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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Mittel zur
Diagnose von pathologischen oder anderen schädlichen Zuständen oder
der allgemeinen Gesundheit einer Gruppe von Individuen, insbesondere Wirbeltieren,
typischerweise Säugern
und/oder Vögeln,
wie Nutztieren. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verfahren
und Mittel zur mikrobiologischen Typisierung von Substanzen, die
eine Vielzahl von mikrobiologischen Organismen umfassen, wie unter
anderem Lebensmittel, Lebensmittelzusätze, Abfall, Böden usw.
Als Beispiel für
die Erfindung sei die Verwendung von Fäkalien als Quelle für mikrobiologische
Populationen genannt. Die Verfahren und Mittel der Erfindung sind
jedoch gleichermaßen
auf mikrobiologische Populationen aus anderen Quellen anwendbar.
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Bei
Nutztieren wurden mehrere pathologische Zustände und/oder Syndrome bemerkt,
die sich anscheinend nicht zum Beispiel einer Infektion mit einem
einzigen Mikroorganismus zuordnen lassen. Diese Syndrome scheinen
jedoch eine Wirkung auf das Gleichgewicht zu haben, das normalerweise
innerhalb der verschiedenen Bakterien, die die Bakterienflora bilden,
existiert. Mehrere dieser Syndrome werden als Dysbakteriose und
bakterielle Fehlbesiedelung bezeichnet.
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Ohne
uns auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, besteht eine
mögliche
Erklärung
für das Vorkommen
dieser Syndrome darin, dass diese Krankheiten vielleicht auftreten
aufgrund von:
- 1. der Nahrungsaufnahme/Art der
Nahrung
Die Nahrung stört
die Verdauung, was zu Veränderungen
bei den Bakterien führt:
Einige besondere Bakterien oder Gruppen von Bakterien sind häufig und im Übermaß vorhanden,
und einige besondere Bakterien oder Gruppen von Bakterien werden
gehemmt und können
nicht überleben.
- 2. Invasion durch eine (oder mehrere) Bakterienspezies
Die
Bakterien müssen
nicht selbst pathogen sein, aber sie stören die Ausgewogenheit innerhalb
der Flora.
- 3. Invasion durch eine (oder mehrere) Virus- oder Pilzspezies
- 4. Immundepression
- 5. Umwelteinflüssen,
wie Temperatur und Feuchtigkeit.
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Typischerweise
haben diese Syndrome einen Einfluss auf die allgemeine Gesundheit
und Leistungsfähigkeit
eines Tiers und häufig
sogar auf die ganze Gruppe von Tieren. Bei Geflügel gibt es sogar mehrere Syndrome,
die klinische Symptome zeigen, welche direkt mit dem Zustand der
Darmbakterienflora zusammenhängen.
Daher ist es wichtig, die allgemeine Gesundheit einer Population
von Nutztieren überprüfen zu können und/oder
ein Mittel zu haben, um wenigstens die Anwesenheit eines solchen
schlecht definierten pathologischen Zustands in einer Gruppe (Herde,
Schar) von zum Beispiel Nutztieren zu bestimmen.
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Beispiele
für Syndrome,
die mit einem bakteriellen Ungleichgewicht zusammenhängen, sind
zum Beispiel Steatorrhoe bei Kälbern,
Ileitis bei Schweinen und auch Diarrhoe beim Entwöhnen, Diarrhoe
bei Geflügel.
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue Mittel (z.B. Kits) und Verfahren
zur Bestimmung der (relativen) Häufigkeit
sowie von (Schätzwerten
von) tatsächlichen
Mengen von verschiedenen Bakterien bereit, die in der Darmbakterienflora
vorhanden sind, um zum Beispiel die Anwesenheit oder Abwesenheit
eines Gleichgewichts in der Darmbakterienflora zu bestimmen, insbesondere
im Vergleich zu einer Menge von normalen Zusammensetzungen der Darmbakterienflo ra.
Bis zur vorliegenden Erfindung erfolgten Analysen der Bakterienflora
mit Verfahren, die in der klassischen Bakteriologie verwendet werden.
Die klassische Bakteriologie beruht auf der Kultivierung und Identifizierung
von verschiedenen Bakterienstämmen.
Verschiedene Verfahren werden verwendet; dazu gehören aerobes
und anaerobes Wachstum, Voranreicherung usw. Weiterhin wird das Bestimmen
der Zahl der Kolonien allgemein verwendet, um Informationen über die
Zahl der in Proben vorhandenen Bakterien zu erhalten.
