KR102575756B1 - 내부 대조군으로 장내 정상세균총을 이용하여 시료로부터 장내 미생물을 검출하는 방법 - Google Patents

내부 대조군으로 장내 정상세균총을 이용하여 시료로부터 장내 미생물을 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산을 내부 대조군 핵산으로 이용하여 시료로부터 장내 미생물의 핵산을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 핵산 증폭용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 내부 대조군은 처음부터 시료 내에 존재하여, 시료 채취 이후에 별도로 추가해야하는 번거로움이 없으며, 시료 채취 과정의 내부 대조군, 핵산 추출 과정의 내부 대조군 및 핵산 증폭 과정의 내부 대조군으로 이용할 수 있다. 또한, 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군으로 이용함으로써, 위음성 및 위양성 판단을 최소화하여 시료 내의 장내 미생물 핵산의 존재 여부를 높은 정확도로 검출할 수 있다.

Description

내부 대조군으로 장내 정상세균총을 이용하여 시료로부터 장내 미생물을 검출하는 방법
본 발명은 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산을 내부 대조군 핵산으로 이용하여 시료로부터 장내 미생물의 핵산을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 핵산 증폭용 조성물에 관한 것이다.
인간의 질병은 체내진단과 체외진단을 통해 검출할 수 있다. 체내진단으로는 X선과 CT촬영 등을 통해서 질병의 원인을 분석하며, 체외진단은 소변, 혈액, 조직세포 등을 통해 질병의 원인을 분석한다.
체외진단에는 면역 화학적 진단, 자가 혈당 측정, 현장진단, 분자진단 등이 있다. 이 중 분자 진단은 유전자 증폭기술인 PCR 등을 이용해 유전자를 직접 검사하는 기법으로, 바이러스나 세균에 감염된 사람의 타액, 혈액, 분변 등과 같은 시료에서 병원체의 유전자 정보를 담고 있는 핵산을 추출한 후, 이를 증폭하여 질병 감염 여부를 확인한다. 이러한 분자진단은 혈액검사 또는 소변검사보다 정확도가 높으며 조직검사를 하지 않아도 된다는 장점이 있으며, 질병의 조기 진단을 통한 예방과 효율적인 치료를 가능하게 한다.
분자진단에서 정확한 검사 결과를 위해서는 검사에 대한 적절하고 정확한 시료의 채취가 필수적이다. 만약, 시료 채취 시, 시료의 용량이 부족하거나, 시료가 오염된 경우, 부정확한 검사 결과를 초래하여 재검율을 증가시키고 검사 결과 보고를 지연시킬 수 있다. 또한, 분자진단은 상술한 바와 같이, 시료로부터 핵산을 추출하여 증폭하는 과정을 포함하고 있는데, 핵산 추출 과정에서 손실이 발생하거나, 증폭 반응을 저해하는 물질 (예를 들면, 헤파린, 계면 활성제, 단백질 변성제 또는 유기 용매 등)이 시료 용액 내에 포함되어 있는 경우, 증폭 효율이 저하되기 때문에 병원체의 핵산을 충분히 증폭할 수 없게 된다. 이러한 경우, 시료 중에 병원체가 존재함에도 불구하고, 병원체의 핵산을 증폭할 수 없어 위음성(False Negative) 결과를 초래할 수 있으며, 동일한 시료를 이용한 경우라도, 핵산 추출 과정의 손실 정도에 따라 다른 결과가 얻어질 가능성이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 시료로부터 핵산을 추출하는 과정, 추출된 핵산을 증폭하는 과정에 대한 내부 대조군을 이용하여 위음성을 확인하는 방법이 개발되었다(미국 등록 특허 제 5,770,360호). 시료에 항상 존재하거나 핵산 추출 전에 시료에 추가되는 핵산을 내부 대조군으로 이용하여, 시료 내 병원체의 존재 여부와 상관없이 대조군의 핵산은 항상 추출 및 증폭되어 검출되도록 한다. 내부 대조군의 핵산의 미검출은 추출과정에서 손실이 발생하였거나, PCR 억제물질에 의한 증폭 저하로 인해 위음성이 발생하였음을 확인할 수 있도록 한다.
인간의 장 속에는 수만 종의 미생물이 살고 있으며, 이 중 각각의 개인은 수백 종 정도의 미생물을 가지고 살아간다. 이러한 장내 미생물은 일생동안 사람과 공생하면서 소화, 분비 등에 많은 영향을 미치고 있는 것으로 나타나고 있다. 최근에는 장-뇌 축(Gut-Brain Axis)이란 이론이 나올 정도로 장내 미생물은 인간의 육체적인 건강 및 정신적인 건강에 지대한 영향을 주는 것으로 나타나고 있으며 이에 대한 연구가 활발히 실시되고 있다(Augusto J. et al., Front. Integr. Neurosci., 2013). 또한 장내 미생물이 아토피나 천식과 같은 자가 면역 질환, 자폐나 우울증 같은 정신적인 질환과도 밀접한 관계가 있다는 사실이 생리학, 면역학, 역학 등 다양한 각도에서 증명되고 있다. 이러한 이유로 장내 미생물을 검출 및 분석하고자 하는 요구가 대두되고 있으며, 이에 따라, 장내 미생물의 검출방법에 대한 내부 대조군의 개발 역시 필수적이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 핵산 증폭을 이용한 장내 미생물 검출 방법에서 위음성 및 위양성 판단을 최소화하여 검출의 정확성을 향상시킬 수 있는 신규한 내부 대조군을 개발하고자 예의 연구 노력하였다.
그 결과, 본 발명자들은 핵산 증폭을 이용한 장내 미생물 검출 방법에 있어서, 시료를 채취하는 과정, 시료로부터 핵산을 추출하는 과정 및/또는 추출된 핵산을 증폭하는 과정에 대한 내부 대조군으로서 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 성공적으로 이용할 수 있음을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군(internal control) 핵산으로 이용하여 시료로부터 장내 미생물(gut microorganism)의 핵산을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군 핵산으로 이용하여 시료로부터 장내 미생물의 핵산을 증폭하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군(internal control) 핵산으로 이용하여 시료로부터 장내 미생물(gut microorganism)의 핵산을 검출하는 방법을 제공한다:
시료를 채취하여 준비하는 단계;
(i) 장내 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍; 및 (ii) 내부 대조군(internal control) 핵산으로서 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료 내 핵산의 증폭 반응을 수행하는 단계;
상기 증폭 반응의 결과를 검출하는 단계; 및
상기 내부 대조군 핵산의 증폭 반응의 결과로부터 장내 미생물 핵산의 증폭 반응의 유효성을 판단하고; 및
(i) 상기 판단된 유효성 및 (ii) 상기 장내 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과에 의해 상기 시료 내에 상기 장내 미생물의 핵산의 존재 여부를 판단하는 단계.
