DE69823346T2

DE69823346T2 - Verfahren zur detektion und identifikation biologischer sustanzen vom rind unter einsatz von oligonnucleotiden

Info

Publication number: DE69823346T2
Application number: DE69823346T
Authority: DE
Inventors: Catherine Hanni; Vincent Laudet; Corine Grangette; Marc Lange; Stephane Pasteau
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1997-05-05
Filing date: 1998-05-04
Publication date: 2005-05-12
Anticipated expiration: 2018-05-05
Also published as: CA2286585A1; EP0980378B1; ES2221172T3; DE69823346D1; EP0980378A1; AU753665B2; FR2762842B1; AU7659098A; WO1998050401A1; FR2762842A1; ATE264865T1; CA2286585C; US6756495B1; ZA983771B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Detektion biologischer Substanzen vom Rind in einer organischen Substanzprobe.
Gegenstand dieser Erfindung ist unter anderem die Verwendung von Oligonucleotiden zur Durchführung des Verfahrens.
1986 wurde der Erreger der Bovinen Spongiformen Enzephalophatie (BSE), auch „Rinderwahnsinn" genannt, erstmals bei britischen Rindern nachgewiesen. Seitdem wurden mehr als 100.000 Fälle infizierter Rinder bekannt. Bei dieser Seuche, die verstärkt in Großbritannien auftritt, lässt sich eine endemische Ausbreitung beobachten. Auch in anderen europäischen Ländern wurden Fälle bekannt, so in Irland, der Schweiz, Frankreich, Dänemark und Deutschland, wo BSE sporadisch auftritt.
Das Krankheitsbild von BSE ist bekannt. Der verantwortliche Erreger, „Prion" genannt, zeichnet sich unter anderem durch seine extrem hohe Resistenz gegenüber klassischen Dekontaminationsmaßnahmen wie Hitze, Strahlung oder Reiningungsmitteln aus. Neue Untersuchungen haben zudem die hohe Resistenz des Erregers in „natürlichen" Umgebungen gezeigt, insbesondere seine Überlebensfähigkeit auf Weideland. So können die infektiösen Prione im Boden für einen Zeitraum von mindestens drei Jahren aktiv bleiben.
Eine der Übertragungsarten des Erregers ist die Aufnahme verseuchter Futtermittel, wobei die Übertragung von einer tierischen Spezies zur anderen erfolgen kann.
Basierend auf der Analyse der epidemiologischen Daten ließ sich der Ursprung der englischen BSE-Epidemie auf Rindermehle und Knochenmehle zurückführen, die mit dem Erreger infiziert waren und zur Herstellung von Futteradditiven für Milchkuhfutter verwendet wurden.
Solche Mehle sind Nebenprodukte von Abdeckereien und entstammen der Verarbeitung von Tierleichen und Abfällen aus Schlachthäusern.
Die Struktur des „Prions" ist bis heute nicht bekannt, und bisher existiert kein Verfahren zum Nachweis von Prionen.
Der Feststellung, ob eine organische Substanz biologische Substanzen von Rindern aufweist und somit möglicherweise „Prionen" enthält, kommt somit eine große Bedeutung zu.
Auf dem Gebiet der Futtermittelherstellung erfolgte die Charakterisierung tierischer Spezies zunächst mithilfe biochemischer Methoden der Proteinanalyse (BARA et al., 1992, Trends in Food Science and Technology, 3, 69–72; SOTELO et al. 1993, Trends in Food Science and Technology, 4, 395–401; Hernandez et al.; 1994, Food and Agricultural Immunology, 6, 95–104). Diese Verfahren sind jedoch entweder kaum spezifisch (Elektrophorese) oder aber inkompatibel mit der Denaturierung der zu analysierenden Proben (Immunoanalyse). Sie werden inzwischen allmählich durch Verfahren zur DNS-Analyse ersetzt, denn DNS-Moleküle reagieren weniger empfindlich als Proteine auf denaturierende physikalisch-chemische Bedingungen.
Die Identifikation der wichtigsten tierischen Spezies, die hier von Interesse sind, erfolgte zunächst durch das Verfahren der Hybridisierung von DNS-Proben (BUNTJER et al. 1995, Zeitschrift für Lebensmittel Untersuchung und Forschung 201 (6): 577–582; MEYER et al., 1994, Fleischwirtschaft 74 (11): 1237–1238; TSUMURA et al. 1992, Journal of Japanese Society of Food Science and Technology 39 (1): 60–63; EBBEHOJ et THOMSEN, 1991, Meat Science 30 (4): 359–366; BAUER et al., 1987, Archiv für Lebensmittelhygiene 38 (6): 172–174; EBBEHOJ et THOMSEN, 1991, Meat Science 30 (3): 221–234).
An die Stelle dieses technisch schwierigen Verfahren ist heute die PCR-Methode (Polymerase-Kettenreaktion) getreten, die zunächst angewandt wurde, um biologische Substanzen verschiedener tierischer Spezies zu bestimmen.
Die einzigen beim Rind (Bos taurus) beschriebenen Verfahren der PCR-Amplifikation betreffen die Amplifizierung der spezifischen mitochondrialen DNS-Region (mtDNS), die für ein Cytochrom codiert, mithilfe von PCR-Primern zur Erkennung von DNS-Sequenzen, die bei Wirbeltierenarten konserviert sind, sowie die Charakterisierung dieser DNS mithilfe von Restriktionsenzymen (RFLP) oder durch Sequenzierung (MEYER et al. 1995, Journal of ADAC – International 78 (6): 1542–1551; CHIKUNI et al. 1994, Animal Science and Technology, 65 (6): 571–579; GUGLICH et al. 1994, J. Forensic. Sci. 39 (2): 353–361).
Die Zusammensetzung sowie die komplette Sequenz der mitochondrialen DNS (mtDNS) des Rindes sind bekannt (ANDERSON et al. 1982, J. Mol. Biol. 156 (4): 683–717). Auf der Grundlage dieser Daten befassten sich mehrere Arbeiten mit der Untersuchung der genetischen Variabilität des mitochondrialen Genoms heimischer Rinder durch RFLP- (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus)-Analyse (CHEN et al. 1995, Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. 111 (4): 643–649; KIKKAWA et al. 1995, Biochem. Genet. 33 (1–2): 51–60; BRADLEY et al. 1994, Anim. Genet. (4): 265–271; AMANO et al. 1994, Anim. Genet. 25 (1): 29–36; SUZUKI et al. 1993, Anim. Genet. 24 (5): 339–343; LAN et al. 1993, I. Chuan. Hsueh. Pao 20 (5): 419–425; BHAT et al. 1990, Biochem. Genet. 28 (7–8): 311–318; LOFTUS et al. 1994, Anim. Genet. 25: 265–271) oder durch Sequenzierung (LOFTUS et al. 1994, Proc. Natl. Sci. USA 91 (7); 2757–2761; RON et al. 1993, Anim. Genet. 24 (3): 183–186; BRADLEY et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5131–5135; BAILEY et al., 1996, Proc. R. Soc. Lond. B, 263: 1467–1473).
