JP2003500009A

JP2003500009A - 増幅および制限酵素分析を使用する微生物の検出および定量

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Publication number: JP2003500009A
Application number: JP2000602816A
Authority: JP
Inventors: ハーリンゲン，ヘンドリックファン; ハーリンゲン，ウィレムアンネファン
Original assignee: ドクトルファンハーリンゲンラボラトリウムベー．フェー．
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2003-01-07
Also published as: EP1155148B1; DE60025906T2; CA2367587A1; NZ513848A; EP1155148A1; IL145179A0; AU779813B2; MXPA01008847A; BR0008665A; AU2948000A; WO2000052206A1; EP1605062A1; DE60025906D1; ATE317455T1; US20030143531A1; DK1155148T3; US6495325B1

Abstract

(57)【要約】家畜においては、たとえば単一の微生物による感染に起因するとは思われない多数の病理学的状態および／または症候群が認められている。しかしながら、これらの症候群は、細菌叢を構成する種々の細菌内で通常存在している平衡に対して影響を有しているように思われる。これらの多数の症候群は細菌異常症または細菌過剰増殖と称される。家畜の「総合的な」健康を少なくとも部分的に評価できるように、本発明は微生物学的叢の構成を分析する手段および方法を提供する。１つの局面では、本発明の方法は、上記叢の試料を提供し、該試料中に存在する核酸を選択的に増幅し、この増幅物を制限消化に付し、そして得られた制限フラグメントのパターンを分析することを含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は一群の個体、特に脊椎動物、さらに典型的には哺乳動物および／また
はトリ、たとえば家畜の病理学的状態もしくは他の障害状態または総合的な健康
の診断方法および手段に関する。本発明はさらに、多様な微生物学的生物を含ん
でいる物質、たとえば、食品、食品添加物、廃棄物、土壌等であるが、これらに
限定されない物質を微生物学的に分類する方法および手段に関する。本発明は、
微生物学的集団の供給源として糞便を使用することによって例証される。しかし
ながら、本発明の方法および手段は他の供給源から得られる微生物学的集団にも
同等に適用することができる。

【０００２】家畜においては、たとえば単一の微生物による感染に起因するとは思われない
多数の病理学的状態および／または症候群が認められている。しかしながら、こ
れらの症候群は、細菌叢を構成する種々の細菌内で通常存在している平衡に対し
て影響を有しているように思われる。これらの多数の症候群は細菌異常症または
細菌過剰増殖と称される。

【０００３】これら症候群の存在に関して考え得る説明が理論で拘束されることは望まない
が、これらの疾病は下記によって生じる可能性がある：１．飼料摂取／飼料のタイプ飼料は消化に干渉し、その結果細菌に変化が生じる：或る特定の細菌または細菌
群は豊富かつ圧倒的であり、或る特定の細菌または細菌群は阻害されそして生存
できない。２．１つ（またはそれより多く）の細菌種の侵入これら細菌自体が病原性である必要はないが、細菌叢内の均衡を乱す。３．１つ（またはそれより多く）のウイルスまたは真菌種の侵入４．免疫低下５．温度や湿度のような環境的な影響。

【０００４】典型的には、これらの症候群は動物の総合的な健康や行動に影響を有しており
、そしてしばしば動物群全体に対してさえ影響を有している。家禽では、腸内細
菌叢の状態に直接関連した臨床的症状を示す多数の症候群さえ存在する。それ故
、家畜集団の総合的な健康を点検できることが重要でありそして／または、たと
えば家畜群（集団、フロック）でこのような病気と特定される病理学的状態の存
在を少なくとも決定する手段を有することが重要である。

【０００５】細菌不均衡に関連した症候群の例は、たとえば仔ウシの脂肪便症、ブタの回腸
炎、そしてさらにまた離乳時の下痢、家禽の下痢である。

【０００６】本発明は、たとえば腸内細菌叢における平衡の存在または不存在を決定するた
めに、特に腸内細菌叢の正常な構成物のセットと比較して、該腸内細菌叢内に存
在する種々の細菌の（相対的な）存在量（アバンダンス）ならびに実際の量の（
推計値）を決定する新規な手段（例えばキット）および方法を提供する。本発明
より前には、細菌叢の分析は古典的な細菌学で使用される方法で行われた。古典
的な細菌学は種々の細菌株の培養および同定に基づいている。好気性および嫌気
性増殖、前増菌等を含む種々の方法が使用される。さらに、試料中に存在する細
菌の数に関する情報を得るために、コロニー数の計数が一般的に使用されてきた
。

