JP2013223428A - LNAクランプ技術による植物内生菌のSSUrRNA遺伝子の選択的PCR増幅法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】植物試料由来のDNAと植物内生菌のSSU rRNA遺伝子増幅用のプライマーセットと当該プライマーセットのプライマーと競合する位置に設計した植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子に対応するロックド核酸(LNA)含有オリゴヌクレオチドとを含む反応液を用いて、PCRを行い、当該LNA含有オリゴヌクレオチドにより植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子の増幅を阻害する。
【選択図】図1
Description
(1)植物試料由来のDNAと、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子に対する2つのプライマーから成るプライマーセットと、植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチドを含有する反応液をPCRに供する工程を含む、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子を増幅する方法であって、前記LNA含有オリゴヌクレオチドは、前記プライマーが前記植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングする部位と競合する位置に設計され、その5'末端において該プライマーの3'末端と1塩基以上同一であり、該プライマーが前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングする位置から伸長反応側にスライドした位置において該植物内生菌のSSU rRNA遺伝子と比較して該植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子に特異的な塩基をLNAに置換した塩基配列を有し、且つ該LNA含有オリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されており、該LNA含有オリゴヌクレオチドにより植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子の増幅が阻害される、前記方法。
(2)植物試料由来のDNAと以下の(a)及び(b)のプライマーから成るプライマーセットと以下の(c)〜(f)のLNA含有オリゴヌクレオチドを含有する反応液をPCRに供する工程を含み、該LNA含有オリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されており、且つ該LNA含有オリゴヌクレオチドにより植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子の増幅が阻害される、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子を増幅する方法。
(a)CRKGCYTAACACATGCAAGTC (配列番号1)の塩基配列から成るプライマー(63fm)、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングするプライマー
(b)GGCTACCTTGTTACGACTT(配列番号2)の塩基配列から成るプライマー(1492r)、又は配列番号2に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングするプライマー
(c)CAAGTCGAACGTTGTTTTCG(配列番号3)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Mit63)、又は配列番号3に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物ミトコンドリアのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号3に記載の塩基配列において、第9、12、13、15及び19番目の塩基がLNAである)
(d)CTTCACCCCAGTCGAAGA(配列番号4)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Mit1492)、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物ミトコンドリアのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号4に記載の塩基配列において、第5、14、15、17及び18番目の塩基がLNAである)
(e)GTCGAACGGGAAGTGGT(配列番号5)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Pla63)、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物プラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号5に記載の塩基配列において、第5、12、13及び16番目の塩基がLNAである)
(f)GACTTCACTCCAGTCGCAA(配列番号6)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Pla1492)、又は配列番号6に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物プラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号6に記載の塩基配列において、第7、9、13、16及び18番目の塩基がLNAである)
(3)PCRを、順に熱変性、LNA含有オリゴヌクレオチドのアニーリング、プライマーのアニーリング及び伸長反応を含む反応サイクルの繰り返しにより行う、(1)又は(2)記載の方法。
(4)LNA含有オリゴヌクレオチドのアニーリング温度は、熱変性温度よりも低く、且つプライマーのアニーリング温度よりも高い温度である、(3)記載の方法。