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Unter
Verwendung dieser Verfahren wurden bisher nur schätzungsweise
20% der Bakterien isoliert und charakterisiert. Fast axiomatisch
bei diesen klassischen bakteriellen Techniken (sowie bei Techniken
zum Auffinden anderer Mikroorganismen, wie Viren, Hefen oder Pilzen)
ist die Denkweise, dass eine bestimmte Krankheit ein bestimmtes
kausales Agens hat, oder wenigstens, dass ein oder mehrere bestimmte
Agentien als zur Verursachung der bestimmten Krankheit beitragend
anzusehen sind. Diese klassischen Einsichten ergeben jedoch keine
praktikable Methode, um Einsicht in die Anwesenheit oder Abwesenheit
eines "gesunden" Gleichgewichts in
Darmtrakten zu gewinnen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt also das Verfahren von Anspruch 1 bereit,
das für
einen Nachweis der gegenseitigen Beziehungen zwischen Bestandteilen
der Flora sorgt, wie zwischen bekannten und unbekannten Bakterien,
Pilzen, Viren und dergleichen, zum Beispiel unter bestimmten Krankheitsbedingungen,
ohne einen Organismus identifizieren zu müssen. Die Nucleinsäure wird
selektiv amplifiziert, gegebenenfalls ergänzt um die spezifische Amplifikation
von bekannten Organismusspezies oder Teilen davon, die möglicherweise
in der Probe vorhanden sind, um gegebenenfalls für eine Identifizierung zu sorgen,
wenn man dies möchte.
Zu den typischen Ergebnissen gehören
der Nachweis eines Haufens von amplifizierten Fragmenten (die vielleicht einem
Restriktionsabbau unterzogen wurden), wobei die Fragmente in einem
Muster (das zum Beispiel durch die Molekülmasse bestimmt wird) lokalisiert
oder nachgewiesen werden, das die Erkennung von spezifischen (Haufen-)
Mustern ermöglicht.
Diese können
in verschiedenen Proben identisch sein, sie können verschieden sein, oder
sie können
um zusätzliche
Haufen (typischerweise fast gleich große Fragmente) ergänzt sein.
Wenn die Probe repräsentativ
für eine "normale" Population ist,
ist typischerweise ein gut ausgewogenes Haufenmuster zu erkennen,
während
zum Beispiel dann, wenn eine Dysbakteriose oder Fehlbesiedelung
stattgefunden hat, ein Haufen (der häufig einen einzigen Mikroorganismus
repräsentiert) überrepräsentiert
sein kann, typischerweise auf Kosten anderer Haufen (die andere
Mikroorganismen repräsentieren).
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Die
Probe kann typischerweise aus Fäkalien
oder einer Biopsie stammen und kann in vielen Fällen postmortal entnommen werden.
Vorzugsweise werden Proben unter reproduzierbaren Bedingungen entnommen,
so dass die Unterschiede in der Flora auf die zu diagnostizierenden
und/oder zu analysierenden Bedingungen und nicht auf temporale,
Nahrungs- oder andere Variationen zurückzuführen sind. Postmortale Proben und
Biopsien sollten aus demselben bereich im Darmtrakt entnommen werden.
Wenn man diese von der Erfindung bereitgestellte Technik verwendet,
ist es nicht an sich die bloße
Identifizierung eines mutmaßlichen kausalen
Mikroorganismus, auf die es ankommt, sondern die Erkennung von bestimmten
Mustern in den Analyseergebnissen, die es ermöglichen, ein Gleichgewicht
in Bezug auf einen bestimmten oder übereinstimmenden Zustand (krank
oder nicht krank) in der Flora nachzuweisen, und die Identifizierung
von ähnlichen
Mustern bei Tieren aus derselben oder einer anderen Herde zu ermöglichen.
Bei den klassischen Techniken wurde eindeutig nicht auf Muster in
der Flora geachtet, die sich zum Beispiel auf multifaktorielle Krankheitsmuster
beziehen, sondern es wurde üblicherweise
versucht, ein oder mehrere bestimmte kausale Agentien zu identifizieren, nach
denen man im Allgemeinen mit vorbestimmten und spezifischen Nachweismitteln,
wie Nucleinsäure-Primern
oder -sonden, Antikörpern
usw., sucht, um spezifische Mikroorganismen oder spezifische Komponenten derselben
nachzuweisen. Zum Beispiel werden in
US
5,543,294 ,
JP 05 317096 ,
Ratcliff et al., Path. (1994) 26: 477-479, Wood et al., Appl. Env. Microb.
(1998), 64: 3683–3689,
und
US 5,571,674 überall spezifische
und direkte Anweisungen gegeben, wie man ein spezifisches Bakterium
oder ein Bakterium, das zu einer spezifischen Gattung oder Familie
gehört,
identifiziert, aber es wird nicht auf andere Mikroorganismen geachtet,
die in den Testproben vorhanden sind oder sein können, was eindeutig beweist,
dass man sich nicht für
den gesamten Inhalt der Flora, sondern nur für spezifische Mikroorganismen
darin interessiert. Sie werden daher niemals in der Lage sein, Beziehungen
zwischen Florabestandteilen, wie bekannten und unbekannten Bakterien, Pilzen,
Viren und dergleichen, nachzuweisen. Wood et al., Applied Environ.