【０００７】これらの方法を使用すると、今日までに細菌の推計で２０％しか単離されずそ
して特徴付けられていない。これらの古典的な細菌技術では（ならびに他の微生
物、たとえばウイルス、酵母または真菌を検出する技術では）、１つの疾病が１
つの原因作用物を有しているかまたは少なくとも１つのもしくは異なる２，３の
作用物が異常な疾病を引き起こす手段となっていると考えることができるとの見
解はほぼ自明の理である。しかしながら、これらの古典的な洞察では、腸管内の
「健康な」平衡の存在または不存在の洞察を得ることに関して実際的な方法は何
も提供されない。

【０００８】かくして、本発明は、腸管内の微生物学的（たとえばウイルス、真菌、酵母ま
たは細菌）叢の試料を提供し、該試料中の核酸を選択的に増幅し、この増幅物を
制限消化に付し、そして得られた制限フラグメントのパターンを分析することを
含んでいる、腸管内の上記叢の構成を分析する方法を提供し、これによって、た
とえば異常な疾病状態下で、生物を同定する必要なしに、既知および未知の細菌
、真菌、ウイルス等の叢構成成分間における相互関係の検出が提供される。上記
核酸は選択的に増幅されるが、これら核酸は通常、上記試料中に存在するできる
だけ多くのまたは大部分の微生物種から得られ、そして所望のときには、任意の
同定を提供するために、上記試料中に存在する可能性のある既知の生物種または
それらの部分の特異的な増幅が補充される。典型的な結果には、増幅フラグメン
ト（これらは制限に付されていることができる）の１つまたは複数のクラスター
の検出が含まれ、その際或るパターン（たとえば分子量によって決定される）内
に位置するかまたはそこで検出される上記フラグメントによって特定の（クラス
ター）パターンの認定が可能になる。これらは種々の試料で同一であることがで
き、異なっていることができ、または追加的なクラスター（典型的にはほぼ同じ
大きさのフラグメント）を補充されていることができる。典型的には、試料が「
正常な」集団を表しているとき、良好に均衡のとれたクラスターパターンを見る
ことができ、一方、例えば細菌異常症または過剰増殖が生起しているときには、
１つのクラスター（通常は１つの微生物を表している）が、典型的には他のクラ
スター（他の微生物を表している）に有害となって、過剰に表されている可能性
がある。

【０００９】試料は典型的には糞便または生検に由来することができ、そして多くの場合に
は死後に採取することができる。好ましくは、試料は、叢内の差異が診断されそ
して／または分析される状態に起因しそして一時的な飼料または他のものの変化
に起因しないように、反復可能な条件下で採取される。死後試料および生検は腸
管内の同一領域から採取すべきである。この技術を本発明によって提供されてい
るようにして使用するとき、この技術は本質的に、問題となっている一時的な原
因微生物の単なる同定ではなく、上記叢における異常または適合状態（病気であ
るかまたは病気ではない）に関して平衡を示すことができかつ同じかまたは異な
るフロックに由来する動物の類似パターンの同定を可能にする分析結果において
異常なパターンを認定するものである。明らかに、古典的な技術は、たとえば多
因子疾病パターンに関係のある叢内パターンに注意を払っているのではなく、通
常は１つまたはそれより多くの異常な原因作用物を同定するように試みており、
そしてこれら原因作用物は一般的に、特定の微生物またはこれらの特定の構成成
分を検出するために、予め定められた特定の検出手段、たとえば核酸プライマー
またはプローブ、抗体等を使用した後に探求されている。たとえば、米国特許５
，５４３，２９４；日本特許０５３１７０９６；ラトクリッフ（Ratcliff）等
、Path. (1994) 26:477〜479；ウッド（Wood）等、Appl. Env. Microb. (1998)
64:3683〜3689；および米国特許５，５７１，６７４中において、これらは全て
特定の細菌または特定の属若しくは科に属する細菌の同定方法に関して特定のそ
して直接的な示唆を与えているが、試験試料中に存在しているかまたは存在して
いる可能性のある他の微生物には注意を払っておらず、これは明らかに、彼等が
叢の内容物全体に関心があるのではなく、そのなかの特定の微生物にだけ関心が
あることを示している。それ故、彼等は既知および未知の細菌、真菌、ウイルス
等のような叢構成成分間の相互関係は決して検出できないであろう。