Die partielle Sequenzierung der mitochondrialen DNS-kontrollierenden Region beim Rind wurde außerdem bei verschiedenen europäischen, afrikanischen und indischen Rinderrassen durchgeführt (LOFTUS et al. 1994, Proc. Natl. Sci. USA 91 (7): 2757–2761; BRADLEY et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5131–5135; BAILEY et al., 1996, Proc. R. Soc. Lond. B, 263: 1467–1473).
Das US-Patent 5.596.089 betrifft Oligonucleotid-Sequenzen des SRY-Gens bei Rindern und Schweinen, welches Proteine zwecks Induzierung der Geschlechtsentwicklung codiert. Das in diesem Dokument beschrie bene Verfahren ist ein DNS-Test zur Geschlechtsbestimmung anhand von Rinder- oder Schweinegewebe.
Der Aufsatz von Sinclair et al. (Gene, 1995, Bd. 1, Nr. 167, S. 285–289) behandelt Strategien unter Zuhilfenahme der Polymerasekettenreaktion (PCR), um das 5' Ende der cDNS vom Rind zu isolieren, welche für Immunoglobulin codiert.
Die Studie über den technologischen Status quo ergibt also, dass bei bestimmten Spezies und Rinderrassen bereits DNS-Analysen durchgeführt wurden. Nichtsdestoweniger findet sich in keinem der Dokumente zum Stand der Technik die Beschreibung eines spezifischen und sensitiven Verfahrens zur DNS-Amplifikation beim Rind, welches die Identifikation von Spuren biologischer Substanzen aus Rindern ermöglicht und welches bei sämtlichen Rinderrassen anhand verschiedenartig zusammengesetzter organischer Substanzen angewandt werden kann.
Hinzu kommt, dass die bekannten Verfahren zur Identifikation der DNS vom Rind (beispielsweise die Genom-Analyse von Sequenzteilen von geringer Variabilität mittels RFLP oder PCR-RFLP) einige Nachteile haben. Bei diesen wenig spezifischen Methoden ist es aufgrund der großen Anzahl der Bänder oft schwierig, DNS-Mischungen, die DNS verschiedener Spezies enthalten, zu analysieren, was wiederum zu Interpretationproblemen führt.
Die geringe Sensitivität einiger dieser Verfahren verhindert den sicheren Nachweis organischer, vom Rind stammender Substanzen in den verschiedensten organischen Substraten. Diese Verfahren sind zudem nicht anwendbar, wenn die in der Probe enthaltene DNS degradiert ist, d. h. aus kleinen Fragmenten mit weniger als 500 Basenpaaren besteht.
Das Problem der Identifikation organischer Substanzen aus sämtlichen Rinderrassen ist von besonderer Bedeutung, da die Bovine Spongiforme Enzephalophatie sich nicht auf die europäischen Rinderrassen beschränkt, sondern auch bei afrikanischen und indischen Rinderrassen auftritt (Bos taurus und Bos indicus).
Der Antragsteller präsentiert die Lösungen für alle zuvor geschilderten Probleme.
Er hat auf ein spezifisches und einfaches – und gleichzeitig hochsensitives – Verfahren zur Detektion biologischer Substanzen vom Rind hingewiesen, unabhängig von der Rinderrasse (Bos taurus und Bos indicus), in organischen Substanzproben durch die spezifische Methode der Amplifizierung einer besonderen Sequenz aus dem Rindergenom.
In ihrer allgemeinsten Form bezieht sich die vorliegende Erfindung also auf ein Verfahren zur Herstellung eines DNS-Fragments aus Rindergenom mit einer bestimmten Größe und einer bestimmten Sequenz, die für Rinder typisch sind und insbesondere typisch für die Spezies Bos taurus und Bos indicus, wobei dieses DNS-Fragment aus einer organischen Substanzprobe gewonnen wird; das genannte Verfahren beinhaltet die Amplifizierung einer bestimmten Sequenz aus dem Rindergenom mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR), wobei diese Sequenz nur im Rindergenom vorkommt, nicht jedoch in den Genomen anderer tierischer Spezies.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Detektion und Identifikation biologischer Substanzen vom Rind in einer organischen Substanzprobe; dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die DNS vom Rind in der erwähnten organischen Substanz durch Amplifizierung einer spezifischen DNS-Sequenz aus dem Rindergenom nachgewiesen wird.
Unter organischer Substanz ist jede feste oder flüssige Substanz zu verstehen, von der anzunehmen ist, dass sie zumindest teilweise biologischen Ursprungs ist.
Die DNS-Sequenz stammt günstigerweise aus mitochondrialer DNS. Die Wahl einer mitochondrialen Sequenz ist besonders vorteilhaft, da in einer tierischen Zelle auf jede Kopie der Kern-DNS zwischen 100 und 1000 Kopien der mitochondrialen DNS kommen. Im Falle einer Degradation der DNS ist die Wahrscheinlichkeit der Detektion von mitochon drialer DNS somit wesentlich höher als die Wahrscheinlichkeit der Detektion von Kern-DNS. In organischen Substanzen, in denen die DNS dem Einfluß verschiedener physischer (Temperatur, Druck usw.), chemischer (Hydrolyse, Oxydation usw.) oder biochemischer Faktoren unterworfen ist, welche eine Degradation fördern, kann die Detektion mitochondrialer DNS also mit größerer Sicherheit erfolgen.
Diese Besonderheit erweist sich als besonders wichtig beim Versuch, biologische Substanzen vom Rind in organischen Substanzen nachzuweisen, die zahlreichen Transformationen unterliegen, beispielsweise in Kosmetika oder Futtermitteln, in Mehlen, die für Futtermittel verwendet werden, in Komposten, Düngern und Düngemitteln, usw..
In ihrer vorteilhaften Ausgestaltung ermöglicht die vorliegende Erfindung zudem die Detektion biologischer Substanzen vom Rind in den folgenden organischen Substraten: rohes, geräuchertes oder gekochtes Fleisch, Granulate, Blut und blutgestützte Produkte, Milch und milchgestützte Produkte, Knochen und knochengestützte Produkte, Leder, Häute, Elfenbeine, Haare, Horn und horngestützte Produkte, Guano, Kot, Jaucheflüssigkeit, Jauche, Gelatine und gelatingestützte Produkte, Kosmetik- und Futtermittelprodukte.
Die Erfindung betrifft spezifische Fragmente mitochondrialer DNS im Rindergenom, die aus etwa 100 bis 500 Basenpaaren, vor allem aus ungefähr 152 bis 480 Basenpaaren, bestehen und mindestens eine 80prozentige, bevorzugt mindestens eine 90prozentige Sequenz-Identität mit den homologen Regionen in der Sequenz der mitochondrialen DNS-kontrollierenden Region haben, wie sie von ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683–7171 bestimmt wurde, vor allem von der Stelle 15824 bis zu der Stelle 171, wobei diese Stellen nach der gesamten mitochondrialen DNS-Sequenz vom Rind bestimmt werden, die 16338 Nucleotide enthält, wie von ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683–717 festgestellt.