본 발명자들은 핵산 증폭을 이용한 장내 미생물 검출 방법에 사용될 수 있는 신규한 내부 대조군을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 장내에 상재하는 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군 핵산으로 이용하여 시료로부터 장내 미생물의 핵산을 검출할 수 있는 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이 신규한 프로토콜에 따르면, 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산은 시료를 채취하는 과정, 시료로부터 핵산을 추출하는 과정 및/또는 추출된 핵산을 증폭하는 과정에 대한 내부 대조군으로 이용할 수 있다.
이하에서 각 단계에 따라 본 발명을 보다 상세하게 설명한다:
시료의 채취 및 준비
본 발명에 따르면, 먼저, 시료를 채취하여 준비한다.
본 명세서에서 용어 "시료"란 핵산 증폭 방법에 의해 장내 미생물의 핵산을 검출하고자 하는 인간 또는 동물의 검사 대상(subject)으로부터 얻은 시료를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시료는 인간 또는 동물의 직장도말(rectal swab) 시료, 대변 시료, 또는 소변 시료를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 장내 미생물의 핵산이 검출이 가능한 환경 시료, 예컨대 인간 또는 동물이 접촉한 화장실 변기, 수건, 휴지 등으로부터 채취한 시료도 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시료는 병원성 미생물의 감염이 의심되는 인간 및 동물의 검사 대상으로부터 얻은 시료이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동물은 영장류, 가축들(예를 들어, 돼지, 양, 소, 말 및 당나귀), 실험용 동물들(예를 들어, 쥐, 생쥐, 기니피크, 햄스터 및 토끼), 애완용 동물들(예를 들어, 개 및 고양이), 사육 야생 동물들(예를 들어, 다람쥐, 여우, 캥거루 및 사슴) 및 조류 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시료 내의 핵산은 시료로부터 핵산을 추출하는 단계 없이 직접 분석될 수 있다. 예컨대, Pannacio et al.(Nucleic Acids Res. 1993 September 25; 21(19): 4656) 및 Pandori et al.(BMC Infect Dis. 2006 Jun 24;6: 104)에 개시된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시료의 준비는 시료로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 용어 “핵산” 또는 “핵산 분자”는 단일-가닥 형태 또는 이중-가닥 형태의 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 폴리머를 지칭하며, 상기 뉴클레오타이드는 자연(naturally occurring) 뉴클레오타이드와 동일한 방식으로 기능(function)할 수 있는 자연 뉴클레오타이드의 유도체, 비-자연 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 시료로부터 핵산을 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있다. 또한, 시료의 종류에 따른 다양한 핵산 추출용 키트가 시판되고 있으며, 당업자는 시판 키트를 이용하여 다양한 시료로부터 핵산을 추출할 수 있다.
시료 내 핵산의 증폭 반응
본 발명에 따르면, 상기 시료 내 핵산은 (i) 장내 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍; 및 (ii) 내부 대조군(internal control) 핵산으로서 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한다.
상기 핵산의 증폭 반응은 (i) 상기 장내 미생물의 핵산 검출용 프로브; 및 (ii) 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 검출용 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “프라이머”는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 핵산 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브(probe)"는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다.
본 발명에서 이용되는 프라이머 또는 프로브는 자연 NMPs (즉, AMP, GMP, CMP 및 UMP), 자연 dNMPs(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있도록 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다.
본 명세서에서 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 지칭하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 분자에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산 서열” 또는 “타겟 핵산 분자”는 최종적으로 증폭 또는 검출하고자 하는 핵산 분자를 지칭하며, 특정의 혼성화 조건하에서 프라이머와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명에서 사용되는 용어 “장내 미생물”은 시료에서 검출하고자 하는 미생물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “장내 미생물의 핵산”은 시료에서 검출하고자 하는 미생물의 핵산을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 통해 검출하고자 하는 장내 미생물은 인간 또는 동물의 장내에 존재하는 미생물을 의미하며, 상기 미생물은 박테리아, 효모, 진균, 바이러스, 원생동물(protozoan) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장내 미생물은 약물 내성 장내 박테리아일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약물 내성 장내 박테리아는 CRE(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae), CRE(Vancomycin-resistant enterococci) 또는 ESBL(Extended-spectrum beta-lactamases)-생성 박테리아일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 장내 미생물의 핵산은 DNA 분자 또는 RNA 분자를 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약물 내성 장내 박테리아의 핵산은 약물 내성을 나타내게 하는 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예컨대, 유전자의 변이, 플라스미드(plasmid) 또는 트랜스포존(transposon)이 매개하는 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 내부 대조군 핵산으로서 사용된 박테리아의 핵산은 본 발명의 방법에 따라 검출하고자 하는 장내 미생물의 핵산과 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 장내 미생물의 핵산 검출 방법은 1 내지 30개, 구체적으로 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개 또는 1 내지 5개의 장내 미생물 핵산을 동시에 검출할 수 있으며, 보다 구체적으로, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개의 장내 미생물 핵산을 검출할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 증폭 반응은 1 내지 30쌍, 구체적으로 1 내지 25쌍, 1 내지 20쌍, 1 내지 15쌍, 1 내지 10쌍 또는 1 내지 5쌍의 장내 미생물 핵산의 증폭용 프라이머 쌍을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로, 1쌍, 2쌍, 3쌍, 4쌍, 5쌍, 6쌍, 7쌍, 8쌍, 9쌍, 10쌍, 15쌍, 20쌍, 25쌍 또는 30쌍의 장내 미생물 핵산의 증폭용 프라이머 쌍을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "혼성화"는 소정의 혼성화 조건 또는 엄격 조건 하에 2개의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드가 상보적인 뉴클레오타이드 서열 간의 비공유 결합을 통해 이중-가닥을 형성하는 것을 지칭한다.
혼성화는 2개의 핵산 서열 간에 혼성화가 일어나는 부위(이중-가닥을 형성하는 부위)에서의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 미스매치(mismatch) 염기(예를 들어, 1-4의 미스매치)가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절된다.
본 명세서에서 용어“혼성화”와 “어닐링”은 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
타겟 핵산분자의 증폭은 당업계에 공지된 다양한 프라이머-관여 핵산 증폭 방법들에 따라 실시될 수 있다. 구체적으로, 타겟 핵산의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시되며, PCR 방법은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시되어 있다. 다른 예로는 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction (LCR)) (미국특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification (SDA)) (Walker, et al. Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992); Walker PCR Methods Appl 3(1):1-6 (1993)), 전사 매개 증폭(transcription-mediated amplification) (Phyffer, et al., J. Clin. Microbiol. 34:834-841 (1996); Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859 (1995)), 염기순서기반증폭(nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)) (Compton, Nature 350(6313):91-2 (1991)), 롤링서클 증폭(rolling circle amplification, RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12(1):75-99 (1999); Hatch et al., Genet. Anal. 15(2):35-40 (1999)) 및 Q-beta 레플리카제(Q-Beta Replicase) (Lizardi et al., BiolTechnology 6:1197 (1988)) 등이 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 핵산 증폭에 이용될 수 있으며, 이는 E. coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 상기 DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05 및 Thermus species sps 17를 포함한다.