【００１０】細菌学の分野では、本発明はたとえば、問題の細菌種の品質管理、同定および
定量用の手段、ならびに高度に病原性でかつ致死的な細菌種の存在／不存在を検
出するための手段、または新たな、これまでに知られていない細菌を検出するた
めの手段を提供する。本発明は、たとえば任意の与えられた試料中の細菌全体に
関する情報を提供する。この技術の性質のため、多数の同定されていない細菌が
増幅される。それ故、臨床試料を試験するとき、未知の細菌集団に由来し今まで
は同定することができなかった新たな細菌種が見いだされる。

【００１１】さらに、本発明は、細菌集団の分析を提供して品質管理方法を提供する。たと
えば、全ての下水処理施設において、細菌は廃水清浄化方法の一部として使用さ
れる。これらの系に存在する細菌の性質は、多くの理由により証明されなければ
ならない。これらの系に存在する細菌の性質および構成の分析は定期的に点検し
なければならない。次いで、得られた水も同様に証明されなければならない。こ
れらの点検は共に現在、「古典的な」方法を使用して行われており、そしてこれ
ら方法のなかには種々の条件下での培養がある。本発明は、この方法全体の品質
管理に関して迅速で、より良好な技術を提供する。本発明のさらなる利点は、本
発明による方法で試料を試験するのと同じ方法で既知の病理学的細菌（たとえば
、レジオネラ、サルモネラ種）を同定できることである。

【００１２】他の実施例では、本発明はブロイラーのような家畜の疾病または健康状態を試
験する方法を提供する。ブロイラーの腸管内細菌叢は飼料の組成によって影響を
受ける。ブロイラーの発育中、一般的に２回またはそれより多くの回で飼料の組
成が変更される。これは、飼料摂取と成長間の比率を最適化するために行われる
。飼料の変化によって、腸管内細菌集団も同様に影響を受ける。本発明による細
菌パターンの分析は飼料の変化による差異を示すであろう。

【００１３】他の実施例では、本発明は微生物カウントを含んでいる方法を提供する。多く
の場合に、細菌集団の培養は多くの目的や多くの研究プロジェクトで行われる。
しかしながら、特定の細菌群だけが視覚化されそして同定される（たとえば、全
ての大腸菌群を１つのグループとして）ことが知られている。本発明は、所望の
ときには、定量的であり、そして細菌培養に関する現在の使用を代替することが
できる。また、多くの場合に、腸管内疾病も同定が困難である。任意の器官また
は組織中の総細菌内容物の分析は、迅速で信頼性のある態様で行うことができ、
そしてヒトおよび動物の疾病の診断に一様に有用であることができる。

【００１４】さらに他の実施例は食品技術を構成する。食品製造方法または（生または発酵
）製品、たとえばソーセージもしくはチーズの品質管理においては、同じ製品が
一定レベルで製造されることが必須である。本発明は、細菌、ウイルスまたは真
菌種を検出でき、それによって製造条件が同じ手順であることを証明することも
できる方法を提供する。

【００１５】一般的に、試料は、核酸を増幅に利用できるようにするために予め処理し、た
とえばホモジネートしなければならないであろう。試料は、腸管を有しそして腸
管内に細菌叢を有する任意の脊椎動物から採取することができる。しかしながら
、哺乳動物およびトリ、特にヒトおよび家畜、特にウシ、家禽および他の家畜は
本発明の好ましい対象である。核酸の増幅は、腸内叢に存在する全てのまたは少
なくとも代表的な数の微生物の代表的な増幅物が得られるようにプライマーを選
択しなければならない点で選択的であろう。プライマーが良好に選択される場合
、使用される増幅技術のさらなる詳細はさほど重要でないので、任意の増幅方法
を使用することができるが、ＰＣＲが好ましい。

