DE102005038214A1

DE102005038214A1 - Verfahren und Kit zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs

Info

Publication number: DE102005038214A1
Application number: DE200510038214
Authority: DE
Inventors: Roger Prof. Dr.med.vet. Stephan; Taurai Dr.med.vet. Tasara
Original assignee: Universitaet Zuerich
Current assignee: Universitaet Zuerich
Priority date: 2005-08-12
Filing date: 2005-08-12
Publication date: 2007-02-15
Also published as: WO2007019945A2; WO2007019945A3

Abstract

Verfahren und Kit zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs, bei dem ein DNA-Extrakt aus einer Probe des Produkts gewonnen wird, der DNA-Extrakt mittels PCR aufgearbeitet wird, wobei die bei der PCR eingesetzten Primer so designt sind, dass sie eine bovinspezifische Sequenz mit einer Länge von weniger als 150 Nukleotiden erkennen, und geprüft wird, ob während der PCR mit den eingesetzten Primern eine Amplifikation stattgefunden hat.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und einen Kit zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs.
Wesentlicher Anwendungsfall der Erfindung ist die Untersuchung bzw. Zertifizierung von Produkten, für die sichergestellt werden soll, dass sie keine Anteile bovinen Gewebes enthalten.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Untersuchung von Gelatine. Der Wunsch nach einer verläßlichen Zertifizierung von Gelatine bezüglich der Abwesenheit boviner Anteile geht auf die BSE-Krise zurück. In diesem Zusammenhang wurde z.B. von der EU eine Direktive bezüglich der Herstellung von eßbarer Gelatine erlassen, die einen dokumentarischen Nachweis vorschreibt, dass die zur Herstellung der Gelatine verwendeten Ausgangsmaterialien von Tieren stammen, die für den menschlichen Verzehr geeignet sind. Dies ist im Falle von BSE relativ aufwändig, da Knochen und Schlachtabfälle vieler unterschiedlicher Rinder bei der Herstellung gepoolt werden, was bedeutet, dass für jede Charge eine entsprechende Anzahl an BSE-Tests dokumentiert werden müsste. Hier wäre es ggf. einfacher, auf die Verwendung von Ausgangsmaterialien aus Rindern ganz zu verzichten und dies zu zertifizieren.

Bislang gibt es keine verläßlichen Methoden, mit denen sich insbesondere z.B. in Gelatine die Herkunft bzw. Spezieszugehörigkeit der zur Herstellung verwendeten tierischen Gewebe bestimmen läßt. Dies ist im Wesentlichen darauf zurückzuführen, dass die extremen Temperatur- und pH-Bedingungen während der Herstellung von Gelatine die Ausgangsgewebe so weitgehend zersetzen, dass eine speziesspezifische Bestimmung nicht möglich ist.

Aufgabe der Erfindung ist, ein auch in solchen Produkten zuverlässig funktionierendes Nachweisverfahren bereitzustellen.

Gelöst wird die Aufgabe mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie einem Kit gemäß Anspruch 23.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst ein DNA-Extrakt aus einer Probe des Produkts gewonnen. Der DNA-Extrakt wird dann mittels PCR aufgearbeitet, wobei die bei der PCR eingesetzten Primer so designt sind, dass sie als Targetsequenz eine bovinspezifische Sequenz mit einer Länge von weniger als 150 Nukleotiden erkennen. Abschließend wird dann geprüft, ob während der PCR mit den eingesetzten Primern eine Amplifikation stattgefunden hat.

In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird wie erwähnt aus der zu untersuchenden Probe ein DNA-Extrakt gewonnen, der mittels PCR weiter aufgearbeitet werden kann.

Zur Gewinnung des DNA-Extrakts kann die Probe z.B. homogenisiert, dann in Gegenwart eines Lysis-Puffers und/oder einer Proteinase, insbesondere Proteinase K, inkubiert und dann die enthaltene DNA extrahiert und aufgereinigt werden.

In einer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass dann mittels insbesondere alkoholischer Fällung die DNA weiter extrahiert und aufgereinigt wird, ggf. nach vorheriger Ausfällung der Proteine.

Als besonders geeignet hat sich in diesem Zusammenhang ein Kit und das entsprechende dazugehörige Aufarbeitungsprotokoll der Firma GEN-IAL (All-tissue DNA-extraction Kit Cat. No. D0502000) gezeigt.