본 발명의 일 구현에에 따르면, 상기 핵산의 증폭은 fast PCR을 행하여 실시될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “fast PCR”은 일반 PCR 방법에 비해 PCR의 속도를 높인 PCR 방법을 지칭한다. 상기 fast PCR은 DNA 중합효소의 연장 속도(extension rate), 열순환기기의 온도변화속도(ramp speed) 및 주형의 복합성(complexity) 등과 같은 다양한 인자들을 조절하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 분당 1kb의 표준 연장 속도를 갖는 일반 PCR에 사용되는 Taq DNA 중합효소 대신, 분당 2-4kb의 표준 연장 속도를 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하여 Fast PCR을 달성할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “장내 정상세균총”은 인간 또는 동물의 장관 내에 형성된 세균 전체의 군집을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장내 정상세균총은 인간의 장내 정상세균총이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장내 정상세균총은 Bacteroides, Lactobacillus, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas 및 Clostridium 을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아는 Bacteroides spp., 또는 Lactobacillus spp.일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산은 16s rRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산은 시료를 채취하는 단계, 시료로부터 핵산을 추출하는 단계 및/또는 추출된 핵산을 증폭하는 단계에 대한 내부 대조군으로 이용될 수 있다.
본 발명자들은 상기 장내 정상세균총이 장내에 상재하고 있음을 근거로 하여, 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내인성(endogenous) 내부 대조군 핵산으로 이용하여 시료에서 장내 미생물의 핵산을 검출할 수 있는 방법을 고안하였다.
본 발명에서 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산은 동일한 반응 용기 내에서 장내 미생물 핵산의 증폭과 동시에 증폭된다. 이때, 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산의 증폭이 검출되지 않으면, 시료를 채취하는 단계, 핵산을 추출하는 단계, 및 시료 내의 핵산을 증폭하는 단계 중 적어도 어느 하나의 단계에서 목적하는 과정(process)이 정상적으로 일어나지 않았음을 시사할 수 있다. 따라서, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산은 상기 각 단계의 내부 대조군으로 사용될 수 있다. 각 단계에서의 내부 대조군으로서의 역할을 상술하면 다음과 같다.
(i) 시료를 채취하는 단계에서의 내부 대조군:
시료를 채취하는 단계에서 시료가 적절하게 채취되지 않은 경우, 예를 들어, 채취된 시료의 양이 핵산을 검출하기에 너무 적은 경우에는 시료 내에 장내 미생물의 핵산이 존재할지라도 장내 미생물의 핵산이 검출되지 않을 수 있다. 이는 결국 위음성의 결과를 초래할 수 있으며, 이러한 위음성은 내부 대조군으로서 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산의 존재 유무를 확인함으로써 판단할 수 있다.
(ii) 핵산 추출 단계에서의 내부 대조군:
핵산 추출 단계에서 핵산의 손실이 발생한 경우, 즉, 증폭 반응을 위한 주형으로서 추출된 핵산의 양이 부족한 경우, 증폭 반응의 효율이 저하되어 핵산이 검출되지 않고 위음성의 결과를 초래할 수 있다. 이러한 경우, 내부 대조군으로서 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산의 존재 유무를 확인함으로써 위음성 여부를 판단할 수 있다.
(iii) 핵산 증폭 단계에서의 내부 대조군:
핵산 증폭 과정에서 증폭 반응 용액 내에 증폭 반응을 저해하는 물질 (예를 들면, 헤파린, 계면 활성제, 단백질 변성제, 유기 용매 등)이 포함되어 있는 경우, 타겟 핵산이 존재함에도 불구하고 증폭 효율이 저하되어 핵산 증폭이 검출되지 않고 위음성 결과를 초래할 수 있다. 이러한 경우, 내부 대조군으로서 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산의 존재 유무를 확인함으로써 위음성 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 내부 대조군 핵산으로서 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 채취된 시료 내 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고, 이에 의해 상기 시료의 채취가 유효(valid) 또는 무효(invalid)인지를 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 내부 대조군 핵산으로서 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료로부터 추출된 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고, 이에 의해 상기 추출이 유효 또는 무효인지를 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 핵산의 증폭 반응은 검출하고자 하는 핵산의 존재에 의존적으로 시그널을 제공할 수 있는 표지 또는 표지된 올리고뉴클레오타이드 (표지된 프라이머 또는 표지된 프로브의) 존재 하에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출하고자 하는 핵산이 증폭되는 과정에서 표지로부터 시그널이 제공되거나 증폭이 완료된 후 시그널이 제공될 수 있다.
증폭 반응 결과의 검출
본 발명의 일 구현예에 따르면, 핵산의 증폭 반응의 결과는 핵산이 증폭되는 과정에서 검출되거나 핵산 증폭반응이 완료된 후 검출될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과의 검출은 포스트-증폭 검출 방법 또는 실시간 검출 방법으로 실시될 수 있다.
상기 포스트-증폭 검출 방법은 핵산 증폭 후 증폭산물을 검출하는 방법이다. 포스트-증폭 검출 방법은 예를 들어 증폭산물을 크기 차이에 의해 분리하거나(예를 들어, 전기영동 방법) 또는 증폭산물의 고정화에 의하여 분리하는 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 포스트-증폭 검출 방법은 타겟 핵산 서열의 증폭 후 일정 구간에서 온도를 올리거나 내리면서 형광세기를 모니터링한 다음, 멜팅 프로파일(melting profile)에 의해 증폭산물을 검출하는 post-PCR 멜팅 분석(미국 특허 제5,871,908호, 미국 특허 제6,174,670호 및 WO 2012/096523)이 사용될 수 있다.
상기 실시간 검출 방법은 실시간 방식으로 타겟 핵산의 증폭을 모니터링하면서 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는 방법이다.
상기 포스트 증폭 검출 방법이나 실시간 검출 방법은 검출하고자 하는 핵산의 존재에 의존적으로 시그널을 제공하는 표지 또는 표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭된 핵산의 검출은 검출하고자 하는 핵산이 증폭되는 과정에서 표지로부터 제공되는 시그널을 검출하거나 검출하고자 하는 핵산의 증폭이 완료된 후 제공되는 시그널을 검출하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 타겟 핵산 서열의 증폭산물(amplicon)인 이합체(duplex)에 비특이적으로 인터칼레이팅되는 비특이적 형광염료를 이용하여 행할 수 있다.
또한, 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 표지된 프라이머 또는 표지된 프로브를 이용할 수 있다.
표지된 프라이머를 이용한 방법의 예로는 Sunrise 프라이머 방법(Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 제6,117,635호), Scorpion 프라이머 방법(Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 제6,326,145) 및 TSG 프라이머 방법(WO 2011/078441)이 있다.