【００１６】プライマーの長さおよび増幅条件は、試料、動物の種類、特異性の必要性等に
依存して当該技術分野の熟練者が決定することができる。典型的には、プライマ
ーは２０から３０ヌクレオチドの間の長さで変動し、そしてこれらは典型的には
、飼料採取される対象の腸内叢に存在する選択された微生物中に存在する核酸配
列、たとえば１６ＳｒＲＮＡおよび２３ＳｒＲＮＡに向けられるであろう。

【００１７】或る場合には、ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ（入れ子式ＰＣＲ）が有用であると思われ
る。

【００１８】増幅物自体は典型的には、それぞれの微生物の頻度／存在／不存在／等の良好
な分析を得ることができるほど十分な特異的フラグメントを与えないであろう。
そのため、それぞれの微生物から得られた核酸を多数の制限酵素による処理に付
すことによって、これら核酸をさらに識別することが重要である。このようにし
て、腸内叢における豊富さ、均一性、相対的存在量、量、簡単に言えば腸内叢の
状態に関して良好な分析の実施を可能にするのに十分な情報を含有するパターン
が得られるであろう。これは確かに、特定の微生物を同定する必要がない場合や
、得られたパターンを健康個体の既知のパターン、好ましくは確実性区間も示さ
れている多数の健康個体の平均と比較することで十分な場合には非常に容易であ
ろう。

【００１９】制限酵素は、関連情報を示しているフラグメントが得られるように選択すべき
であろう。熟練者は、まさに上記を行い得る１組の制限酵素を設計することがで
きる。典型的には、上記酵素は４〜８塩基対の配列を認識すべきであり、そして
それによって増幅物中に存在する情報を増強する選択的消化が可能になる。典型
的には少なくとも１０種の酵素が使用されるが、通常はせいぜい４個の酵素が必
要である。

【００２０】有用な制限酵素の例にはＣｆｏＩおよびＨａｅＩＩＩが含まれるが、これらに
限定されない。

【００２１】制限された増幅物の分析は、核酸、特にＤＮＡフラグメントの大きさ間を識別
できる任意の態様で実施することができる。当該技術分野の熟練者は、彼の目的
に最も良く適合する方法を選択することができる。分析しなければならない試料
が多い場合には、或る種の自動システムが勿論好ましい。自動分析システム用の
方法の良い例には、ＤＮＡフラグメントを分離しそして定量できることが必要で
ある。本発明の場合には、ＡＢＩプリズム（ABI Prism）（Perkin Elmer）が適
している。本発明の方法でパターンを分析できるためには、試料の増幅および制
限の結果を少なくとも１つの参照試料と比較することが好ましい。或る動物の現
在の状態（平衡）を総合的に健康であることが知られている同じ動物、別の動物
、または好ましくは動物群の健康な状態（平衡）と比較するために或る参照が利
用可能でなければならない。健康な状態に関して存在する情報が多ければ多いほ
ど、健康な腸内叢と病理学的状態に関連しているかまたは総合的な健康問題に関
連している叢間の差異がより容易に見えるようになる。勿論この比較は、試料が
、同一でない場合には類似する環境下で同一の方法で採取されているときに最も
信頼できる。試料間を直接比較することはしばしば必要でなく、一般的には或る
種の試験結果（数、バーコード、グラフ、パターン等）を比較することで十分で
あろう。

【００２２】細菌叢図の標準化は、たとえば次のようにして行うことができる。種々の目的のために試料を解釈できるように、家禽の腸管およびブタの糞便材
料の基線を確立する。

【００２３】基線用に使用される動物の選択はａ）年齢、ｂ）収容、ｃ）飼料（摂取）、ｄ）繁殖系、ｅ）臨床的な健康、ｆ）性、に依存する。

【００２４】最も重要な局面は、基線を構成している試料と試験される試料の比較可能性で
ある。それ故、上記で示したパラメーターの少なくとも幾つかを目盛付けするこ
とが必要である。

【００２５】多数の参照を得る容易な方法は、純粋な細菌培養物（腸内叢に存在することが
知られている細菌の）を、試料を処理する方法と同じ方法で増幅および制限に付
すことである。腸管におけるこれら細菌の存在および／または豊富さは、（多数
の）特徴的なピークの存在または不存在に基づいて決定することができる。