In der bevorzugten Ausgestaltung dieser Erfindung wird die Amplifizierung der DNS mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt, die die Wiederholung eines aus folgenden Schritten bestehenden Zyklus enthält:

– die Erhitzung der aus der organischen Substanzprobe gewonnenen DNS, um die DNS in zwei Einzelstränge zu trennen.
– die Hybridisierung der Oligonucleotid-Primer zu den DNS-Einzelsträngen bei einer günstigen Temperatur; und
– die Verlängerung der Oligonucleotid-Primer mit einer Polymerase bei einer günstigen Temperatur.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung dieser Erfindung ist einer der Primer ein Oligonucleotid, welches mindestens eine 80prozentige, bevorzugt mindestens eine 90prozentige und vorteilhaft mindestens eine 95prozentige Sequenz-Identität mit einem Oligonucleotid hat, welches aus einer Sequenz von ungefähr 15 bis 25 Nucleotiden, vor allem aus ungefähr 20 bis 25 Nucleotiden, besteht, welche in der folgenden Sequenz SEQ ID Nr. 1 eingeschlossen ist (Stellen 136 bis 178 nach ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683–717):
TAATGTCCATGCTTATCATTATGCTGGTGCTCAAGATGCAGTT
Dieser erste Primer kann insbesondere aus einem Oligonucleotid oder aus einer Mischung aus Oligonucleotiden bestehen und folgende Sequenz ID Nr. 2 enthalten (Stellen 156 bis 166 nach ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683–717):
YTATCATTATGCTGG
worin Y T oder C bedeutet.
Der Primer besteht bevorzugt aus einem Oligonucleotid oder einer Mischung aus Oligonucleotiden, die folgende Sequenz ID Nr. 3 enthalten (Stellen 152 bis 171 nach ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683–717):
CATGCYTATCATTATGCTGG (PBR6)
worin Y T oder C bedeutet.
Der zweite Primer besteht aus einem Oligonucleotid, welches mindestens eine 80prozentige, bevorzugt mindestens eine 90prozentige und vorteilhaft mindestens eine 95prozentige Sequenz-Identität mit einem Oligonucleotid hat, welches aus einer Sequenz von ungefähr 15 bis 25 Nucleotiden, vor allem aus ungefähr 20 bis 25 Nucleotiden, besteht, welche in der folgenden Sequenz SEQ ID Nr. 4 eingeschlossen ist (Stellen 16015 bis 16060 nach ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683–717):
ATTATATGCCCCATGCATATAAGCAAGTACATGACCTCTATAGCAG
Dieses Oligonucleotid enthält bevorzugt die folgende Sequenz ID Nr. 5 (Stellen 16034 bis 16048 nach ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683–717):
TAAGCAAGTACATGA
oder noch bevorzugter die folgende Sequenz ID Nr. 6 (Stellen 16029 bis 16048 nach ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683–717):
GCATATAAGCAAGTACATGA (PBF9)
Jedes der Oligonucleotide SEQ ID Nr. 1 bis 3 wird im Paar mit irgendeinem der Oligonucleotide SEQ ID Nr. 4 bis 6 verwendet. Das vorteilhafteste Primerpaar ist das Paar SEQ ID Nr. 3/SEQ ID Nr. 6.
Eine besonders vorteilhafte Ausführung der vorliegenden Erfindung sieht vor, dass mindestens ein Teil der Hybridisierungsschritte der Zyklen, aus denen der Amplifikations-Prozeß besteht, bei einer Temperatur von ungefähr 50°C bis 58°C, vor allem bei 50°C bis 55°C, durchgeführt wird. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass eine Temperatur von ungefähr 51°C besonders geeignet war, um eine spezifische Amplifizierung durchzuführen.
Eine solche Durchführung des Verfahrens erlaubt eine wesentlich spezifiziertere Amplifizierung.
Bei den Schritten der Auftrennung und Verlängerung der DNS-Stränge beträgt die Temperatur vorteilhaft jeweils ungefähr 94°C bzw. 72°C.
Das vorangehend beschriebene Verfahren ist spezifisch, weil detektierbare Amplifikationsprodukte nur dann entstehen, wenn DNS vom Rind (Bos taurus und Bos indicus) vorhanden ist. Die Verwendung der Primer SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 6 führt lediglich zur Bildung eines DNS-Fragments mit ungefähr 480 Basenpaaren. Dieses Oligonucleotid-Fragment ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung dieser Erfindung hat es mindestens eine 80prozentige, bevorzugt mindestens eine 90prozentige und vorteilhaft mindestens eine 95prozentige Sequenz-Identität mit der folgenden Sequenz SEQ ID Nr. 8 (Stellen 16029 bis 171 nach der Sequenz von ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683–717, welche 16338 Nucleotide enthält):
Dabei bedeutet R: A oder G; Y: C oder T; N: A, G, C oder T.
In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, dass der Antragsteller bei der Entwicklung dieses Verfahren einige technische Probleme löste. Zunächst stellte die Wahl der Primer ein wirkliches Problem dar, denn es mussten Sequenzen gefunden werden, die einerseits glei chermaßen bei verschiedenen Rinderrassen vorkommen und andererseits zu stabiler Hybridisierung fähig sind, und dies unter physikalisch-chemisch höchst unterschiedlichen Bedingungen, entsprechend der großen Diversität organischer Substanzen, die biologische Substanzen vom Rind enthalten könnten.
Der Antragsteller hat zudem andere Oligonucleotid-Primer entwickelt, die nachfolgend aufgeführt sind und die Fähigkeit besitzen, bei der Amplifizierung kleinere Fragmente zu erzeugen, die nur ungefähr 100 bis 200 Basenpaare und vorteilhaft ungefähr 150 Basenpaaren enthalten. Diese Oligonucleotid-Primer weisen die folgenden Sequenzen auf:
SED ID Nr. 9: GAGCCTTATCAGTATTAAATTTATC (15824–15848)
SED ID Nr. 10: CATTAATGTTATGTACATTA (15962–15981)
SED ID Nr. 11: TTTCACGCGGCATGGTAATT (16162–16181)
SED ID Nr. 12: ATCCAATGAATTTTACCAGG (16245–16264)
SED ID Nr. 13: GTCAATGGTCACAGGACATA (181–200)
SED ID Nr. 14: ATTGACTTTGTTTGGAGTGC (319–338)
Die Stellen dieser Oligonucleotid-Primer, die nach der Sequenz von ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683–717, bestimmt wurden, sind in Klammern angegeben.
