JP2001149073A - 腸内細菌叢の分析方法及び分析装置 - Google Patents
腸内細菌叢の分析方法及び分析装置Info
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 腸内細菌の核酸に基づいて、腸内細菌叢を分
析する。 【解決手段】 本発明の腸内細菌叢を分析する方法は、
被験者から試料を採取して（Ｓ０１）、細菌を抽出して
細菌懸濁液を調製する（Ｓ０２）。細菌懸濁液から細菌
のＤＮＡを抽出してＤＮＡ抽出液を調製する（Ｓ０
３）。このＤＮＡ抽出液を用い、例えば、１６ＳｒＤＮ
Ａなどの特定の領域を増幅する（Ｓ０４）。増幅された
増幅断片を電気泳動により分画して分画パターンを得る
（Ｓ０５）。この分画パターンを予め測定された腸内細
菌の増幅断片の泳動パターン（Ｓ０６）と対比して、被
験者の腸内細菌叢を分析する（Ｓ０７）。
析する。 【解決手段】 本発明の腸内細菌叢を分析する方法は、
被験者から試料を採取して（Ｓ０１）、細菌を抽出して
細菌懸濁液を調製する（Ｓ０２）。細菌懸濁液から細菌
のＤＮＡを抽出してＤＮＡ抽出液を調製する（Ｓ０
３）。このＤＮＡ抽出液を用い、例えば、１６ＳｒＤＮ
Ａなどの特定の領域を増幅する（Ｓ０４）。増幅された
増幅断片を電気泳動により分画して分画パターンを得る
（Ｓ０５）。この分画パターンを予め測定された腸内細
菌の増幅断片の泳動パターン（Ｓ０６）と対比して、被
験者の腸内細菌叢を分析する（Ｓ０７）。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、被験者の腸内細菌
叢（腸内フローラ）を分析するための方法及び装置に関
する。
叢（腸内フローラ）を分析するための方法及び装置に関
する。
【０００２】
【従来の技術】腸内には腸内細菌と呼ばれる常在細菌類
が存在し、この細菌類の分布状態を腸内細菌叢という。
腸内細菌には、Enterobacteriaceaeに属する大腸菌と近
縁のSalmonella等、また、Bacteroides、Eubacterium、
Bifidobacterium、Peptostreptococcus、Clostridium、
Lactobacillusなどが含まれる。
が存在し、この細菌類の分布状態を腸内細菌叢という。
腸内細菌には、Enterobacteriaceaeに属する大腸菌と近
縁のSalmonella等、また、Bacteroides、Eubacterium、
Bifidobacterium、Peptostreptococcus、Clostridium、
Lactobacillusなどが含まれる。
【０００３】これら腸内細菌は、食物の消化に補助的な
役割を果たす他、外来の病原菌の発育を抑制するなどの
体調の維持に役立っているが、このような腸内細菌叢
は、各個体において一定ではなく、宿主の年齢、食物習
慣などにより変化する。また、同一の個体においても、
疾病や精神的なストレスなどによって変化することが知
られている。
役割を果たす他、外来の病原菌の発育を抑制するなどの
体調の維持に役立っているが、このような腸内細菌叢
は、各個体において一定ではなく、宿主の年齢、食物習
慣などにより変化する。また、同一の個体においても、
疾病や精神的なストレスなどによって変化することが知
られている。
【０００４】こうした腸内細菌叢を分析する場合に、従
来は、培養法が利用されてきた。すなわち、被験者の糞
便などの試料を選択培地又は非選択培地などに植菌し、
各細菌の生育条件に合わせて、各培地を培養し、成長し
た細菌を染色等により細菌の性質に基づいて各腸内細菌
が同定されていた。
来は、培養法が利用されてきた。すなわち、被験者の糞
便などの試料を選択培地又は非選択培地などに植菌し、
各細菌の生育条件に合わせて、各培地を培養し、成長し
た細菌を染色等により細菌の性質に基づいて各腸内細菌
が同定されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、腸内細菌群は
１００種類にも及ぶといわれており（「腸内フローラと
プロバイオティクス（INTESTINAL FLORA AND PROBIOTIC
S）」,Proceedings of V.Symposium of Intestinal Flo
ra,Tokyo,1996,学会出版センター）、これら多数の腸内
細菌群を培養法により分析することが極めて困難であ
り、分析可能な細菌の範囲も限定されることになる。ま
た、一定の細菌群の範囲については分析が可能であると
しても、多数の細菌を培養し同定するためには、時間と
労力の係る作業であった。
１００種類にも及ぶといわれており（「腸内フローラと
プロバイオティクス（INTESTINAL FLORA AND PROBIOTIC
S）」,Proceedings of V.Symposium of Intestinal Flo
ra,Tokyo,1996,学会出版センター）、これら多数の腸内
細菌群を培養法により分析することが極めて困難であ
り、分析可能な細菌の範囲も限定されることになる。ま
た、一定の細菌群の範囲については分析が可能であると
しても、多数の細菌を培養し同定するためには、時間と
労力の係る作業であった。
【０００６】一方、細菌にも、それぞれの細菌の特質が
記録された遺伝情報が、ＤＮＡとして染色体にコードさ
れている。これら細菌の特性の違いは、この遺伝情報を
司る染色体上の配列に反映され、細菌ごとに特徴的な配
列が存在する。
記録された遺伝情報が、ＤＮＡとして染色体にコードさ
れている。これら細菌の特性の違いは、この遺伝情報を
司る染色体上の配列に反映され、細菌ごとに特徴的な配
列が存在する。
【０００７】一例として、細菌のリボソーマルＲＮＡの
１６ＳｒＲＮＡサブユニットをコードした１６ＳｒＤＮ
Ａでは、細菌間で異なり、この配列の相違により細菌を
同定することができることが示されている（Ｃｈｒｉｓ
ｔｉｎｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．６５：１０２−１０９）。
１６ＳｒＲＮＡサブユニットをコードした１６ＳｒＤＮ
Ａでは、細菌間で異なり、この配列の相違により細菌を
同定することができることが示されている（Ｃｈｒｉｓ
ｔｉｎｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．６５：１０２−１０９）。
【０００８】そこで、本発明は、前記課題に鑑みてなさ
れたものであり、その目的は、腸内細菌間の核酸配列の
相違を利用して、腸内細菌叢を分析することである。
れたものであり、その目的は、腸内細菌間の核酸配列の
相違を利用して、腸内細菌叢を分析することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】請求項１に係る発明は、
被験者の腸内細菌叢を分析する方法であって、被験者か
ら採取した試料中の腸内細菌群の核酸を特定のＰＣＲプ
ライマーを用いて増幅させる核酸増幅工程と、前記核酸
増幅工程において得られた増幅断片に基づき腸内細菌叢
を分析する分析工程とを含むことを特徴とする。
被験者の腸内細菌叢を分析する方法であって、被験者か
ら採取した試料中の腸内細菌群の核酸を特定のＰＣＲプ
ライマーを用いて増幅させる核酸増幅工程と、前記核酸
増幅工程において得られた増幅断片に基づき腸内細菌叢
を分析する分析工程とを含むことを特徴とする。
【００１０】請求項２に係る発明は、請求項１の発明に
おいて、前記分析工程には、前記増幅断片を電気泳動で
分画する分画工程と、前記分画工程において得られた分
画パターンを分析する分析工程とを含むことを特徴とす
る。
おいて、前記分析工程には、前記増幅断片を電気泳動で
分画する分画工程と、前記分画工程において得られた分
画パターンを分析する分析工程とを含むことを特徴とす
る。
【００１１】請求項３に係る発明は、請求項１の発明に
おいて、前記分析工程には、複数のプローブを用いて前
記増幅断片とハイブリッド形成を行わせ、その形成の有
無から腸内細菌叢の分析が行われることを特徴とする。
おいて、前記分析工程には、複数のプローブを用いて前
記増幅断片とハイブリッド形成を行わせ、その形成の有
無から腸内細菌叢の分析が行われることを特徴とする。
【００１２】請求項４に係る発明は、請求項３の発明に
おいて、前記プローブは、検出部中の特定の位置に配置
されていることを特徴とする。
おいて、前記プローブは、検出部中の特定の位置に配置
されていることを特徴とする。
【００１３】請求項５に係る発明は、請求項４の発明に
おいて、前記核酸増幅工程で用いたＰＣＲプライマーで
各腸内細菌から増幅された核酸をプローブとすること特
徴とする。
おいて、前記核酸増幅工程で用いたＰＣＲプライマーで
各腸内細菌から増幅された核酸をプローブとすること特
徴とする。
【００１４】請求項６に係る発明は、請求項４の発明に
おいて、前記核酸増幅工程において得られた核酸は、前
記検出部への導入前に変性せしめることを特徴とする。
おいて、前記核酸増幅工程において得られた核酸は、前
記検出部への導入前に変性せしめることを特徴とする。
【００１５】請求項７に係る発明は、請求項４の発明に
おいて、前記検出部の設定温度は、温度制御部からの命
令により任意に変更できることを特徴とする。
おいて、前記検出部の設定温度は、温度制御部からの命
令により任意に変更できることを特徴とする。
【００１６】請求項８に係る発明は、請求項１〜７のい
ずれかの発明において、前記特定のＰＣＲプライマー
が、前記腸内細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードした核酸領
域を増幅し得る配列を有していることを特徴とする。
ずれかの発明において、前記特定のＰＣＲプライマー
が、前記腸内細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードした核酸領
域を増幅し得る配列を有していることを特徴とする。
【００１７】請求項９に係る発明は、請求項１〜７のい
ずれかの発明において、前記特定のプライマーが特定の
増幅確率を有するプライマーであることを特徴とする。
ずれかの発明において、前記特定のプライマーが特定の
増幅確率を有するプライマーであることを特徴とする。
【００１８】請求項１０に係る発明は、腸内細菌叢を分
析するための装置であって、被験者から採取した試料中
の腸内細菌群の核酸を増幅させる核酸増幅部と、前記増
幅された核酸を電気泳動により分画する電気泳動部と、
前記電気泳動部において分画された泳動パターンから腸
内細菌叢を解析する解析部とを有することを特徴とす
る。
析するための装置であって、被験者から採取した試料中
の腸内細菌群の核酸を増幅させる核酸増幅部と、前記増
幅された核酸を電気泳動により分画する電気泳動部と、
前記電気泳動部において分画された泳動パターンから腸
内細菌叢を解析する解析部とを有することを特徴とす
る。
【００１９】請求項１１に係る発明は、腸内細菌叢を分
析するための装置であって、被験者から採取した試料中
の腸内細菌群の核酸を増幅させる核酸増幅部と、前記増