(5)熱変性温度が94℃前後(例えば92〜96℃)であり、LNA含有オリゴヌクレオチドのアニーリング温度がプライマーのアニーリング温度よりも高く、且つプライマーがアニーリングできない温度帯の最も低い温度(例えば70〜72℃)であり、プライマーのアニーリング温度が54℃前後(例えば50〜64℃)であり、及び伸長反応温度が72℃前後(例えば68〜74℃)である、(3)又は(4)記載の方法。
(6)植物内生菌のSSU rRNA遺伝子に対する2つのプライマーから成るプライマーセットと、植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチドを含む、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子増幅用キットであって、前記LNA含有オリゴヌクレオチドは、前記プライマーが前記植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングする部位と競合する位置に設計され、その5'末端において該プライマーの3'末端と1塩基以上同一であり、該プライマーが前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングする位置から伸長反応側にスライドした位置において該植物内生菌のSSU rRNA遺伝子と比較して該植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子に特異的な塩基をLNAに置換した塩基配列を有し、且つ該LNA含有オリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されている、前記キット。
(7)以下の(a)及び(b)のプライマーから成るプライマーセットと以下の(c)〜(f)のLNA含有オリゴヌクレオチドを含む、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子増幅用キットであって、該LNA含有オリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されている、前記キット。
(a)CRKGCYTAACACATGCAAGTC(配列番号1)の塩基配列から成るプライマー(63fm)、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングするプライマー
(b)GGCTACCTTGTTACGACTT(配列番号2)の塩基配列から成るプライマー(1492r)、又は配列番号2に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングするプライマー
(c)CAAGTCGAACGTTGTTTTCG(配列番号3)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Mit63)、又は配列番号3に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ植物ミトコンドリアのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号3に記載の塩基配列において、第9、12、13、15及び19番目の塩基がLNAである)
(d)CTTCACCCCAGTCGAAGA(配列番号4)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Mit1492)、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ植物ミトコンドリアのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号4に記載の塩基配列において、第5、14、15、17及び18番目の塩基がLNAである)
(e)GTCGAACGGGAAGTGGT(配列番号5)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Pla63)、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ植物プラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号5に記載の塩基配列において、第5、12、13及び16番目の塩基がLNAである)
(f)GACTTCACTCCAGTCGCAA(配列番号6)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Pla1492)、又は配列番号6に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ植物プラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号6に記載の塩基配列において、第7、9、13、16及び18番目の塩基がLNAである)
(8)植物試料由来のDNAと植物内生菌のSSU rRNA遺伝子に対する2つのプライマーから成るプライマーセットを含有する反応液をPCRに供する工程を含む、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子を増幅する方法において、植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子の増幅を阻害するための、植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチドであって、前記プライマーが前記植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングする部位と競合する位置に設計され、その5'末端において該プライマーの3'末端と1塩基以上同一であり、該プライマーが前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングする位置から伸長反応側にスライドした位置において該植物内生菌のSSU rRNA遺伝子と比較して該植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子に特異的な塩基をLNAに置換した塩基配列を有し、且つその3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されている、前記LNA含有オリゴヌクレオチド。