【００２６】本発明はまた、分析が上記腸内叢に含まれている微生物の相対的存在量を決定
するか、またはさらには、構成細菌について多くを知ることさえなく、パターン
がパターンの健康な変動範囲内であるのかどうかを単に決定することだけに関与
している本発明による方法も提供する。これは、一度健康なパターンの収集物を
入手できたときに、行うことができる。かくして、上記ピークがどの生物から生
じているのかを知ることなく、健康個体の叢に存在していることが知られている
ピークの相対的存在量および存在／不存在を単に測定するだけである。

【００２７】勿論、上記で言及した純粋な細菌培養物は、所望の場合、どのピークがどの微
生物に属するのかを同定する可能性を与える。このようなピークの、特に他の既
知のピークと比較した高さおよび／またはピーク下面積は、試料中に存在する或
る微生物の量の尺度である。かくして、本発明はまた、分析が上記腸内叢に存在
する少なくとも１つの微生物の量を決定することに関与している本発明による方
法も提供する。もう１つの実施態様では、本発明は、増幅用プライマー、消化用
の制限酵素、および任意に、少なくとも１つの純粋な細菌培養物に由来する材料
を含んでいる少なくとも１つの参照試料を含んでいる本発明による方法を実施す
るための診断用試験キットを提供する。好ましくはこのような試験キットは本明
細書で上記した少なくとも１つの参照パターンを含んでいる。

【００２８】本発明による試験キットに含めるのに適しているプライマーは整列した配列か
ら誘導されるプライマーである。この配列情報は、プライマーを発生させること
ができる相同配列の選択を可能にする。好ましくは、プライマーはリボソームＲ
ＮＡ配列から選択される。好ましくは少なくとも１つのプライマーは配列５’−
ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’またはその機能的フラグメン
トおよび／もしくは誘導体を含んでいる。機能的な誘導体またはフラグメントは
、増幅後に同一または類似の核酸が得られるように、元の配列が塩基対合してい
る配列と、または元の配列の近くで非常に密接している配列と塩基対合している
配列を有するプライマーである。

【００２９】もう１つの好ましいプライマーは配列５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲ
ＡＧＴＴＴ−３’またはその機能的フラグメントおよび／もしくは誘導体を含ん
でいる。

【００３０】本発明はまた、本明細書で上記した腸内細菌叢における平衡の存在または不存
在を決定するために本発明による試験キットを使用することも提供する。本発明
はまた、腸内細菌叢における平衡の存在または不存在を決定するために本発明に
よる方法を使用することも提供する。

【００３１】本明細書において使用する、用語「腸内叢」は、消化管、たとえば腸管、胃、
食道、口もしくは口先、または消化管の他の部分もしくは消化管に近接した他の
部分に存在する叢を意味する。

【００３２】本発明の手段および方法は一般的に、多種多様な微生物学的生物を含有してい
る疑いのある微生物学的試料の分析に適している。微生物学的生物の例は任意の
種類の細菌、ファージ、ウイルス、真菌または酵母である。微生物学的叢の試料
は多様な微生物を含有している疑いのある任意の供給源から得ることができ、好
ましくは上記試料は消化管から、最も好ましくは腸管から得られる。当該技術分
野の熟練者には、本発明の手段および方法を使用して、核酸含有食品中の植物お
よび哺乳動物材料の種類を決定しそして／または追跡できることも明白である。
当該技術分野の熟練者には、開示された方法および手段は腸管細菌叢に限定され
るものではなく、多数の異なる供給源、たとえば食品試料、食品添加物、廃棄物
、土壌等から得られる微生物学的叢の分類に実際に適していることが明白である
。

【００３３】用語「叢」によって、微生物学的生物の集合が意味される。用語「細菌叢」に
よって、消化管、好ましくは腸管に、存在する、該管から得られる、または該管
に由来する叢が意味される。

【００３４】本発明は以下の実験の部でさらに詳細に説明されよう。材料および方法試料採取腸管の部分は死後検査中に単離し／入手した。たとえば家禽では、膵管の出口とメッケル憩室間の回腸の良好に特定された部
分を使用した。内視鏡検査を使用して、生存中に腸管の特定の部分から試料を収集する。糞便は生存個体から入手した。