Die Erfindung betrifft zudem Oligonucleotid-Primerpaare, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die sie bildenden Oligonucleotide aus folgenden ausgewählt wurden:

– Oligonucleotide, die mindestens eine 80prozentige, bevorzugt mindestens eine 90prozentige und vorteilhaft mindestens eine 95prozentige Sequenz-Identität mit einem Oligonucleotid haben, welches aus einer Sequenz von ungefähr 15 bis 25 Nucleotiden, vor allem aus ungefähr 20 bis 25 Nucleotiden, besteht, welche mindestens 10 angrenzende Nucleotide aus der folgenden SEQ ID Nr. 9 enthält: GAGCCTTATCAGTATTAAATTTATC
– oder aus der folgenden SEQ ID Nr. 10: CATTAATGTTATGTACATTA
– oder aus der folgenden SEQ ID Nr. 11: TTTCACGCGGCATGGTAATT
– oder aus der folgenden SEQ ID Nr. 12: ATCCAATGAATTTTACCAGG
– oder aus der folgenden SEQ ID Nr. 13: GTCAATGGTCACAGGACATA
– oder aus der folgenden SEQ ID Nr. 14: ATTGACTTTGTTTGGAGTGC

Jeder der Oligonucleotid-Primer SEQ ID Nr. 4 bis 6 und SEQ ID Nr. 9, 12 und 13 wird paarweise mit irgendeinem der Oligonucleotid-Primer SEQ ID Nr. 1 bis 3 und SEQ ID Nr. 10, 11 und 14 verwendet. Die vorteilhaftesten Oligonucleotid-Primerpaare sind die folgenden: SEQ ID Nr. 9 mit SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 6 mit SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 12 mit SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 13 mit SEQ ID Nr. 14.
Das Primerpaar SEQ ID Nr. 9/SEQ ID Nr. 10 liefert das DNS-Fragment, welches vorteilhaft mindestens eine 80prozentige, bevorzugt mindestens eine 90prozentige und vorteilhaft mindestens eine 95prozentige Sequenz-Identität mit dem folgenden DNS-Fragment aufweist:
SEQ ID Nr. 15 (Stellen 15824–15981)
Das Primerpaar SEQ ID Nr. 6 mit SEQ ID Nr. 11 liefert das DNS-Fragment, welches vorteilhaft mindestens eine 80prozentige, bevorzugt mindestens eine 90prozentige und vorteilhaft mindestens eine 95prozentige Sequenz-Identität mit dem folgenden DNS-Fragment aufweist:
SEQ ID Nr. 16 (Stellen 16029–16181)
Das Primerpaar SEQ ID Nr. 12 mit SEQ ID Nr. 3 liefert das DNS-Fragment, welches vorteilhaft mindestens eine 80prozentige, bevorzugt mindestens eine 90prozentige und vorteilhaft mindestens eine 95prozentige Sequenz-Identität mit dem folgenden DNS-Fragment aufweist:
SEQ ID Nr. 17 (Stellen 16245–171)
Das Primerpaar SEQ ID Nr. 13 mit SEQ ID Nr. 14 liefert das DNS-Fragment, welches vorteilhaft mindestens eine 80prozentige, bevorzugt mindestens eine 90prozentige und vorteilhaft mindestens eine 95prozentige Sequenz-Identität mit dem folgenden DNS-Fragment aufweist:
SEQ ID Nr. 18 (Stellen 181–338)
Die vorgenannt aufgeführten Amplifikationsprodukte und vor allem die Sequenzen SEQ ID Nr. 15 bis SEQ ID Nr. 18 können selbst dann detektiert werden, wenn ein großes Teilstück der DNS durch den Einfluss vorangehend beschriebenen physikalischer, chemischer und/oder biochemischer Faktoren oder bei Transformationen organischer Substrate degradiert ist.
Der Experimentator überprüft bevorzugt das Vorhandensein der vorgenannt beschriebenen Sequenz SEQ ID Nr. 8 mithilfe geeigneter Primer, und in den Fällen, wo ein negatives Resultat erzielt wird, überprüft er die kleineren DNS-Fragmente und vor allem jene mit ungefähr 150 bis 260 Basenpaaren, die vor allem von den Primern SEQ ID Nr. 9 bis SEQ ID Nr. 14 geliefert werden.
Die Primer SEQ ID Nr. 9 bis SEQ ID Nr. 14 liefern lediglich einzigartige DNS-Fragmente, die ungefähr 150 bis 260 Basenpaare umfassen. Das vorgenannt beschriebene Verfahren ist spezifisch, weil detektierbare Amplifikationsprodukte nur dann entstehen, wenn Rinder-DNS vorhanden ist. Diese Oligonucleotid-Fragmente sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Einzigartigkeit des Amplifikationsproduktes stellt einen weiteren Vorteil der vorliegenden Erfindung dar, weil sie eine hohe Sensitivität gewährleistet und somit die Interpretation der Resultate wesentlich erleichtert.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bringt also zahlreiche Vorteile im Vergleich zu den bereits bekannten Methoden, DNS vom Rind nachzuweisen.
Außerdem liefert das beschriebene Verfahren Resultate, die sehr leicht zu interpretieren sind, weil nur ein einziges und einzigartiges Amplifikationsprodukt erzeugt wird, welches spezifisch für die DNS vom Rind ist und welches somit nicht bei der Amplifikation der DNS anderer Spezies erzeugt wird.
Die Überprüfung der Migrationsprofile der Amplifikationsprodukte, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, besteht also einfach darin, das Vorhandensein eines einzigen und einzigartigen migrierten DNS-Strangs in einem Elektrophorese-Gel zu bestimmen. Wenn ein solcher DNS-Strang nicht detektiert wird, ist davon auszugehen, dass keine nachweisbaren Spuren von Rinder-DNS vorhanden sind. Wird dagegen ein entsprechender DNS-Strang detektiert, bedeutet dies, dass die Probe Spuren von Rinder-DNS aufweist und dass die fragliche Probe somit biologische Substanz vom Rind enthält.
Das Amplifikationsprodukt kann mithilfe sämtlicher in Fachkreisen bekannten Methoden nachgewiesen werden, insbesondere durch einfache Agarose-Gel-Elektrophorese. Dieses Amplifikationsprodukt kann sequenziert werden, um die Nucleotid-Sequenz zu bestimmen und seine Identität zu bestätigen. Ebenso kann es mittels Hybridisierung mit einer Sonde nachgewiesen werden, die einen Oligonucleotid-Teil und einen Marker enthält. Das Oligonucleotid, welches Bestandteil dieser Sonde ist, enthält mindestens ungefähr 15 Nucleotide, bevorzugt mindestens ungefähr 20 Nukleotide.