幅された核酸と特定のプローブとをハイブリッド形成さ
せるハイブリッド形成部と、前記ハイブリッド形成の結
果から腸内細菌叢を解析する解析部とを有することを特
徴とする。
析するための装置であって、被験者から採取した試料中
の腸内細菌群の核酸を増幅させる核酸増幅部と、前記増
幅された核酸と特定のプローブとをハイブリッド形成さ
せるハイブリッド形成部と、前記ハイブリッド形成の結
果から腸内細菌叢を解析する解析部とを有することを特
徴とする。
【００２０】請求項１２に係る発明は、請求項７の発明
において、前記ハイブリッド形成部には、腸内細菌群由
来の核酸からなるプローブが配列されたＤＮＡチップが
備えられていることを特徴とする。
において、前記ハイブリッド形成部には、腸内細菌群由
来の核酸からなるプローブが配列されたＤＮＡチップが
備えられていることを特徴とする。
【００２１】請求項１３に係る発明は、請求項１１の発
明において、前記ハイブリッド形成部には、腸内細菌群
由来の核酸からなる特定のプローブが特定の位置に配置
された検出部が備えられていることを特徴とする。
明において、前記ハイブリッド形成部には、腸内細菌群
由来の核酸からなる特定のプローブが特定の位置に配置
された検出部が備えられていることを特徴とする。
【００２２】請求項１４に係る発明は、請求項１３の発
明において、前記核酸増幅部で用いたＰＣＲプライマー
で各腸内細菌から増幅された核酸をプローブとすること
特徴とする。
明において、前記核酸増幅部で用いたＰＣＲプライマー
で各腸内細菌から増幅された核酸をプローブとすること
特徴とする。
【００２３】請求項１５に係る発明は、請求項１３の発
明において、前記検出部の前段には、核酸を変性せしめ
るＤＮＡ変性部を設けることを特徴とする。
明において、前記検出部の前段には、核酸を変性せしめ
るＤＮＡ変性部を設けることを特徴とする。
【００２４】請求項１６に係る発明は、請求項１３の発
明において、前記検出部の設定温度を任意に変更できる
温度制御部を備えることを特徴とする。
明において、前記検出部の設定温度を任意に変更できる
温度制御部を備えることを特徴とする。
【００２５】
【発明の実施の形態】以下、本発明の好適な実施形態を
図面を用いて説明する。 [第一の実施形態]図１は、第一の実施形態の腸内細菌叢
の分析方法の工程図を模式的に示す。 （１）試料の調製 図１において、被験者から試料、例えば糞便を採取し
（Ｓ０１）、この試料を生理食塩水等に懸濁する。この
懸濁液は、その後、フィルターなどに通されて、細菌以
外の不要な細胞などの固体が除去され、細菌群懸濁液が
調製される（Ｓ０２）。
図面を用いて説明する。 [第一の実施形態]図１は、第一の実施形態の腸内細菌叢
の分析方法の工程図を模式的に示す。 （１）試料の調製 図１において、被験者から試料、例えば糞便を採取し
（Ｓ０１）、この試料を生理食塩水等に懸濁する。この
懸濁液は、その後、フィルターなどに通されて、細菌以
外の不要な細胞などの固体が除去され、細菌群懸濁液が
調製される（Ｓ０２）。
【００２６】この細菌の分離回収に用いるフィルター
は、細菌とそれ以外の個体とを分離し得るサイズのもの
であれば特に限定はない。また、好適には、このフィル
ターとして、径の異なる複数のフィルターを用い、粗い
目のものから細かな目のフィルターを順次通すことによ
り、フィルターの目詰まりを低減させることができる。
例えば、目の粗いフィルターとしてストマフィルター
（グンゼ産業）を、目の細かいフィルターとしてポリプ
ロピレンスクリーン８０μｍ、４５μｍ、２５μｍ（Ｍ
ＩＬＬＩＰＯＲＥ）、ミニザルト５μｍ（ｓａｒｔｏｒ
ｉｕｓ）などのメンブランフィルターを組み合わせて好
適に利用することもできる。 （２）特定ＤＮＡのＰＣＲによる増幅 前記分離された細菌は、細菌懸濁液として回収され、こ
れを用いてＤＮＡ抽出が行われる（Ｓ０３）。このＤＮ
Ａ抽出は、例えば、current protocol in molecular bi
ology,p2.4.1-2.4.5(Green Publishing Associates and
Wiley-Interscene,New York)に従って実施し、最終的
に緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液など）に懸濁
されて、この核酸懸濁液が調製される。
は、細菌とそれ以外の個体とを分離し得るサイズのもの
であれば特に限定はない。また、好適には、このフィル
ターとして、径の異なる複数のフィルターを用い、粗い
目のものから細かな目のフィルターを順次通すことによ
り、フィルターの目詰まりを低減させることができる。
例えば、目の粗いフィルターとしてストマフィルター
（グンゼ産業）を、目の細かいフィルターとしてポリプ
ロピレンスクリーン８０μｍ、４５μｍ、２５μｍ（Ｍ
ＩＬＬＩＰＯＲＥ）、ミニザルト５μｍ（ｓａｒｔｏｒ
ｉｕｓ）などのメンブランフィルターを組み合わせて好
適に利用することもできる。 （２）特定ＤＮＡのＰＣＲによる増幅 前記分離された細菌は、細菌懸濁液として回収され、こ
れを用いてＤＮＡ抽出が行われる（Ｓ０３）。このＤＮ
Ａ抽出は、例えば、current protocol in molecular bi
ology,p2.4.1-2.4.5(Green Publishing Associates and
Wiley-Interscene,New York)に従って実施し、最終的
に緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液など）に懸濁
されて、この核酸懸濁液が調製される。
【００２７】より具体的には、細菌懸濁液を例えばマイ
クロチューブなどに注入し、遠心する。遠心後、上清を
除き、得られたペレットをＳＤＳ及びプロテイネースＫ
含有ＴＥバッファ等に再懸濁する。再懸濁液を３７℃で
１時間インキュベートして溶菌させる。インキュベート
後、懸濁液に５Ｍ塩化ナトリウム溶液を添加し、混合す
る。混合後、ＣＴＡＢ（hexadecyltrimethyl ammonium
bromide）／塩化ナトリウム溶液を添加して、６５℃、
１０分間インキュベートする。
クロチューブなどに注入し、遠心する。遠心後、上清を
除き、得られたペレットをＳＤＳ及びプロテイネースＫ
含有ＴＥバッファ等に再懸濁する。再懸濁液を３７℃で
１時間インキュベートして溶菌させる。インキュベート
後、懸濁液に５Ｍ塩化ナトリウム溶液を添加し、混合す
る。混合後、ＣＴＡＢ（hexadecyltrimethyl ammonium
bromide）／塩化ナトリウム溶液を添加して、６５℃、
１０分間インキュベートする。
【００２８】クロロホルム／イソアミルアルコール溶液
を同量添加後、５分間遠心し菌体を沈殿させる。得られ
た上清を別のチューブなどに移し、フェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコールを添加し、遠心して、上
清を回収して除蛋白処理を行う。
を同量添加後、５分間遠心し菌体を沈殿させる。得られ
た上清を別のチューブなどに移し、フェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコールを添加し、遠心して、上
清を回収して除蛋白処理を行う。
【００２９】回収した上清は、さらに別のチューブに移
し、イソプロパノールを添加して、核酸を沈殿させる。
沈殿した核酸を７０％エタノールで洗浄し、上清を除去
して、沈さを軽く乾燥させる。この沈さをＴＥバッファ
で再懸濁して核酸懸濁液とする。
し、イソプロパノールを添加して、核酸を沈殿させる。
沈殿した核酸を７０％エタノールで洗浄し、上清を除去
して、沈さを軽く乾燥させる。この沈さをＴＥバッファ
で再懸濁して核酸懸濁液とする。
【００３０】調製された核酸懸濁液を用いてＰＣＲが実
施される（Ｓ０４）。このＰＣＲにおいて増幅させる核
酸としては、細菌間で配列が相違し、その配列に基づい
て細菌を識別し得る領域、例えば、細菌の１６ＳｒＤＮ
Ａなどを挙げることができる。
施される（Ｓ０４）。このＰＣＲにおいて増幅させる核
酸としては、細菌間で配列が相違し、その配列に基づい
て細菌を識別し得る領域、例えば、細菌の１６ＳｒＤＮ
Ａなどを挙げることができる。
【００３１】この１６ＳｒＤＮＡは、細菌間でわずかに
配列が相違し、また、配列に基づいた系統樹なども作ら
れていることから（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅら、前掲）、こ
の１６ＳｒＤＮＡに基づけば、後の分析工程において、
細菌の特定をも行うことが可能となる。
配列が相違し、また、配列に基づいた系統樹なども作ら
れていることから（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅら、前掲）、こ
の１６ＳｒＤＮＡに基づけば、後の分析工程において、
細菌の特定をも行うことが可能となる。
【００３２】従って、ここで用いられるＰＣＲプライマ
ーは、前記において選択された特定領域を増幅し得るも
のであればよく、例えば、前記１６ＳｒＲＮＡを増幅し
得るプライマーとしては、配列番号１と２とのプライマ
ー対又は配列番号１と３とのプライマー対が好適に用い
ることができる。また、配列番号４及び５のプライマー
対も、１６ＳｒＲＮＡを増幅し得るプライマーとして好
適に用いることができる（Microbes and Environments
12：57−68）。さらに、配列番号６及び７のプライマー
対を用いてもよい。（「腸内フローラと腸内増殖」,Pro
ceedings of 3rd Symposium on Intestinal Flora,Toky
o,1994,学会出版センター）。
ーは、前記において選択された特定領域を増幅し得るも
のであればよく、例えば、前記１６ＳｒＲＮＡを増幅し
得るプライマーとしては、配列番号１と２とのプライマ
ー対又は配列番号１と３とのプライマー対が好適に用い
ることができる。また、配列番号４及び５のプライマー
対も、１６ＳｒＲＮＡを増幅し得るプライマーとして好
適に用いることができる（Microbes and Environments
12：57−68）。さらに、配列番号６及び７のプライマー
対を用いてもよい。（「腸内フローラと腸内増殖」,Pro
ceedings of 3rd Symposium on Intestinal Flora,Toky
o,1994,学会出版センター）。
【００３３】また、ＰＣＲ反応液は、例えば、前記Ｃｈ
ｒｉｓｔｉｎｅら（前掲）に従って調製することができ
る。具体的には、前記核酸懸濁液の一部に、ＰＣＲ用の
バッファを添加し、また、最終濃度、３ｍＭ塩化マグネ
シウム、５％ＤＭＳＯ、各０．１ｍＭｄＮＴＰ、０．５
ＵＴａｑ酵素となるように各酵素を添加して反応液を調
製する。
ｒｉｓｔｉｎｅら（前掲）に従って調製することができ
る。具体的には、前記核酸懸濁液の一部に、ＰＣＲ用の
バッファを添加し、また、最終濃度、３ｍＭ塩化マグネ
シウム、５％ＤＭＳＯ、各０．１ｍＭｄＮＴＰ、０．５
ＵＴａｑ酵素となるように各酵素を添加して反応液を調
製する。
