratisiert. 10 ml Hybridisierungspuffer und 1 μl einer mit FITC markierten Sonde (50 μl^–1) wurden zu den Ausstrichen gegeben. Der Hybridisierungspuffer bestand aus 0,9 M NaCl 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) und 0,1% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat. Die Ausstriche wurden mit einem Objektträger abgedeckt, und die Träger wurden 16 h lang bei 50°C in einer mit Puffer gesättigten Hybridisierungskammer inkubiert. Anschließend wurden die Ausstriche 30 min lang bei 50°C in 50 ml Hybridisierungspuffer gewaschen, an der Luft getrocknet und an Vectrashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) angebracht. Diese Behandlung führte zu Hybridisierungs-Prozentwerten von über 90%.
Tabelle 2 Für Spezifitätstests der Laborsonden verwendete Refererenzstämme
Tabelle 3 Für Spezifitätstests der Laborsonden verwendete Lactobacillus-Stämme
Whole-Cell-in-situ-Hybridisierung und Auszählung von Lactobacilli in Fäkalproben
Zur Auszählung von Lactobacilli in Fäkalproben wurde dasselbe Protokoll befolgt, das unter "Whole-Cell-in-situ-Hybridisierung und Auszählung von phylogenetischen Clustern in Fäkalproben" beschrieben ist, außer, dass vor der Verdünnung der mit Paraformaldehyd fixierten und gewaschenen Zellsuspensionen in 50%igem Ethanol Zellen im Prälyse-Puffer resuspendiert und 1 h lang bei 37°C inkubiert wurden. Zellen wurden zweimal (8000 × g, 5 min) in 1 ml filtriertem PBS gewaschen und in 1 ml einer Mischung aus PBS und Ethanol (1:1) resuspendiert und wie oben beschrieben in Lösung hybridisiert.
ERGEBNISSE
Bei der phylogenetischen Analyse waren die vorherrschenden Bakterienspezies der humanen Darmflora über 15 getrennte Cluster verteilt. Einige dieser Cluster bestanden aus monophyletischen Gattungen wie Bifidobacterium und Fusobacterium. Andere bestanden aus einer Mischung aus Eubacterium, Clostridium und Peptostreptococcus spp., wie im Fall der Clostridiumcoccoides-Gruppe (Larsen et al., 1993). Einzigartige Sequenzen für jeden dieser getrennten Cluster wurden identifiziert, und der Prozentwert der Gesamtpopulation, den die Sonde hybridisieren würde, wurde bestimmt. In demjenigen Fall, in dem erwartet wurde, dass eine bestimmte Spezies einen Hauptteil der Population bildet, wie Peptostreptococcus anaerobius, oder wenn eine Spezies nicht in eine Clustersonde eingeschlossen werden konnte, wie Bacterioides distasonis, wurden speziespezifische Sonden entwickelt.
Die folgenden Sonden wurden entwickelt:

1. Die Sonde His5 der Untergruppe Clostridium hystolyticum (TTATGCGGTATTAATCT(TC)CCTT), Td = 56,5 – 58,4°C, wies eine vollständige Übereinstimmung mit Clostridium putrificum, C. butyricum, C. barati, C. carnis, C. botulinum, C. novyi, C. sporogenes, C. putrificum, C. tyrobytyricum, C. scatologenes, C. scatologenes, C. proteolyticum, C. limosum, C. Sardiniensis, C. perfringens, C. beijerinckii, C. acebutylicum, C. puniceum, C. cellulovorans, C. paraputrificum, C. thermobutyricum, C. thermopalmarium, C. subterminale, C. argentinense, C. estertheticum, C. pasteurianum, C. histolyticum, Eubacterium budayi, E. delafieldii, E. moniliforme, E. multiforme, E. nitritogenes, E. tarantellus und Flexibacter canadensis auf.
2. Die Sonde Lit135 der Untergruppe Clostridium lituseburense (GTTATCCGTGTGTACAGGG), Td = 59,2°C, wies eine vollständige Übereinstimmung mit Eubacterium tenue, Clostridium difficile, C. bifermentans, C. sordellii, C. ghoni, C. lituseburense und C. mangenotti auf.
3. Die Peptostreptococcus-Sonde Pep197 (TCTTACACCGATAAACTTTG), Td = 55,4°C wies eine vollständige Übereinstimmung mit Peptostreptococcus micros, P. tetradius, P, vaginalis und dem Morphotyen Epilopiscium Al auf.