Um die Identität des Fragments SEQ ID Nr. 8 zu bestätigen, wird ein Oligonucleotid mit einem Sequenzteil verwendet, der mindestens eine 80prozentige, bevorzugt eine 90prozentige Identität mit den folgenden Sequenzen SEQ ID Nr. 7 oder Nr. 19 aufweist:
SEQ ID Nr. 7 (16114–16140): CTTGATAGTATATCTATTATATATTCC (BH1)
SEQ ID Nr. 19 (16227–16251): TAARCCGTGGGGGTCGCTATCCAAT (BH2)
worin R G oder A bedeutet.
Die Identität der Fragmente SEQ ID Nr. 15 bis SEQ ID Nr. 18 wird vorteilhaft durch Sequenzierung bestätigt.
Als Marker kann jeder in Fachkreisen bekannte Marker verwendet werden, bevorzugt jedoch Digoxygenin (DIG).
Die Verwendung der vorstehenden genannten Sonden zum Nachweis des Amplifikationsproduktes SEQ ID Nr. 8 ist besonders vorteilhaft, weil damit bestätigt werden kann, dass dieses Amplifikationsprodukt vom Rind stammt, und so die Spezifität und Sensitivität des Verfahrens noch gesteigert werden kann.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich zudem auf Oligonucleotide, die komplementär und invers-komplementär zu den vorgenannten Oligonucleotiden sind.
Für Fachleute als Referenzmaterial empfehlenswert ist das allgemeine Handbuch von SAMBROOK et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y., oder eine neuere Auflage davon; es behandelt die Implementierung der molekularbiologischen Techniken der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Detektion vorhandener Rindersubstanzen in Produkten, die bei der Futtermittelherstellung und in der Kosmetikindustrie verwendet werden, wie etwa gekochtes oder rohes Fleisch, Granulate und Mehle in Futtermitteln, Komposte, Dünger und Düngemittel, Produkte auf der Basis von Blut, Knochenmehl, Leder und Guano, sowie Gelatinen und Tierfette.
Die vorliegende Erfindung wird anhand von Abbildungen veranschaulicht, ohne jedoch auf die nachfolgenden Beispiele beschränkt zu sein.
1 zeigt ein Agarose-Gel, das mit Ethidiumbromit gefärbt ist. Die DNS der Spezies Rind, Pferd, Schaf, Schwein, Ente, Huhn und Pute (jeweils Streifen 2 bis 8) wurde jeweils mithilfe der Primer SEQ ID Nr. 6 (PBF9) und SEQ ID Nr. 3 (PBR6) amplifiziert. Streifen 1 entspricht einer Negativkontrolle. Das Amplifikationsprodukt migriert, wobei es einen Strang mit 480 Basenpaaren bildet.
2 zeigt ein anderes Agarose-Gel, auf dem die Amplifikationsprodukte der DNS von verschiedenen europäischen Rinderrassen zur Migration aufgetragen wurden: Weiß-Blauer Belgier (Streifen 2 und 3), Limousin (Streifen 4 und 5), Charolaise (Streifen 6 bis 10), Normande (Streifen 11 und 12), Prim'Holstein (Streifen 13 bis 16), Blonde d'Aquitaine (Streifen 17 bis 20), Frisonne (Streifen 21), Kreuzung (Streifen 22 und 23) und Parthenaise (Streifen 24). Streifen 1 entspricht einer Negativkontrolle.
3 veranschaulicht, wie das Agarose-Gel aus 1 mithilfe der Southern-Technik transferiert und mithilfe der markierten Sonde SEQ ID Nr. 7 (BH1) hybridisiert wird.
4 zeigt ein Agarose-Gel mit den Amplifikationsprodukten aus Futtermitteln, die jeweils folgenden Anteil an Rindermehl aufweisen: 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1; 0,075; 0,06; 0,05; 0,01% (jeweils Streifen 2 bis 11). Streifen 1 entspricht einer Negativkontrolle.
5 zeigt den Transfer des Gels aus 4 mithilfe der Southern-Technik und die Hybridisierung mithilfe der markierten Sonde SEQ ID Nr. 7 (BH1).
BEISPIEL 1
EXTRAKTION UND DOSIERUNG DER DNS VERSCHIEDENER ORGANISCHER SUBSTANZEN
Um eine Detektionsmethode durch Gen-Amplifikation von Rindersubstanzen in Produkten, die bei der Futtermittel- und Kosmetikherstellung verwendet werden, entwickeln zu können, wurden die in Beispiel 1 beschriebenen Experimente mit verschiedenen Probentypen durchgeführt, die potenzielle Quellen der Verbreitung von BSE repräsentieren.
Die ausgewählten Proben verteilen sich auf 12 Gruppen von Fertigprodukten oder Produkten, die Bestandteile von Fertigprodukten sind:
Um die Analyse einer Probe mittels PCR durchführen zu können, sind DNS-Extraktionstechniken erforderlich. Angesichts der Verschiedenartigkeit der getesteten Proben werden mehrere Verfahren angewendet:
1) DNS-Extraktion mithilfe der Phenol-Chloroform-Methode
Diese Methode kommt vorzugsweise bei Proben zum Einsatz, die größtenteils aus tierischen Substanzen bestehen (Mehle, Granulate, Knochen, Blut, Federn, Leder usw.).
Diese Methode basiert auf Techniken, die von HÄNNI et al., 1990, C. R. Acad. Sci. Paris., 310, 365–370 sowie HÄNNI et al., 1995, Nucl. Acids Res., 23, 881–882 bei der Beschreibung der DNS-Extraktion aus Knochen und Zähnen aufzeigt wurden.
0,5 g Pulver wird für einen Zeitraum von 3 Stunden bei 56°C in 2,5 ml Lysepuffer mit folgender Zusammensetzung inkubiert:
Tris 100 mM, ph8
NaCl 100 mM
Sarcosyl 1%
Das Gemisch enthält 200 μg/ml K Proteinase zur Degradation der Proteine und Freisetzung der Nukleinsäuren.
Das Lysat wird sodann mit einem Volumen Phenol/Chloroforme 1/1 extrahiert, um den Proteinanteil des Lysats zu eliminieren. Eine zweite Extraktion wird durchgeführt. Die wässrige Phase wird anschließend mit 1 Volumen Chloroform extrahiert.
Die DNS wird dann mit ein 0,6 Volumen Isopropanol und 0,1 Volumen Ammoniumacetat 2 M bei –20°C für mindestens 2 Stunden präzipitiert. Anschließend wird sie durch Zentrifugation (15 mn bei 12000 rpm) her ausgelöst, wieder aufgenommen und dann bei 70°C mit Ethanol gewaschen (konserviert bei –20°C). Nach Evaporation des Restalkohols (1 bis 2 Stunden unter der Dunstabzugshaube) wird die DNS sodann zur Injektionsvorbereitung in Wasser aufgelöst (WFI-Wasser, das Wasservolumen hängt von der Menge der herausgelösten und wieder aufgenommenen DNS ab).