本発明に係る植物内生菌のSSU rRNA遺伝子を増幅する方法(以下、「本方法」と称する)は、鋳型DNAとして植物試料由来のDNAと、2つの植物内生菌のSSU rRNA遺伝子増幅用のプライマー(植物内生菌のSSU rRNA遺伝子に対するプライマー)から成るプライマーセット(すなわち、フォワードプライマーとリバースプライマー)と当該プライマーセットのプライマーと競合する位置に設計した植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子に対応するロックド核酸(LNA)含有オリゴヌクレオチドとを含む反応液を用いて、PCRを行う方法である。当該LNA含有オリゴヌクレオチドによれば、植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子の増幅が阻害され、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子増幅用のプライマーセットにより植物内生菌のSSU rRNA遺伝子を選択に増幅することができる。
LNAは、下記の化学式に示すように、核酸の糖分子内に架橋構造を持つ核酸アナログの一種である。
(a)CRKGCYTAACACATGCAAGTC (配列番号1)の塩基配列を含むか、又は当該塩基配列から成るプライマー(63fm);
(b)GGCTACCTTGTTACGACTT(配列番号2)の塩基配列を含むか、又は当該塩基配列から成るプライマー(1492r)。
(c)CAAGTCGAACGTTGTTTTCG(配列番号3)の塩基配列を含むか、又は当該塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Mit63)(ここで、配列番号3に記載の塩基配列において、第9、12、13、15及び19番目の塩基がLNAである);
(d)CTTCACCCCAGTCGAAGA(配列番号4)の塩基配列を含むか、又は当該塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Mit1492)(ここで、配列番号4に記載の塩基配列において、第5、14、15、17及び18番目の塩基がLNAである);
(e)GTCGAACGGGAAGTGGT(配列番号5)の塩基配列を含むか、又は当該塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Pla63)(ここで、配列番号5に記載の塩基配列において、第5、12、13及び16番目の塩基がLNAである);
(f)GACTTCACTCCAGTCGCAA(配列番号6)の塩基配列を含むか、又は当該塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Pla1492)(ここで、配列番号6に記載の塩基配列において、第7、9、13、16及び18番目の塩基がLNAである)。
また、本方法において鋳型DNAとして使用する植物試料由来のDNAは、例えば一般的な核酸抽出法により植物試料から得られたDNA、植物試料から抽出されたRNAと逆転写酵素を用いてRT-PCRにより作製されたcDNA等である。当該植物試料由来のDNAは、植物内に生育する植物内生菌のSSU rRNA遺伝子に加えて、植物オルガネラ(ミトコンドリア及びプラスチド)由来のSSU rRNA遺伝子を含む。植物試料としては、例えば植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)、植物培養細胞等が挙げられる。
細菌のSSU rRNA遺伝子の増幅に汎用されているプライマーを用いてアライメントした結果、Forwardプライマーでは63fm(Marchesi J.R.ら, Design and Evaluation of Useful Bacterium-Specific PCR Primers That Amplify Genes Coding for Bacterial 16S rRNA, Applied and Environmental Microbiology, 1998年, Vol. 64, No. 2, pp. 795-799に記載のプライマー63fを改変したプライマー)と、Reverseプライマーでは1492r(Ikenaga M.ら, Community structure of the microbiota associated with nodal roots of rice plants along with the growth stages: estimation by PCR-RFLP analysis, Biology and Fertility of Soils, 2002年, Vol. 36, No. 6, pp. 397-404)と競合する位置で、植物オルガネラに特異的なLNA含有オリゴヌクレオチドを設計した。設計したLNA含有オリゴヌクレオチドの配列は、次の通りである。
・ミトコンドリア用(LNA-Mit63);5'-CAAGTCGA+ACG+T+TG+TTTT+CG-3'(配列番号3)
・プラスチド用(LNA-Pla63);5'-GTCG+AACGGGA+A+GTG+GT-3'(配列番号5)
Reverseプライマー側
・ミトコンドリア用(LNA-Mit1492);5'-CTTC+ACCCCAGTC+G+AA+G+A-3'(配列番号4)
・プラスチド用(LNA-Pla1492);5'-GACTTC+AC+TCCA+GTC+GC+AA-3'(配列番号6)
注1)下線部は63f又は1492rと重なっている部位
注2)塩基の左側に+を付した塩基はLNA(例;+A)
注3)Tm値はいずれも70℃
注4)いずれも3'末端をリン酸化
本実施例では、水稲(日本晴)を畑状態で約3週間栽培して得られた幼苗の根を使用した。根は、滅菌水中で注いで付着した土壌を取り除き、磨り潰してからDNA抽出を行った。PCR条件は、94℃1分(熱変性)・70℃1分(LNA含有オリゴヌクレオチドのアニーリング)・54℃1分(プライマーのアニーリング)・72℃2分(伸長反応)の30サイクルの反応を基準として、プライマー63fm(配列番号1)及び1492r(配列番号2)並びに上記第1節で説明した4つのLNA含有オリゴヌクレオチドを全て使用して、植物オルガネラのSSU rRNA遺伝子の増幅を阻害する最適条件を検討した。PCR反応後、PCR産物を電気泳動により確認した。反応液の組成は、以下の通りであった:反応液50μl当たり、鋳型DNA 100ng、基質(dNTP; dATP、dTTP、dGTP、dCTP) 各2.5mM、DNAポリメラーゼ(TaKaRa EX Taq) 1.25U、プライマー63fm 0.8μM、プライマー1492r 0.8μM、LNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Pla63、LNA-Pla1492)各0.5μM、LNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Mit63、LNA-Mit1492)各3.0μM。
