JP2000504922A - 混合集団における微生物の相対的存在量を定量するための方法および物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は数種の微生物混合集団における個々の微生物種またな下位系統分類亜種の相対的存在量の定量方法に関し、1)標識したインシチュー（in situ）ハイブリッド形成用クラスターオリゴヌクレオチドプローブのセットを調製する工程；2)当該プローブを当該混合集団の標本とハイブリッド形成する工程；および3)標識された微生物数を定量分析する工程よりなる。さらに本発明は混合集団における個々の微生物種の相対的存在量動態を分析する方法に関する。さらに本発明はクラスターに特異的なプローブであって、本発明の方法に使用する少なくとも一種の標識物を備えているプローブのセットに関し、本発明はさらに数種の微生物混合集団における個々の微生物種の相対的存在量を定量するためのキットに関し、該キットは上記プローブのセットと、標本を前処理するのに適当な物質および/またはハイブリッド形成を実施するのに適当な物質および/またはハイブリッド形成の結果を分析するための適当な物質からなる。

Description

【発明の詳細な説明】 混合集団における微生物の相対的存在量を定量するための方法および物質 本発明は数種の微生物混合集団における個々の微生物種の相対的存在量を定量 するための方法および物質に関し、特に、ヒトにおける常在腸管フローラの個々 の微生物種の相対的存在量を定量する方法に関する。 そのような方法は本発明以前には利用できなかったものである。本発明以前に 可能であったことは、腸管フローラのような混合集団での個々の微生物種の存在 を定量することである。 腸管内フローラ組成を決める伝統的な方法では集団中の微生物を選択的および 非選択的培地の両方で培養しなければならない。これらの方法は面倒であり時間 もかかるばかりでなく、混合集団中に存在する微生物を同定する以外のことは殆 ど不可能である。さらに、これらの方法では方法論的および統計的エラーが生じ 易い。もう一つの障害は、他の微生物群に対して一つの微生物の存在量（相対的 存在量）を定量するに際して、培養が微生物群を同時に増殖し、しかもそれは同 じ比率で分割することができないことである。従って、これらの方法では相対的 存在量の定量が実質的に不可能であるし、当然、経時的にそのような集団の動態 を調べることもできない。 常在腸管フローラの組成と活性はヒトの免疫学、栄養学、病原論、および個々 人の健康にとって最も重要なことである（ヴァン・デル・ヴァイイ（Van der Wa aij）ら、１９７１）。例えば、定着抵抗または常在腸内微生物叢の細菌拮抗は 腸管内での病原微生物の侵入に対しての最初の防衛線を表わしている（ヴァン・ デル・ヴァイイら、１９７１；１９８９）。 ヒト（哺乳類）の腸管は単なる微生物類の混合集団ではないので、微生物の個 々の種あるいは他の亜種についてその相対的存在量を測定することは有意義であ り重要である。 工業的には、とりわけ食品分野および醗酵工業においては細菌あるいは酵母依 存の醗酵工程をモニターすることは、衛生上および製品の安定性の双方において 品質保証の観点から重要である。環境学的にも、複雑な混合細菌集団をモニター することは、土壌、ガスおよび廃水処理における生物学的再処理の効果を予測す るのに必須である。環境微生物学者はその手段を必要としており、それによって 細菌個々の代謝集塊のバイオマスについて栄養再生能力を説明し得るとする。 殆どの個々細菌種の生理学について、あるいは混合細菌の集合体全体としての 代謝活性については多くのことが分かっているが、それらの存在量を決めるファ クターおよび集団組成における神秘的で劇的な変化を引起こすファクターについ ては、古典的な培養法と同定法の技術に技術的な制限があるために殆ど未知のま まである。それ故、複雑な混合細菌集合体の集団組成を解明するための迅速モニ ター技術は科学上も非常に重要である。 本発明は数種微生物の混合集団における微生物の個々の種あるいは下位系統発 生微生物群の相対的存在量を定量するための迅速実施可能な信頼性の高い方法を 提供する。本発明方法は以下の工程よりなる： １）標識したインシチュー（in situ）ハイブリッド形成用クラスターオリゴ ヌクレオチドプローブのセットを調製する工程； ２）当該プローブを当該混合集団の標本とハイブリッド形成する工程； ３）標識された微生物数を定量分析する工程。 インシチュー・ハイブリッド形成それ自体は周知の技術であり、EP-A-O ４９ ７４６４に記載されているとおり、固定化した、透過性を上げてあってスライド に固定していない細胞を使用するインシチュー・ハイブリッド形成技術である。 この方法は単一の微生物の存在を定量するのに用いる。しかしこれまでインシチ ュー・ハイブリッド形成は下位系統発生的亜種の定量に適用されたことはないし 、ましてや微生物の混合集団の動態に使用されたこともない。標識したプローブ はインシチュー・ハイブリッド形成の必須の部分である。本発明はクラスタープ ローブのセットを提供するものであり、該プローブは予期せぬ新しい方法で、す なわち通常の分類原則に基づかずに選択される。本発明に使用するクラスタープ ローブのセットとはクラスターから微生物を、例えば種、属あるいは他の系統 発生的亜群として同定し得るオリゴヌクレオチドのセットとして定義できるもの である。好ましくは、これらのプローブはすべて混合集団中の異なる微生物の相 当する標的核酸に基づくものであり、この場合例えば、16S rRNAである。 クラスター−プローブは水性もしくあは土壌微生物学において多くの注目を集 めた。