Microbiol., Vol. 64, S. 3683–89, 1998,
offenbaren ein Verfahren zur Bestimmung der genetischen Zusammensetzung
von Bakteroiden und Prevotella-Populationen im Darm, das eine PCR-Amplifikation
und Spaltung durch Abbau mit Restriktionsenzymen umfasst.
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Auf
dem Gebiet der Bakteriologie stellt die Erfindung zum Beispiel die
Mittel zur Qualitätskontrolle, Identifizierung
und Quantifizierung von interessierenden Bakterienspezies und zum
Nachweis der Anwesenheit/Abwesenheit von hochgradig pathogenen und
letalen Bakterienspezies oder zum Nachweis von neuen, bisher unbekannten
Bakterien bereit. Die Erfindung liefert zum Beispiel Informationen über die
Gesamtheit der Bakterien in jeder gegebenen Probe. Wegen der Natur
der Technologie werden viele unidentifizierte Bakterien amplifiziert.
Wenn man klinische Proben testet, findet man also neue Bakterienspezies,
die bisher aus unbekannten Bakterienpopulationen nicht identifiziert
werden konnten.
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Weiterhin
gibt die Erfindung die Analyse von Bakterienpopulationen an, so
dass man ein Verfahren für die
Qualitätskontrolle
erhält.
Zum Beispiel werden in allen Kläranlagen
Bakterien als Bestandteil des Verfahrens zur Abwasserreinigung verwendet.
Die Natur der in diesen Systemen vorhandenen Bakterien muss aus vielerlei
Gründen überprüft werden.
Die Analyse der Qualität
und Zusammensetzung der in diesen Systemen vorhandenen Bakterien
muss regelmäßig überprüft werden.
Zweitens muss das resultierende Wasser ebenfalls überprüft werden.
Beide Überprüfungen werden
zur Zeit mit Hilfe von "klassischen" Verfahren durchgeführt, darunter
das Kultivieren unter verschiedenen Bedingungen. Die Erfindung stellt
eine schnelle und bessere Technologie für die Qualitätskontrolle
des gesamten Verfahrens bereit. Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht
darin, dass bekannte pathologische Bakterien (z.B. Legionellen,
Salmonellen) in demselben Vorgang des Testens der Probe mit einem
Verfahren gemäß der Erfindung
identifiziert werden können.
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In
einem anderen Beispiel stellt die Erfindung ein Verfahren zum Testen
des Krankheits- oder Gesundheitsstatus von Nutztieren, wie Masthähnchen,
bereit. Die Bakterienflora im Darmtrakt von Masthähnchen wird durch
die Futterzusammensetzung beeinflusst. Während des Wachstums von Masthähnchen gibt
es im Allgemeinen bei zwei oder mehr Gelegenheiten Unterschiede
in der Zusammensetzung des Futters. Dies geschieht, um das Verhältnis zwischen
Nahrungsaufnahme und Wachstum zu optimieren. Aufgrund der Änderung
des Futters werden auch die Bakterienpopulationen im Darmtrakt beeinflusst.
Eine Analyse der bakteriellen Muster gemäß der Erfindung zeigt die Unterschiede
aufgrund der Änderungen
in der Fütterung.
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In
einem anderen Beispiel stellt die Erfindung ein Verfahren bereit,
das das Zählen
von Keimen umfasst. Bei vielen Gelegenheiten erfolgt das Kultivieren
von Bakterienpopulationen für
viele Zwecke und in vielen Forschungsprojekten. Es ist jedoch bekannt,
dass nur bestimmte Gruppen von Bakterien sichtbar gemacht oder identifiziert
werden (z.B. alle koliformen in einer Gruppe). Die vorliegende Erfindung
ist quantitativ, wenn man dies wünscht,
und kann die derzeitige Verwendung von Bakterienkulturen ersetzen.
Außerdem
sind Krankheiten im Darmtrakt bei vielen Gelegenheiten schwierig
zu identifizieren. Eine Analyse des gesamten Gehalts an Bakterien
bei einem beliebigen Organ oder Gewebe kann schnell und zuverlässig durchgeführt werden
und bei der Diagnose von Krankheiten bei Mensch und Tier gleichermaßen hilfreich
sein.
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Noch
ein weiteres Beispiel umfasst die Lebensmitteltechnik. Bei dem Vorgang
der Herstellung von Lebensmitteln oder der Qualitätskontrolle
von (rohen oder fermentierten) Produkten, wie Wurst oder Käse, ist
es wesentlich, dass dasselbe Produkt auf gleichbleibendem Niveau
hergestellt wird. Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das
den Nachweis von Bakterien-, Virus- oder Pilzspezies ermöglicht und
es auch erlaubt, in demselben Verfahren die Herstellungsbedingungen
zu überprüfen.