(1) 図6に示すように、LNA含有オリゴヌクレオチドを加えずに、プライマーのアニーリング温度を変更してPCR増幅を行った結果、アニーリング温度が70℃以上の時、PCR産物は検出されなかった。この結果は、LNA含有オリゴヌクレオチドのアニーリング温度に70℃が使用できることを意味している。
(2) 図7に示すように、LNA含有オリゴヌクレオチドの濃度を段階的に振り分け、PCR増幅を行った。その結果、ミトコンドリアSSU rRNA遺伝子に由来するPCR産物は、LNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Mit63、LNA-Mit1492)3.0μM以上で、プラスチドSSU rRNA遺伝子に由来するPCR産物は、LNA含有オリゴヌクレオチド(LNA-Pla63、LNA-Pla1492)0.5μM以上で検出されなくなった。また、LNA含有オリゴヌクレオチドの濃度が増加しても、細菌DNAのPCR増幅は阻害されていないことが判明した。
(3) 図8に示すように、LNA含有オリゴヌクレオチドのアニーリング温度を70℃、プライマーのアニーリング温度を50℃〜64℃の範囲で検討したところ、いずれも検出されるPCR産物に差異は認められなかった。LNA含有オリゴヌクレオチドのTm値は70℃であること、一般的なプライマーのアニーリング温度は54±2℃であることから、本実施例ではLNA含有オリゴヌクレオチド及びプライマーのアニーリング温度は、それぞれ70℃及び54℃が妥当であると判断した。また、プライマーのアニーリング温度を50℃まで下げても、LNA含有オリゴヌクレオチドが細菌DNAにミスマッチしてPCR増幅を阻害しないことが判明した。
Claims (8)
- 植物試料由来のDNAと、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子に対する2つのプライマーから成るプライマーセットと、植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするロックド核酸(LNA)含有オリゴヌクレオチドを含有する反応液をPCRに供する工程を含む、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子を増幅する方法であって、
前記LNA含有オリゴヌクレオチドは、前記プライマーが前記植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングする部位と競合する位置に設計され、その5'末端において該プライマーの3'末端と1塩基以上同一であり、該プライマーが前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングする位置から伸長反応側にスライドした位置において該植物内生菌のSSU rRNA遺伝子と比較して該植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子に特異的な塩基をLNAに置換した塩基配列を有し、且つ該LNA含有オリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されており、
該LNA含有オリゴヌクレオチドにより植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子の増幅が阻害される、
前記方法。 - 植物試料由来のDNAと以下の(a)及び(b)のプライマーから成るプライマーセットと以下の(c)〜(f)のロックド核酸(LNA)含有オリゴヌクレオチドを含有する反応液をPCRに供する工程を含み、該LNA含有オリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されており、且つ該LNA含有オリゴヌクレオチドにより植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子の増幅が阻害される、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子を増幅する方法。
(a)CRKGCYTAACACATGCAAGTC(配列番号1)の塩基配列から成るプライマー、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングするプライマー
(b)GGCTACCTTGTTACGACTT(配列番号2)の塩基配列から成るプライマー、又は配列番号2に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングするプライマー
(c)CAAGTCGAACGTTGTTTTCG(配列番号3)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド、又は配列番号3に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物ミトコンドリアのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号3に記載の塩基配列において、第9、12、13、15及び19番目の塩基がLNAである)
(d)CTTCACCCCAGTCGAAGA(配列番号4)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物ミトコンドリアのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号4に記載の塩基配列において、第5、14、15、17及び18番目の塩基がLNAである)
(e)GTCGAACGGGAAGTGGT(配列番号5)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物プラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号5に記載の塩基配列において、第5、12、13及び16番目の塩基がLNAである)