【００３４】ＰＣＲの反応条件は、例えば、９４℃で７
分間保温することにより、鋳型ＤＮＡを十分に変性さ
せ、その後、変性工程（９４℃、１分間）、アニーリン
グ工程（５４℃、１分間）、伸長工程（７２℃、１分
間）の３工程を３５サイクル繰り返し、最終的に１０分
間、７２℃に保温して伸長工程を実施する。 （３）増幅断片の電気泳動による分画 前記ＰＣＲ反応液の一部を用いて、電気泳動を実施し
（Ｓ０５）、増幅断片の分画を行う。この電気泳動は、
通常のアクリルアミドゲル又はアガロースゲルを用いた
電気泳動を採用してもよいが、前記１６ＳｒＤＮＡのよ
うにわずかに塩基配列が異なった増幅断片が複数反応液
中に含まれ、これら増幅断片を識別可能とする場合に
は、温度グラディエント電気泳動を利用することが好ま
しい。
分間保温することにより、鋳型ＤＮＡを十分に変性さ
せ、その後、変性工程（９４℃、１分間）、アニーリン
グ工程（５４℃、１分間）、伸長工程（７２℃、１分
間）の３工程を３５サイクル繰り返し、最終的に１０分
間、７２℃に保温して伸長工程を実施する。 （３）増幅断片の電気泳動による分画 前記ＰＣＲ反応液の一部を用いて、電気泳動を実施し
（Ｓ０５）、増幅断片の分画を行う。この電気泳動は、
通常のアクリルアミドゲル又はアガロースゲルを用いた
電気泳動を採用してもよいが、前記１６ＳｒＤＮＡのよ
うにわずかに塩基配列が異なった増幅断片が複数反応液
中に含まれ、これら増幅断片を識別可能とする場合に
は、温度グラディエント電気泳動を利用することが好ま
しい。
【００３５】このグラディエント電気泳動は、例えば、
８Ｍ尿素、２０％ホルムアミドを含有した６％アクリル
アミドゲルを準備し、予め、ゲルに３９〜５２℃の温度
グラディエントを形成させておく。そして、このゲルに
前記ＰＣＲ反応液を載せ、３９℃から５２℃までの温度
グラディエントが形成された状態で、１００Ｖ、１７時
間泳動を行う。
８Ｍ尿素、２０％ホルムアミドを含有した６％アクリル
アミドゲルを準備し、予め、ゲルに３９〜５２℃の温度
グラディエントを形成させておく。そして、このゲルに
前記ＰＣＲ反応液を載せ、３９℃から５２℃までの温度
グラディエントが形成された状態で、１００Ｖ、１７時
間泳動を行う。
【００３６】最終的に、電気泳動後の泳動（分画）パタ
ーンをエチジウムブロマイド染色などにより視角化し
て、コンピュータにより読み取らせ、この分画パターン
に基づいて、次の腸内細菌叢の分析が行われる。 （４）腸内細菌の分析 前記分画パターンの分析は、例えば、前記と同一の条件
で各腸内細菌の１６ＳｒＤＮＡを分画し、その分画パタ
ーンをデータベースに記録する。そして、このデータベ
ース上のデータと前記被験者の分画パターンと対比して
（Ｓ０６）、腸内細菌叢に含まれる細菌の種類を直接同
定することもできる（Ｓ０７）。この際、予め、病気や
老化に関係のある細菌が同定されている場合には、その
細菌の有無を判定してもよい。
ーンをエチジウムブロマイド染色などにより視角化し
て、コンピュータにより読み取らせ、この分画パターン
に基づいて、次の腸内細菌叢の分析が行われる。 （４）腸内細菌の分析 前記分画パターンの分析は、例えば、前記と同一の条件
で各腸内細菌の１６ＳｒＤＮＡを分画し、その分画パタ
ーンをデータベースに記録する。そして、このデータベ
ース上のデータと前記被験者の分画パターンと対比して
（Ｓ０６）、腸内細菌叢に含まれる細菌の種類を直接同
定することもできる（Ｓ０７）。この際、予め、病気や
老化に関係のある細菌が同定されている場合には、その
細菌の有無を判定してもよい。
【００３７】または、各腸内細菌と増幅断片との関係が
対応付けされていない場合には、定期的に測定された被
験者の腸内細菌叢を示す分画パターンをデータベースに
記録しておき、そのデータベース上の分画パターンと対
比して、腸内細菌叢の変化を検出することもできる。そ
して、ここで検出された新たな増幅断片などに基づき、
疾患や、不調時等に関連する腸内細菌を調べることもで
きる。 （５）応用 図２には、本腸内細菌叢の分析方法の応用例として、一
人の被験者の健康状態を腸内細菌叢に基づきモニターす
る場合を示す。
対応付けされていない場合には、定期的に測定された被
験者の腸内細菌叢を示す分画パターンをデータベースに
記録しておき、そのデータベース上の分画パターンと対
比して、腸内細菌叢の変化を検出することもできる。そ
して、ここで検出された新たな増幅断片などに基づき、
疾患や、不調時等に関連する腸内細菌を調べることもで
きる。 （５）応用 図２には、本腸内細菌叢の分析方法の応用例として、一
人の被験者の健康状態を腸内細菌叢に基づきモニターす
る場合を示す。
【００３８】上述した一連の操作により、被験者の腸内
細菌叢を定期的に調べ、良好な健康状態における、腸内
細菌群の１６ＳｒＤＮＡ等の増幅断片の分画パターンを
記録する。そして、被験者が身体において不調を感じる
ようになった場合にも、前記一連の操作により同様に腸
内細菌群における１６ＳｒＤＮＡの分画パターンを継続
して調べる。この「不調時」分画パターンと前記「良好
時」の分画パターンを比較し、不調時に生じるバンド又
は消失するバンドの有無及びバンドの強度の変化等を判
定する。
細菌叢を定期的に調べ、良好な健康状態における、腸内
細菌群の１６ＳｒＤＮＡ等の増幅断片の分画パターンを
記録する。そして、被験者が身体において不調を感じる
ようになった場合にも、前記一連の操作により同様に腸
内細菌群における１６ＳｒＤＮＡの分画パターンを継続
して調べる。この「不調時」分画パターンと前記「良好
時」の分画パターンを比較し、不調時に生じるバンド又
は消失するバンドの有無及びバンドの強度の変化等を判
定する。
【００３９】また、体調が回復している時期にも継続し
て腸内細菌叢の分析を行う。そして、不調時に生じてい
るバンドが消失するか、良好時に特徴的なバンドが出現
又は、バンド強度が高まるかなどがモニターされる。
て腸内細菌叢の分析を行う。そして、不調時に生じてい
るバンドが消失するか、良好時に特徴的なバンドが出現
又は、バンド強度が高まるかなどがモニターされる。
【００４０】例えば、図２を用いて説明すると、バンド
ｅは不調時又は不調となる直前に出現し、また、バンド
ｂは、不調となると出現し、この不調状態が継続するに
つれてバンド強度が高くなることが示されている。ま
た、「回復時」には、再びバンドｅは消失し、これに変
わって良好時に特徴的なバンドｂが出現する。このよう
に、体調変化に伴った腸内細菌群の特有の分画パターン
変化を検知することにより、体調の変化を検知すること
が可能となる。
ｅは不調時又は不調となる直前に出現し、また、バンド
ｂは、不調となると出現し、この不調状態が継続するに
つれてバンド強度が高くなることが示されている。ま
た、「回復時」には、再びバンドｅは消失し、これに変
わって良好時に特徴的なバンドｂが出現する。このよう
に、体調変化に伴った腸内細菌群の特有の分画パターン
変化を検知することにより、体調の変化を検知すること
が可能となる。
【００４１】このように腸内細菌叢は、健康状態、スト
レスなどにより変化すると考えられていることから、こ
の腸内細菌叢の分析は、血液検査などから検知すること
ができない微妙な健康状態の変化を検知し得る手段とし
て健康診断などに利用することが期待される。特に、腸
内細菌叢はストレスなどの精神的な要因によっても変化
することから、精神的な要因から生じる身体への影響を
早期に検出することにも利用されることが期待される。
レスなどにより変化すると考えられていることから、こ
の腸内細菌叢の分析は、血液検査などから検知すること
ができない微妙な健康状態の変化を検知し得る手段とし
て健康診断などに利用することが期待される。特に、腸
内細菌叢はストレスなどの精神的な要因によっても変化
することから、精神的な要因から生じる身体への影響を
早期に検出することにも利用されることが期待される。
【００４２】また、前記図２に示すような判定結果から
健康状態を示す腸内細菌由来のバンドパターンを特定す
ることができると共に、不調時に出現する増幅バンドか
ら不調時に関連する腸内細菌を同定することもできる。
また、このような腸内細菌の人体への影響などの研究な
どにもつなげることが可能となる。
健康状態を示す腸内細菌由来のバンドパターンを特定す
ることができると共に、不調時に出現する増幅バンドか
ら不調時に関連する腸内細菌を同定することもできる。
また、このような腸内細菌の人体への影響などの研究な
どにもつなげることが可能となる。
【００４３】さらには、図２に示す通り、この腸内細菌
叢の分析方法は、薬剤などを投与した時に、その薬剤が
与える腸内細菌叢への影響を調べる場合にも利用し得
る。 [第二の実施形態]前記第一の実施形態は腸内細菌の特定
領域を指標に細菌群を検出し、細菌叢を分析する方法を
示したが、本実施形態では、染色体の任意の領域を対象
として、細菌群を検出し、腸内細菌叢を分析する方法を
示す。
叢の分析方法は、薬剤などを投与した時に、その薬剤が
与える腸内細菌叢への影響を調べる場合にも利用し得
る。 [第二の実施形態]前記第一の実施形態は腸内細菌の特定
領域を指標に細菌群を検出し、細菌叢を分析する方法を
示したが、本実施形態では、染色体の任意の領域を対象
として、細菌群を検出し、腸内細菌叢を分析する方法を
示す。
【００４４】なお、第二の実施形態でも、被験者から採
取した試料から細菌懸濁液を調製する点、調製された細
菌懸濁液から核酸懸濁液を調製する点は同様であるた
め、ここではその説明を省略する。 （１）腸内細菌群の任意領域のＰＣＲ増幅 第二の実施形態では、染色体の任意の領域を対象として
増幅断片を合成し、この合成された増幅断片に基づいて
細菌群を検出する。このような種々の細菌の任意の領域
を増幅し得るプライマーとしてランダムＰＣＲのプライ
マーなどがあるが、一般のランダムＰＣＲプライマーで
は、非常に多くの増幅断片が合成され、電気泳動により
分画した際に、バンド間が接近してパターンの読み取り
が困難になる場合がある。そのため、ここでは、特定の
増幅確率を有するプライマーを用い、腸内細菌群の任意
のＤＮＡ断片を増幅することとする。
取した試料から細菌懸濁液を調製する点、調製された細
菌懸濁液から核酸懸濁液を調製する点は同様であるた
め、ここではその説明を省略する。 （１）腸内細菌群の任意領域のＰＣＲ増幅 第二の実施形態では、染色体の任意の領域を対象として
増幅断片を合成し、この合成された増幅断片に基づいて
細菌群を検出する。このような種々の細菌の任意の領域
を増幅し得るプライマーとしてランダムＰＣＲのプライ
マーなどがあるが、一般のランダムＰＣＲプライマーで
は、非常に多くの増幅断片が合成され、電気泳動により
分画した際に、バンド間が接近してパターンの読み取り
が困難になる場合がある。そのため、ここでは、特定の
増幅確率を有するプライマーを用い、腸内細菌群の任意
のＤＮＡ断片を増幅することとする。
【００４５】この特定の増幅確率を有するプライマー
は、前記所定の鋳型核酸の塩基長に対し限定された種類
数のＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーを意味する。こ