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Im
Allgemeinen muss die Probe vorbehandelt, z.B. homogenisiert, werden,
um die Nucleinsäure
für die
Amplifikation zugänglich
zu machen. Die Probe kann von jedem Wirbeltier entnommen werden,
das einen Darmtrakt und darin eine Bakterienflora besitzt. Säuger und
Vögel sind
jedoch bevorzugte Gegenstände
der vorliegenden Erfindung, insbesondere Menschen und Haustiere,
insbesondere Rinder, Geflügel
und andere Nutztiere. Wenn die Primer gut gewählt werden, sind die weiteren
Einzelheiten der eingesetzten Amplifikationstechnik weniger entscheidend,
so dass jedes Amplifikationsverfahren verwendet werden kann, wenn
auch PCR bevorzugt ist. Die Länge
der Primer und die Amplifikationsbedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit
von der Probe, der Art des Tiers, der benötigten Spezifität usw. bestimmt
werden. Typischerweise variiert die Länge der Primer zwischen 20
und 30 Nucleotiden, und sie sind auf eine Nucleinsäuresequenz
gerichtet, die in den ausgewählten
Mikroorganismen vorhanden ist, die in der Darmflora der Individuen,
von denen Proben genommen werden sollen, vorkommen, wie 165-rRNA
und 235-rRNA.
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In
manchen Fällen
kann eine nested-PCR geeignet sein.
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Das
Amplifikat selbst ergibt typischerweise nicht genug spezifische
Fragmente, so dass eine gute Analyse der Häufigkeit/Anwesenheit/Abwesenheit
usw. der jeweiligen Mikroorganismen erhalten werden kann. Daher
ist es wichtig, die von den jeweiligen Mikroorganismen erhaltenen
Nucleinsäuren
weiter zu differenzieren, indem man sie einer Behandlung mit mehreren
Restriktionsenzymen unterzieht. Auf diese Weise werden Muster erhalten,
die ausreichend Informationen enthalten, um die Durchführung einer
guten Analyse der Reichhaltigkeit, Gleichmäßigkeit, relativen Häufigkeit,
der Mengen, kurz des Zustands der Darmflora zu ermöglichen. Dies
ist sicher dann sehr leicht, wenn es nicht notwendig ist, bestimmte
Mikroorganismen zu identifizieren, und wo es genügt, die erhaltenen Muster mit
bekannten Mustern von gesunden Individuen zu vergleichen, vorzugsweise
einem Durchschnitt von vielen gesunden Individuen, wobei auch Zuverlässigkeitsintervalle
angegeben sind. Die Restriktionsenzyme sollten so ausgewählt werden,
dass Fragmente erhalten werden, die relevante Informationen ergeben.
Der Fachmann kann eine Menge von Restriktionsenzymen entwerfen,
die eben dies leisten können.
Typischerweise sollten die Enzyme Sequenzen von 4–8 Basenpaaren
erkennen, was einen selektiven Abbau zur Verstärkung der im Amplifikat vorhandenen
Information ermöglicht.
Typischerweise werden wenigstens 10 verschiedene Enzyme verwendet,
aber gewöhnlich
sind nicht mehr als 4 Enzyme notwendig. Beispiele für geeignete
Restriktionsenzyme sind unter anderem CfoI und HaeIII.
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Die
Analyse des einem Restriktionsabbau unterzogenen Amplifikats kann
in einer beliebigen Weise erfolgen, die es erlaubt, zwischen Größen von
Nucleinsäuren,
insbesondere DNA-Fragmenten, zu unterscheiden. Der Fachmann kann
ein Verfahren auswählen,
das für
seine Zwecke am besten geeignet ist. Wenn viele Proben analysiert
werden müssen,
wird natürlich
irgendeine Art von automatisiertem System bevorzugt. Gute Beispiele
für Verfahren
für automatisierte
Analysesysteme erfordern Möglichkeiten,
um DNA-Fragmente zu trennen und zu quantifizieren. Zum Beispiel
ist das ABI Prism (Perkin Elmer) für die vorliegende Erfindung
geeignet. Um das Muster gemäß der Erfindung
analysieren zu können,
wird das Ergebnis der Amplifikation und des Restriktionsabbaus der
Probe mit einem Muster verglichen, das mit einer Menge von normalen
Zusammensetzungen mikrobiologischer Flora erhalten wird. Eine Referenz
sollte zur Verfügung
stehen, um den gegenwärtigen
Zustand eines bestimmten Tiers mit einem gesunden Zustand (Gleichgewicht)
desselben Tiers, eines anderen Tiers oder vorzugsweise einer Gruppe
von Tieren, die bekanntermaßen
allgemein gesund sind, vergleichen zu können. Je mehr Informationen über den
gesunden Zustand vorhanden sind, desto leichter wird es, Unterschiede
zwischen gesunden Darmfloren und Floren, die mit pathologischen
Zuständen
oder allgemeinen Gesundheitsproblemen zusammenhängen, zu erkennen. Natürlich ist
der Vergleich am zuverlässigsten, wenn
Proben in derselben Weise unter ähnlichen
oder sogar gleichen Umständen
entnommen werden. Es wird häufig
nicht notwendig sein, direkte Vergleiche zwischen Proben durchzuführen, sondern
es wird im Allgemeinen ausreichen, einen Aspekt des Testergebnisses
(Zahlen, Strichcodes, Graphiken, Muster und dergleichen) zu vergleichen.