【００３５】保存および輸送試料は収集後直ちにドライアイスに入れてそこで維持し、そして実験室に輸送
した。実験室に到着すると、試料は−２０℃で貯蔵した。

【００３６】材料＊溶解緩衝液ＤＮＡ抽出（ｐＨ６．４）１４２．５ｇＧｕＳＣＮ４．８ｇトリス１．６３ｇＥＤＴＡ水を加えて２００ｍｌとする＊洗浄溶液ＤＮＡ抽出（ｐＨ６．４）１４２．５ｇＧｕＳＣＮ４．８ｇトリス水を加えて２００ｍｌとする＊ＤＥ溶液ＤＮＡ抽出０．７５ｍｌＨＣｌ３５％１０ｇ珪藻土水を加えて５０ｍｌとする

【００３７】試料調製１．試料取扱いａ．腸管特定の位置の概ね２ｃｍは、小刀を使用して縦方向にスライスした。全内容物
を無菌管に移した。ｂ．内視鏡生検および糞便材料試料は無菌管に移した。２．均質化手で振とうして混合し、そしてこれは物質が視覚的に均質になるまで実施した
。３．ＤＮＡ抽出ａ．量概ね０．２ｇの均質材料を使用した。水性試料の場合には、概ね２５０μｌの
容量を使用した。ｂ．ＤＮＡ抽出

【００３８】ＤＮＡ抽出は一般的にブーム（Boom）の方法に従って実施した。＊溶解緩衝液１ｍｌを上記均質試料に加えた。この懸濁物を３０秒間撹拌し、
そして室温で１時間放置した。＊上記懸濁物を１５０００〜１７０００ｇで２０秒間遠心分離した。＊上清液は、ＤＥ溶液５０μｌを含有する無菌管に移した。この懸濁物を３０
秒間撹拌し、そして１５０００〜１７０００ｇで２０秒間遠心分離した。＊上清液を取出した後、５段階の洗浄を行った：１．２００μｌ洗浄溶液、２．２００μｌ洗浄溶液、３．２００μｌ７０％エタノール、４．２００μｌ７０％エタノール、５．２００μｌアセトンｐ．ａ．＊ペレットを５６℃で１５分間風乾した。＊ペレットを７５μｌのｄｄＨ２Ｏ中に再度懸濁した（３７℃で１夜）。＊最後に、上清液を新たなエッペンドルフカップに移し、そして４℃で貯蔵し
た。

【００３９】ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応は、ａｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（０．０７
単位／μｌ）；プライマー（１．３ｍＭの前進および逆プライマー）、ｄＮＴＰ
（２００ｍＭ）ならびに６０ｍＭＫＣｌ、１２ｍＭＨＣｌｐＨ８．３および
１．８ｍＭＭｇＣｌ２を含有する１５μｌの総反応容量中で１．５μｌのＤＮ
Ａを使用して実施した。

【００４０】プライマーの配列：前進５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’ 標識ＦＡＭ逆５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ−３’ 標識ＴＥＴＰＣＲプログラム：９５℃で５分を１サイクル９５℃で３０秒５６℃で４５秒７２℃で２分を３５サイクル７２℃で５分を１サイクル両プライマーは、自動分析が可能になるように蛍光プローブで標識した。

【００４１】この反応の目的は、できるだけ多くの細菌生物を増殖することである。これに
よって一般的に約５０個のフラグメントが生じる。

【００４２】制限制限消化は種々の制限酵素、たとえばＨａｅＩＩＩＧＧ’ＣＣ、ＣｆｏＩ（＝ＨｈａＩ）ＧＣＧ’Ｃ、ＴａｑＩＴ’ＣＧＡ、ＨｉｎｆＩＧ’ＡＮＴＣ、ＭｓｐＩＣ’ＣＧＧ、ＰｓｔＩＣＴＧＣＡ’Ｇ、ＨｉｎＤＩＩＩＡ’ＡＧＣＴＴ、を使用してＰＣＲ産生物に対して実施した。

【００４３】分析ＤＮＡフラグメントのサイズ分析は、蛍光標識したプライマーを使用してＡＢ
Ｉ３７７ＤＮＡシークエンサー（Sequencer）で実施した。ＡＢＩ３７７プリズ
ム・シークエンシング（Prism Sequencing）システム上のタン（tun）の条件は
次のとおりであった：３６ｃｍの良好に読みとれる距離を有するＡＢＩコレクシ
ョン・ソフトウエア・バージョン２．１；ランニング条件３０００Ｖ、６０ｍ
Ａ、２００Ｗ、収集時間５時間。