4. Die Peptostreptococcus-Sonde Ana134 (ATGTTATCCATGTGTATAGGGC), Td = 60,2°C, wies eine vollständige Übereinstimmung mit Peptostreptococcus anaerobius und Peptostreptococcus sp. C. auf.
5. Die Sonde Fus390 der Gattung Fusobacterium (CACACAGAATTGCTGGATC) , Td = 60,2°C, wies eine vollständige Übereinstimmung mit Fusobacterium simiae, F. nucleatum, F. alocis, F. russii, F. gonidoformans, F. necrophorum, F, varium, F, mortiferum, F. perfoetens, Propionigenium modestum, Leptotrichia buccalis und Sebalcella termitidis auf. Die Sonde kann auch an F, ulcerans, F. periodonticum und F. necrogenes hybridisieren, weil diese Bakterien eine unbekannte Base in der Zielregion haben.
6. Die Sonde Lab158 der Lactobacillus-Untergruppe (GGTATTAGCA(TC)CTGTTTCCA), Td = 56,1 – 58,2°C, wies eine vollständige Übereinstimmung mit Lactobacillus acidophilus, L. acidophilus subsp. johnsonii, L. delbrueckii subsp. lactis, L, delbrueckii subsp. delbrueckii, L. brevis, L. salivarius subsp. salicinius, L, amylovorus, L. acetotolerans, L. oris, L. hilgardii, L. kefir, L, mali, L. animalis, L, murinus, L. ruminis, L. agilis, L, sharpeae, L. gasseri, L, amylophilus, L. reuteri, L. fermentum, L. sake, L. sanfrancisco, L. fructivorans, L. plantarum L. bifernentans, L. coryniformis, L, casei subsp. casei, L. casei subsp. rhamosus, Leuconostoc lactis, Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides, Lc. mesenteroides subsp, cremoris, Lc. oenos, Enterococcus faecalis, E, columbae, Periococcus pentosaceus, P. acidilactici, Streptococcus cecorum, Vagococcus fluvialis, V. salmoninarium, Weissella confusa und W. kandleri auf.
7. Die Streptococcus/Lactococcus-Sonde Str493 (GTTAGCCGTCCCTTTCTGG), Td = 61,3 °C, wies eine vollständige Übereinstimmung mit Streptococcus sanguis, S. salivarius, S. bovis, S. pneumoniae, S. parasanguis, S. acidominimus, S. dysgalactiae, S. anginosus, S. vestibulariis, S. eguinus, S. alactolytiens, S. downei, S. sobrinus, S. rattus, S. cricetus, S. hyointestinalis, S. agalactiae, S. suis, S. porcinus, S. canis, S. pyogenes, Lactococcus lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris, L. piscium, L. raffinolactis, L. plantarium, L. garvieae auf. Die Sonde kann auch zum Nachweis von Streptococcus ora-lis, S. intermedius, S. macacae, s. mutans, S. anginosus, S. criae und S. equi verwendet werden, weil diese Bakterien ein oder mehrere unbekannte Basen in der Zielregion enthalten.
8. Die Sonde Fra602 der Bacteroides vulgatus-Gesellschaft (GAGCCGCAAACTTTCACAA), Td = 57,0°C, weist eine vollständige Übereinstimmung mit Bacteroides eggertii, B. thetaiotaomicron, B. ovatus, B. fragilis, B. uniformis und B. vulgatus auf.
9. Die Bacteroides-distasonis-Spezies Dis657 (CCGCCTGCCTCAAACATA), Td = 58,0°C, weist eine vollständige Übereinstimmung mit Bacteroides distasonis auf.
10. Die Sonde Cyl387 für Verwandte der Gruppe II von Mycoplasmen mit Zellwandung (CGCGGCATTGCTCGTTCA) , Td = 60,2°C, weist eine vollständige Übereinstimmung mit Eubacterium cylindroides, E. tortuosum, E. dolichum, E. biforme, Clostridium innocuum und Streptococcus pleomorphus auf.
11. Die Sonde Ato292 der Atopobium-Untergruppe (GGTCGGTCTCTCAACCC), Td = 59,0°C, weist eine vollständige Übereinstimmung mit Atopobium minutum, A. parvulum, A. rimae, Eubacterium lentum und möglicherweise E. fosser (eine unbekannte Base in der Zielregion) auf.