のように特定の増幅断片を合成し得るプライマーを用い
ることにより、その後の電気泳動において分画パターン
の読みとりを容易にすることができる。
は、前記所定の鋳型核酸の塩基長に対し限定された種類
数のＤＮＡ断片を増幅し得るプライマーを意味する。こ
のように特定の増幅断片を合成し得るプライマーを用い
ることにより、その後の電気泳動において分画パターン
の読みとりを容易にすることができる。
【００４６】具体的には、ここで用いることができるプ
ライマーの増幅確率は特に限定はないが、増幅されたＤ
ＮＡ断片を電気泳動により分画し精度よく解析し得るた
めには、増幅断片の数が２５本以下であり、また、多数
の腸内細菌群を効率よく解析するためには、増幅断片の
数は、少なくとも１０程度とすることが好ましい。
ライマーの増幅確率は特に限定はないが、増幅されたＤ
ＮＡ断片を電気泳動により分画し精度よく解析し得るた
めには、増幅断片の数が２５本以下であり、また、多数
の腸内細菌群を効率よく解析するためには、増幅断片の
数は、少なくとも１０程度とすることが好ましい。
【００４７】一方、細菌の染色体長さは、８×１０5〜
１×１０7ｂｐであり（Molecular Biology of the Cel
l,third edition,p.340）、腸内細菌群の染色体遺伝子
を平均５×１０6ｂｐと仮定する。また、腸内細菌はお
よそ１００種類程度存在すると考えられていることか
ら、腸内細菌群全体として塩基長は、５×１０8ｂｐと
仮定される。このような鋳型に対して、５×１０7ｂｐ
当たり１本の増幅断片を合成し得る増幅確率を有するプ
ライマーを用いれば、およそ１０種類程度の増幅バンド
が生成され、この増幅バンドが異なる細菌に由来すると
１０種類の細菌を調べることが可能となる。
１×１０7ｂｐであり（Molecular Biology of the Cel
l,third edition,p.340）、腸内細菌群の染色体遺伝子
を平均５×１０6ｂｐと仮定する。また、腸内細菌はお
よそ１００種類程度存在すると考えられていることか
ら、腸内細菌群全体として塩基長は、５×１０8ｂｐと
仮定される。このような鋳型に対して、５×１０7ｂｐ
当たり１本の増幅断片を合成し得る増幅確率を有するプ
ライマーを用いれば、およそ１０種類程度の増幅バンド
が生成され、この増幅バンドが異なる細菌に由来すると
１０種類の細菌を調べることが可能となる。
【００４８】従って、前記計算によれば、１００種類の
腸内細菌を調べるためには、例えば５×１０-7の増幅確
率を有するプライマーを少なくとも１０種類用いる必要
がある。さらに、細菌により塩基配列の偏りを考慮すれ
ば、５×１０-7の増幅確率を有するプライマーを５０種
類程度、より確実には１００種類程度のプライマーを用
いることが好ましい。
腸内細菌を調べるためには、例えば５×１０-7の増幅確
率を有するプライマーを少なくとも１０種類用いる必要
がある。さらに、細菌により塩基配列の偏りを考慮すれ
ば、５×１０-7の増幅確率を有するプライマーを５０種
類程度、より確実には１００種類程度のプライマーを用
いることが好ましい。
【００４９】なお、このプライマーの増幅確率は一例で
あり、増幅確率を５×１０-7に限定されるものではな
い。従って、実験操作などにより所望の増幅確率を選択
し、それに対応して、プライマーの種類を増減させるこ
とができる。
あり、増幅確率を５×１０-7に限定されるものではな
い。従って、実験操作などにより所望の増幅確率を選択
し、それに対応して、プライマーの種類を増減させるこ
とができる。
【００５０】また、この増幅確率を求めるには、多数の
種類の核酸が混在している溶液等、例えば、複数の腸内
細菌由来の核酸が含有されている核酸懸濁液を鋳型とし
て、種々のプライマーを用いて、それぞれのプライマー
における増幅断片の生成数を調査する。そして、この調
査結果から各プライマーの増幅確率を求め、その中から
所望の増幅確率を有するプライマーを選択する。この調
査に用いることができるプライマーの候補としては、井
上ら（「ＳＳＣ−ＰＣＲ法によるポピュレーションダイ
ナミクスの研究」、第２回日本水環境学会シンポジウム
講演集（平成１１年）、ｐ５４〜５５、日本水環境学
会）による5'-GGCTTCGAATCG-3'（配列番号８）、5'-TGG
ATCTTTGAC-3'（配列番号９）、5'-AACATCTCCGGG-3'（配
列番号１０）など、また市販のプライマーとしては、Ｄ
ＮＡオリゴマー（ニッポンジーン社製）などを用いるこ
とができる。 （２）ＰＣＲの条件 ＰＣＲ反応溶液の組成は、１×ＰＣＲ用バッファ、１．
５ｍＭＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ、２μ
Ｍプライマー、０．０１２５ユニット／μＬＴａｑポリ
メラーゼとすることができる。また、鋳型ＤＮＡは、前
記第一の実施形態における核酸懸濁液を用いることがで
きる。
種類の核酸が混在している溶液等、例えば、複数の腸内
細菌由来の核酸が含有されている核酸懸濁液を鋳型とし
て、種々のプライマーを用いて、それぞれのプライマー
における増幅断片の生成数を調査する。そして、この調
査結果から各プライマーの増幅確率を求め、その中から
所望の増幅確率を有するプライマーを選択する。この調
査に用いることができるプライマーの候補としては、井
上ら（「ＳＳＣ−ＰＣＲ法によるポピュレーションダイ
ナミクスの研究」、第２回日本水環境学会シンポジウム
講演集（平成１１年）、ｐ５４〜５５、日本水環境学
会）による5'-GGCTTCGAATCG-3'（配列番号８）、5'-TGG
ATCTTTGAC-3'（配列番号９）、5'-AACATCTCCGGG-3'（配
列番号１０）など、また市販のプライマーとしては、Ｄ
ＮＡオリゴマー（ニッポンジーン社製）などを用いるこ
とができる。 （２）ＰＣＲの条件 ＰＣＲ反応溶液の組成は、１×ＰＣＲ用バッファ、１．
５ｍＭＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ、２μ
Ｍプライマー、０．０１２５ユニット／μＬＴａｑポリ
メラーゼとすることができる。また、鋳型ＤＮＡは、前
記第一の実施形態における核酸懸濁液を用いることがで
きる。
【００５１】また、ＰＣＲ反応条件は、９４℃１分、４
５℃２分、７２℃３分とすることができ、この場合の反
応サイクルは、例えば、３５サイクルとすることができ
る。但し、この条件等は、例示であるため、この条件を
変更することは可能である。 （３）ＤＮＡ断片の増幅方法及び電気泳動による解析 例えば、マイクロタイタプレートの各ウェルに異なる増
幅確率を有するプライマー、例えば５×１０-7の増幅確
率を有するプライマーを添加し、前記核酸懸濁液と混合
する。そして、表１に示すようにＰＣＲバッファ、塩化
マグネシウム、ｄＮＴＰミックス、Taqポリメラーゼを
添加して、反応液を調製する。
５℃２分、７２℃３分とすることができ、この場合の反
応サイクルは、例えば、３５サイクルとすることができ
る。但し、この条件等は、例示であるため、この条件を
変更することは可能である。 （３）ＤＮＡ断片の増幅方法及び電気泳動による解析 例えば、マイクロタイタプレートの各ウェルに異なる増
幅確率を有するプライマー、例えば５×１０-7の増幅確
率を有するプライマーを添加し、前記核酸懸濁液と混合
する。そして、表１に示すようにＰＣＲバッファ、塩化
マグネシウム、ｄＮＴＰミックス、Taqポリメラーゼを
添加して、反応液を調製する。
【００５２】
【表１】
【００５３】反応液調製後、ＰＣＲ増幅器にセットし、
前述の反応条件でＰＣＲを実行する。なお、この増幅器
は、特に限定はなく、通常市販されている増幅器を使用
することができる。
前述の反応条件でＰＣＲを実行する。なお、この増幅器
は、特に限定はなく、通常市販されている増幅器を使用
することができる。
【００５４】増幅反応修了後、反応液の一部が電気泳動
にかけられ、増幅断片が分画される。この電気泳動の条
件等は、解析するＤＮＡ断片の数や長さにより、適切な
ものが使用される。例えば、アガロースゲルを用いた電
気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを用いる
ことができる。また、分画するＤＮＡ断片の長さに幅が
ある場合には、ロングレンジ型ゲル及び装置を用いるこ
とができる。
にかけられ、増幅断片が分画される。この電気泳動の条
件等は、解析するＤＮＡ断片の数や長さにより、適切な
ものが使用される。例えば、アガロースゲルを用いた電
気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを用いる
ことができる。また、分画するＤＮＡ断片の長さに幅が
ある場合には、ロングレンジ型ゲル及び装置を用いるこ
とができる。
【００５５】電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド
染色等により増幅断片の分画パターンを視角化し又はコ
ンピュータなどにより読み取る。最終的に、この分画パ
ターンに基づいて、次の被験者の通常の腸内細菌叢が分
析される。 （４）分画パターンに基づき腸内細菌叢の分析 腸内細菌叢の分析には、可能であれば、図３に示すよう
に、前記分析に使用される同一のプライマーを用い同一
のＰＣＲ条件で、各腸内細菌の染色体を増幅させ、その
増幅断片の泳動パターンをデータベース１に記録したも
のを準備する。
染色等により増幅断片の分画パターンを視角化し又はコ
ンピュータなどにより読み取る。最終的に、この分画パ
ターンに基づいて、次の被験者の通常の腸内細菌叢が分
析される。 （４）分画パターンに基づき腸内細菌叢の分析 腸内細菌叢の分析には、可能であれば、図３に示すよう
に、前記分析に使用される同一のプライマーを用い同一
のＰＣＲ条件で、各腸内細菌の染色体を増幅させ、その
増幅断片の泳動パターンをデータベース１に記録したも
のを準備する。
【００５６】このデータベース１中のパターンと、被験
者の試料から得られ泳動パターン２とを照合して、細菌
を同定し、腸内細菌叢を分析する。
者の試料から得られ泳動パターン２とを照合して、細菌
を同定し、腸内細菌叢を分析する。
【００５７】または腸内細菌叢の分析には、図３に示す
ように各腸内細菌の分画パターンを記録したデータベー
スが準備できない場合にも、予め定期的に被験者の腸内
細菌叢の状態を示す分画パターンを記録し保存ておくこ
とが好ましい。そして、記録された腸内細菌群の分画パ
ターンと対比し、健康状態が良好な時の分画パターンと
一致するか、若しくは、良好な時の分画パターンとは一
致せず、腸内細菌叢において変化が生じているかを分析
し、健康状態をモニターすることもできる。
ように各腸内細菌の分画パターンを記録したデータベー
スが準備できない場合にも、予め定期的に被験者の腸内
細菌叢の状態を示す分画パターンを記録し保存ておくこ
とが好ましい。そして、記録された腸内細菌群の分画パ
ターンと対比し、健康状態が良好な時の分画パターンと
一致するか、若しくは、良好な時の分画パターンとは一
致せず、腸内細菌叢において変化が生じているかを分析