【００４４】サイズ分析はＡＢＩソフトウエアを使用して実施した。レーントラッキング（
Lanetracking）、ゼノタイパー（Genotyper）、データ分析は、ジーンスキャン
（GeneScan）３．１およびゼノタイパー２．０ソフトウエアを製造者の指示に従
って使用して実施した。

【００４５】純粋な培養細菌たとえばウエルシュ菌、黄色ブドウ球菌、マイコプラズマ・ガリセプチクム、
マイコプラズマ・シノビウム、オルニトバクター・リノトラキーレ、大腸菌、乳
酸桿菌族、腸球菌族および緑膿菌のような幾つかの細菌株を参照として使用した
。

【００４６】上記したポリメラーゼ連鎖反応は純粋な培養細菌で実施した。ＰＣＲ産生物の
大きさは各細菌に特異的である。制限酵素を使用して多数のフラグメントを同定することができる。

【００４７】ＰＣＲ後および制限酵素使用後のフラグメントの全体図から、純粋な培養物の
「パターン」が得られる。このパターンは、存在する細菌の量に依存して、任意
の腸試料で同定することができる。

【００４８】解釈１．豊富さ分析結果は、ＤＮＡフラグメントの大きさに対応するピークを示している図面で
視覚化される。これらのピークは一般的に細菌種に関係している。同定されたピ
ーク数は細菌種の総数を示すものである。純粋培養した細菌から得られた情報を
使用することによって、特定の細菌の存在または不存在に関する情報も提供され
る。２．均一性さらに、これらのピークは各ＤＮＡフラグメントの相対的な量に関する情報を
提供する。ピーク高とピーク面積に基づくＤＮＡフラグメントの比率を使用して
、試料中に存在する或る細菌の数を推計することができる。上記したポリメラー
ゼ連鎖反応は、純粋な培養細菌からＤＮＡを抽出した後に実施される。かくして
、或る細菌が圧倒的に存在しているのかそれとも殆ど存在していないのかを知る
ために試料を解釈することができる。

【００４９】図面の説明図面は考え得る状況の幾つかの説明図として含まれている。図１および２は、
３つの個体から得られた３つの微生物学的集団のＤＮＡパターンを表す。図１は
１００から９００塩基対までの範囲の大きさを有するＤＮＡフラグメントを示し
、一方、図２は３００から６００塩基対の間のＤＮＡフラグメントを示す。これ
ら図面中の各ピークは特定のＤＮＡフラグメントを表す。

【００５０】３羽の個々のニワトリのＤＮＡフラグメントは十二指腸から得られた試料に基
づいていた。２つの試料は臨床的に「健康な」個体（ＡおよびＢ）に由来し、一
方、１つの試料は「健康でない」個体（Ｃ）を表す。健康でない個体は、２つの
「健康な」個体には存在していなかった１つの主要な追加的ＤＮＡフラグメント
（「追加的」と記されている）を示した。

【００５１】図３および４は、ブロイラーにおける細菌過剰増殖を試験する方法の一部を図
示している。これらの説明図は、疾病状態下では試料が同一のクラスターを示し
、一方、細菌の変化は本発明者の技術で容易に同定できることを示している。

【００５２】細菌クラスターまたは種は、塩基対を使用してＤＮＡフラグメントの大きさで
同定される。

【００５３】図３。合計１１個の試料が示されている。各試料は、３．５週齢の臨床的に健
康なニワトリの腸管から得た標本に基づいている。

【００５４】少なくとも４つの主要な細菌クラスターが存在しており、一方、幾つかの試料
中には他の２，３の細菌種も同様に存在している。ここでは２つの論点が図示さ
れている：Ａ．主要なクラスターは全ての試料中に存在する、Ｂ．存在する細菌の相対数は試料で異なっている。