天然微生物界の多様性と生態を研究するための培養依存法を用いることの 限界はこの分野ではよく知られたことであるが、それはこれら生息地に存在する 微生物の殆ど（９９％）が培養不可能であり、分類学的同定も未知であったため である。結果として、より直接的な分子特性化の利用がこの領域ではより一般的 となった。最近の総説（アマン（Amann）ら、１９９５）には、これまで開発さ れた下位群準位/種準位プローブの多くのものを要約してある。これらのプロー ブは廃水および沈殿物の微生物学の環境領域において変わらずその適用場所を見 出している。上位群準位のプローブ（例えば、プロテオバクテリアル（Proteoba cterial）サブクラス）およびドメイン準位のプローブ（始原菌、細菌および真 核生物の間の区別に用いる）は、それらがあまりに系統的にかけ離れた進化の道 筋をたどっているが故に、記述的価値に限りがある。複雑な混合細菌集合体の群 落構造の解析に種準位のプローブを適用することは、多分伝統的な培養技術と同 様その方法を時間浪費なものとしてしまうだろう。この種のクラスタープローブ は、従って、本発明には適さない。クラスタープローブを日常的に使用する領域 では、下位系統発生的クラスタープローブを使用することなど誰も考えないが、 ましてやそのようなプローブをヒトの腸内フローラの微生物相対的存在量を決め る領域で使う訳がない。 これら１６S rRNAプローブは本発明における好ましい態様の一つである。 頻度が増大するにつれ、16S rRNAを標的とするハイブリッド形成プローブは、 標的DNAをPCR−増幅と組み合わせて用いることにより、混合細菌集団の特定の細 菌分類群を検出するのに適用し得る。現在、PCR技術を用いることにより、非標 的細胞が10⁹存在しても単一の細胞の存在が定性的に確認できる。このようにこ の方法は非常に高感度である。しかし、この技術といえども絶対的な細胞数につ いては定量的情報を殆どあるいは全く与えない。系統分類的クラスタープローブ のセットを用いて蛍光インシチューハイブリッド形成することは、ある種細菌群 に属する個々の細胞を数え上げる上でPCRよりも優れている。この技術はまた、P CRを集積部分とする混合集団分析用のDGGE−技術よりも優れている。 ±４００種の細菌の内、およそ100種が培養可能な（そして同定される）集団 に優位を占めている。これら細菌の殆どのものについて１６S rRNAが現在分か っている。糞便中細菌の優勢群に対して特異的なプローブをデザインするのに十 分すぎる程の配列データが揃っている。我々は１５ １６S rRNA標的オリゴヌク レオチドプローブのセットを開発したことをここに報告する；該プローブを用い てヒト腸内微生物叢優位な細菌群をインシチュー（in situ）で算出できる。 該プローブは好ましくは蛍光物質で標識する。このことが適正な自動化画像分 析との組み合わせにより顕微分析を可能にする。 顕微鏡スライド上細菌にハイブリッド形成した蛍光オリゴヌクレオチドプロー ブを検出するには、写真を適用する。しかし、ハイブリッド形成した細胞と形成 しなかった細胞との間に識別のための客観的な限界基準がないために、この方法 では定量が旨くいかない。それ故に、プローブの特異性を客観的に評価するため に、個々の細胞を蛍光分析的に測定可能な画像分析システムを採用する。このシ ステムのハードウエアーおよびソフトウェアーの詳細は他の文献に報告してある （ランゲンディック（Langendijk）ら、ビフィドバクテリウム−ペーパー、8月 号、１９９５）。 また、好ましい態様として、ある一つの種を同定するプローブには他の種を同 定するプローブとは異なる標識物を用いることである。このことによりアッセイ 回数および/または採取する標本を減らすことができる。 本発明はまた、本発明方法を実施するためのプローブおよびキットを提供する 。 本キットはプローブおよびインシチューハイブリッド形成のための他の試薬な らびに標本を前処理するための試薬および/または標本を後処理するための試薬 からなる。 本発明の応用 このようなキットにおいて、プローブはフルオレセイン−５−イソチオシアネ ート（FITC）で５’−末端を標識してもよい。他の標識物はこれらプローブの3' −または5'−末端のいずれかに、あるいは両端または内部に結合していてもよい 。 これら標識物の中で可能なものは： １） 直接の蛍光標識： − FLUOS （5（6）−カルボキシフルオレセイン−N−ヒドロキシスクシンイミ ド−エステル） − TRITC（テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート） − AMCA（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸） − テキサス・レッド − CY3、CY5またはCY7などのインドカルボシアニン色素 − 他の蛍光標識物 ２） 間接標識 − アルカリ性ホスフアターゼ（AP）または西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP ）などの酵素が直接あるいはC6チオール・リンカーを介して結合したものを、AM PPD（３−（2'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−4−（3'−ホスフォリル オキシ）−フェニル−１，２−ジオキセタン）または蛍光発生物質と組み合わせ て用いる。 − ジオキシゲニン 標識した抗−DIG抗体との組み合わせ −標識物が金微粒子 −標識物がカルボキシフルオレセインまたはカルボキシローダミン１０１な どの蛍光物質 −3−(2'−スピロアダマンタン)−４−メトキシ−4−(3'−ホスフォリルオ キシ)−フェニル-1，2−ジオキセタン（AMPPD）または蛍光発生物質と組み合わ せて用いるアルカリ性ホスファターゼ（AP）または西洋わさびペルオキシダーゼ などの酵素。 − ビオチン アビジンまたはストレプトアビジンと標識した抗−DIG抗体との組み合わせ − ハプテンとしてのジニトロフェニル 適当な抗体と標識した抗−DIG抗体との組み合わせ − または間接標識物のいずれかのもの。 さらに本発明の目的は以下のとおりである： − ヒトおよび哺乳類の腸内微生物叢への新しい食品（プリバイオティック）、 プロバイオティックおよび機能食品の効果を研究すること； − ヒトおよび哺乳類の腸内微生物叢への抗生物質の効果を研究すること； − 工業的醗酵工程（チーズおよび他の（酪農）醗酵製品、ビール、ワインなど ）に関わる混合微生物集団の発育をモニターすること； − 原料物質から最終製品までの生成物または製造器具類における微生物の汚染 を迅速に検出すること（衛生管理）； − 廃水処理システムにおける微生物の存在および活性を同定し、定量すること ； − 生物学的再生処理工程における微生物の存在および活性を同定し、定量する こと； − 海洋システムにおける微生物の存在および活性を同定し、定量すること； − (汚染された)土壌、水、ガスなどの微生物の状況を決定すること； − 携帯水、水泳用水および表面水の状況を病原細菌およびヒトの健康に関して 決定すること； − ヒトおよび動物の腸内微生物叢への登録医薬品および新薬の効果を研究する こと； − ヒトおよび家畜を含む動物の病原菌の感染を診断および/または迅速検出す ること； − 抗生物質に対する細菌抵抗を検出すること； − ヒトおよび動物の腸内微生物叢へのホメオパシー製剤および再生産物の効果 を研究すること； − 歯磨き工業にとっての特異的な虫歯生成口腔連鎖球菌を検出すること；およ び − 病原菌または微生物の集合体について、（収穫物の）生産、収穫、貯蔵およ び輸送する間の成長、収量または品質に対して害があるもの、あるいは有益であ るものを検出することである。 本発明を以下の詳細な記述によりさらに説明する。 発明の詳細な記述 腸管フローラクラスター−プローブの開発 複雑な混合細菌集団の集団組成を解明するために、固型培地での好気性および 嫌気性培養技術を常用技術として採用した。次いで、標準同定プロトコールまた は市販の試験システムを単離した菌株同定のために使用した。総生菌数を得るこ とは比較的容易だが、個々に同定可能な細菌種を算出することは面倒であり、時 間の浪費である。種々の好気性および機能的に嫌気性である種の生菌数は選択培 地を使用することで算出できる。しかし、そのような培地は腸管フローラの最も 厳しい嫌気性種については入手できない。30−40種類の種がヒト腸管フローラの ９９％を占めているので、信頼性のある集団統計値を得るためには、各個人標本 から分離した数百種類の分離菌を同定しなければならない。さらに、単離した純 培養中の醗酵最終産物を分析することが、信頼できる同定のために時に必須とな る。結果として、腸内フローラの集団動態に関する研究が、研究対象者の数ある いは種の数についてしばしば制限を受けることとなる；その結果、組成中に観測 された変化が時として統計的に無意味となる。デザイナー食品（機能食品、プリ −およびプロバイオティック）生産の近年の増加が、これら製品のヒト腸内微生 物叢への影響を研究する手段を必要とさせる。我々は幾つかの革新的な微生物学 的技術、例えば蛍光インシチューハイブリッド形成と画像サイトメトリーを組み 合わせることで一つの手段を開発した。 特に、我々が開発したのは１６S rRNAを標的とするオリゴヌクレオチドプロ ーブであり、それによって腸内細菌の種々の系統分類群を数え出すことができる 。これらのプローブは集団動態に関する蛍光インシチューハイブリッド形成の研 究に用いる。我々は腸内微生物叢内に15種類の主要な系統分類亜集団が存在する ことを発表して後にこれらのプローブを開発した（図１）。 画像分析およびFISH １６S rRNAを標的とする蛍光標識化合成オリゴヌクレオチドでの全細胞のイン シチューハイブリッド形成が個々の培養不可能な細胞についても迅速なその分類 学的位置づけを容易にし、自動顕微画像分析による定量的な細菌集団の正確な記 述を可能とする。これら二種類の技術を組み合わせることで、特異的な細胞タイ プの蛍光を定量的に測定することが可能である。画像分析を使用することで超低 蛍光シグナルでさえ定量することが可能であり、ハイブリッド形成の結果につい て客観的（研究者に依存せずに）評価を確実なものとする。ハイブリッド形成細 胞の自動化認知および算出が、我々の部門で開発した画像分析ソフトウエアーを 使用することで容易になった（メイジャー（Meijer）ら、１９９１；ウイルキン ソン（Wilkinson）、１９９４；ウイルキンソンら、１９９３、１９９４）。 広範な研究の間に、算出培養法を用いておよそ２００種類の細菌がヒト糞便標 本から分離された（ファインゴールド（Finegold）ら、１９７４）。これらの内 約３０種が数字の上で重要であり、１０種の異なる属に属している。属特異的プ ローブは一般に集団構造を描出するのに適していることが証明できる。しかし、 表現形質に基づく細菌に対する自然分類系は、必ずしも遺伝学的方法とは一致し ないことが知られている；すべではないにしても、分類学的な属はそれらの１６ S rRNA配列に基づくと単系統である；例えば、真性細菌類（Eubacterium spp.） は幾種かのクロストリジウム(Clostrldium)およびペプトストレプトコッカス(Pe ptostreptoccus)とクラスターを作り、ペプトストレプトコッカス自体は幾種か の識別し得る系統分類クラスター上に展開する（図１）；しかし、これらの系統 分類クラスター内には保存領域を同定することができるし、このような領域のた めに設計した１６S rRNAを使用すると、明確に定義された分類学レベルで集 団の主要部を同定することができる。