し、健康状態をモニターすることもできる。
【００５８】このように、本実施形態においても、この
分析の結果、不調時に出現する特有の増幅バンドから、
不調時に増殖又は減少し易い腸内細菌を同定してもよ
く、またこの第二の実施形態を用いて投薬時に与える腸
内細菌群への状態を調べることもできる。
分析の結果、不調時に出現する特有の増幅バンドから、
不調時に増殖又は減少し易い腸内細菌を同定してもよ
く、またこの第二の実施形態を用いて投薬時に与える腸
内細菌群への状態を調べることもできる。
【００５９】なお、上述した第一又は第二の実施形態で
は、増幅断片を電気泳動で分画し、その分画パターンか
ら腸内細菌叢を分析する場合を説明したが、これ以外に
ハイブリダイゼーショーン法を用いてもよい。この場
合、プローブには、腸内細菌群を分類等し得るプローブ
を用いることができる。例えば、第一の実施形態におい
て各腸内細菌由来の１６ＳｒＤＮＡの特徴的な領域を有
するプローブ群を、また、第二の実施形態では、特定の
増幅確率を有するプライマーにより増幅され得る断片に
相補的な配列を有するプローブ群を用いることができ
る。そして、これらプローブ群と各増幅断片とハイブリ
ダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無に基づ
いて、各増幅断片と腸内細菌の種類とを対応づけて腸内
細菌叢を分析してもよい。
は、増幅断片を電気泳動で分画し、その分画パターンか
ら腸内細菌叢を分析する場合を説明したが、これ以外に
ハイブリダイゼーショーン法を用いてもよい。この場
合、プローブには、腸内細菌群を分類等し得るプローブ
を用いることができる。例えば、第一の実施形態におい
て各腸内細菌由来の１６ＳｒＤＮＡの特徴的な領域を有
するプローブ群を、また、第二の実施形態では、特定の
増幅確率を有するプライマーにより増幅され得る断片に
相補的な配列を有するプローブ群を用いることができ
る。そして、これらプローブ群と各増幅断片とハイブリ
ダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無に基づ
いて、各増幅断片と腸内細菌の種類とを対応づけて腸内
細菌叢を分析してもよい。
【００６０】特にドットブロットハイブリダイゼーショ
ンによれば、処理能力を向上させることができ、また、
後述するＤＮＡチップを用いることにより、さらなる処
理能力の向上が図られる。
ンによれば、処理能力を向上させることができ、また、
後述するＤＮＡチップを用いることにより、さらなる処
理能力の向上が図られる。
【００６１】これらドットブロットハイブリダイゼーシ
ョン及びＤＮＡチップを用いたハイブリッド形成解析で
は、特定のドット又は特定のチップ上の区画におけるハ
イブリッド形成の有無から腸内細菌叢を構成する細菌の
種類を特定することができれば望ましいが、細菌の種類
が特定することができない場合でも、ＤＮＡチップ等の
ハイブリッドの形成のパターン変化から腸内細菌叢の変
化を検出してもよい。そして、この分析から、被験者の
不調時等にシグナルが出現するドット又は区画上のプロ
ーブを用いて、「不調時」等に関連する腸内細菌等を特
定してもよい。 [第三の実施形態]本実施形態では、前記第一又は第二の
実施形態の腸内細菌叢を分析方法を実行し得るシステム
構成を図４を用いて説明する。
ョン及びＤＮＡチップを用いたハイブリッド形成解析で
は、特定のドット又は特定のチップ上の区画におけるハ
イブリッド形成の有無から腸内細菌叢を構成する細菌の
種類を特定することができれば望ましいが、細菌の種類
が特定することができない場合でも、ＤＮＡチップ等の
ハイブリッドの形成のパターン変化から腸内細菌叢の変
化を検出してもよい。そして、この分析から、被験者の
不調時等にシグナルが出現するドット又は区画上のプロ
ーブを用いて、「不調時」等に関連する腸内細菌等を特
定してもよい。 [第三の実施形態]本実施形態では、前記第一又は第二の
実施形態の腸内細菌叢を分析方法を実行し得るシステム
構成を図４を用いて説明する。
【００６２】図４において、システム１０には、被験者
から採取した糞尿などの試料から細菌を抽出する細菌自
動抽出部１２が備えられている。この細菌自動抽出部１
２は、生理食塩水が収容され、この生理食塩水に試料を
懸濁させる。また、この細菌自動抽出部１２は、調製さ
れた懸濁液から細菌以外の固体を除去するために、内部
にフィルタが備えられ、このフィルターにより、細菌の
みを分離し、細菌懸濁液を調製する。細菌の回収時にお
けるフィルターの目詰まりを防止するために、このフィ
ルターは、好ましくは目の粗いフィルターから目の細か
いフィルターを備えることが好ましい。例えば、目の粗
いフィルターとしてストマフィルター（グンゼ産業）
を、目の細かいフィルターとしてポリプロピレンスクリ
ーン８０μｍ、４５μｍ、２５μｍ（ＭＩＬＬＩＰＯＲ
Ｅ）、ミニザルト５μｍ（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）などの
メンブランフィルターを組み合わせて好適に利用するこ
ともできる。
から採取した糞尿などの試料から細菌を抽出する細菌自
動抽出部１２が備えられている。この細菌自動抽出部１
２は、生理食塩水が収容され、この生理食塩水に試料を
懸濁させる。また、この細菌自動抽出部１２は、調製さ
れた懸濁液から細菌以外の固体を除去するために、内部
にフィルタが備えられ、このフィルターにより、細菌の
みを分離し、細菌懸濁液を調製する。細菌の回収時にお
けるフィルターの目詰まりを防止するために、このフィ
ルターは、好ましくは目の粗いフィルターから目の細か
いフィルターを備えることが好ましい。例えば、目の粗
いフィルターとしてストマフィルター（グンゼ産業）
を、目の細かいフィルターとしてポリプロピレンスクリ
ーン８０μｍ、４５μｍ、２５μｍ（ＭＩＬＬＩＰＯＲ
Ｅ）、ミニザルト５μｍ（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）などの
メンブランフィルターを組み合わせて好適に利用するこ
ともできる。
【００６３】前記細菌自動抽出部１２には、この細菌自
動抽出部１２において調製された細菌懸濁液が移送され
る移送ライン１３を介して、ＤＮＡ自動抽出部１４が接
続されている。このＤＮＡ自動抽出部１４には、細菌か
らＤＮＡを抽出するための試薬など備えられ、細菌から
ＤＮＡが抽出され、ＤＮＡ懸濁液が調製される。なお、
このＤＮＡ自動抽出部は、市販されているＤＮＡ自動抽
出器などを利用してもよい。
動抽出部１２において調製された細菌懸濁液が移送され
る移送ライン１３を介して、ＤＮＡ自動抽出部１４が接
続されている。このＤＮＡ自動抽出部１４には、細菌か
らＤＮＡを抽出するための試薬など備えられ、細菌から
ＤＮＡが抽出され、ＤＮＡ懸濁液が調製される。なお、
このＤＮＡ自動抽出部は、市販されているＤＮＡ自動抽
出器などを利用してもよい。
【００６４】前記ＤＮＡ自動抽出部１４には、調製され
たＤＮＡ懸濁液を移送するための移送ライン１５を介し
て、ＰＣＲ反応部１６が接続され、このＰＣＲ反応部１
６において、ＰＣＲ反応液の調製及びＰＣＲ反応が実行
される。そのため、このＰＣＲ反応部１６には、腸内細
菌叢を分析するためのＰＣＲプライマーと、その他のＰ
ＣＲ反応液を調製するための試薬（緩衝液、ｄＮＴＰ、
ポリメラーゼ、塩化マグネシウムなどの塩類等）が収容
され、移送ライン１５を介して移送されたＤＮＡ懸濁液
に、試薬が添加されてＰＣＲ反応液が調製される。この
ＰＣＲ反応液の調製後、操作者の所望の条件でＰＣＲ反
応が実行される。
たＤＮＡ懸濁液を移送するための移送ライン１５を介し
て、ＰＣＲ反応部１６が接続され、このＰＣＲ反応部１
６において、ＰＣＲ反応液の調製及びＰＣＲ反応が実行
される。そのため、このＰＣＲ反応部１６には、腸内細
菌叢を分析するためのＰＣＲプライマーと、その他のＰ
ＣＲ反応液を調製するための試薬（緩衝液、ｄＮＴＰ、
ポリメラーゼ、塩化マグネシウムなどの塩類等）が収容
され、移送ライン１５を介して移送されたＤＮＡ懸濁液
に、試薬が添加されてＰＣＲ反応液が調製される。この
ＰＣＲ反応液の調製後、操作者の所望の条件でＰＣＲ反
応が実行される。
【００６５】なお、このＰＣＲ反応部１６におけるプラ
イマーは、対象とする増幅領域に対応させて選択するこ
とができる。例えば、第一の実施形態に示したように、
腸内細菌の特定領域として１６ＳｒＤＮＡを増幅させる
場合には、配列番号１、２のプライマー対、配列番号
１、３のプライマー対又は配列番号４、５のプライマー
対を選択することができる。また、腸内細菌の任意の領
域を対象としてＤＮＡ増幅を行う場合には、第二の実施
形態における所望の増幅確率を有するプライマーから用
いることができる。
イマーは、対象とする増幅領域に対応させて選択するこ
とができる。例えば、第一の実施形態に示したように、
腸内細菌の特定領域として１６ＳｒＤＮＡを増幅させる
場合には、配列番号１、２のプライマー対、配列番号
１、３のプライマー対又は配列番号４、５のプライマー
対を選択することができる。また、腸内細菌の任意の領
域を対象としてＤＮＡ増幅を行う場合には、第二の実施
形態における所望の増幅確率を有するプライマーから用
いることができる。
【００６６】ＰＣＲ反応部１６には、電気泳動部１８が
接続され、この電気泳動部１８では、ＰＣＲ反応部１６
における反応液を電気泳動ゲル内で泳動させ、反応液中
の増幅断片を分画する。なお、このＰＣＲ反応部１６と
電気泳動部１８とは複数のキャピラリ１７により接続す
ることができる。そして、これらキャピラリ１７の先端
は、電気泳動部１８における電気泳動ゲル（図示せず）
の各レーンに接続させ、各ＰＣＲ反応液がそれぞれ電気
泳動ゲルの各レーンに注入されるように構成することが
できる。
接続され、この電気泳動部１８では、ＰＣＲ反応部１６
における反応液を電気泳動ゲル内で泳動させ、反応液中
の増幅断片を分画する。なお、このＰＣＲ反応部１６と
電気泳動部１８とは複数のキャピラリ１７により接続す
ることができる。そして、これらキャピラリ１７の先端
は、電気泳動部１８における電気泳動ゲル（図示せず）
の各レーンに接続させ、各ＰＣＲ反応液がそれぞれ電気
泳動ゲルの各レーンに注入されるように構成することが
できる。
【００６７】前記電気泳動部１８には、信号線１９を介
して解析用コンピュータ２０が接続される。この解析用
コンピュータ２０では、電気泳動部１８において分画さ
れた分画パターンを読み取り、ここで読みとられた分画
パターンが解析される。
して解析用コンピュータ２０が接続される。この解析用
コンピュータ２０では、電気泳動部１８において分画さ
れた分画パターンを読み取り、ここで読みとられた分画
パターンが解析される。
【００６８】この分画パターンの解析のために、解析用
コンピュータ２０には、データベース２２が接続されて
いる。このデータベースには、例えば、各腸内細菌由来
の１６ＳｒＤＮＡなどの特定領域に対する分画パターン
データ、第二の実施形態に示した特定の増幅確率を有す
るプライマーを用いた場合の各細菌の分画パターンデー
タ又は被験者の定期的な検査における分画パターンデー