표지된 프로브를 이용한 방법의 예로는 헤어핀 구조를 형성하는 이중 표지된 프로브를 이용하는 분자 비콘(Molecular beacon) 방법(Tyagi et al, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), 공여체(donor) 또는 수여체(acceptor)로 단일 표지된 두 개의 프로브를 이용하는 혼성화 프로브(Hybridization probe) 방법(Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용하는 Lux 방법(미국특허 제 7,537,886호), 이중 표지된 프로브의 혼성화 뿐만 아니라 DNA 중합효소의 5'-뉴클레아제활성에 의한 이중 표지된 프로브의 절단반응을 이용하는 TaqMan 방법(미국특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체를 이용하여 행할 수 있다. 상기 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체는 증폭 반응에 의해 형성되는 타겟 서열의 증폭산물 그 자체는 아니며, 타겟 핵산서열의 증폭에 비례하여 그 양이 증가하는 이합체이다. 타겟 핵산서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체는 다양한 방법에 따라 얻을 수 있으며, 예컨대, Invader 분석(미국 특허 제5,691,142호, 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 방법(WO 2012/096523), PCEC(PTO Cleavage and Extension-dependent Cleavage) 방법(WO 2012/134195), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442), PCE-SC(PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage) 방법(WO 2013/157821), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-dependent Non-Hybridization) 방법(WO 2014/104818), PCE-IH(PTO Cleavage and Extension-dependent Immobilized Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2015/008985) 방법에 의해 얻을 수 있으며, 상기 특허문헌들은 본 명세서에서 참조문헌으로 삽입된다.
또한, 타겟의 실시간 검출을 위하여, 상이한 온도에서의 시그널 검출을 이용하여 단일 유형의 표지만으로 하나 이상의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 사용할 수 있다. 이에 대한 내용은 WO 2015/147412, WO 2016/093619, WO 2016/093620에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌들은 본 명세서에 참조문헌으로 삽입된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응은 (i) 상기 장내 미생물의 핵산 검출용 프로브; 및 (ii) 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 검출용 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응은 1 내지 30개, 구체적으로 1 내지 25개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개 또는 1 내지 5개의의 장내 미생물의 핵산 검출용 프로브를 포함할 수 있으며, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개 또는 30개의 장내 미생물 핵산의 검출용 프로브를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산의 프라이머 쌍 또는 프로브는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열 및 이들의 상보적인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다(도 1).
본 명세서에서 사용되는 용어“특이적으로 혼성화”는 2 이상의 분자가 공유 결합 또는 비공유 결합을 통해 서로 상호 작용하는 것을 의미하는 것으로, 예를 들면 단일 가닥 타겟 서열 및 이와 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 단일 가닥 뉴클레오타이드 분자의 결합일 수 있다.
장내 미생물 핵산 증폭 반응의 유효성 판단 및 장내 미생물 핵산의 존재 여부 판단
상기 내부 대조군 핵산의 증폭 반응의 검출 결과로부터, 상기 장내 미생물 핵산의 증폭 반응의 유효성을 판단하고, (i) 상기 판단된 유효성 및 (ii) 상기 장내 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과에 의해 상기 시료 내에 상기 장내 미생물의 핵산의 존재 여부를 판단한다.
본 발명에 따르면, 상기 증폭 반응의 결과 중 내부 대조군의 증폭 반응 결과에 따라, 장내 미생물 핵산의 증폭 반응 결과의 유효성을 판단할 수 있다.
통상적으로, 본 발명에 따른 내부 대조군으로서의 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산은 장내 미생물의 핵산 존재 여부와 상관없이, 항상 증폭 반응에 의해 증폭되고 검출되어야 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 내부 대조군으로서 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산이 검출되는 경우, 시료의 채취, 핵산의 추출 및/또는 핵산의 증폭 반응이 성공적으로 수행되었다고 판단할 수 있으며, 상기 장내 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과는 유효(valid)하다고 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 내부 대조군으로서 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산이 검출되지 않은 경우, 시료의 채취, 핵산 추출 및/또는 핵산의 증폭 과정에서 문제가 발생하였다고 판단할 수 있으며, 상기 장내 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과는 유효하지 않는 결과, 즉 무효(invalid)인 것으로 판단할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “유효하지 않은 결과(invalid result)”란 검출 결과가 해석(interpretation)될 수 없어 무효로 처리되는 결과를 지칭하며, 유효하지 않은 결과로 판단된 시료의 검사 대상자(subject)는 시료 채취 단계부터 검출을 위한 실험(test)을 다시 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 내부 대조군 핵산이 검출되지 않은 경우, 상기 장내 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과는 무효인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 내부 대조군 핵산이 검출된 경우, 상기 장내 미생물 핵산의 검출은 상기 장내 미생물의 핵산의 존재(양성)를 의미하고, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 장내 미생물 핵산의 미검출은 상기 장내 미생물의 핵산이 존재하지 않음(음성)을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 내부 대조군 핵산이 검출되지 않은 경우, 상기 장내 미생물 핵산이 검출되지 않은 결과에 대하여 무효인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 내부 대조군 핵산은 검출되지 않은 경우, 상기 장내 미생물 핵산이 검출된 결과에 대하여 무효인 것으로 판단할 수 있다.
일반적으로 핵산 증폭 효율은 타겟 핵산에 따라 상이하며, 시료 내 초기 핵산 량, 증폭산물의 크기 등과 같은 다양한 인자들에 따라 동일 튜브내에서도 증폭 효율이 서로 상이하다.
장내 미생물의 핵산이 내부 대조군 핵산보다 상대적으로 과량으로 존재하는 경우, 증폭 과정에서 과량의 장내 미생물의 핵산을 증폭하면서 필수 시약(예컨대, 중합효소, dNTP 등)을 소모시키고 내부 대조군의 핵산은 상대적으로 증폭 효율이 저하되어 내부 대조군 핵산의 증폭이 검출되지 않는 경우가 발생할 수 있다.
즉, 이와 같은 경우 시료 내에 내부 대조군 핵산이 존재함에도 불구하고, 장내 미생물의 핵산은 증폭되는 반면 내부 대조군 핵산의 증폭은 검출되지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응 결과에서 상기 내부 대조군 핵산은 검출되지 않고, 상기 장내 미생물 핵산이 검출된 결과에 대하여 상기 장내 미생물의 핵산이 존재(양성)하는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은, 전술한 내부 대조군 이외에, 시료 채취 후에 채취된 시료에 외래 내부 대조군(exogenous internal control)을 추가(add)하여 실시할 수 있으며, 핵산 증폭 단계에서 외부 양성 대조군 (positive control) 및/또는 외부 음성 대조군 (negative control)을 포함시켜 실시할 수 있다. 상기 외래 내부 대조군은 핵산 추출 과정의 대조군으로서 사용될 수 있고, 상기 외부 양성 대조군은 핵산 증폭 과정의 대조군으로서 사용될 수 있으며, 상기 외부 음성 대조군은 시료의 오염 및 비특이적 반응에 대한 대조군으로 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 내인성 내부 대조군과 함께 시료 채취 후 시료에 외래 내부 대조군을 추가하여 사용할 수 있으며, 외래 내부 대조군은 검출되고 본 발명에 따른 내부 대조군은 검출되지 않은 경우, 시료의 채취 과정이 실패한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군 핵산으로 이용하여 시료로부터 장내 미생물의 핵산을 증폭하기 위한 조성물을 제공한다:
(i) 장내 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍 및
(ii) 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍.