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Eine
Standardisierung des Bilds der Bakterienflora kann zum Beispiel
in folgender Weise erfolgen.
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Um
eine Interpretation von Proben für
verschiedene Zwecke zu ermöglichen,
wird eine Vergleichsbasis für
den Darmtrakt von Geflügel
und Fäkalien
von Schweinen erstellt.
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Die
Wahl der für
die Vergleichsbasis verwendeten Tiere hängt ab von
- a)
Alter
- b) Unterbringung
- c) Futter (Aufnahme)
- d) Zuchtlinie
- e) klinische Gesundheit
- f) Geschlecht.
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Der
wichtigste Aspekt ist die Vergleichbarkeit der Proben, die die Vergleichsbasis
bilden, mit der zu testenden Probe. Wenigstens für einige der oben angegebenen
Parameter wird also eine Eichung benötigt.
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Eine
leichte Möglichkeit,
um mehrere Referenzen zu erhalten, ist die Durchführung von
Amplifikation und Restriktionsabbau mit Bakterienreinkulturen (eines
Bakteriums, von dem bekannt ist, dass es in der Darmflora vorhanden
ist) in derselben Weise, wie die Probe behandelt werden wird. Die
Anwesenheit und/oder Häufigkeit
dieser Bakterien in Darmtrakten kann auf der Grundlage der Anwesenheit
oder Abwesenheit von (mehreren) charakteristischen Peaks bestimmt
werden.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren gemäß der Erfindung bereit, bei
dem die Analyse das Bestimmen der relativen Häufigkeit von Mikroorganismen,
die in der Darmflora vorhanden sind, oder auch einfach das Bestimmen,
ob ein Muster innerhalb einer gesunden Variation von Mustern liegt,
ohne auch nur viel über
die konstituierenden Bakterien zu wissen, beinhaltet. Dies kann
geschehen, sobald eine Sammlung von gesunden Mustern zur Verfügung steht.
Man misst also lediglich die relative Häufigkeit und Anwesenheit/Abwesenheit von
Peaks, die in den Floren von gesunden Individuen bekanntermaßen vorhanden
sind, ohne zu wissen, von welchen Organismen diese Peaks stammen.
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Natürlich liefern
die zuvor erwähnten
Bakterienreinkulturen die Möglichkeit,
zu identifizieren, welche Peaks zu welchen Mikroorganismus gehören, wenn
man dies möchte.
Von solchen Peaks sind die Höhe und/oder
die Fläche
unter dem Peak, insbesondere im Vergleich mit anderen bekannten
Peaks, ein Maß für die Menge
eines bestimmten, in einer Probe vorhandenen Mikroorganismus. Die
Erfindung stellt also auch ein Verfahren gemäß der Erfindung bereit, bei
dem die Analyse das Bestimmen der Menge wenigstens eines in der
Darmflora vorhandenen Mikroorganismus beinhaltet. In einer anderen
Ausführungsform
stellt die Erfindung einen diagnostischen Testkit zur Durchführung eines
Verfahrens gemäß der Erfindung
bereit, der Primer für
die Amplifikation, die von ausgerichteten Sequenzen abgeleitet sind,
um möglichst
viele Mikroorganismen zu amplifizieren, wenigstens 4 Restriktionsenzyme
zum Abbau sowie Material, das von wenigstens einer Bakterienreinkultur
stammt, umfasst. Vorzugsweise umfasst ein solcher Testkit wenigstens
ein Referenzmuster, wie es oben beschrieben wurde.