タなどが記録される。
コンピュータ２０には、データベース２２が接続されて
いる。このデータベースには、例えば、各腸内細菌由来
の１６ＳｒＤＮＡなどの特定領域に対する分画パターン
データ、第二の実施形態に示した特定の増幅確率を有す
るプライマーを用いた場合の各細菌の分画パターンデー
タ又は被験者の定期的な検査における分画パターンデー
タなどが記録される。
【００６９】そして、これらデータベース上の分画パタ
ーンと電気泳動部１８から得られた分画パターンとを解
析用コンピュータ２０において対比させ、腸内細菌叢の
解析が行われ、腸内細菌の特定、腸内細菌叢に変化があ
るか、又は「良好時」もしくは「不調時」の腸内細菌叢
と一致するか等が判定される。
ーンと電気泳動部１８から得られた分画パターンとを解
析用コンピュータ２０において対比させ、腸内細菌叢の
解析が行われ、腸内細菌の特定、腸内細菌叢に変化があ
るか、又は「良好時」もしくは「不調時」の腸内細菌叢
と一致するか等が判定される。
【００７０】最終的に判定された判定結果を表示等する
ために、解析用コンピュータ２０には、表示部２４に接
続され、この表示部において判定結果の表示及び出力が
行われる。
ために、解析用コンピュータ２０には、表示部２４に接
続され、この表示部において判定結果の表示及び出力が
行われる。
【００７１】このように本システムでは、前記第一の実
施形態又は第二の実施形態に示す腸内細菌叢の分析方法
が実施され、被験者から採取された腸内細菌群の核酸に
基づき、腸内細菌叢が分析される。従って、本システム
では、従来のような各腸内細菌に対応させて培養するよ
うな手間と、培養時間を削減することができる。 [第四の実施形態]第四の実施形態では、腸内細菌叢を分
析するための他のシステム２５を示す。前記第三の実施
形態のシステムでは、電気泳動部１８を備え、増幅断片
を電気泳動により分画していたが、この電気泳動による
分画工程の代替として、図５に示すように、前記電気泳
動部１８に代えて、例えば、ハイブリッド解析部２６を
備えることもできる。
施形態又は第二の実施形態に示す腸内細菌叢の分析方法
が実施され、被験者から採取された腸内細菌群の核酸に
基づき、腸内細菌叢が分析される。従って、本システム
では、従来のような各腸内細菌に対応させて培養するよ
うな手間と、培養時間を削減することができる。 [第四の実施形態]第四の実施形態では、腸内細菌叢を分
析するための他のシステム２５を示す。前記第三の実施
形態のシステムでは、電気泳動部１８を備え、増幅断片
を電気泳動により分画していたが、この電気泳動による
分画工程の代替として、図５に示すように、前記電気泳
動部１８に代えて、例えば、ハイブリッド解析部２６を
備えることもできる。
【００７２】このハイブリッド解析部２６には、例え
ば、ＤＮＡチップなどを備え、このＤＮＡチップ等に
は、腸内細菌叢の分析に用いるプライマーにより増幅さ
れ得る各腸内細菌由来のＤＮＡ領域、例えば、１６Ｓｒ
ＤＮＡ領域や、所望の増幅確率を有するプライマーによ
り増幅され得るＤＮＡ領域が独立して固定される。そし
て、このＤＮＡチップ等に、前記ＰＣＲ反応部１６にお
いて増幅された増幅断片を変性させた後、接触させて、
ハイブリッド形成を行わせる。
ば、ＤＮＡチップなどを備え、このＤＮＡチップ等に
は、腸内細菌叢の分析に用いるプライマーにより増幅さ
れ得る各腸内細菌由来のＤＮＡ領域、例えば、１６Ｓｒ
ＤＮＡ領域や、所望の増幅確率を有するプライマーによ
り増幅され得るＤＮＡ領域が独立して固定される。そし
て、このＤＮＡチップ等に、前記ＰＣＲ反応部１６にお
いて増幅された増幅断片を変性させた後、接触させて、
ハイブリッド形成を行わせる。
【００７３】なお、このＤＮＡチップの作製等について
は、情報処理，ｖｏｌ４０（１９９０年３月），ｐ３２
３−３２５に従って実施することができる。例えば、Ｄ
ＮＡチップの作製については、予め準備したプローブを
チップ基板上に配置させるプローブ配置型、例えば、Ｇ
ＥＭ ａｒｒａｙ（Ｓｙｎｔｅｎｉ社製）などでも、ま
た、ガラスやシリコンなどの基板上で直接ＤＮＡの伸長
反応を用いてプローブＤＮＡを生成させたプローブ合成
型、例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ
社製）でもよい。また、簡便には、市販のＤＮＡチップ
作製装置及びその読み取りには、ＤＮＡチップ読み取り
装置（例えば、ＧＭＳ社製）等を用いてもよい。
は、情報処理，ｖｏｌ４０（１９９０年３月），ｐ３２
３−３２５に従って実施することができる。例えば、Ｄ
ＮＡチップの作製については、予め準備したプローブを
チップ基板上に配置させるプローブ配置型、例えば、Ｇ
ＥＭ ａｒｒａｙ（Ｓｙｎｔｅｎｉ社製）などでも、ま
た、ガラスやシリコンなどの基板上で直接ＤＮＡの伸長
反応を用いてプローブＤＮＡを生成させたプローブ合成
型、例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ
社製）でもよい。また、簡便には、市販のＤＮＡチップ
作製装置及びその読み取りには、ＤＮＡチップ読み取り
装置（例えば、ＧＭＳ社製）等を用いてもよい。
【００７４】一方、このようにＤＮＡチップを用いた場
合には、、データベース３０にＤＮＡチップ上の各腸内
細菌の位置などを記録しておく。そして、解析用コンピ
ュータ２８において、データベース３０中のデータに基
づき、ＤＮＡチップ上のハイブリッドが形成された位置
から腸内細菌群を特定し、腸内細菌叢が分析され、分析
結果が表示部３２に表示される。
合には、、データベース３０にＤＮＡチップ上の各腸内
細菌の位置などを記録しておく。そして、解析用コンピ
ュータ２８において、データベース３０中のデータに基
づき、ＤＮＡチップ上のハイブリッドが形成された位置
から腸内細菌群を特定し、腸内細菌叢が分析され、分析
結果が表示部３２に表示される。
【００７５】または、ハイブリッド形成の有無から腸内
細菌叢を構成する細菌の種類を特定することができない
場合には、健康状態について「良好時」と「不調時」と
の間等におけるＤＮＡチップ上でのハイブリッド形成の
パターン変化に基づき、腸内細菌叢の変化を検出するこ
ともできる。そして、この分析結果から、被験者の不調
時等においてハイブリッド形成が観察される区画上のプ
ローブを用いて、「不調時」等に関連する腸内細菌等を
特定してもよい。
細菌叢を構成する細菌の種類を特定することができない
場合には、健康状態について「良好時」と「不調時」と
の間等におけるＤＮＡチップ上でのハイブリッド形成の
パターン変化に基づき、腸内細菌叢の変化を検出するこ
ともできる。そして、この分析結果から、被験者の不調
時等においてハイブリッド形成が観察される区画上のプ
ローブを用いて、「不調時」等に関連する腸内細菌等を
特定してもよい。
【００７６】このように電気泳動部に代えて、ハイブリ
ッド解析部２６を備え、ハイブリッドの形成の有無によ
り、細菌を同定することが可能となれば、より操作が簡
便になる。
ッド解析部２６を備え、ハイブリッドの形成の有無によ
り、細菌を同定することが可能となれば、より操作が簡
便になる。
【００７７】また、細菌懸濁液から調製される核酸懸濁
液が、ＤＮＡチップなどを用いて腸内細菌叢の分析に必
要な量のＤＮＡが含まれている場合には、図６に示すシ
ステム３４ように、前記ＰＣＲ反応部を省略して、ＤＮ
Ａ自動抽出部１４とハイブリッド解析部２６とを直接接
続してシステムを構成してもよい。 ［第五の実施形態］第五の実施形態では、腸内細菌叢を
分析するための他のシステム４０を示す。
液が、ＤＮＡチップなどを用いて腸内細菌叢の分析に必
要な量のＤＮＡが含まれている場合には、図６に示すシ
ステム３４ように、前記ＰＣＲ反応部を省略して、ＤＮ
Ａ自動抽出部１４とハイブリッド解析部２６とを直接接
続してシステムを構成してもよい。 ［第五の実施形態］第五の実施形態では、腸内細菌叢を
分析するための他のシステム４０を示す。
【００７８】第五の実施形態の腸内細菌叢の分析方法を
実行し得るシステム構成を図７を用いて説明する。
実行し得るシステム構成を図７を用いて説明する。
【００７９】図７において、ＰＣＲ反応部１６は、チュ
ーブを介して、電磁弁４３、ＤＮＡ変性部４４、及び検
出部４５に接続され、ＰＣＲ反応部１６の反応液は最終
的に排出口からシステム４０の外部に排出されるように
構成されている。電磁弁４２はＰＣＲ反応部１６とＤＮ
Ａ変性部４４との間に設けられ、この電磁弁４３の切り
換えにより洗浄液４１、或いは色素（例えば、エチジウ
ムブロマイド）を検出部４５（後述する。）に送出させ
ることができる。
ーブを介して、電磁弁４３、ＤＮＡ変性部４４、及び検
出部４５に接続され、ＰＣＲ反応部１６の反応液は最終
的に排出口からシステム４０の外部に排出されるように
構成されている。電磁弁４２はＰＣＲ反応部１６とＤＮ
Ａ変性部４４との間に設けられ、この電磁弁４３の切り
換えにより洗浄液４１、或いは色素（例えば、エチジウ
ムブロマイド）を検出部４５（後述する。）に送出させ
ることができる。
【００８０】検出部４５は、Pr1用細菌検出管４５ａ、P
r2用細菌検出管４５ｂ、及びPr3用細菌検出管４５ｃか
ら構成されており、各検出管４５ａ〜４５ｃのプローブ
担持体には腸内細菌叢の分析に用いるプライマーにより
増幅され得る各腸内細菌由来のＤＮＡ領域、例えば１６
ＳｒＤＮＡ領域や、所望の増幅確率を有するプライマー
により増幅され得るＤＮＡ領域が独立して固定されてい
る。
r2用細菌検出管４５ｂ、及びPr3用細菌検出管４５ｃか
ら構成されており、各検出管４５ａ〜４５ｃのプローブ
担持体には腸内細菌叢の分析に用いるプライマーにより
増幅され得る各腸内細菌由来のＤＮＡ領域、例えば１６
ＳｒＤＮＡ領域や、所望の増幅確率を有するプライマー
により増幅され得るＤＮＡ領域が独立して固定されてい
る。
【００８１】このＤＮＡ領域のプローブ担持体への固定
手法としては、 （１）プローブ担持体にフィルターを用いる手法 ニトロセルロース膜（フィルタ）からなるプローブ担持
体を所定温度に加熱処理したり、またナイロンメンブラ
ンからなるプローブ担持体を紫外線照射する、 （２）化学的結合手法 プローブ担持体とプローブをチオール分子等を介して結
合する、 （３）ビオチン化手法 ビオチンを用いる、等の種々の手法が確立されている
が、本発明はこれらの手法に限定されるものではない。
手法としては、 （１）プローブ担持体にフィルターを用いる手法 ニトロセルロース膜（フィルタ）からなるプローブ担持
体を所定温度に加熱処理したり、またナイロンメンブラ
ンからなるプローブ担持体を紫外線照射する、 （２）化学的結合手法 プローブ担持体とプローブをチオール分子等を介して結
合する、 （３）ビオチン化手法 ビオチンを用いる、等の種々の手法が確立されている
が、本発明はこれらの手法に限定されるものではない。
【００８２】温度制御部４７はＤＮＡ変性部４４、検出
部４５の温度を任意に設定できる。この温度制御により
ＤＮＡ変性部４４でのＤＮＡの変性割合、及び検出部４
５でのハイブリッド形成状態の割合を制御することが可
能になる。