このように、一定数のプローブがあれば腸 管フローラの種々系統分類群の算出が可能である（図１）。 リボソームの多くのコピーは十分なシグナルを確実にすべきであるけれども、 現実はしばしば理想とかけ離れている。標的領域への接近し易さ、プローブに結 合した蛍光色素の数と種類、ハイブリッド形成温度、細胞の代謝状況、および非 標的細胞が自ら発する蛍光のレベルが十分な特異的蛍光シグナルを得る上での重 要なファクターである。成長の遅いrRNA量の少ない小さな細胞のためには、CCD- カメラの形態のような光学的機器がしばしば必要となる。画像分析は非消光性自 己蛍光体と急速に消光する蛍光色素蛍光体との間の識別に非常に有効である。こ のような蛍光寿命を画像化する技術を用いて、ほんの二三個がハイブリッド形成 した細胞をも数千もの非標的細胞の中から顕微鏡下に識別することができる（原 稿作成中）。この技術は集団の中の少数派を形成している細菌クラスターを数え 出すのに必要である（例えば、ストレプトコクシ（Streptococci））。 材料と手法 細菌の維持 細菌は、嫌気条件下のＣＭＣ（Chopped Meat Carbohydrate）培地を用いて（ Ｈｏｌｄｅｍａｎら、１９７７）、室温で継代的に維持した。培地は隔月で交換 した。また、嫌気条件下、−２０℃の脱脂粉乳中でも細菌の維持を行った。ハイ ブリッド形成を行う前に、新鮮な菌液をペプトン／酵母エキス／グルコース（Ｐ ＹＧ）培地を用いて(Ｈｏｌｄｅｍａｎら、１９７７)、３７℃で培養した。 プローブの開発 １９９４年６月１８日付けのＲＤＰデータベースから、１１３種の糞中細菌に おける１６ＳリボゾームＲＮＡの塩基配列を得た(Ｌａｒｓｅｎら、１９９３)。 これらの細菌の大半は人糞から検出されることで知られている(Ｂａｒｒoｗら、 １９８５)。これらの細菌の配列を比較するキムラ２パラメータ距離解析は、Ｋ ｕｍａｒら(１９９３)の分子進化遺伝子解析プログラム（ＭＥＧＡ）バージョン １．０２により行った。得られた系統発生的クラスターにおける様々な種の距離 樹（Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ Ｊｏｉｎｉｎｇ）をＲＤＰデータベースの系統発生的 分類(Ｌａｒｇｅｎら、１９９３）と比較した。その結果、顕著なクラスターの 相違は見い出されなかった。したがって、１５のクラスターが決定された(図１) 。個々のクラスターのそれぞれに対する非反復配列を同定し、平均的な糞試料中 の、各クラスターに対するプローブとハイブリダイズすると思われる細胞数の概 算値を得た。集合の中で陽性にハイブリダイズする割合が１〜２５％の間であっ た場合に、プローブの特異性を有効とであると判断した。単一の種が全腸内細菌 叢の大部分を構成すると予想される場合は、種特異的プローブを当該種に対して 開発した。 プローブ特異性の試験 プローブの特異性はＣｈｅｃｋプローブコマンド（Ｌａｒｓｅｎら、１９９３ ）を用い、完全なＲＤＰデータベースに対して試験した。そして、糞中細菌の全 系統発生的クラスター内の細菌に対して、最低２つのミスマッチが確認されれれ ば、特異性は十分であると判断した。さらに、標的同定手段（図１）に含まれる １１３種のサブセットを代表する８６の細菌（表１）から成る基準収集物を培養 し、これら８６種に対して全細胞in situハイブリッド形成を行った。この目的 の為、対数増殖期の細胞を体積比３％のフォルムアミドで固定した。４℃におい て１０分間保存した後、細胞を適度に付着させるために、Ｖｅｃｔａｂｏｎｄ^TM （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇaｍe、ＣＡ）で前 処理を施したスライドガラスに、固定された細胞懸濁液１０μｌを滴下した。４ ５℃で２０分間乾燥させた後、乾燥させた細胞標本を、濃度勾配をつけたエタノ ール系列（５０％、７５％、および９８％エタノール、各２分間）において脱水 した。０．２μｍ孔のフィルターで濾過したハイブリッド形成用緩衝液１２μｌ を、細胞標本に加えた。ハイブリッド形成用緩衝液は、０．９ ＭＮａＣｌ、２ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ(ｐＨ７．５)、および０．１％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫 酸ナトリウムからなる。ＦＩＴＣラベルした８ｎｇ．μｌ^-1のプローブを加えた 後、標 本をカバーガラスで覆った。スライドを、緩衝液で充填したハイブリッド形成装 置内で４５℃で１５〜２０時間インキュベートした。ハイブリッド形成後、スラ イドを、５ｍｌのハイブリッド形成用緩衝液中で、４５℃、１５分間洗浄し、風 乾させ、その後、封入液中に浸漬した。この封入液は、グリセロールとＰＢＳ緩 衝液（８グラム毎リットルＮａＣｌ、０．２グラム毎リットルＫＣｌ、１．４４ グラム毎リットルリン酸二ナトリウム、０．２４グラム毎リットルリン酸一カリ ウム）との体積比１：１混液に２．５％ＮａＩを補充したもので構成されている 。 スライドは、水銀アークランプ(ＨＢＯ １００Ｗ，Ｏｓｒａｍ，Ｇｅｒｍａ ｎｙ)、５０倍ＰＬフルオター対物レンズ(Ｌｅｉｔｚ)、１２／３（青色光励起 ）フィルターブロック、および冷却されたＣＣＤカメラ（Ｌｏｒａｌ，Ｆａｉｒ ｃｈｉｌｄ ＣＣＤ ５０００／Ｌ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を装備したＯ ｒｔｈｏｐｌａｎ^TM蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察し た。