2) Extraktion nach der CTAB-Methode (Cetyltrimethylammoniubromid)
Diese Methode, die von MURRAY beschrieben wurde (Nucleic Acid Res. 8 (19), 4321–4325 (1980)), ist vorzugsweise bei Proben anzuwenden, die Überreste pflanzlichen Ursprungs vermischt mit Produkten tierischen Ursprungs enthalten (Düngemittel, Komposte, Düngemittel, Dünger, Pflanzenerde).
1 g der Probe wird für 3 Stunden bei 56°C in 2,5 ml Pufferlyse mit folgender Zusammensetzung inkubiert
Tris 10 mM pH8
EDTA 0,1 mM
Sodium Dodecylsulfat 1%
Proteinase K 100 μg/ml
450 μl NaCl 5 M und 375 μl CTAB 10% NaCl 0,7 M, vorerhitzt auf 65°C, werden sodann zugefügt und alles wird für 20 min bei 65°C inkubiert. Anschließend wird ein Volumen Chloroform zugefügt. Nach erfolgter Agitation und Zentrifugation (10 min bei 12000 rpm bei 4°C) wird die wässrige Phase ein zweites Mal herausgelöst und erneut extrahiert, um sie aufzuklaren. Dann wird sie erneut mit einem Volumen Phenol/Chloroform extrahiert. Die Extraktionsschritte erfolgen wie in Absatz 1 angegeben.
3) Quantitative Dosierung der extrahierten DNS
Bei der angewandte Dosierungsmethode handelt es sich um die Methode von LABARCA (1980, Analytical Biochemistry 102, 344–352). Sie basiert auf der Interkalationsreaktion eines Moleküls, des Hoechst 33258 (2-(2-4Hydroxyphenyl)Benzimidazolyl)-6(1-Methyl-4- Piperazyl)-Benzimidazol, 3HCl), in der Doppelhelix der DNS, die dosiert werden soll. Unter Bestrahlung bei 356 nm gibt der Komplex Hoechst 33258/DNS ein bestimmtes Fluoreszenz-Signal (458 nm) ab.
Die Fluoreszenz-Emission ist proportional zu der DNS-Menge in der Lösung; die Ablesung erfolgt mittels eines Fluormeters (DyNA quant-Hoeffer). Die DNS der zu dosierenden Probe wird 2 ml Tris-Puffer 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 0,2 M zugefügt, der 1 μg 33258/ml enthält.
Durch Kalibrierung des Gerätes mithilfe einer DNS-Standardlösung mit bekannter Konzentration wird die Menge der aus der Probe extrahierten DNS gemessen.
Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt, dass die beschriebenen Techniken es erlauben, in allen Proben DNS in ausreichender Menge nachzuweisen, die mithilfe des PCR-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung analysiert werden kann.
BEISPIEL 2
PCR-AMPLIFIKATION DER mtDNS-SEQUENZEN VOM RIND AUS DER DNS, DIE AUS DEN PROBEN EXTRAHIERT WURDE
1) Reinigung der extrahierten DNS über eine Silica-Säule
Um die PCR unter optimalen Reaktionsbedingungen durchführen zu können, ist es erforderlich, zunächst die extrahierte DNS zu reinigen. Die nachfolgend beschriebene Reinigung erfolgt anhand einer von BOOM et al. (1990, J. Clin. Microbiol. 28, 495–503) beschriebenen Methode.
50 μl unbehandelte DNS, die durch eine der in Beispiel 1 beschriebenen Methoden gewonnen wurde, werden in 400 μl eines Puffers aufgelöst, der durch Zugabe von 120 g Guanidium-Thiocyanat, 22 ml EDTA 0,2 M-pH8 und 2,6 ml Trition X100 in 100 ml eines Tris-Puffers 0,1 mM-pH 6,4 gewonnen wird.
Diese Lösung wird 5 min bei Raumtemperatur mit 300 μl Silica (Wizard DNA Clean-up System, Promega, Kat. Nr. A7280: Silica und Minisäulen) inkubiert. Das Silica wird über eine Säule mit 2 ml Isopropanol (80%) gewaschen. Die Säule wird 2 min bei 12000 rpm zentrifugiert, um Restalkohol zu eliminieren, dann werden 50 μl auf 70°C vorerhitztes WFI-Wasser hinzugefügt, um die auf dem Silica gebundene DNS zu eluieren (Inkubation 5–30 min bei 70°C).
Das Eluat, welches die durch Zentrifugation (12000 rpm, 2 min) herausgelöste DNS enthält, kann sodann für die PCR verwendet werden.
Erforderlichenfalls kann die Silica-Reinigung wiederholt werden.
2) Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
Die PCR wurde mit den zwei Oligonucleotid-Primern SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 6 durchgeführt, die jeweils die Sequenzen SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 6 darstellen.
Die Amplifikationen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl mit folgenden Inhaltsstoffen durchgeführt:
5 μl Taq-Puffer (10 ×) (ohne Mg++), kommerziell erhältlich, mit dem Enzym
5 μl einer Mischung aus ATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 2 mM)
3 μl MgCl, 25 mM
0,5 μl Albumin 20 mg/ml
5 μl von jedem Primer SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 6 (jeweils 10 μl)
10 μl Matrix-DNS vom Genom (von 100 ng bis 1 μg)
0,2 μl Taq-DNS-Polymerase (5 Einheiten/μl)
16,3 μl destillierts steriles Wasser.
Mit Ausnahme der Genom-Matrix, der Primer und der Taq-DNS-Polymerase bilden alle vorgenannten Substanzen den Basispuffer, der im Volumen präpariert und bei –20°C konserviert wird.

Alle Amplifikationen wurden mit einem „Perkin-Elmer"-Thermocycler mit folgendem Temperaturprogramm durchgeführt: „PCR"-Programm

1 Anfangszyklus mit	5 min bei 94°C
9 Zyklen mit	30 sec bei 94°C 30 sec bei 55°C (danach bei jedem Zyklus 0,5°C weniger bis 51°C) 30 sec bei 72°C
32 Zyklen mit	30 sec bei 94°C 30 sec bei 51°C 30 sec bei 72°C
1 Endzyklus mit	7 min bei 72°C einige Minuten bis einige Stunden bei 4°C.

Die erhaltenen Amplifikationsprodukte werden zur Analyse mittels Elektrophorese auf Agarose-Gel (1,5%) bei Dauerspannung von 130 V für 45 min aufgetrennt und zur Sichtbarmachung mit Ethidiumbromid eingefärbt.
Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der Primerpaare SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 6 bei einer Reihen von DNS-Extrakten aus verschiedenen tierischen und pflanzlichen Geweben durchgeführt. Bei Rindergeweben wurde ein einziges Amplifikationsprodukt (Fragment mit einer Länge von 480 Basenpaaren – 480 bp) beobachtet, dagegen keines bei sämtlichen anderen getesteten DNS-Extrakten (1). Somit sind die Primer SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 6 für die Identifikation rinderspezifischer DNS in einer PCR-Anwendung geeignet.