상기 본 발명의 다른 양태인 “장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군 핵산으로 이용하여 시료로부터 장내 미생물의 핵산을 증폭하기 위한 조성물”은 상술한 일 양태인“장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군 핵산으로 이용하여 시료로부터 장내 미생물의 핵산을 검출하는 방법”을 실시하기 위해 제조되므로, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 상술한 본 발명의 조성물은 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 조성물은 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 조성물은 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수적인 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 조성물은 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명에 따른 시료로부터 장내 미생물의 핵산을 검출하는 방법에 있어서, 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군 핵산으로 이용한다.
(b) 본 발명에 따른 내부 대조군은 시료 채취 과정의 내부 대조군, 핵산 추출 과정의 내부 대조군 및 핵산 증폭 과정의 내부 대조군으로 이용될 수 있다.
(c) 본 발명에 따른 내부 대조군은 처음부터 시료 내에 존재하여, 시료 채취 과정 이후에 내부 대조군을 별도로 추가해야 하는 번거로움이 없다.
(d) 본 발명에 따르면, 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군으로 이용함으로써, 위음성 및 위양성 판단을 최소화하여 시료 내의 장내 미생물 핵산의 존재 여부를 높은 정확도로 검출할 수 있다.
도 1은 서열목록 제 1 서열 및 서열목록 제 2 서열을 나타낸 것이다.
도 2a는 eNATTM을 이용하여 채취한 직장도말 시료 24개에 대하여 Lactobacillus spp. 핵산과 HBB 핵산의 검출 결과로서 Ct 값을 나타낸 것이다.
도 2b는 Fecal SwabTM을 이용하여 채취한 직장도말 시료 48개에 대하여 Lactobacillus spp. 핵산과 HBB 핵산의 검출 결과로서 Ct 값을 나타낸 것이다.
도 2c는 도 1a 및 도 1b 결과에 따른 Lactobacillus spp. 핵산과 HBB 핵산의 검출 결과율 및 평균 Ct값을 나타낸 것이다.
도 3a는 직장도말 시료 32개에 대하여 Bacteroides spp. 핵산과 HBB 핵산의 검출 결과로서 Ct 값을 나타낸 것이다.
도 3b는 대변 시료 40개에 대하여 Bacteroides spp. 핵산과 HBB 핵산의 검출 결과로서 Ct 값을 나타낸 것이다.
도 3c는 도 2a 및 도 2b 결과에 따른 Bacteroides spp. 핵산과 HBB 핵산의 검출 결과율(%) 및 평균 Ct값을 나타낸 것이다.
도 4는 내부 대조군으로서 Lactobacillus spp. 핵산을 이용하는 본 발명에 따른 검출 방법을 이용하여 VanR 양성 시료 및 VanR 음성 시료를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 내부 대조군으로서 Bacteroides spp. 핵산을 이용하는 본 발명에 따른 검출 방법을 이용하여 VanR 양성 시료 및 VanR 음성 시료를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예
실시예 1: 다양한 시료로부터 장내 정상세균총의 검출율 확인
본 발명자들은 핵산 증폭을 이용한 장내 미생물 검출 방법에 있어서, 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아인 Lactobacillus spp. 및 Bacteroides spp.의 핵산을 내부 대조군 핵산으로 사용할 수 있는지 확인하였다.
이를 위하여, 복수의 인간에서 채취한 시료로부터 Lactobacillus spp. 및 Bacteroides spp의 핵산 검출율을 확인하였으며, 이를 종래 내인성 내부 대조군(Endogenous Internal Control)으로 사용되고 있는 Human beta globin(HBB) 유전자의 검출율과 비교하였다.
실시예 1-1. 올리고뉴클레오타이드의 준비
Lactobacillus spp. 및 Bacteroides spp.의 타겟 핵산으로 16s rRNA를 코딩하는 핵산을 이용하였다. 상기 핵산의 검출은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체에 의한 시그널을 이용하여 복수의 타겟을 검출할 수 있는 TOCETM 기술(WO 2012/096523)을 이용하였다.
Lactobacillus spp. 및 Bacteroides spp.의 16s rRNA을 코딩하는 타겟 핵산을 검출하기 위한 프라이머 쌍, PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide) 및 CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide)의 서열은 [표 1]과 같다. HBB는 HBB 검출용 프라이머 쌍(β-globin (human) Primer Set, Cat. No. 3868; TAKARA) 및 상기 프라이머 쌍 기반으로 디자인된 PTO 및 CTO를 사용하였다.
실시예 <1-1> 핵산 증폭용 조성물의 올리고뉴클레오타이드
장내
정상세균총		 서열
목록		 올리고
종류		 서열 (5'-3')
Lactobacillus
spp. 		3 전방향
프라이머		 CTTGAGTGCAGAAGAGGASAGTG
Lactobacillus
spp. 		4 역방향
프라이머		 CRGCACTGAGAGGCGGAAAC
Lactobacillus
spp. 		5 PTO GTCGACAGTAGGGGTCTGYAACTGACGCTGAGGCTC[C3 spacer]
Lactobacillus
spp. 		6 CTO [BHQ-2]TTTTATTTATTTTTTTTTTT[T(Quasar670)]TCACCCCTACTGTCGAC[C3 spacer]
Bacteroides
spp		 7 전방향
프라이머		 GGGGATGCGTTCCATTAG
Bacteroides
spp		 8 역방향
프라이머		 CAATATTCCTCACTGCTGCC
Bacteroides
spp		 9 PTO CATAGGGTTGGCGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCAC[C3 spacer]
Bacteroides
spp		 10 CTO [BHQ-2]TTTTATTTATTTATTTTTTT[T(Quasar670)]TTCCCGCCAACCCTATG[C3 spacer]
실시예 1-2. Lactobacillus spp.와 HBB의 검출율 비교
성병검사 또는 장관관련 질환 검사를 위해 eNATTM(eNATTM PM 2ML REGULAR APPLICATOR; Copan)을 이용하여 채취된 직장도말(rectal swab)시료 24개와 Fecal SwabTM(Cat. No. 480CE; Copan)을 이용하여 채취된 직장도말 시료 48개를 추출 자동화 장비 Microlab NIMBUS IVD(Cat. No. 65415-02, Hamilton) 및 추출시약 STARMag 96X4 Universal Cartridge Kit (Cat. No. 744300.4.UC384, Seegene Inc.)을 이용하여 핵산 추출을 행하였다. 핵산 추출을 위한 각 시료는 200 ㎕을 사용하였고, 용리는 100 ㎕ 용량으로 행하였다. 얻어진 핵산 추출물을 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용하였다.