このカメラ用の露光拡大システムについては以前に記載されている通りであ る(Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９３)。使用された画像解析ソフトは、Groninge n Reduction of Image Data（ＧＲＩＤ）システム（Ｍｅｉｊｅｒら、１９９１ 、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９４）である。蛍光測定は以前に記述された免疫 蛍光パッケージ（Ｊａｎｓｅｎら、１９９３）を用いて行った。表面蛍光シグナ ルは、退色しないウラニルガラスの対照を用いて補正した(１６）。それぞれの 視野の位相差および蛍光像が得られた。各細菌の形状は、位相差像から自動的に 決定された。各対象物の蛍光発光は、蛍光像中の対応する領域から決定した。こ の手法を用いると、蛍光発光しない対象物が排除されることが避けられる。蛍光 像はカメラを用いて露光時間１２秒で記録した。顕微鏡スライド毎に２５０〜５ ００個の対象物を測定した。それぞれのスライドについて、ネガティブコントロ ール（自家蛍光）を測定し、その蛍光分布の第９５百分位数を閾値とした。位相 差照射下で検出された対象物の総数に対する、閾値以上の蛍光強度を示し、ハイ ブリッド形成が陽性であった対象物の割合をハイブリッド形成百分率とした。こ の百分率は、プローブの能力の評価する為に決定し、純粋培養で行った。 全細胞in situハイブリッド形成と糞標本の系統発生的クラスターの枚挙 系統発生的クラスターおよび糞中の全嫌気性細菌の定量のために、健康なボラ ンティアの人達から大便の試料を収集し、次のような処理を行った。排便された ばかりの新鮮な均質化した糞便１ｇを、０．２μｍ孔径のフィルターで濾過した ＰＢＳ ９ｍｌに懸濁した。この懸濁液を、濾過済ＰＢＳで１０倍に希釈し、十 分に混合した。デブリを除去後(３５０ｘｇ；２分間)、上清を回収し、新鮮な４ ％パラフォルムアルデヒド溶液を用いて、４℃で一晩固定した。固定した細胞懸 濁液１ｍｌから得た細胞をフィルターに通したＰＢＳ緩衝液１ｍｌで２度洗浄し (８，０００ｘｇ；５分間)、ＰＢＳ緩衝液とエタノールの混合液（１：１）１ｍ ｌに懸濁した。−２０℃で１時間保存後、細胞懸濁液５μｌを、５０μｌの予め 温めておいたハイブリッド形成用緩衝液に加え、ＦＩＴＣで標識したプローブ５ μｌを加えた。細胞は、５０℃、１６時間でハイブリッド形成させた。細胞は、 １０ｍｌのハイブリッド形成用緩衝液に再懸濁後、０．２μｍ孔径のポリカルボ ン酸メンブランフィルター、Ｉｓｏｐｏｒｅ^TM（ミリポア社、Ｕ．Ｓ．Ａ）上で 濾過し、１０ｍｌの温かい（５０℃）ハイブリッド形成用緩衝液（５０℃）で２ 度洗浄した。フィルターは、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ^TMを用いてスライド上に封 入し、ハイブリッド形成した細胞は、オリンパスのＢＨ２顕微鏡を用いて目視に て計数した。この顕微鏡は、ＤＰｌａｎＡｐｏ１００ＵＶＰＬ対物レンズ(１０ ０ｘ、Ｎ．Ａ．１．３０)と、ＨＢＯ１００高圧水銀電球と、ｅｘｔｒａ ＥＹ ４５５励起フィルターを備えたＩＢ青色光励起ブロックとを装備している。便中 に存在する細菌の総数は、紫外線励起フィルターブロックを用いての照射下で、 ０．５μｇ．ｍｌ^-1 （ｗ／ｖ）の４'，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎ ｙｌｉｎｄｏｌｅ （ＤＡＰＩ）をＤＮＡとして用い、ＰｏｒｓｔｅｒとＦｅｉ ｇ（１９８０）の方法により決定した。顕微鏡によるいずれの計数値も、一度の 解析あたり最低３００個の細胞を用いて２度計数を行うことによって決定した。 lactobacillus種のin situハイブリッド形成のための特別な前処理の手順 多くの細菌が、蛍光プローブとハイブリッド形成したときに、高レベルの蛍光 を示す(Ｌａｎｇｅｎｄｉｊｋら、印刷中)。しかしながら、lactobacillus属の メンバーはハイブリダイズしにくい。この属の純粋培養では、とても低いレベル の蛍光しか見られず、一般的に５０％以下の細胞しかバックグラウンド値以上の 蛍光発光を示さない(Ｌａｎｇｅｎｄｉｊｋら、印刷中)。そのような結果は、ラ クトコッカス、ストレプトコッカス、そしてエンテロコッカスのようなグラム陽 性球菌でもまた報告されている(Ｂｅｉｍｆｏｈｒら、１９９３、Ｓａｌａｍａ ら、１９９１)。これらの細胞の低い透過性がグラム陽性の性質のみによるもの でないことは、クロストリディアやビフィドバクテリアの両方が、通常のハイブ リッド形成の条件下で、１６Ｓのプローブと共に高い蛍光発光を示すという事実 我々は、ラクトバチリ（lactobacilli）の全細胞in situハイブリッド形成を 行うためのプロトコールを開発した。このプロトコールでは、標準全細胞蛍光in situハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）のプロトコールの前に、以下に示すリゾザ イム／リパーゼ処理を行う。 Ｌａｂプローブの特異性の決定 １０のlactobacillus菌株および２６の対照菌株（表２および３参照）の対数 増殖中期の培養液１ｍｌの細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのプレリシス緩衝液に 懸濁した。ＰＢＳは、８ｇ．ｌ^-1ＮａＣｌ，０．２ｇ．ｌ^-1ＫＣｌ，１．４４ｇ ．