Zusätzlich zu diesen Resultaten kam die PCR-Technik unter Einsatz dieser beiden Primer bei DNS-Extrakten aus den Tiergeweben verschiedener europäischer Rinderrassen (Weiß-Blauer Belgier, Limousin, Charolaise, Normande, Prim'Holstein, Kreuzung Charolaise-Normande, Blonde d'Aquitaine, Parthenaise) zur Anwendung. Sämtliche Proben ergaben das gleiche Profil (ein einzelnes Fragment mit 480 bp), was zeigte, dass die Methode zum Nachweis von DNS aller Rinderrassen angewendet werden kann (2).
BEISPIEL 3
CHARAKTERISIERUNG DER MITTELS PCR-REAKTION AMPLIFIZIERTEN DNS DURCH DIE SOGENANNTE „SOUTHERN"-TECHNIK
Die Bestätigung, dass das PCR-Amplifizierungsprodukt (480 bp) vom Rind stammt, wird dadurch erhalten, dass dieses Produkt mit einer Oligonucleotid-Sonde hybridisiert wird, welche der Identifikations-Sequenz BH1 (SEQ ID Nr. 7) entspricht. Die für diesen Zweck verwendete BH1-Sonde wird mithilfe eines kommerziell erhältlichen Kits („DIG Oligonucleotide 3'-End-Labeling Kit", Boehringer) mit Digoxygenin (DIG) markiert.
Nach dem Kapillar-Transfer auf eine Nylonmembran werden die Amplifikations-Produkte denaturiert, bevor sie durch UV-Licht kovalent an die Membran gebunden werden. Nach Inkubation der Membran in einen Hybridisierungs-Puffer, der die markierte BH1-Sonde enthält, werden Waschungen durchgeführt; anschließend wird die Sonde mit einem System aus Anti-DIG-Antikörpern detektiert, die mit Alkalin-Phosphatase unter Zugabe von Nitro Blue Tetrazolium Chlorid und 5-Brom, 4-Chlor, 3-Indolyl-Phosphat gekoppelt sind. Auf diese Weise werden die Amplifikationsprodukte in dieser Reaktion durch eine braun-violette Färbung charakterisiert.
Wenn die Analyse durch Hybridisierung/Transfer des „Southern"-Typs erfolgt, ist festzustellen, dass die BH1-Sonde mit der DNS-Sequenz vom Rind spezifisch hybridisiert, die mittels der Primer SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 6 amplifiziert wurde, und nicht mit DNS anderer tierischer oder pflanzlicher Spezies (3).
BEISPIEL 4
ANWENDUNG DER PCR-TECHNIK UND DER „SOUTHERN-TECHNIK" ZUR DETEKTION VON TIERMEHLEN, DIE VOM RIND STAMMEN, IN FUTTERMITTELN
Die Verfahren aus den Beispiele 1, 2 und 3 wurden bei Futtermittel-Proben (in Mehl- oder Granulatform) angewendet, welche keine Rinderprodukte enthielten und denen experimentell Mehl aus Rindernebenprodukten in Dosierungsraten von 5 bis 0,01% beigefügt wurde.
Durch PCR-Amplifikation mithilfe der Primer SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 6 wurde von allen Proben, die mindestens 0,1% Rindermehl enthielten, ein spezifisches Signal erzeugt, welches proportional zur Dosierungsrate war.
Die Anwendung der „Southern"-Technik mit der Oligonucleotid-Sonde BH1 bei den zuvor gewonnenen Amplifikationsprodukten ermöglicht eine spezifische Detektion der Proben, die Rindermehl enthalten, diesmal mit einer Nachweisgrenze von 0,05% (4).
BEISPIEL 5
ANWENDUNG DER PCR-TECHNIK UND DER „SOUTHERN"-TECHNIK ZUR DETEKTION VON RINDERPRODUKTEN IN ALLEN PROBEN
Die Verfahren aus den Beispielen 1, 2 und 3 wurden bei verschiedenen Proben angewendet, die verschiedene Raten von Rinderprodukten enthalten können, wie beispielsweise gekochtes oder rohes Fleisch, für Futtermittel verwendete Granulate und Mehle, Komposte, Dünger und Düngemittel, Produkte auf der Basis von Blut, Knochenmehl, Leder, Guano, sowie Gelatinen und Tierfette.
Von allen getesteten Proben, die Rinderprodukte enthielten (nachfolgende Tabelle 2), wurde ein spezifisches Signal erzeugt. Eine perfekte Korrelation zwischen der erkannten Präsenz von Rinderprodukt in den Proben und dem PCR-Signal (Präsenz des 480-bp-Amplifikats, das mit der markierten BH1-Sonde hybridisiert) wird festgestellt.
LISTE DER SEQUENZEN

Claims

Oligonucleotide, dadurch gekennzeichnet, daß – sie mindestens eine 80proz. Sequenz-Identität, bevorzugt 90 Prozent und vorteilhaft 95 Prozent, mit einem Oligonucleotid haben, das aus einer Sequenz von ungefähr 15 bis 25 Nucleotide, vor allem 20 bis 25 Nucleotide besteht, welche Sequenz in der folgenden SEQ ID N° 1 eingeschlossen ist: TAATGTCCATGCTTATCATTATGCTGGTGCTCAAGATGCAGTT – oder daß sie die folgende SEQ ID N° 2 enthalten: YTATCATTATGCTGG – oder daß sie aus der folgenden SEQ ID N° 3 bestehen: CATGCYTATCATTATGCTGG worin Y T oder C bedeutet.
Oligonucleotide, dadurch gekennzeichnet, daß – sie mindestens eine 80proz. Sequenz-Identität, bevorzugt 90 Prozent und vorteilhaft 95 Prozent, mit einem Oligonucleotid haben, das aus einer Sequenz von ungefähr 15 bis 25 Nucleotide, vor allem 20 bis 25 Nucleotide besteht, welche Sequenz in der folgenden SEQ ID N° 4 eingeschlossen ist: ATTATATGCCCCATGCATATAAGCAAGTACATGACCTCTATAGCAG – oder daß sie die folgende SEQ ID N° 5 enthalten: TAAGCAAGTACATGA – oder daß sie aus der folgenden SEQ ID N° 6 bestehen: GCATATAAGCAAGTACATGA.
Primerpaar, dadurch gekennzeichnet, daß es aus irgendwelchen Oligonucleotiden der SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 nach Anspruch 1, und aus irgendwelchen Oligonucleotide der SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 nach Anspruch 2, sowie vorteilhaft aus zwei Nucleotiden der SEQ ID N° 3 und SEQ ID N° 6 bestehen.