12. Die Sonde Rec484 für die Clostridium-coccoides-Gruppe (GCTTCTTAGTCA(AG)GTACCG), Td = 59,2°C, weist eine vollständige Übereinstimmung mit Eubacterium contortum, E. formicigenerans, E. rectale, E. ventriosum, E. cellulosolvens, E. eligens, E. fissicatena, E. hadrum, E. halii, E. saburreum, E. uniforme, E. ventriosum, E. xylanophilum, Clostridium aminovalericum, C. clostridiiforme, C. nexile, C. oroticum, C. lentocellum, C. symbiosum, C. aminophilumn, C. xylanolyticum, C. sphenoides, C. celarecrescens, Ruminococcus hansenii, Epulopiscium sp.str., Morphotypen A2 und B, Acetitomaculum ruminis, Lachnospira pectinoschiza, L. multiparus, Roseburia cecicola und möglicherweise auch mit Clostridium coccoides (unbekannte Base) auf.
13. Die Ruminiococcus-Sonde Rum186 (TTCACACCAGACCATGCG) , Td = 58,0°C, weist eine vollständige Übereinstimmung mit Ruminococcus products und Ruminococcus hansenii auf.
14. Die Sonde Lep der Clostridium-leptum-Untergruppe weist eine vollständige Übereinstimmung mit Eubacterium siraeum, E. plautii, E. desmolans, Clostridium sporosphaeroides, C. leptum und C. cellulosi auf.
15. Die Sonde Bif164 der Gattung Bifidobacterium (CATCCGGCATTACCACCC) , Td = 60,2°C, weist eine vollständige Übereinstimmung mit Bifidobacterium longum, B. pseudolongum, B. suis, B. infantis, B. indicum, B. breve, B. adolescents, B. catenulatum, B. minimum und möglicherweise auch mit B. bifidum, B. dentium, B. coryneforme, B. asteroides, B. globosum, B. magnum und Gardnerella vaginalis auf, weil diese Bakterien eine oder mehrere unbekannte Basen in der Zielregion haben.

Diese 15 Cluster wurden gemäß der Angaben in 1 ausgewählt. Schmelztemperaturen (Td) sind theoretische Werte. Eine Hybridisierung erfolgt gewöhnlich bei Temperaturen von etwa 1–5°C unter diesen Werten.
Sequenzen sind 5'–3'.
Literaturstellen

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Claims

Verfahren zur Bestimmung der relativen Häufigkeit von niederen phylogenetischen Untergruppen von Mikroorganismen in einer gemischten Population von mehreren Mikroorganismen, die folgenden Schritte umfassend: 1) Bereitstellen einer Menge von markierten in-situ-Hybridisierungs-Cluster-Oligonucleotidsonden, wobei die Clustersonde eine Sonde auf dem Gattungsniveau ist; 2) Hybridisieren der Sonden mit einer Probe der gemischten Population; und 3) quantitative Analyse der Anzahl an markierten Mikroorganismen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Sonden mit einem fluoreszierenden Material markiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Sonden auf der 16S-rRNA von Zielmikroorganismen beruhen.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die quantitative Analyse durch mikroskopische Bildanalyse erfolgt.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Mikroorganismen Bakterien sind.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei der gemischten Population um die physiologische Darmflora, insbesondere eines Säugers, insbesondere eines Menschen, handelt.
Verfahren zum Analysieren der Dynamik der relativen Häufigkeit von individuellen Mikroorganismen in einer gemischten Population, wobei ein Verfahren gemäß einem der obigen Ansprüche wenigstens zweimal an Proben durchgeführt wird, die zu verschiedenen Zeitpunkten aus einer Population entnommen wurden.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Probe vorbehandelt und/oder gereinigt wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei wenigstens zwei verschiedene Sonden mit einem unterschiedlichen Marker versehen sind.
Menge von Sonden, die clusterspezifisch sind und die mit wenigstens einem Marker versehen sind, wobei die Menge wenigstens zwei Sonden mit den folgenden Sequenzen umfasst: TTATGCGGTATTAATCT (T/C) CCTT (His5), GTTATCCGTGTGTACAGGG (Lit135), TCTTACACCGATAAACTTTG (Pep197), ATGTTATCCATGTGTATAGGGC (Ana134), CACACAGAATTGCTGGATC (Fus390), GGTATTAGCA (T/C) CTGTTTCCA (Lab158), GTTAGCCGTCCCTTTCTGG (Str493), GAGCCGCAAACTTTCACAA (Fra602), CCGCCTGCCTCAAACATA (Dis657), CGCGGCATTGCTCGTTCA (Cyl387), GGTCGGTCTCTCAACCC (Ato292), GCTTCTTAGTCA (A/G) GTACCG (Rec484), TTCACACCAGACCATGCG (Rum186) oder CATCCGGCATTACCACCC (Bif164).