ｌ^-1Ｎａ₂ＨＰＯ₄，０．２４ｇ．ｌ^-1ＫＨ₂ＰＯ₄からなる。プレリシス緩衝液 は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７．５)，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５８５Ｍシュ クロース，５ｍＭ塩化カルシウム，０．３ｍｇ．ｍｌ^-1タウロコール酸ナトリウ ム，５ｍｇ．ｍｌ^-1リソザイム，０．０３１ｍｇ．ｍｌ^-1膵臓由来リパーゼから なる。細胞は３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、エタノー ル−ＰＢＳ（１：１）中で１時間固定した。この懸濁液１０μｌをガラススライ ド上で乾燥させ、熱固定を行った。その細胞標本を、濃度勾配をつけたエタノー ル系列（７０％と９６％、各３分間）中で脱水した。ハイブリ ッド形成用緩衝液１０μｌとＦＩＴＣラベルしたプローブ（５０．μｌ^-1）１μ ｌを標本に添加した。ハイブリッド形成用緩衝液は、０．９Ｍ ＮａＣｌ，２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)，０．１％ドデシル硫酸ナトリウムからな る。その標本をカバーガラスで覆い、そのスライドを緩衝液で飽和したハイブリ ッド形成装置内で、５０℃で１６時間インキュベートした。その後、スライドを ５０℃、５０ｍｌのハイブリッド形成用緩衝液中で３０分間洗浄し、風乾後Ｖｅ ｃｔｒａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉ ｎｇａｍｅ、ＣＡ）中に封入した。この処理により、９０％以上の確率でハイブ リッド形成が確認された。 表２： Ｌａｂプローブの特異性試験に用いた対照菌株表３： Ｌａｂプローブの特異性試験に用いたラクトバシラス（lactobacillus）菌株 プローブ 全細胞in situハイブリッド形成及び糞サンプルからのラクトバチリの枚挙 糞便試料中のラクトバチリを枚挙するために、パラフォムアルデヒドで固定し 洗浄した細胞懸濁液を５０パーセントのエタノールに希釈する前に細胞をプレ・ リシス緩衝液に再懸濁し、３７℃、１時間静置すること以外は、「全細胞in situ ハイブリッド形成と糞標本の系統発生的クラスターの枚挙」以下に記載したのと 同じプロトコールに従った。細胞は、１ｍｌの濾過したＰＢＳ緩衝液中で２度（ ８，０００Ｘｇ，５分間）洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液とエタノールとの１：１混 合液１ｍｌ中に再懸濁し、前述した溶液中でハイブリッド形成を行った。 参考文献 結果 系統発生分析の結果、ヒト腸内細菌叢の優勢細菌種は１５の別個のクラスター に分布していた。これらのクラスターのうちのいくつかは、Bifidobacteriumお よびFusobacteriumなどの単一系統の属を構成していた。他のクラスターは、Clo stridiumcoccoides群の場合のように（larsenら、1993）、Eubacterium,Clostri dium，Peptostreptococcusが入り混じったもので構成されていた。これらの別個 の各クラスターに対する非反復配列を同定し、プローブがハイブリッド形成した と思われる全集合の百分率を評価した。Peptostreptococcus anaerobiuisの場合のように、ある細菌種が集団の大部分を構成すると予想され る場合、または、Bacterioides distasonisのように、クラスター−プローブ内 に細菌種が含まれないと思われるとき、それを種特異的プローブとした。 以下のプローブが開発された。 １．Clostridium hystolyticum亜群プローブＨｉｓ５ は、Clostridium putrificum, C. butyricum, C. barati,C. carnis, C. botulo num,C．novyi, C. sporogenes,C. putrifivum, C. tyrobytyricum, C. scascato logenes,C.scatologenes, a proteolyticum, C.limossum, C. sardiensis, C. perfrinigens, C. beijerinckii, C. acebutylicum, C. puniceum, C. cellulovorans, C. paraputrificum, C. thermobutyricum, C. thermopalmarium , C. subterminale,C. argentinense, C. estertheticum, C. pasteurianum, C. histolyticum, Eubacterium budayi, E. delafieldii, E. moniliforme, E. multiforme, E. nitritogenes, E. tarantellusおよびFlexibacter canadensis に対しての完全な相補性を有する。 ２．Clostridium lituseburense亜群プローブＬｉｔ１３５ Clostridium difficile, C. bifermentans, C. sordellii, C. ghoni, C. lituseburenseおよびC. mangenottiに対しての完全な相補性を有する。 Ｔｄ＝５５．４℃。該プローブは、Peptostreptococcus micros, P.tetradius,P ．vagjnalisおよびEpilopiscium morphotye Al.