部４５の温度を任意に設定できる。この温度制御により
ＤＮＡ変性部４４でのＤＮＡの変性割合、及び検出部４
５でのハイブリッド形成状態の割合を制御することが可
能になる。
【００８３】光源４８は検出部４５に可視光、或いは紫
外光を照射し、一方ＣＣＤカメラ４９は検出部４５での
ハイブリッド形成状態を蛍光、発光等の光強度として捉
え、その光学的データを後段の解析用コンピュータ５０
に送出し、この解析用コンピュータ５０で腸内細菌を検
出することによって同定する。
外光を照射し、一方ＣＣＤカメラ４９は検出部４５での
ハイブリッド形成状態を蛍光、発光等の光強度として捉
え、その光学的データを後段の解析用コンピュータ５０
に送出し、この解析用コンピュータ５０で腸内細菌を検
出することによって同定する。
【００８４】検出部４５でのハイブリッド形成状態を蛍
光、発光等の光強度として捉えるには次の手法を用いる
ことが好ましい。 （１）プライマーの蛍光色素修飾 ＤＮＡに色素を修飾したプライマーを使用する、 （２）２本鎖ＤＮＡ染色試薬エチジウムブロマイド、Ｓ
ＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（日本ジーン試薬）によるハイブリ
ダイズにより２本鎖となったＤＮＡを染色する、 （３）ＤＩＧ（BOEHRINGER MANNHEIM社）、ＥＣＬ（Ame
rsham Pharmacia社）の使用 （４）蛍光プラズモン共鳴法、水晶振動子による質量変
化測定法の使用 次に、第五の実施形態におけるシステム４０の分析方法
を図８の処理工程図に従って説明する。
光、発光等の光強度として捉えるには次の手法を用いる
ことが好ましい。 （１）プライマーの蛍光色素修飾 ＤＮＡに色素を修飾したプライマーを使用する、 （２）２本鎖ＤＮＡ染色試薬エチジウムブロマイド、Ｓ
ＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（日本ジーン試薬）によるハイブリ
ダイズにより２本鎖となったＤＮＡを染色する、 （３）ＤＩＧ（BOEHRINGER MANNHEIM社）、ＥＣＬ（Ame
rsham Pharmacia社）の使用 （４）蛍光プラズモン共鳴法、水晶振動子による質量変
化測定法の使用 次に、第五の実施形態におけるシステム４０の分析方法
を図８の処理工程図に従って説明する。
【００８５】図８において、第二の実施形態で示したＰ
ＣＲ反応条件の下でＰＣＲを実行する（Ｓ１０）。本実
施形態では、３種類のプライマー（Pr1、Pr2、Pr3）を
用いた。
ＣＲ反応条件の下でＰＣＲを実行する（Ｓ１０）。本実
施形態では、３種類のプライマー（Pr1、Pr2、Pr3）を
用いた。
【００８６】この後、電磁弁４３を調整して、チューブ
内に注入したＰＣＲ反応液がＤＮＡ変性部４４に流入す
るようにする（Ｓ１１）。
内に注入したＰＣＲ反応液がＤＮＡ変性部４４に流入す
るようにする（Ｓ１１）。
【００８７】ＤＮＡ変性部４４では、温度コントロール
４７によって所定温度まで昇温せしめて、ＤＮＡを変性
させる（Ｓ１２）。
４７によって所定温度まで昇温せしめて、ＤＮＡを変性
させる（Ｓ１２）。
【００８８】変性されたＤＮＡはチューブを介して検出
部４５の各プライマーに連通する、Pr1用細菌検出管４
５ａ、Pr2用細菌検出管４５ｂ、及びPr3用細菌検出管４
５ｃに導入される（Ｓ１３）。
部４５の各プライマーに連通する、Pr1用細菌検出管４
５ａ、Pr2用細菌検出管４５ｂ、及びPr3用細菌検出管４
５ｃに導入される（Ｓ１３）。
【００８９】温度制御部４７は、Pr1用細菌検出管４５
ａ、Pr2用細菌検出管４５ｂ、及びPr3用細菌検出管４５
ｃを所定温度に設定することによって、各検出管内の変
性されたＤＮＡをハイブリダイゼイーションし易くする
（Ｓ１４）。
ａ、Pr2用細菌検出管４５ｂ、及びPr3用細菌検出管４５
ｃを所定温度に設定することによって、各検出管内の変
性されたＤＮＡをハイブリダイゼイーションし易くする
（Ｓ１４）。
【００９０】ここで、蛍光色素修飾を用いる場合には、
エチジウムブロマイド４２を電磁弁４３を介してPr1用
細菌検出管４５ａ、Pr2用細菌検出管４５ｂ、及びPr3用
細菌検出管４５ｃに注入する（Ｓ１５）。これによっ
て、ハイブリダイゼイーションされていると、光源４８
からプローブ担持体に光を照射すると蛍光し、この蛍光
度等の光強度を画像データとしてＣＣＤカメラ４９によ
って取得することができる（Ｓ１６）。
エチジウムブロマイド４２を電磁弁４３を介してPr1用
細菌検出管４５ａ、Pr2用細菌検出管４５ｂ、及びPr3用
細菌検出管４５ｃに注入する（Ｓ１５）。これによっ
て、ハイブリダイゼイーションされていると、光源４８
からプローブ担持体に光を照射すると蛍光し、この蛍光
度等の光強度を画像データとしてＣＣＤカメラ４９によ
って取得することができる（Ｓ１６）。
【００９１】得られた画像データは、解析用コンピュー
タ５０に送出され、プローブ担持体４６の設置データと
比較され、細菌を同定（検出）する（Ｓ１７）。
タ５０に送出され、プローブ担持体４６の設置データと
比較され、細菌を同定（検出）する（Ｓ１７）。
【００９２】尚、ステップＳ１５では、色素を用いる例
を挙げたが、これには限られず、検出部４５のハイブリ
ッド形成状態を捉えることができる他の手法を適用する
ことができるため、場合によってはステップＳ１５の処
理を割愛しても良い。
を挙げたが、これには限られず、検出部４５のハイブリ
ッド形成状態を捉えることができる他の手法を適用する
ことができるため、場合によってはステップＳ１５の処
理を割愛しても良い。
【００９３】また、システム４０を繰り返して使用する
場合には、電磁弁４３を調整することにより洗浄液４
１、例えば水酸化ナトリウム溶液を検出部４５に送出す
ることにより、一旦ハイブリッド形成されたＤＮＡを解
放することが可能である。この他、温度制御部４７によ
って検出部４５の温度を制御することによっても更にハ
イブリッドされたＤＮＡの解放を促進させることが可能
となる。
場合には、電磁弁４３を調整することにより洗浄液４
１、例えば水酸化ナトリウム溶液を検出部４５に送出す
ることにより、一旦ハイブリッド形成されたＤＮＡを解
放することが可能である。この他、温度制御部４７によ
って検出部４５の温度を制御することによっても更にハ
イブリッドされたＤＮＡの解放を促進させることが可能
となる。
【００９４】
【発明の効果】以上の通り、本発明によれば、腸内細菌
群の染色体に基づいて、腸内細菌群を検出することとし
ていることから、従来のように腸内細菌毎に対応した培
養を行うことなく、腸内細菌叢を分析することができ
る。従って、腸内細菌叢の分析が容易になり、これによ
って健康管理などを腸内細菌叢の変化等に基づいて行う
ことが可能となる。また、疾患、老化などの身体の状態
に関与する腸内細菌の同定などにも利用することが可能
となる。
群の染色体に基づいて、腸内細菌群を検出することとし
ていることから、従来のように腸内細菌毎に対応した培
養を行うことなく、腸内細菌叢を分析することができ
る。従って、腸内細菌叢の分析が容易になり、これによ
って健康管理などを腸内細菌叢の変化等に基づいて行う
ことが可能となる。また、疾患、老化などの身体の状態
に関与する腸内細菌の同定などにも利用することが可能
となる。
【００９５】前記発明によれば、特定のＰＣＲプライマ
ーにより腸内細菌の核酸が増幅され、その増幅断片に基
づいて遺伝学的手法から腸内細菌叢を分析するため、従
来のような各腸内細菌の培養条件に対応させた煩雑な培
養操作を行うことなく、同一の操作で複数の腸内細菌を
検出することができる。
ーにより腸内細菌の核酸が増幅され、その増幅断片に基
づいて遺伝学的手法から腸内細菌叢を分析するため、従
来のような各腸内細菌の培養条件に対応させた煩雑な培
養操作を行うことなく、同一の操作で複数の腸内細菌を
検出することができる。
【００９６】前記分析工程では、前記増幅断片を電気泳
動で分画する分画工程と、前記分画工程において得られ
た分画パターンを分析する分析工程とを含めることがで
きる。または、特定のプローブ群を用いて前記増幅断片
とハイブリッド形成を行わせ、その形成の有無から腸内
細菌叢の分析を行うこともできる。
動で分画する分画工程と、前記分画工程において得られ
た分画パターンを分析する分析工程とを含めることがで
きる。または、特定のプローブ群を用いて前記増幅断片
とハイブリッド形成を行わせ、その形成の有無から腸内
細菌叢の分析を行うこともできる。
【００９７】前記発明によれば、１６ＳｒＲＮＡをコー
ドした核酸（以下、１６ＳｒＤＮＡという）は細菌によ
って、わずかに異なることが知られていることから（Ｃ
ｈｒｉｓｔｉｎｅら、前掲）、このＤＮＡを対象として
増幅し、その増幅断片を分析することにより、腸内の細
菌の分布状態（すなわち、腸内細菌叢）を調べることが
可能となる。
ドした核酸（以下、１６ＳｒＤＮＡという）は細菌によ
って、わずかに異なることが知られていることから（Ｃ
ｈｒｉｓｔｉｎｅら、前掲）、このＤＮＡを対象として
増幅し、その増幅断片を分析することにより、腸内の細
菌の分布状態（すなわち、腸内細菌叢）を調べることが
可能となる。
【００９８】前記発明によれば、特定の増幅確率を有す
るプライマーを一種類又はそれ以上用いることにより、
試料中の腸内細菌の核酸を簡便に増幅させることが可能
となる。なお、前記特定の増幅確率とは、前記プライマ
ーが鋳型核酸を任意に増幅し得るものであり、この場合
の増幅される断片数が鋳型核酸の配列長に対してある程
度特定されているものをいう。
るプライマーを一種類又はそれ以上用いることにより、
試料中の腸内細菌の核酸を簡便に増幅させることが可能
となる。なお、前記特定の増幅確率とは、前記プライマ
ーが鋳型核酸を任意に増幅し得るものであり、この場合
の増幅される断片数が鋳型核酸の配列長に対してある程
度特定されているものをいう。
【００９９】前記発明によれば、核酸増幅部において、
特定のプライマーにより腸内細菌の核酸が増幅され、分
画部で、増幅された核酸が分画され、この分画パターン
に基づいて、解析部において腸内細菌叢の解析が行われ
る。従って、従来のような各腸内細菌の培養条件に対応
させた煩雑な培養操作を行うことなく、腸内細菌の核酸
に基づいて比較的短時間で腸内細菌叢を分析することが
可能となる。
特定のプライマーにより腸内細菌の核酸が増幅され、分
画部で、増幅された核酸が分画され、この分画パターン
に基づいて、解析部において腸内細菌叢の解析が行われ
る。従って、従来のような各腸内細菌の培養条件に対応
させた煩雑な培養操作を行うことなく、腸内細菌の核酸
に基づいて比較的短時間で腸内細菌叢を分析することが
可能となる。
【０１００】前記発明によれば、電気泳動に代えてハイ
ブリダイゼーションにより腸内細菌叢を解析し得るた
め、特異性を向上させ、また、ドットハイブリダイゼー
ションなどによれば、処理能力を向上させることができ
る。
ブリダイゼーションにより腸内細菌叢を解析し得るた
め、特異性を向上させ、また、ドットハイブリダイゼー
ションなどによれば、処理能力を向上させることができ
る。
【０１０１】ＤＮＡチップの基板上には、多数のプロー