Gemäß einer zweiten Ausgestaltung kann das Lysat auch auf eine DNA-bindende Säule gegeben und die Säule anschließend wie in dem Kit "High pure template preparation Kit Cat. No. 1796 828" der Firma Roche Diagnostics vorgeschrieben eluiert werden. Das Eluat wird dann als DNA-Extrakt in der PCR weiter verarbeitet.

Bezüglich der Details der bevorzugt eingesetzten Methoden wird auf die dem Fachmann zugänglichen Protokolle der erwähnten Kits verwiesen.

Im Rahmen der Erfindung konnte erstmals gezeigt werden, dass DNA-Extrakte der z.B. bevorzugt untersuchten Gelatine noch speziespezifische mittels PCR nachweisbare Targetsequenzen enthalten. Ein wesentlicher Aspekt ist, dass die Erfindung sehr kurze Targetsequenzen verwendet, da wie sich gezeigt hat, solche kurzen Sequenzen nach Behandlung unter Extrembedingungen noch intakt sind und in einer für eine Analyse ausreichenden Menge vorliegen.

Besonders bevorzugt wird im Rahmen der Erfindung als Targetsequenz eine bovinspezifische Sequenz ausgewählt, die mehrfach in dem Genom oder der mitochondrialen DNA vorkommt. Grundsätzlich lässt sich sagen, dass mit der Kopienzahl die statistische Nachweissicherheit steigt, was insbesondere bei der gewünschten Zertifizierung ein wesentliches Argument sein kann.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist vorgesehen, dass die Aufarbeitung in Gegenwart von Primern erfolgt, die spezifisch die ATPase 8 Untereinheit erkennen. Die ATPase 8 Untereinheit wird durch die Region 7766–7966 (SEQ ID NO 1) der bovinen mitochondrialen DNA kodiert. Das gesamte mitochondriale Genom ist unter der Nr. AF492351 in der Datenbank von EMBL-EBI veröffentlicht.

Besonders bevorzugt ist ein Primerpaar mit folgenden Sequenzen:

Der Primer Fpc F2 (SEQ ID NO 2) entspricht dem Abschnitt 7799–7823 in der mitochondrialen DNA (34–58 in SEQ ID NO 1) und der Bereich 4–24 des Primers Fpc R (SEQ ID NO 3) dem Abschnitt 7898–7918 in der mitochondrialen DNA bzw. dem Abschnitt 133–154 in der ATPase 8-Sequenz (SEQ ID NO 1). Die ersten 3 Nukleotide am 5' Ende sind nicht komplementär und wurden aus Gründen des Schmelzverhaltens des Primers eingefügt.

Einzelheiten der eingesetzten Primer sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1:

Es konnte gezeigt werden, dass das beschriebene Primerpaar hochspezifisch und verläßlich Anteile bovinen Materials auch in geringsten Konzentrationen in Gelatine nachweisen konnte.

Im Hinblick auf die Tatsache, dass in den meisten PCR-Kits zur Stabilisierung der Enzyme BSA zugesetzt ist, die gegebenenfalls im Rahmen des erfindungsgemäßen Nachweises zu einem falsch positiven Nachweis führen könnte, wird in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung dem Mastermix DNase 1 zugesetzt, um eventuelle Verunreinigungen durch nicht aus dem Produkt stammende bovine Anteile auszuschließen. Es konnte z.B. gezeigt werden, dass 0,2 UDNase I auf 10 Mikroliter Mastermix ausreichend waren, um kontaminierende DNA auszuschließen, ohne dass dadurch die PCR-Reaktion nachteilig beeinflusst wurde.

Falsch positive Ergebnisse können also im Rahmen der Erfindung mit großer Sicherheit ausgeschlossen werden.

Ein weiteres Problem stellt sich jedoch mit eventuellen falsch negativen Ergebnissen.

Ein grundsätzliches Problem bei PCR-Ansätzen ist, dass auf Grund eventuell in den untersuchten Proben enthaltener PCR-Inhibitoren die Reaktion nicht oder nicht ausreichend abläuft. In einer bevorzugten weiteren Ausgestaltung sieht die Erfindung daher vor, dass die PCR in Gegenwart einer internen Amplifikationskontrolle durchgeführt wird.