に対しての完全な相補性を有す る。 Ｔｄ＝６０．２℃。該プローブは、Peptostreptococcus anaerobiusおよび Peptostreptococcus sp．C.に対しての完全な相補性を有する。 Ｔｄ＝６０．２℃。該プローブは、Fusobacteriumsimiae, F. nucleatum, F. alocis, F. russii, F. gonidoformans, F. necrophorum, F. varium, F. mortiferum, F. perfoetens, Propionigenium modestum, Leptotrichia buccali sおよびSebalcella termitidisに対しての完全な相補性を有する。 また該プロ ーブは、標的領域に１つの未知の塩基を有する細菌種であるF. ulcerans, F. periodonticumおよびF. necrogenesともハイブリダイズしうる。 Ｔｄ＝５６．１〜５８．２℃。 該プローブは、Lactobacillus acidophilus, L .acidophllus subsp. johnsonii, L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbruec kii subsp. delbrueckii, L. brevis, L. salivarius subsp. salicinius, L. amylovorus, L. acetotolerans, L. oris, L. hilgardii, L. kefir, L. mali, L.animalis, L. murinus, L. ruminis, L. agilis, L. sharpeae, L. gasseri, L.amylophilus, L. reuteri, L. fermentum, L. sake, L. sanfrancisco, L. fructivorans, L. plantarum, L. bifermentans, L. coryniformis, L. caseisu bsp.casei, L. casei subsp. rhamosus, Leuconostoc lactis, Lc. mesenteroid es subsp. mesenterojdes, Lc. mesenteroides subsp. cremoris, Lc. oenos, E nterococcus faecalis, E. columbae, Periococcus pentosaceus, P. acidilact ici, Streptococcus cecorum, Vagococcus fluvialis, Vsalmoninarium, Weissella c onfusaおよび W. kandleriに対しての完全な相補性を有する。 ７．Streptococcus/LactococcusプローブSｔｒ４９３ sanguis, S. salivarius, S. bovis, S. pneumoniae, S. parasanguis, S. acidominimus, S. dysgalactiae, S. anginosus, S. vestibulariis, S. equinu s,S．alactolytiens, S. downei, S. sobrinus, S. rattus, S. cricetus, S. hyointestinalis, S. agalactiae, S. suis, S. porcinus, S. canis, Spyogene s, Lactococcus lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris, L. pisci um, L. raffinolactis, L. plantariumおよびL. garvieaeに対しての完全な相補 性を有する。 該プローブは、標的領域に１つまたは２つの未知の塩基を含む Streptococcus oralis, S. intermedius, S. macacae, S. mutans, S. anginosu s,S. criaeおよびS. equiを検出するためにも用いることができる。 Ｔｄ＝５７.０℃。該プローブは、Bacteroides eggertii, B. thetaiotaomicron , Hovatus, B. fragilis, B. uniformisおよびB. vulgatusに対しての完全な相 補性を有する。 Ｔｄ＝５８．０℃。 該プローブは、Bacteroides distasonisに対しての完全な 相補性を有する。 １０．マイコプラズマの細胞壁を有する系統群IIプローブＣｙ１３８７ cylindroides, E. tortuosum, E. dolichum, E. biforme, Clostridium innocuu mおよびStreptococcus pleomorphusに対しての完全な相補性を有する。 ９.０℃。該プローブは、Atopobium minutum A. parvulum, A rimae, Eubacteri um lentumとの、またおそらくはE. fosser(標的領域内に１つの未知の塩基があ る)に対しての完全な相補性を有する。 １２．