ブが集積されているため、多数のプローブを用いたハイ
ブリッド形成解析を並行して行うことができ、さらなる
処理能力の向上が図られる。
ブが集積されているため、多数のプローブを用いたハイ
ブリッド形成解析を並行して行うことができ、さらなる
処理能力の向上が図られる。
【０１０２】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成ＤＮＡ 配列 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20 配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成ＤＮＡ 配列 GGCTACCTTG TTACGACTT 19 配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成ＤＮＡ 配列 AAGGAGGTGA TCCAACCG 18 配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成ＤＮＡ 配列 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20 配列番号：５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成ＤＮＡ 配列 GGCTACCTTG TTACGACTT 19 配列番号：６ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成ＤＮＡ 配列 GCGGATCCTG CAGGAGTTTG ATCCTGGCTC AG 32 配列番号：７ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成ＤＮＡ 配列 GCCTCGAGCG GCCGCTACCT TGTTACGACT T 31 配列番号：８ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成ＤＮＡ 配列 GGCTTCGAAT CG 12 配列番号：９ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成ＤＮＡ 配列 TGGATCTTTG AC 12 配列番号：１０ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他 合成ＤＮＡ 配列 AACATCTCCG GG 12
【図１】第一の実施形態の腸内細菌叢の分析方法の操作
を模式的に示した図である。
を模式的に示した図である。
【図２】第一の実施形態の腸内細菌叢の分析結果を模式
的に示した図である。
的に示した図である。
【図３】第二の実施形態の腸内細菌叢の分析において、
被験者の泳動パターンと、データベース中のパターンデ
ータとの照合を模式的に示した図である。
被験者の泳動パターンと、データベース中のパターンデ
ータとの照合を模式的に示した図である。
【図４】第三の実施形態における腸内細菌叢の分析シス
テムの構成図である。
テムの構成図である。
【図５】第四の実施形態における腸内細菌叢の分析シス
テムの構成図である。
テムの構成図である。
【図６】第四の実施形態における他の腸内細菌叢の分析
システムの構成図である。
システムの構成図である。
【図７】第五の実施形態における腸内細菌叢の分析シス
テムの構成図である。
テムの構成図である。
【図８】第五の実施形態における腸内細菌叢の分析シス
テムの処理工程図である。
テムの処理工程図である。
１０…腸内細菌叢の分析システム １２…細菌自動抽出部 １４…ＤＮＡ自動抽出部 １６…ＰＣＲ反応部 １８…電気泳動部 ２０…解析用コンピュータ ２２…データべース ２４…表示部 ２６…ハイブリッド解析部 ４４…ＤＮＡ変性部 ４５…検出部 ４６…プローブ担持体 ４７…温度制御部
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 CA09 CA11 DA05 HA12 4B029 AA07 BB02 BB20 CC04 FA03 4B063 QA01 QA07 QA18 QA19 QQ03 QQ06 QQ42 QQ54 QR08 QR32 QR39 QR55 QR62 QS16 QS25 QS34 QS38 QS39 QX02
Claims (16)
- 【請求項１】 被験者の腸内細菌叢を分析する方法であ
って、 被験者から採取した試料中の腸内細菌群の核酸を特定の
ＰＣＲプライマーを用いて増幅させる核酸増幅工程と、 前記核酸増幅工程において得られた増幅断片に基づき腸
内細菌叢を分析する分析工程とを含むことを特徴とする
腸内細菌叢の分析方法。 - 【請求項２】 前記分析工程には、前記増幅断片を電気
泳動で分画する分画工程と、前記分画工程において得ら
れた分画パターンを分析する分析工程とを含むことを特
徴とする請求項１に記載の腸内細菌叢の分析方法。 - 【請求項３】 前記分析工程には、複数のプローブを用
いて前記増幅断片とハイブリッド形成を行わせ、その形
成の有無から腸内細菌叢の分析が行われることを特徴と
する請求項１に記載の腸内細菌叢の分析方法。 - 【請求項４】 前記プローブは、検出部中の特定の位置
に配置されていることを特徴とする請求項３に記載の腸
内細菌叢の分析方法。 - 【請求項５】 前記核酸増幅工程で用いたＰＣＲプライ
マーで各腸内細菌から増幅された核酸をプローブとする
こと特徴とする請求項４に記載の腸内細菌叢の分析方
法。 - 【請求項６】 前記核酸増幅工程において得られた核酸
は、前記検出部への導入前に変性せしめることを特徴と
する請求項４に記載の腸内細菌叢の分析方法。 - 【請求項７】 前記検出部の設定温度は、温度制御部か
らの命令により任意に変更できることを特徴とする請求
項４に記載の腸内細菌叢の分析方法。 - 【請求項８】 前記特定のＰＣＲプライマーが、前記腸
内細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードした核酸領域を増幅し
得る配列を有していることを特徴とする請求項１〜７の
いずれかに記載の腸内細菌叢の分析方法。 - 【請求項９】 前記特定のプライマーが特定の増幅確率
を有するプライマーであることを特徴とする請求項１〜
７のいずれかに記載の腸内細菌叢の分析方法。 - 【請求項１０】 腸内細菌叢を分析するための装置であ
って、 被験者から採取した試料中の腸内細菌群の核酸を増幅さ
せる核酸増幅部と、 前記増幅された核酸を電気泳動により分画する電気泳動
部と、 前記電気泳動部において分画された泳動パターンから腸
内細菌叢を解析する解析部とを有することを特徴とする
腸内細菌叢の分析装置。 - 【請求項１１】 腸内細菌叢を分析するための装置であ
って、 被験者から採取した試料中の腸内細菌群の核酸を増幅さ
せる核酸増幅部と、 前記増幅された核酸と特定のプローブとをハイブリッド
形成させるハイブリッド形成部と、 前記ハイブリッド形成の結果から腸内細菌叢を解析する
解析部とを有することを特徴とする腸内細菌叢の分析装
置。 - 【請求項１２】 前記ハイブリッド形成部には、腸内細
菌群由来の核酸からなるプローブが配列されたＤＮＡチ
ップが備えられていることを特徴とする請求項７に記載
の腸内細菌叢の分析装置。 - 【請求項１３】 前記ハイブリッド形成部には、腸内細
菌群由来の核酸からなる特定のプローブが特定の位置に
配置された検出部が備えられていることを特徴とする請
求項１１に記載の腸内細菌叢の分析装置。 - 【請求項１４】 前記核酸増幅部で用いたＰＣＲプライ
マーで各腸内細菌から増幅された核酸をプローブとする
こと特徴とする請求項１３に記載の腸内細菌叢の分析装
置。 - 【請求項１５】 前記検出部の前段には、核酸を変性せ
しめるＤＮＡ変性部を設けることを特徴とする請求項１
３に記載の腸内細菌叢の分析装置。 - 【請求項１６】 前記検出部の設定温度を任意に変更で
きる温度制御部を備えることを特徴とする請求項１３に
記載の腸内細菌叢の分析装置。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33092499A JP2001149073A (ja) | 1999-09-16 | 1999-11-22 | 腸内細菌叢の分析方法及び分析装置 |
| PCT/JP2000/005943 WO2001020032A1 (fr) | 1999-09-16 | 2000-08-31 | Methode d'analyse de la flore intestinale et appareil d'analyse associe |
| EP00956865A EP1215285A4 (en) | 1999-09-16 | 2000-08-31 | METHOD OF ANALYSIS OF THE DARM FLORA AND ANALYZER |
| US10/069,977 US6986991B1 (en) | 1999-09-16 | 2000-08-31 | Method of analyzing intestinal flora and analytical apparatus |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-262590 | 1999-09-16 | ||
| JP26259099 | 1999-09-16 | ||
| JP33092499A JP2001149073A (ja) | 1999-09-16 | 1999-11-22 | 腸内細菌叢の分析方法及び分析装置 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001149073A true JP2001149073A (ja) | 2001-06-05 |
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|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP2001149073A (ja) |
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1999
- 1999-11-22 JP JP33092499A patent/JP2001149073A/ja active Pending
-
2000
- 2000-08-31 EP EP00956865A patent/EP1215285A4/en not_active Withdrawn
- 2000-08-31 WO PCT/JP2000/005943 patent/WO2001020032A1/ja not_active Application Discontinuation
- 2000-08-31 US US10/069,977 patent/US6986991B1/en not_active Expired - Fee Related
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