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Geeignete
Primer, die in einem Testkit gemäß der Erfindung
enthalten sein sollen, sind Primer, die von ausgerichteten Sequenzen
abgeleitet sind. Diese Sequenzinformation ermöglicht die Selektion von homologen
Sequenzen, aus denen Primer entwickelt werden können. Vorzugsweise werden Primer
aus ribosomalen RNA-Sequenzen ausgewählt. Vorzugsweise umfasst wenigstens
ein Primer die Sequenz 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' oder ein funktionelles
Fragment und/oder Derivat davon. Ein funktionelles Derivat oder
Fragment ist ein Primer mit einer Sequenz, die eine Basenpaarung
mit der Sequenz, mit der die ursprüngliche Sequenz eine Basenpaarung
durchführt,
oder mit einer Sequenz, die sehr nahe in der Nachbarschaft der ursprünglichen
Sequenz liegt, durchführt,
so dass nach der Amplifikation dieselben oder ähnliche Nucleinsäuren erhalten
werden.
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Ein
weiterer bevorzugter Primer umfasst die Sequenz 5'-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3' oder ein funktionelles
Fragment und/oder Derivat davon.
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Die
Erfindung gibt auch die Verwendung eines Testkits gemäß der Erfindung
zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Gleichgewichts
in der Darmbakterienflora, wie es oben erläutert wurde, an. Die Erfindung
gibt auch die Verwendung eines Verfahrens gemäß der Erfindung zur Bestimmung
der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Gleichgewichts in der Darmbakterienflora
an.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Darmflora" bedeutet eine Flora,
die im Verdauungstrakt, wie dem Darmtrakt, dem Magen, der Speiseröhre, dem
Maul oder Schnabel oder anderen Teilen des Verdauungstrakts oder
in dessen Nähe
vorhanden sind. Darmfloraproben können also aus jedem Teil des
Verdauungstrakts oder in dessen Nähe entnommen werden.
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Die
Mittel und Verfahren der Erfindung sind im Allgemeinen für die Analyse
einer mikrobiologischen Probe geeignet, von der man annimmt, dass
sie eine Vielzahl von verschiedenen mikrobiologischen Organismen
enthält.
Ein Beispiel für
einen mikrobiologischen Organismus ist eine beliebige Art von Bakterium,
Phage, Virus, Pilz oder Hefe. Eine Probe der mikrobiologischen Flora
kann aus jeder Quelle erhalten werden, von der man annimmt, dass
sie eine Vielzahl von Mikroorganismen enthält, und vorzugsweise wird die
Probe aus dem Verdauungstrakt, am meisten bevorzugt dem Darmtrakt,
entnommen. Dem Fachmann ist auch klar, dass die Mittel und Verfahren
der Erfindung auch verwendet werden können, um die Art des Pflanzen-
oder Säugermaterials
in nucleinsäurehaltigen
Lebensmitteln zu bestimmen und/oder zu verfolgen. Dem Fachmann ist
klar, dass die offenbarten Verfahren und Mittel nicht auf die Bakterienflora
des Darmtrakts beschränkt
sind, sondern tatsächlich
für die
Typisierung der mikrobiologischen Flora aus vielen verschiedenen
Quellen, wie Lebensmittelproben, Lebensmitteladditiven, Abfall,
Böden usw.,
geeignet ist. Der Ausdruck "Flora" bedeutet eine Sammlung
von mikrobiologischen Organismen. Der Ausdruck "Bakterienflora" bedeutet eine Flora, die im Verdauungstrakt,
vorzugsweise im Darmtrakt, vorhanden ist oder daraus erhalten wird
oder stammt.
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Die
Erfindung wird ausführlicher
im folgenden experimentellen Teil erläutert.
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Material und
Verfahren
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Probenahme
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Teile
des Darmtrakts wurden während
der postmortalen Untersuchung isoliert/erhalten.
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Bei
Geflügel
wurde zum Beispiel ein wohldefinierter Teil des Ileums zwischen
dem Ausgang des Pankreasgangs und dem Meckelschen Divertikulum verwendet.
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Eine
endoskopische Untersuchung wird verwendet, um Proben zu Lebzeiten
aus bestimmten Teilen des Darmtrakts zu entnehmen.
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Fäkalien wurden
von lebenden Individuen erhalten.
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Konservierung
und Transport
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Proben
wurden sofort nach der Entnahme auf Trockeneis gelegt und gehalten
und zum Labor transportiert.
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Bei
der Ankunft im Labor wurden die Proben bei –20 °C gelagert.
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Materialien
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- – Lysepuffer
DNA-Extraktion (pH 6,4)
142,5 g GuSCN
4,8 g TRIS
1,63
g EDTA
Wasser auf 200 ml
- – Waschlösung DNA-Extraktion
(pH 6,4)
142,5 g GuSCN
4,8 g TRIS
Wasser auf 200
ml
- – DE-Lösung DNA-Extraktion
0,75
ml HCl 35%
10 g Kieselerde
Wasser auf 50 ml
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Probenvorbereitung
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- 1. Probenhandhabung
a. Darmtrakt
Ungefähr 2 cm
der angegebenen Stelle wurden mit einem Skalpell längs abgeschnitten.