Geeignete Amplifikationskontrollen können dabei beliebige Target-DNA-Sequenzen (Kontroll-DNA) sein, die sich mit entsprechend designten Primern standardisiert und reproduzierbar unter ähnlichen Bedingungen wie die ATPase 8 Untereinheit Sequenzen amplifizieren lassen.

Besonders bevorzugt wird die interne Amplifikationskontrolle im gleichen Ansatz durchgeführt, in dem auch der Nachweis der rinderspezifischen Sequenz erfolgt.

Als Kontroll-DNA wird im Rahmen der Erfindung bevorzugt PuC19 Plasmid-DNA eingesetzt. Einzelheiten zu diesem Plasmid, insbesondere zu der Sequenz sind z.B. von "Yanisch-Perron et al." in "Gene 33(1), 103–119 (1985)" veröffentlicht worden. PuC19 kann unter der Nr. ATCC 37254/L09137 oder bei New England Biolabs (Kat. Nr. N3041 S) bezogen werden.

Geeignete Kontroll-Primer, die PuC 19 erkennen, können z.B. die folgenden Sequenzen aufweisen:

Die genannten Primer hybridisieren mit den Abschnitten 49–65 (SEQ ID NO 4) beziehungsweise 433–448 (SEQ ID NO 5) der genannten PuC19Plasmid-DNA.

Einzelheiten der eingesetzten Primer sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefasst: Tabelle 2:

Das erfindungsgemäße Verfahren kann eine konventionelle PCR mittels anschließender Auswertung im Gel verwenden.

Bevorzugt ist jedoch vorgesehen, dass die Aufarbeitung des DNA-Extrakts mittels Realtime PCR erfolgt.

Realtime-PCR-Verfahren sind seit längerem bekannt und unterscheiden sich im wesentlichen von konventionellen PCR-Verfahren dadurch, dass in dem PCR-Ansatz zusätzlich Sonden enthalten sind, die ein mit der Zunahme von amplifizierter DNA korreliertes, sich veränderndes Signal erzeugen. Weiterhin weist die eingesetzte PCR-Apparatur (Cycler) eine Messeinrichtung auf, die die erzeugten Signale während der PCR in den Ansätzen erfasst, so dass unmittelbar, d.h. noch während der Messung festgestellt werden kann, ob eine Amplifikation der Target-Sequenz stattgefunden hat.

Für Realtime-PCR geeignete Sonden- und Cyclersysteme mit entsprechenden Messeinrichtungen werden von unterschiedlichen, dem Fachmann bekannten Herstellern angeboten.

Besonders bevorzugt werden im Rahmen der Erfindung zum Nachweis der während der PCR erzeugten Amplifikate spezifische Sonden eingesetzt, die gezielt ein Signal nur bei Amplifikation von bovinen Sequenzen und/oder der internen Kontroll-DNA-Sequenz erzeugen. Es versteht sich, dass die erzeugten Signale bei gleichzeitiger Aufarbeitung der Amplifikationskontrolle in einem gemeinsamen Ansatz von den bei Amplifikation der bovinen Sequenz erzeugten Signalen differenzierbar sein müssen, was durch entsprechende Markerwahl kein Problem darstellt.

Spezifische Sonden weisen in der Regel einen DNA-Abschnitt auf, der so gewählt ist, das er spezifisch mit einem Abschnitt der Target-DNA hybridisieren kann. An den DNA-Abschnitt ist ein Marker oder ein Markersystem gekoppelt, welche bei Hybridisierung ein anderes Signal erzeugen als im nichthybridisierten Zustand. Geeignete Sonden sind in der Fachwelt z.B. unter dem Begriff "TAQMAN-Sonden" bekannt geworden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird besonders bevorzugt ein anderes, das sogenannte "Light-Cycler System" von "Roche-Diagnostics" eingesetzt. Dieses System arbeitet mit 2 Sonden pro Target, die beide mit benachbarten Bereichen der Target-Sequenz hybridisieren. Die eine Sonde ist mit Fluorescein markiert, die andere mit einem Fluoreszenzfarbstoff, z.B. LC-Red-705 oder LC-Red-640 (Roche-Diagnostics). Bei räumlicher Nähe, die sich nach Hybridisierung der beiden Sonden an der Target-DNA einstellt, kann das Fluorescein die Fluoreszenzfarbstoffe aktivieren, die dann ein Signal mit den jeweils angegebenen Wellenlängen 705 nm oder 640 nm erzeugen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren haben sich bovine Sonden mit den folgenden Sequenzen als besonders geeignet gezeigt:

Als interne Amplifikationskontrolle wird besonders bevorzugt eine Kontroll-DNA eingesetzt, die mit denselben Primern wie die ATPase 8 Untereinheit aufgearbeitet werden kann.