(f)GACTTCACTCCAGTCGCAA(配列番号6)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド、又は配列番号6に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物プラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号6に記載の塩基配列において、第7、9、13、16及び18番目の塩基がLNAである) - PCRを、順に熱変性、LNA含有オリゴヌクレオチドのアニーリング、プライマーのアニーリング及び伸長反応を含む反応サイクルの繰り返しにより行う、請求項1又は2記載の方法。
- LNA含有オリゴヌクレオチドのアニーリング温度は、熱変性温度よりも低く、且つプライマーのアニーリング温度よりも高い温度である、請求項3記載の方法。
- 熱変性温度が92〜96℃であり、LNA含有オリゴヌクレオチドのアニーリング温度が70〜72℃であり、プライマーのアニーリング温度が50〜64℃であり、及び伸長反応温度が68〜74℃である、請求項3又は4記載の方法。
- 植物内生菌のSSU rRNA遺伝子に対する2つのプライマーから成るプライマーセットと、植物ミトコンドリア及びプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするロックド核酸(LNA)含有オリゴヌクレオチドを含む、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子増幅用キットであって、
前記LNA含有オリゴヌクレオチドは、前記プライマーが前記植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングする部位と競合する位置に設計され、その5'末端において該プライマーの3'末端と1塩基以上同一であり、該プライマーが前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングする位置から伸長反応側にスライドした位置において該植物内生菌のSSU rRNA遺伝子と比較して該植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子に特異的な塩基をLNAに置換した塩基配列を有し、且つ該LNA含有オリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されている、
前記キット。 - 以下の(a)及び(b)のプライマーから成るプライマーセットと以下の(c)〜(f)のロックド核酸(LNA)含有オリゴヌクレオチドを含む、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子増幅用キットであって、該LNA含有オリゴヌクレオチドの3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されている、前記キット。
(a)CRKGCYTAACACATGCAAGTC(配列番号1)の塩基配列から成るプライマー、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングするプライマー
(b)GGCTACCTTGTTACGACTT(配列番号2)の塩基配列から成るプライマー、又は配列番号2に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングするプライマー
(c)CAAGTCGAACGTTGTTTTCG(配列番号3)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド、又は配列番号3に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ植物ミトコンドリアのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号3に記載の塩基配列において、第9、12、13、15及び19番目の塩基がLNAである)
(d)CTTCACCCCAGTCGAAGA(配列番号4)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ植物ミトコンドリアのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号4に記載の塩基配列において、第5、14、15、17及び18番目の塩基がLNAである)
(e)GTCGAACGGGAAGTGGT(配列番号5)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ植物プラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号5に記載の塩基配列において、第5、12、13及び16番目の塩基がLNAである)
(f)GACTTCACTCCAGTCGCAA(配列番号6)の塩基配列から成るLNA含有オリゴヌクレオチド、又は配列番号6に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つ植物プラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするLNA含有オリゴヌクレオチド(ここで、配列番号6に記載の塩基配列において、第7、9、13、16及び18番目の塩基がLNAである) - 植物試料由来のDNAと植物内生菌のSSU rRNA遺伝子に対する2つのプライマーから成るプライマーセットを含有する反応液をPCRに供する工程を含む、植物内生菌のSSU rRNA遺伝子を増幅する方法において、植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子の増幅を阻害するための、植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングするロックド核酸(LNA)含有オリゴヌクレオチドであって、前記プライマーが前記植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子にアニーリングする部位と競合する位置に設計され、その5'末端において該プライマーの3'末端と1塩基以上同一であり、該プライマーが前記植物内生菌のSSU rRNA遺伝子にアニーリングする位置から伸長反応側にスライドした位置において該植物内生菌のSSU rRNA遺伝子と比較して該植物ミトコンドリア又はプラスチドのSSU rRNA遺伝子に特異的な塩基をLNAに置換した塩基配列を有し、且つその3'末端は伸長反応が起きないようにリン酸化又はジデオキシ化されている、前記LNA含有オリゴヌクレオチド。
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