전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 CTO의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
동일한 시료로부터 얻은 핵산 추출물에 대해 Lactobacillus spp. 타겟 핵산과 HBB 유전자의 검출율을 비교하기 위하여, 각각의 핵산 추출물 5㎕를 담은 2개의 튜브를 준비하였다. 첫 번째 튜브(튜브 1)에는 Lactobacillus spp. 16s rRNA를 코딩하는 타겟 핵산 증폭을 위한 전방향 프라이머(서열목록 제 3 서열) 4 pmole, 역방향 프라이머(서열목록 제 4 서열) 4 pmole, PTO(서열목록 제 5 서열) 4 pmole 및 CTO(서열목록 제 6 서열) 1 pmole 을 넣고, 두 번째 튜브(튜브 2)에는 Lactobacillus spp. 검출용 올리고뉴클레오타이드와 동일 양으로 HBB 검출용 올리고뉴클레오타이드(전방향 및 역방향 프라이머, PTO, CTO)를 넣었다. 2개의 튜브 각각에 4×효소 혼합물[최종적으로 3.2 mM dNTPs, 3.2 mM MgCl2, 및 4U Taq DNA 중합효소] 5 ㎕ 및 4×효소 버퍼[최종적으로 0.04% BSA] 5 ㎕를 첨가하여 최종 부피 20 ㎕가 되도록 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 제조한 반응 혼합물을 사용하여 Real-time PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 90℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 10초 과정을 45 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 60℃에서 실시하였다.
그 결과, 도 2a-2c에 나타난 바와 같이, eNATTM을 이용하여 채취된 직장도말 시료에 대한 Lactobacillus spp.의 검출율은 100%, HBB의 검출율은 95.83%였으며, Fecal SwabTM 을 이용하여 채취된 직장도말에 대한 Lactobacillus spp.의 검출율은 97.92%, HBB의 검출율은 70.83%인 것을 확인하였다. 또한, Lactobacillus spp.의 평균 Ct 값은 eNATTM을 이용하여 채취된 직장도말의 경우 27.36 및 Fecal SwabTM 을 이용하여 채취된 직장도말의 경우 29.07인 반면, HBB의 평균 Ct 값은 eNATTM을 이용하여 채취된 직장도말의 경우 35.59 및 Fecal SwabTM 을 이용하여 채취된 직장도말의 경우 33.23으로 나타나, Lactobacillus spp.의 평균 Ct 값이 HBB의 평균 Ct 값 보다 낮은 것을 확인하였다.
이러한 결과는 Lactobacillus spp. 핵산이 내부 대조군으로서 HBB 유전자 보다 더 안정적인 수준(즉, HBB보다 낮은 Ct값)으로 우수한 검출율을 가지는 것을 의미하며, 이는, 일반적으로 내부 대조군으로서 많이 사용되고 있는 HBB 유전자 보다, Lactobacillus spp. 핵산이 내부 대조군으로서 더욱 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 1-3. Bacteroides spp와 HBB의 검출율 비교
성병검사 또는 장관관련질환 검사를 위해 채취된 대변 시료(stool sample) 40개와 직장도말(rectal swab) (Fecal SwabTM을 이용하여 채취) 시료 42개를 추출 자동화 장비 Microlab NIMBUS IVD (Cat. No. 65415-02, Hamilton) 및 추출시약 STARMag 96X4 Universal Cartridge Kit (Cat. No. 744300.4.UC384, Seegene)을 이용하여 핵산 추출을 행하였다. 대변 시료는 전처리 단계를 추가로 실시하였으며, 대변 시료에 대한 전처리를 위해 ASL 버퍼(Cat. No. 19082, Qiagen) 1mL에 약 100~200 mg의 대변을 풀어준 후 상온에서 10 분간 방치하고 20,000 xg (14,000 rpm)에서 2분간 원심분리하여 상층액을 이용하였다. 핵산 추출을 위한 각 시료는 200 ㎕를 사용하였고, 용리는 직장도말 시료는 100 ㎕, 대변 시료는 50 ㎕ 용량으로 행하였다. 얻어진 핵산 추출물을 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용하였다.
전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 CTO 의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
동일한 시료로부터 얻은 핵산 추출물에 대해 Bacteroides spp. 타겟 핵산과 HBB 유전자의 검출율을 비교하기 위하여, 각각의 핵산 추출물 5㎕를 담은 2개의 튜브를 준비하였다. 첫 번째 튜브(튜브 1)에는 Bacteroides spp. 16s rRNA을 코딩하는 타겟 핵산 증폭을 위한 전방향 프라이머(서열목록 제 7 서열) 4 pmole, 역방향 프라이머(서열목록 제 8 서열) 4 pmole, PTO (서열목록 제 9 서열) 4 pmole 및 CTO(서열목록 제 10 서열) 1 pmole을 넣고, 두 번째 튜브(튜브 2)에는 Bacteroides spp. 검출용 올리고뉴클레오타이드와 동일 양으로 HBB 검출용 올리고뉴클레오타이드(전방향 및 역방향 프라이머, PTO, CTO)를 넣었다. 2개의 튜브 각각에 4×효소 혼합물[최종적으로 3.2 mM dNTPs, 3.2 mM MgCl2, 및 4U Taq DNA 중합효소] 5 ㎕ 및 4×효소 버퍼[최종적으로 0.04% BSA] 5 ㎕를 첨가하여 최종 부피 20 ㎕가 되도록 반응 혼합물을 제조하였다. 제조한 반응 혼합물을 사용하여 Real-time PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 90℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 10초 과정을 45 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 60℃에서 실시하였다.
그 결과, 도 3a-3c에 나타난 바와 같이, 직장도말에 대한 Bacteroides spp.의 검출율은 90.6%, 평균 Ct 값은 23.30이었으며, HBB의 검출율은 78.1%, 평균 Ct 값은 31.91이었다. 대변 시료에 대한 Bacteroides spp. 의 검출율은 80%, 평균 Ct 값은 19.01이었으며, HBB의 검출율은 85%로 Bacteroides spp. 보다 다소 높았으나, 평균 Ct 값은 34.72로 Bacteroides spp. 보다 높은 평균 Ct값을 나타냈다.
이러한 결과는 Bacteroides spp. 핵산 역시, 내부 대조군으로서 HBB 유전자 보다 더 안정적인 수준(즉, HBB보다 낮은 Ct값)으로 우수한 검출율을 가지는 것을 의미하며, 이는, 일반적으로 내부 대조군으로서 많이 사용되고 있는 HBB 유전자 보다, Bacteroides spp. 핵산이 내부 대조군으로서 더욱 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 2: 내부 대조군으로서 장내 정상세균총의 이용
본 발명자들은 장내 미생물의 핵산 검출과 함께 내부 대조군으로서 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아인 Lactobacillus spp. 및 Bacteroides spp.의 핵산을 검출하였다.
본 발명자들은 장내 미생물로 반코마이신 내성장구균(Vancomycin Resistant Enterococci; VRE)을 검출하였으며, 반코마이신 내성장구균 핵산을 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드로 Anyplex™ VanR Real-time Detection 제품(Seegene Inc, 한국)에 포함된 올리고뉴클레오타이드를 사용하였으며, 내부 대조군 핵산을 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드는 상기 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다.