Clostridium coccoides群プローブＲｅｃ４８４ contortum, E. formicigeneransm, E.rectale, E. ventriosum, E. cellulosolv ens, E. eligens, E. fissicatena, E. hadrum, E. halii, E. saburreum, E. unifor me,E. Ventridiiforme, E. xylanophilum, Closteridium aminovalericum, C clostridiiforme, Cnexile, C. oroticum, C. lentocellum, C. symbiosum, C. aminophilumn, C. xylanolyticum, C. sphenoides, C. celarecrescens, Ruminococcus hansenii, Epulopiscium sp. str. morphotypes A2 and B, Acetitomaculum ruminis, Lachnospira pectinoschiza, L. multiparus, Rosebu riacecicolaとの、またおそらくはClostridium coccoides（未知の塩基）に対し ての完全な相補性を有する。 ８.０℃ 。該プローブは、Ruminococcusの生産物およびRuminococcusu hansenii に対しての完全な相補性を有する。 １４．Clostridium leptum亜群プローブＬｅｐは、Eubacterium siraeum, E. plautii, E.desmolans, Clostridium sporospaeroides, C. leptumおよびC. cellulosiに対しての完全な相補性を有する。 ｄ＝６０．２℃。 該プローブは、Bifidobacterium longum, B. pseudolongum, B.suis, B. infantis, B. indicllm, B. breve, B. adolescents, B. catenula tum, B. minimumに対しての完全な相補性を有し、またおそらくはB. bifidum, B . dentium, B. coryneforme, B. asteroides, B. globosum, B. magnumおよびGa rdnerella vaginalisが標的領域内に１つまたは２つの未知の塩基を有することから、これ らの細菌種に対しても完全な相補性も有する。 図１に示すように、これらの１５のクラスターが選ばれた。 融解温度（Ｔｄ）は理論値である。 ハイブリッド形成は、通常約１〜５℃以下の温度でおこる。 配列は、５'→３'方向に示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ランヘンデイク，ペートラ シーモーネ オランダ国 エヌエル−9712 セーペー グロニンゲン ブロエルストラート ５ リュークスニベルシテイト グロニンゲン (72)発明者 ヤンセン，ヘイスベルト ヨハン オランダ国 エヌエル−9712 セーペー グロニンゲン ブロエルストラート ５ リュークスニベルシテイト グロニンゲン (72)発明者 ウィルキンソン，ミシャエル ヘンドリク フランシス オランダ国 エヌエル−9712 セーペー グロニンゲン ブロエルストラート ５ リュークスニベルシテイト グロニンゲン (72)発明者 エルフフリフ，ペーター オランダ国 エヌエル−9712 セーペー グロニンゲン ブロエルストラート ５ リュークスニベルシテイト グロニンゲン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．数種の微生物混合集団における個々の微生物種またな下位系統発生亜種の 相対的存在量の定量方法であって、以下の工程からなる方法： １）標識したインシチュー（in situ）ハイブリッド形成用クラスターオリゴ ヌクレオチドプローブのセットを調製する工程； ２）当該プローブを当該混合集団の標本とハイブリッド形成する工程； ３）標識された微生物数を定量分析する工程。 ２．当該プローブが蛍光物質で標識してある請求項１の方法。 ３．当該プローブが標的微生物の１６S rRNAに基づくものである請求項１また は２の方法。 ４．当該定量分析を顕微画像分析にて実施する前記請求項のいずれかの方法。 ５．当該プローブが微生物の系統発生的クラスターに特異的である前記請求項 のいずれかの方法。 ６．当該系統発生的クラスターが属または種である請求項５の方法。 ７．当該微生物がバクテリアである前記請求項のいずれかの方法。 ８．混合集団が特に哺乳類、とりわけヒトの常在腸管フローラ由来のものであ る前記請求項のいずれかの方法。 ９．混合集団における個々の微生物種の相対的存在量動態を分析する方法であ って、前記請求項のいずれかの方法を、一つの集団から異なった時期に採取した 標本につき少なくとも２度実施することを特徴とする方法。 １０．標本を前処理および/または精製処理する前記請求項のいずれかの方法 。 １１．少なくとも二種の異なったプローブに異なった標識物を備える前記請求 項のいずれかの方法。 １２．クラスターに特異的なプローブであって、前記請求項のいずれかの方法 に使用する少なくとも一種の標識物を備えているプローブのセット。 １３．バクテリア１６S rRNAから誘導される請求項１２のプローブのセット。 １４．標識物が蛍光物質である請求項１２または１３のプローブのセット。 １５．異なった標識物を備える少なくとも二種の異なったプローブを含む前記 請求項１２−１４のいずれかのプローブのセット。 １６．数種の微生物混合集団における個々の微生物種の相対的存在量を定量す るためのキットであって、請求項１２〜１５のいずれかのプローブのセットと、 標本を前処理するのに適当な物質および／またはハイブリッド形成を実施するの に適当な物質および/またはハイブリッド形成の結果を分析するための適当な物 質とを含むキット。