Der gesamte Inhalt wurde in ein steriles Röhrchen übergeführt.
b. Endoskopische
Biopsien und Fäkalienproben
wurden in sterile Röhrchen übergeführt.
- 2. Homogenisierung
Es wurde durch manuelles Schütteln gemischt,
bis die Substanz visuell homogen war.
- 3. DNA-Extraktion
a. Menge
Ungefähr 0,2 g homogenes Material
wurden verwendet. In Fällen
von wässrigen
Proben wurde ein Volumen von ungefähr 250 μl verwendet.
b. DNA-Extraktion
Die
DNA-Extraktion wurde im Allgemeinen nach dem Verfahren von Boom
durchgeführt.
– Zu der
homogenen Probe wurde 1 ml Lysepuffer gegeben. Die Suspension wurde
30 Sekunden lang mit dem Vortexrührer
gerührt
und eine Stunde lang bei Raumtemperatur gelagert.
– Die Suspension
wurde 20 Sekunden lang mit 15 000 bis 17 000 × g zentrifugiert.
– Der Überstand
wurde in ein steriles Röhrchen übergeführt, das
50 μl DE-Lösung enthielt. Die Suspension wurde
30 Sekunden lang mit dem Vortexrührer
gerührt
und 20 Sekunden lang mit 15 000 bis 17 000 × g zentrifugiert.
– Nach der
Entfernung des Überstands
wurden fünf
Waschschritte durchgeführt:
1.
200 μl Waschlösung
2.
200 μl Waschlösung
3.
200 μl 70%
Ethanol
4. 200 μl
70% Ethanol
5. 200 μl
Aceton p.a.
– Das
Sediment wurde 15 Minuten lang bei 56 °C an der Luft getrocknet.
– Das Sediment
wurde in 75 μl
ddH2O resuspendiert (über Nacht 37 °C).
– Schließlich wurde
der Überstand
in einen neuen Eppendorf-Becher übergeführt und
bei 4 °C
gelagert.
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PCR
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Eine
Polymerase-Kettenreaktion wurde durchgeführt, wobei man 1,5 μl DNA in
einem Gesamtreaktionsvolumen von 15 μl verwendete, das Amplitaq-DNA-Polymerase
(0,07 Einheiten/μl),
Primer (1,3 mM Vorwärts-
und Rückwärtsprimer),
dNTPs (200 mM) und 60 mM KCl, 12 mM HCl, pH 8,3, und 1,8 mM MgCl2 enthielt.
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PCR-Programm:
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- 1 Zyklus von 5 min bei 95 °C
- 35 Zyklen von 30 s bei 95 °C
45
s bei 56 °C
2
min bei 72 °C
- 1 Zyklus von 5 min bei 72 °C
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Beide
Primer waren mit fluoreszenten Sonden markiert, um eine automatisierte
Analyse zu ermöglichen.
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Der
Zweck dieser Reaktion ist eine Amplifikation von möglichst
vielen bakteriellen Organismen. Dies führt im Allgemeinen zu etwa
50 Fragmenten.
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Restriktionsabbau
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Mit
den PCR-Produkten wurde ein Restriktionsabbau mit verschiedenen
Restriktionsenzymen durchgeführt,
wie
| HaeIII | GG'CC, |
| CfoI
(= HhaI) | GCG'C, |
| TaqI | T'CGA, |
| HinfI | G'ANTC, |
| MspI | C'CGG, |
| PstI | CTGCA'G, |
| HindIII | A'AGCTT. |
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Analyse
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Die
Größenanalyse
der DNA-Fragmente wurde mit einem ABI 377 DNA Sequencer unter Verwendung von
fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt. Die Bedingungen der Einstellungen
am ABI377-Prism-Sequenzierungssystem waren wie folgt: ABI Collection
Software Version 2.1 mit Napf-Lese-Abstand 36 cm, Laufbedingungen
3000 V, 60 mA, 200 W, Sammelzeit 5 Stunden.
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Die
Größenanalyse
wurde mit Hilfe von ABI-Software durchgeführt. Lanetracking, Genotyper,
Datenanalyse wurden mit Hilfe von GeneScan-3.1- und Genotyper-2.0-Software
nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
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Reinkulturbakterien
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Mehrere
Bakterienstämme,
wie z.B. Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Mycoplasma gallisepticum,
Mycoplasma synovium, Ornithobacterium rhinotracheale, Escherichia
coli, Lactobacilliae, Enterococcae und Pseudomonas aeruginosa, wurden
als Referenzen verwendet.
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Polymerase-Kettenreaktion,
wie sie oben beschrieben wurde, wird mit Reinkulturbakterien durchgeführt. Die
Größe des PCR-Produkts
ist für
jedes Bakterium spezifisch.