실시예 2-1. 내부 대조군으로서 Lactobacillus spp.의 이용
본 실험의 객관성과 명확성을 위해, 시료는 약제내성의 gold standard 방법인 표현형적 항생제 감수성 시험 및 단독 PCR을 수행하여 반코마이신 내성장구균(Vancomycin Reststant Enterococci; VRE) 존재 여부에 대한 진단결과가 확인된 직장도말 시료를 수집하여 사용하였다.
상기 수집된 직장도말 시료로부터 핵산의 추출은 추출 자동화 장비 Microlab NIMBUS IVD (Cat. No. 65415-02, Hamilton) 및 추출시약 STARMag 96X4 Universal Cartridge Kit (Cat. No. 744300.4.UC384, Seegene Inc.)을 이용하여 행하였다. 핵산 추출을 위한 각 시료는 200 ㎕을 사용하였고, 용리는 100 ㎕ 용량으로 행하였다. 얻어진 핵산 추출물을 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용하였다.
전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 CTO 의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
반코마이신 내성장구균의 존재가 확인된 시료 및 반코마이신 내성장구균의 존재가 확인되지 않은 시료로부터 얻은 핵산 추출물 5㎕ 각각에 대하여, (i) Lactobacillus spp. 16s rRNA을 코딩하는 타겟 핵산 증폭을 위한 전방향 프라이머(서열목록 제 3 서열) 4 pmole, 역방향 프라이머(서열목록 제 4 서열) 4 pmole, PTO(서열목록 제 5 서열) 4 pmole 및 CTO(서열목록 제 6 서열) 1 pmole 및 (ii) 상기 Lactobacillus spp.에 대한 올리고뉴클레오타이드와 동일 양으로 반코마이신 내성장구균 핵산을 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드(전방향 및 역방향 프라이머, PTO, CTO)를 넣고, 4×효소 혼합물[최종적으로 3.2 mM dNTPs, 3.2 mM MgCl2, 및 4U Taq DNA 중합효소] 5 ㎕ 및 4X 효소 버퍼[최종적으로 0.04% BSA] 5 ㎕를 첨가하여 최종 부피가 20 ㎕이 되도록 반응혼합물을 제조하였다. 상기 제조한 반응혼합물을 사용하여 Real-time PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 10초 과정을 45 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 60℃에서 실시하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 반코마이신 내성장구균의 존재가 확인된 시료의 경우, 반코마이신 내성장구균의 핵산(Ct 값 29.08) 및 Lactobacillus spp.의 핵산(Ct값 20.56)이 검출되었다.
반면, 반코마이신 내성장구균의 존재가 확인되지 않았던 시료의 경우, 반코마이신 내성장구균의 핵산 및 Lactobacillus spp.의 핵산 모두가 검출되지 않았다. 내부 대조군이 검출되지 않는 경우, 시료 채취 과정, 핵산 추출 과정 또는 핵산 증폭 과정에서 문제가 발생한 것을 의미하는데, 해당 시료를 호기성배양(aerobic culture)을 수행한 결과, 배지에서 자라는 균이 없는 것을 확인하였다. 이는 시료 채취 과정에서 채취가 정상적으로 이루어지지 않은 것을 의미하며, 내부 대조군 핵산이 검출되지 않았으므로, 타겟 핵산 검출 결과를 유효하지 않은 결과(invalid result)로 판단할 수 있다.
이러한 실험 결과는 Lactobacillus spp. 핵산이 반코마이신 내성장구균의 검출 과정에서 내부 대조군으로서 유용하게 사용될 수 있음을 증명한다.
실시예 2-2. 내부 대조군으로서 Bacteroides spp.의 이용
본 실험의 객관성과 명확성을 위해, 시료는 약제내성의 gold standard 방법인 표현형적 항생제 감수성 시험 및 단독 PCR을 수행하여 반코마이신 내성 장구균 존재 여부에 대한 진단결과가 확인된 직장도말 시료를 수집하여 사용하였다.
상기 수집된 직장도말로부터 핵산의 추출은 추출 자동화 장비 Microlab NIMBUS IVD (Cat. No. 65415-02, Hamilton) 및 추출시약 STARMag 96X4 Universal Cartridge Kit (Cat. No. 744300.4.UC384, Seegene)을 이용하여 행하였다. 핵산 추출을 위한 각 시료는 200 ㎕을 사용하였고, 용리는 100 ㎕ 용량으로 행하였다. 얻어진 핵산 추출물을 실시간 중합효소 연쇄반응에 사용하였다.
전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 CTO 의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
반코마이신 내성장구균의 존재가 확인된 시료 및 반코마이신 내성장구균의 존재가 확인되지 않은 시료로부터의 핵산 추출물 5㎕ 각각에 대하여, (i) Bacteroides spp. 16s rRNA를 코딩하는 타겟 핵산 증폭을 위한 전방향 프라이머(서열목록 제 7 서열) 4 pmole, 역방향 프라이머(서열목록 제 8 서열) 4 pmole, PTO(서열목록 제 9 서열) 4 pmole 및 CTO(서열목록 제 10 서열) 1 pmole 및 (ii) Bacteroides spp.에 대한 올리고뉴클레오타이드와 동일 양으로 반코마이신 내성장구균 핵산을 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드(전방향 및 역방향 프라이머, PTO, CTO)를 넣고, 4×효소 혼합물[최종적으로 3.2 mM dNTPs, 3.2 mM MgCl2, 및 4U Taq DNA 중합효소] 5 ㎕ 및 4×효소 버퍼[최종적으로 0.04% BSA] 5 ㎕를 첨가하여 최종 부피가 20 ㎕이 되도록 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 제조한 반응 혼합물을 사용하여 Real-time PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 10초 과정을 45 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 60℃에서 실시하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 반코마이신 내성장구균의 존재가 확인된 시료의 경우, 반코마이신 내성장구균의 핵산(Ct 값 34.26) 및 Bacteroides spp.의 핵산(Ct값 22.9)이 검출되었다,
반면, 반코마이신 내성장구균의 존재가 확인되지 않았던 시료의 경우, 반코마이신 내성장구균의 핵산 및 Bacteroides spp.의 핵산 모두가 검출되지 않았다. 내부 대조군의 미검출은 시료 채취 과정, 핵산 추출 과정 또는 핵산 증폭 과정에서 문제가 발생한 것을 의미하는데, 해당 시료를 호기성배양(aerobic culture)을 수행한 결과, 배지에서 자라는 균이 없는 것을 확인하였다. 이는 시료 채취 과정에서 채취가 정상적으로 이루어지지 않은 것을 의미하며, 내부 대조군 핵산이 검출되지 않았으므로, 타겟 핵산 검출 결과를 유효하지 않은 결과(invalid result)로 판단할 수 있다.