Eine in diesem Zusammenhang geeignete Kontroll-DNA kann z.B. folgende Sequenz aufweisen:

Die gezeigte Sequenz (SEQ ID NO 8) entspricht der Region 34–153 der bovinen ATPase Sequenz (SEQ ID NO 1), wobei der Abschnitt 67–90 in SEQ ID NO 8 ersetzt wurde durch ein 21 bp großes Fragment, das der Region 355–375 des puC19 Plasmids entspricht.

Der wesentliche Vorteil bei der Verwendung der beschriebenen Kontroll-DNA gemäß SEQ ID NO 8 besteht darin, dass eine Amplifizierung mit denselben Primern erfolgen kann wie für die bovine Sequenz, wodurch nicht nur eine grundsätzliche PCR-Kontrolle sondern zusätzlich auch eine Primer-Kontrolle gegeben ist.

Wird als interne Amplifikationskontrolle die oben beschriebene Kontroll-DNA gemäß SEQ ID 8 eingesetzt, so ergibt sich als weiterer Vorteil, dass nur eine an das PuC19-Insert bindende Kontroll-Sonde erforderlich ist, die ihrerseits mit der bovinen Sonde gemäß SEQ ID NO 6 (BovSP-3'Fluo) zusammenwirkt.

Diese Kontroll-Sonde hat in einer bevorzugten Ausgestaltung eine Sequenz gemäß:

Einzelheiten der erwähnten Sonden sind in Tabelle 3 zusammengefasst: Tabelle 3:

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit, in dem die zur Durchführung des Verfahrens erforderlichen Reagenzien enthalten sind.

Der erfindungsgemäße Kit enthält mindestens Reagenzien zur Gewinnung eines DNA-Extrakts aus Probematerial, und Reagenzien zur Durchführung einer PCR, insbesondere einer Realtime PCR, enthaltend ein für eine bovine Sequenz spezifisches Primerpaar, eine interne Amplifikationskontrolle sowie mit der bovinen Sequenz und der internen Amplifikationskontrolle hybridisierende Sonden, die jeweils unterschiedliche detektierbare Marker aufweisen.

Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden.
Beispiel 1
Probenbehandlung und DNA-Extraktion unter Verwendung des "Qiagen tissue extraction kits" (Qiagen AG, Schweiz)
Gelatineproben mit jeweils einem Gewicht von 500 mg wurden in einem Rybolyser (Hybaid, Ashford) in Gegenwart von 1 ml des in dem Kit enthaltenen Lysis-Puffers und 6Oμl Proteinase K homogenisiert (6.5msec^–1 für 45s) und dann 30 min bei 70C° und 15 min bei 90C° inkubiert. Die genomische DNA wurde dann wie in dem Kit-Protokoll vorgeschrieben mit der vorgesehenen Säule aufgereinigt. Die DNA Templates wurden dann mit 100μl des Elutionspuffers (Kit) ausgewaschen. 5μl Aliquots wurden anschließend in die PCR eingesetzt.
Beispiel 2
PCR Konditionen:
Die Realtime PCR wurde in 20 μl Glaskapillaren mittels Light Cycler 2.0 Instrument (Roche Diagnostics) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch besteht aus QuantiTect PCR Master Mix (Qiagen), 0,5 μM von jedem Primer (Fpc F2/SEQ NO ID 1, Fpc R/SEQ NO ID 2), 0,2μM von jeder Sonde (BovSP-3'Fluo, BovSP-5'LC Red 640, puC19-5'LC Red 705) und 0,008 atomol der internen Amplifikationskontrolle (SEQ ID NO 5). Die Amplifikation startete mit einer initialen Vorinkubation bei 95°C für 20 Minuten, gefolgt von 55 Zyklen (95°C für 0s, 55°C für 30s und 72°C für 30s). Die Fluoreszenzmessung erfolgte während der Annealing-Phase bei 55C° bei 640nm (Kanal 4) für die bovine Sequenz und bei 705 nm (Kanal 6) für die Amplifikationskontrolle.
Beispiel 3
Gemäß obiger Beispiele wurde die DNA aus Gemischen (unterschiedliche mengenmäßige Anteile von Rindergelatine in Schweinegelatine) extrahiert und aufge reinigt und die jeweiligen DNA-Extrakte wurden mittels Realtime PCR aufgearbeitet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben. Tabelle 4:

n/t = nicht getestet

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich demzufolge mittels PCR bis zu 0,01 % bovine Anteile in Geweben bzw. 0,1 % in Gelatineproben nachweisen, die zusätzlich Schwein, Fisch oder Geflügel enthalten. Wird mittels LC-PCR gemessen, so steigt die Nachweisempfindlichkeit um einen Faktor 10.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs, bei dem – ein DNA-Extrakt aus einer Probe des Produkts gewonnen wird, der DNA-Extrakt mittels PCR aufgearbeitet wird, wobei die bei der PCR eingesetzten Primer so designt sind, dass sie eine bovinspezifische Sequenz mit einer Länge von weniger als 150 Nukleotiden erkennen, und – geprüft wird, ob während der PCR-mit den eingesetzten Primern eine Amplifikation stattgefunden hat.
Verfahren nach einem der Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Produkt um Gelatine handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Gewinnung des DNA-Extrakts die Probe homogenisiert, dann in Gegenwart eines Lysis-Puffers und/oder einer Proteinase, insbesondere Proteinase K, inkubiert und dann die enthaltene DNA extrahiert und aufgereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion der DNA mittels alkoholischer Fällung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion der DNA mittels einer DNA-bindenden Säule erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die von den Primern erkannte bovinspezifische Sequenz mehrfach in dem Genom oder der mitochondrialen DNA vorkommt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer Sequenzabschnitte erkennen, die spezifisch für ATPase 8 Untereinheit von Rindern sind.
Verfahren nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, dass die Primer-Sequenzen SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 2 entsprechen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR in Gegenwart eurer internen Amplifikationskontrolle (Kontroll-DNA) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid PuC19 als Amplifikationskontrolle dient.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein in das Plasmid PuC19 klonierter Sequenzabschnitt als Kontroll DNA dient.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontroll DNA so designt ist, dass sie von denselben Primern erkannt wird, die auch die bovine DNA erkennen
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontroll DNA eine Sequenz gemäß SEQ ID NO 5 aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR in Gegenwart von Sonden durchgeführt wird, die Signale mit von der Menge an amplifizierter DNA abhängiger Stärke erzeugen, und die erzeugten Signale kontinuierlich oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der PCR gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Sonden eingesetzt werden, die einen mit bovinspezifische DNA-Sequenzabschnitte (bovine Sonden) und/oder Kontroll-DNA-Gensequenzen (Kontroll-Sonden) hybridisierenden DNA-Abschnitt aufweisen und einen mit dem DNA-Abschnitt gekoppelten Marker, der im hybridisierten Zustand des DNA-Abschnitts ein anderes Signal abgibt als im nicht hybridisierten Zustand.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch- gekennzeichnet, dass zwei bovine Sonden mit zusammenwirkenden Markern eingesetzt werden, die bei benachbarter Hybridisierung an der bovinspezifischen Sequenz ein Signal erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Abschnitte der beiden bovinspezifischen Sonden Sequenzen gemäß SEQ ID NO 6 und SEQ ID NO 7 aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Kontroll-Sonden mit zusammenwirkenden Markern eingesetzt werden, die bei benachbarter Hybridisierung an der Kontroll-DNA ein Signal erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine der Kontrollsonden mit einer der bovinen Sonden identisch ist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der DNA-Abschnitt der anderen Kontrollsonde eine Sequenz gemäß SEQ ID NO 8 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15–20, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den DNA-Abschnitten gekoppelten Marker von bovinen Sonden und die von Kontroll-Sonden voneinander differenzierbare Signale erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den DNA-Abschnitten gekoppelten Marker Fluoreszenzfarbstoffe sind.
Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, mit – Reagenzien zur Gewinnung eines DNA-Extrakts aus Proben, und – Reagenzien zur Durchführung einer PCR, insbesondere einer Realtime PCR, enthaltend ein für eine bovine Sequenz spezifisches Primerpaar, eine interne Amplifikationskontrolle sowie mit der bovinen Sequenz und der internen Amplifikationskontrolle hybridisierende Sonden, die jeweils unterschiedliche detektierbare Macker aufweisen.