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Restriktionsenzyme
können
verwendet werden, um mehrere Fragmente zu identifizieren.
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Das
Gesamtbild von Fragmenten nach der PCR und nach der Verwendung von
Restriktionsenzymen führt
zu einem "Muster" einer Reinkultur.
Dieses Muster kann in jeder Darmprobe in Abhängigkeit von der vorhandenen
Menge der Bakterien identifiziert werden.
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Interpretation
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1. Reichhaltigkeit
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Die
Ergebnisse der Analyse werden in einem Bild sichtbar gemacht, das
Peaks zeigt, die der Größe der DNA-Fragmente
entsprechen. Diese Peaks hängen
im Allgemeinen mit Bakterienspezies zusammen. Die Zahl der identifizierten
Peaks ist ein Hinweis für
die Gesamtzahl der Bakterienspezies. Unter Verwendung von Informationen,
die von Reinkulturbakterien erhalten wurden, ergibt dies auch Informationen über die
Anwesenheit oder Abwesenheit von spezifischen Bakterien.
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2. Gleichmäßigkeit
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Weiterhin
liefern die Peaks Informationen über
die relative Menge jedes DNA-Fragments.
Das Verhältnis
der DNA-Fragmente auf der Grundlage der Peakhöhe und der Peakfläche kann
verwendet werden, um die Zahl von bestimmten, in der Probe vorhandenen
Bakterien abzuschätzen.
Polymerase-Kettenreaktion, wie sie oben beschrieben wurde, wird
nach der DNA-Extraktion aus Reinkulturbakterien durchgeführt. Somit
können Proben
interpretiert werden, um festzustellen, ob einige Bakterien im Übermaß vorhanden
sind oder fast fehlen.
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Legenden zu
den Figuren
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Figuren
sind als Veranschaulichungen einiger der möglichen Situationen beigefügt. Die 1 und 2 stellen
die DNA-Muster von drei mikrobiologischen Populationen dar, die
von drei Individuen erhalten wurden. 1 zeigt
DNA-Fragmente mit
Größen im Bereich
von 100 bis 900 Basenpaaren, während 2 DNA-Fragmente
zwischen 300 und 600 Basenpaaren zeigt. Jeder Peak in den Figuren
stellt ein spezifisches DNA-Fragment dar.
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Die
DNA-Fragmente für
drei individuelle Hühner
beruhten auf Proben aus dem Zwölffingerdarm.
Zwei Proben stammten von klinisch "gesunden" Individuen (A und B), während eine
Probe ein "nicht
gesundes" Individuum
darstellt (C). Das nicht gesunde Individuum zeigte ein größeres zusätzliches
DNA-Fragment (als "zusätzlich" bezeichnet), das
bei den beiden "gesunden" Individuen nicht
vorhanden war.
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Die 3 und 4 zeigen
einen Teil eines Verfahrens zum Testen auf bakterielle Fehlbesiedlung
bei Masthähnchen.
Die Darstellungen zeigen, dass Proben unter bestimmten Krankheitsbedingungen
dieselben Haufen aufweisen, während
eine bakterielle Variation mit unserer Technologie leicht identifiziert
werden kann.
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Bakterielle
Haufen oder Spezies werden anhand der DNA-Fragmentgröße unter
Verwendung von Basenpaaren identifiziert.
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3.
Insgesamt elf Proben sind gezeigt. Jede Probe beruht auf einer Probe
aus dem Darmtrakt von klinisch gesunden Hühnern im Alter von 3,5 Wochen.
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Wenigstens
vier größere bakterielle
Haufen sind vorhanden, während
in einigen der Proben außerdem einige
andere Bakterienspezies vorhanden sind. Zwei Punkte werden hiermit
veranschaulicht.
- A. Größere Haufen sind in allen Proben
vorhanden.
- B. Die relative Zahl der vorhandenen Bakterien ist in den Proben
unterschiedlich.
-
4.
Insgesamt vier Proben sind gezeigt. Jede Probe weist bekanntermaßen große Unterschiede bei üblichen
Bakterien-/Keim-Zahlen auf.
-
Zwei
Punkte werden hier veranschaulicht.
- A. Unser
Verfahren ist eindeutig in der Lage, ähnliche große Unterschiede, wie sie bei
den Keimzählungen nachgewiesen
wurden, zu identifizieren. Proben mit hohen Zahlen für spezifische
Gruppen bei den Keimzählungen
zeigen identische DNA-Fragmente, während diese Fragmente in den
Proben ohne diese spezifischen Bakterien nicht vorhanden sind.
- B. Diese neue Technologie identifiziert zusätzliche Informationen im Vergleich
zu den "klassischen" Keimzählungen,
da unsere Verfahren alle Bakterienspezies in einer einzigen Analyse
einschließen.
Selbst unbekannte Bakterien sind mit eingeschlossen.