이러한 결과는 Bacteroides spp. 핵산이 반코마이신 내성장구균 검출 과정에 내부 대조군으로서 유용하게 사용될 수 있음을 증명한다.
따라서, 상기 실험결과에 의해 Lactobacillus spp. 및 Bacteroides spp. 와 같은 장내 정상세균총 핵산은 핵산 증폭을 이용하는 장내 미생물 검출 방법에 있어서, 내부 대조군으로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seegene Inc. <120> METHOD FOR DETECTING GUT MICROORGANISM IN A SAMPLE USING NORMAL GUT FLORA AS INTERNAL CONTROL <130> PP180025KR <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 529 <212> DNA <213> Lactobacillus sp. <400> 1 agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 60 ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggaagaat aagtctgatg tgaaagccct 120 cggcttaacc gaggaactgc atcggaaact gtttttcttg agtgcagaag aggagagtgg 180 aactccatgt gtagcggtgg aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg 240 ctctctggtc tgcaactgac gctgaggctc gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata 300 ccctggtagt ccatgccgta aacgatgagt gctaagtgtt gggaggtttc cgcctctcag 360 tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca 420 aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 480 aagaacctta ccaggtcttg acatctagtg caatccgtag agatacgga 529 <210> 2 <211> 776 <212> DNA <213> Bacteroides sp. <400> 2 cttttacaat gaagagtttg atcctggctc aggatgaacg ctagctacag gcttaacaca 60 tgcaagtcga ggggcagcat tttagtttgc ttgcaaacta aagatggcga ccggcgcacg 120 ggtgagtaac acgtatccaa cctgccgata actcggggat agcctttcga aagaaagatt 180 aatatccgat ggtatatttt ctccgcatgg tgagaatatt aaagaatttc ggttatcgat 240 ggggatgcgt tccattagtt tgttggcggg gtaacggccc accaagacca cgatggatag 300 gggttctgag aggaaggtcc cccacattgg aactgagaca cggtccaaac tcctacggga 360 ggcagcagtg aggaatattg gtcaatggac gagagtctga accagccaag tagcgtgaag 420 gatgactgcc ctatgggttg taaacttctt ttatatggga ataaagtgtt ccacgtgtgg 480 gattttgtat gtaccatatg aataaggatc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat 540 acggaggatc cgagcgttat ccggatttat tgggtttaaa gggagcgtag gtggattgtt 600 aagtcagttg tgaaagtttg cggctcaacc gtaaaattgc agttgaaact ggcagtcttg 660 agtacagtag aggtgggcgg aattcgtggt gtagcggtga aatgcttaga tatcacgaag 720 aactccgatt gcgaaggcag ctcactagac tgcaactgac actgatgctc gaaagt 776 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for detecting Lactobacillus sp. <400> 3 cttgagtgca gaagaggasa gtg 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for detecting Lactobacillus sp. <400> 4 crgcactgag aggcggaaac 20 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTO for detecting Lactobacillus sp. <400> 5 gtcgacagta ggggtctgya actgacgctg aggctc 36 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTO for detecting Lactobacillus sp. <400> 6 ttttatttat tttttttttt ttcaccccta ctgtcgac 38 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for detecting Bacteroides sp. <400> 7 ggggatgcgt tccattag 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for detecting Bacteroides sp. <400> 8 caatattcct cactgctgcc 20 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTO for detecting Bacteroides sp. <400> 9 catagggttg gcgggttctg agaggaaggt cccccac 37 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTO for detecting Bacteroides sp. <400> 10 ttttatttat ttattttttt tttcccgcca accctatg 38

Claims (23)

  1. 다음의 단계를 포함하는 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군(internal control) 핵산으로 이용하여 인간 또는 동물의 검사 대상(subject)으로부터 얻은 시료로부터 장내 미생물(gut microorganism)의 핵산을 검출하는 방법:
    시료를 채취하여 준비하는 단계;
    (i) 장내 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍; 및 (ii) 내부 대조군(internal control) 핵산으로서 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료 내 핵산의 증폭 반응을 수행하는 단계;
    상기 증폭 반응의 결과를 검출하는 단계; 및
    상기 내부 대조군 핵산의 증폭 반응의 결과로부터 장내 미생물 핵산의 증폭 반응의 유효성을 판단하고; 및
    (i) 상기 판단된 유효성 및 (ii) 상기 장내 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과에 의해 상기 시료 내에 상기 장내 미생물의 핵산의 존재 여부를 판단하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 시료의 준비는 시료로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산은 시료를 채취하는 단계, 시료로부터 핵산을 추출하는 단계 및/또는 추출된 핵산을 증폭하는 단계에 대한 내부 대조군으로 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 방법은 내부 대조군 핵산으로서 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 채취된 시료 내 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고, 이에 의해 상기 시료의 채취가 유효(valid) 또는 무효(invalid)인지를 판단할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 방법은 내부 대조군 핵산으로서 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료로부터 추출된 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하고, 이에 의해 상기 추출이 유효 또는 무효인지를 판단할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 내부 대조군 핵산이 검출되지 않은 경우, 상기 장내 미생물 핵산의 증폭 반응의 결과는 무효인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 장내 정상세균총은 인간 장내 정상세균총인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아는 Bacteroides spp. 또는 Lactobacillus spp. 인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산은 16s rRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 시료는 직장도말(rectal swab) 시료, 대변 시료, 또는 소변 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 증폭 반응 결과의 검출은 포스트-검출 방법 또는 실시간 검출 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 증폭 반응은 (i) 상기 장내 미생물의 핵산 검출용 프로브; 및 (ii) 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 검출용 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산의 프라이머 쌍 또는 프로브는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열 및 이들의 상보적인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 증폭 반응은 fast PCR 방법에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 장내 미생물은 약물 내성 장내 미생물( drug-resistant gut microorganism)인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 다음을 포함하는, 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산을 내부 대조군 핵산으로 이용하여 인간 또는 동물의 검사 대상(subject)으로부터 얻은 시료로부터 장내 미생물의 핵산을 증폭하기 위한 조성물:
    (i) 장내 미생물의 핵산 증폭용 프라이머 쌍 및
    (ii) 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 증폭용 프라이머 쌍.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산은 시료를 채취하는 단계, 시료로부터 핵산을 추출하는 단계 및/또는 추출된 핵산을 증폭하는 단계에 대한 내부 대조군으로 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 장내 정상세균총은 인간 장내 정상세균총인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아는 Bacteroides spp. 또는 Lactobacillus spp. 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 16 항에 있어서, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산은 16s rRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 조성물.
  21. 제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 (i) 상기 장내 미생물의 핵산 검출용 프로브 및 (ii) 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아의 핵산 검출용 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 장내 정상세균총으로부터 선택된 박테리아 핵산의 프라이머 쌍 또는 프로브는 서열목록 제 1 서열, 서열목록 제 2 서열 및 이들의 상보적인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 16 항에 있어서, 상기 장내 미생물은 약물 내성 장내 미생물인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물.

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