Primerpaar, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonucleotide, aus denen es besteht, aus den folgenden gewählt werden: – Oligonucleotide, die mindestens eine 80proz. Sequenz-Identität, bevorzugt 90 Prozent und vorteilhaft 95 Prozent, mit einem Oligonucleotid haben, das aus einer Sequenz von ungefähr 15 bis 25 Nucleotide, vor allem 20 bis 25 Nucleotide besteht, welche Sequenz mindestens 10 angrenzenden Nucleotide aus der folgenden SEQ ID N° 9 enthält: GAGCCTTATCAGTATTAAATTTATC – oder aus der folgenden SEQ ID N° 10: CATTAATGTTATGTACATTA – oder aus der folgenden SEQ ID N° 11: TTTCACGCGGCATGGTAATT – oder aus der folgenden SEQ ID N° 12: ATCCAATGAATTTTACCAGG – oder aus der folgenden SEQ ID N° 13: GTCAATGGTCACAGGACATA – oder aus der folgenden SEQ ID N° 14: ATTGACTTTGTTTGGAGTGC und vor allem die folgenden Primerpaare: SEQ ID N° 9 mit SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 6 mit SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12 mit SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 13 mit SEQ ID N° 14.
Oligonucleotid, das mindestens 15 Nucleotide enthält, bevorzugt mindestens 20 Nucleotide, und worin mindestens ein Teil der Sequenz mindestens eine 80proz. Identität, bevorzugt 90 Prozent, mit der folgenden SEQ ID N° 7: CTTGATAGTATATCTATTATATATTCC oder mit der folgenden SEQ ID N° 19: TAARCCGTGGGGGTCGCTATCCAAT hat.
Sonden, dadurch gekennzeichnet, daß sie Oligonucleotide nach Anspruch 5, oder komplementäre oder reverse/komplementäre Oligonucleotide zu den Oligonucleotiden nach Anspruch 5 enthalten.
Verfahren für die Herstellung eines Rinder-mitochondriales DNS-Fragment mit einer bestimmten Größe und Sequenz, das spezifisch für Rinder ist, insbesondere für Bos taurus und Bos indicus Spezies, aus einer organischen Substanzprobe, mit denem über eine Kettenpolymerisationsreaktion eine besondere Sequenz aus dem Rindergenom amplifiziert wird, welche Sequenz im Rindergenom anwesend ist, aber im Genom anderer Spezies nicht anwesend ist, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die Amplification mit einer Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird, die die Wiederholung des Kreislaufs von den folgenden Schritten enthält: – die Wärmung der aus der organischen Substanzprobe gewonnenen DNS um die DNS in zwei Einzelstränge zu trennen; – die Hybridisierung der Oligonucleotid-Primer nach Ansprüche 1 bis 4 zu den DNS Einzelsträngen bei einer günstigen Temperatur, und – die Verlängerung der Oligonucleotid-Primer mit einer Polymerase bei einer günstigen Temperatur.
Verfahren für die Detektion und Identifizierung der Anwesenheit von biologischen Substanzen aus Rinder in einer organischen Substanzprobe, dadurch gekennzeichnet, daß die Anwesenheit der Rinder-mitochondrialen DNS in der besagten organischen Substanz durch Amplifizierung einer rinderspezifischen mitochondrialen DNS-Sequenz detektiert wird, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifizierung mit der Polymerasekettenreaktion durchgeführt wird, die die Wiederholung des Kreislaufs von den folgenden Schritten enthält: – die Wärmung der aus der organischen Substanzprobe gewonnenen DNS um die DNS in zwei Einzelstränge zu trennen; – die Hybridisierung der Oligonucleotid-Primer nach Ansprüche 1 bis 4 zu den DNS Einzelsträngen bei einer günstigen Temperatur, und – die Verlängerung der Oligonucleotid-Primer mit einer Polymerase bei einer günstigen Temperatur.
Verfahren nach Ansprüchen 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Rindergenom-spezifische mitochondriale DNS-Sequenz ungefähr 500 bis ungefähr 100 Basenpaare, vor allem ungefähr 152 bis 480 Basenpaare enthält, und mindestens eine 80proz. Sequenz-Identität, bevorzugt mindestens 90 Prozent, mit homologen Regionen in der Sequenz der mitochondrialen DNS-kontrollierenden Region, und vor allem von der Stelle 15834 bis der Stelle 171 hat, worin diese Stellen nach der gesamten Rinder-mitochondrialen DNS-Sequenz, die 16338 Nucleotide enthält, bestimmt werden.
Verfahren nach Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltene amplifizierte Sequenz durch Hybridisierung mit einer Probe oder durch Sequenzierung detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Probe mindestens ein Teil des Oligonucleotides nach irgendwelchem Anspruch 5 oder 6 und ein Marker enthält.
DNS-Fragment, das durch das Verfahren nach irgendwelchem Anspruch 7 bis 9 erhalten werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß es von ungefähr 500 bis ungefähr 100 Basenpaare enthält.
Fragment nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine 80proz. Sequenz-Identität, bevorzugt 90 Prozent und vorteilhaft 95 Prozent, mit einem Oligonucleotid hat, das aus einer Sequenz besteht, die ungefähr 15 bis 25 Nucleotide enthält, die in der folgenden SEQ ID N° 8 eingeschlossen sind:
und vor allem ein 480 Basenpaarefragment, das die wie oben definierte SEQ ID N° 8 enthält oder aus dieser Sequenz besteht.
Fragmente nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine 80proz. Sequenz-Identität, bevorzugt 90 Prozent und vorteilhaft 95 Prozent mit einem Nucleotid haben, das aus einer Sequenz besteht, die ungefähr 15 bis 25 Nucleotide enthält, die in der folgenden SEQ ID N° 15 eingeschlossen sind:
oder in der folgenden SEQ ID N° 16:
oder in der folgenden SEQ ID N° 17:
oder in der folgenden SEQ ID N° 18:
und vor allem ein 159 Basenpaarefragment, das die wie oben definierte SEQ ID N° 15 enthält oder aus dieser Sequenz besteht, und vor allem ein 153 Basenpaarefragment, das die wie oben definierte SEQ ID N° 16 enthält oder aus dieser Sequenz besteht, und vor allem ein 265 Basenpaarefragment, das die wie oben definierte SEQ ID N° 17 enthält oder aus dieser Sequenz besteht, und vor allem ein 158 Basenpaarefragment, das die wie oben definierte SEQ ID N° 18 enthält oder aus dieser Sequenz besteht.
Anwendung des Verfahrens nach irgendwelchem Anspruch 7–11 für die Detektion von einer Rinder-biologischen Substanz in Produkte wie: Mehle, die als Rindfutter benutzt werden, Composts, Dünger und Düngemittel, rohe, geräucherte oder gekochte Fleische und Fleischmischungen, Granulate, Blut und blutgestützte Produkte, Milch und milchgestützte Produkte, Knochen und knochengestützte Produkte, Leder, Häute, Elfenbeine, Haare, Horn und horngestützte Produkte, Guano, Kot, Jaucheflüssigkeit, Jauche, Gelatine und gelatingestützte Produkte, Kosmetika und Produkte, die in der Ernährungsindustrie benutzt werden.