【００５５】図４。合計４個の試料が示されている。各試料は共通の細菌／微生物カウント
で大きな差異を示していることがわかる。

【００５６】ここでは２つの論点が図示されている。Ａ．本発明者の方法は明らかに、微生物カウントで検出するとき、同様な、大
きな差異を同定することができる。微生物カウントで特定の群のカウントが高い
試料は同一のＤＮＡフラグメントを示し、一方、これら特定の細菌を有していな
い試料中にはこれらフラグメントは存在していない。Ｂ．本発明者の方法は１回の分析で全ての細菌種を含めるので、この新規な技
術は「古典的な」微生物カウントと比較してさらに別の情報を同定している。未
知の細菌であっても含まれる。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年８月１２日（２００２．８．１２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ドクトルファンハーリンゲンラボラトリウムベー．フェー． <120> 増幅および制限酵素分析を使用する微生物の検出および定量 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> /Note="Label FAM" <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> /Note="Label TET, whereby "R" in the sequence stands for G or A" <220> <223> Description of Artificial Sequence: restriction enzyme site <400> 2 ccgtcaattc ctttragttt 20 <210> 3 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> /Note="restriction enzyme HaeIII" <220> <223> Description of Artificial Sequence: restriction enzyme site <400> 3 ggcc 4 <210> 4 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> /Note="restriction enzyme CfoI (=HhaI)" <220> <223> Description of Artificial Sequence: restriction enzyme site <400> 4 gcgc 4 <210> 5 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> /Note="restriction enzyme TaqI" <220> <223> Description of Artificial Sequence: restriction enzyme site <400> 5 tcga 4 <210> 6 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> /Note="restriction enzyme HinfI, whereby "N" in the sequence stands for any nucleotide" <220> <223> Description of Artificial Sequence: restriction enzyme site <400> 6 gantc 5 <210> 7 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> /Note="restriction enzyme MspI" <220> <223> Description of Artificial Sequence: restriction enzyme site <400> 7 ccgg 4 <210> 8 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> /Note="restriction enzyme PstI" <220> <223> Description of Artificial Sequence: restriction enzyme site <400> 8 ctgcag 6 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> /Note="restriction enzyme HinDIII" <220> <223> Description of Artificial Sequence: restriction enzyme site <400> 9 aagctt 6

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ファンハーリンゲン，ウィレムアンネオランダ国フェーネンダールレーウェリック 69 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 CA20 HA09 HA11 4B063 QA01 QA11 QA18 QA20 QQ03 QQ05 QQ06 QQ07 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR32 QR38 QR39 QR40 QR42 QR62 QS16 QS25 QX02 QX10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物学的叢の組成を分析する方法において、微生物学的叢の
試料を提供し、該試料中に存在する核酸を選択的に増幅し、この増幅物を制限消
化に付し、そして得られた制限フラグメントのパターンを分析することを含むこ
とを特徴とする方法。
【請求項２】上記微生物学的叢が細菌叢であることを特徴とする、請求項１
に記載の方法。
【請求項３】上記叢が消化管に由来することを特徴とする、請求項１または
請求項２に記載の方法。
【請求項４】上記分析が試料の制限パターンを少なくとも１つの参照パター
ンと比較することを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項５】上記参照パターンが純粋な細菌培養物から得られることを特徴
とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】上記分析が腸内叢に含まれている微生物の相対的存在量を決定
することに関与していることを特徴とする、上記請求項のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項７】上記分析が上記腸内叢に存在している少なくとも１つの微生物
の量を決定することに関与していることを特徴とする、上記請求項のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項８】増幅用のプライマー、消化用の制限酵素、および任意に、少な
くとも１つの純粋な細菌培養物に由来する材料を含む少なくとも１つの参照試料
を含む上記請求項のいずれか１項に記載の方法を実施するための診断用試験キッ
ト。
【請求項９】少なくとも１つの参照パターンをさらに含むことを特徴とする
、請求項８に記載の試験キット。
【請求項１０】１つのプライマーが配列５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴ
ＧＧＣＴＣＡＧ−３’またはその機能的フラグメントおよび／もしくは誘導体を
含むことを特徴とする、請求項８または９に記載の試験キット。
【請求項１１】１つのプライマーが配列５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴ
ＴＲＡＧＴＴＴ−３’またはその機能的フラグメントおよび／もしくは誘導体を
含むことを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の試験キット。
【請求項１２】腸内細菌叢における平衡の存在または不存在を決定するため
の、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の試験キットの使用。
【請求項１３】腸内細菌叢における平衡の存在または不存在を決定するため
の、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法の使用。