JP2003164287A - プライマー配列 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
を提供すること。 【解決手段】 ミトコンドリアゲノムのATP合成酵素
サブユニット8遺伝子配列に由来するそれぞれの動物特
異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中のDNAを
鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工
程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含
む、動物種識別方法を提供する。
Description
よびそれに用いるプライマー対配列に関する。詳細に
は、ミトコンドリアゲノムATP合成酵素サブユニット
8遺伝子配列に由来する動物特異的遺伝子配列を増幅す
る工程を含む動物種識別方法、および該増幅工程で使用
されるプライマー対配列に関する。
来する肉骨粉が飼料に添加され、その飼料を与えられた
牛がBSEに罹患し、問題となっている。そして、BS
Eと類似する病気が種々の家畜にも存在する可能性が指
摘されている。そこで、BSEの発生以来、先端技術を
用いた鋭敏な動物種の検出技術の開発が、必要となって
おり、特に行政上の緊急対応事項となっている。
法、ならびに核遺伝子を用いる遺伝子識別手法が用いら
れてきた。免疫学的手法としては、例えば、ELISA
法、イムノブロット法が挙げられる。核遺伝子を用いる
遺伝子識別手法としては、例えば、PCR法が挙げられ
る。しかし、加熱処理されている肉骨粉などは、タンパ
ク質の変性や核酸の断片化が生じている可能性が高いこ
と、および肉骨粉混入飼料には植物由来成分が多く、動
物由来成分について微量分析が必要であることなど、現
在行われている動物種識別方法には、多くの問題点があ
る。このように加熱処理後サンプルについても実施可能
な、感度が高くかつ有効な検出方法の開発が急務であ
る。
あるいは核遺伝子を用いる遺伝子識別手法以外に、微量
混入する動物由来成分の動物種を検出し、同定する方法
が望まれている。特に、家畜あるいはペットに与える飼
料中に、どのような動物の肉あるいは肉骨粉が使用され
ているかを検出することは重要であり、大量に存在する
植物の遺伝子、あるいは他の動物種の遺伝子の中から、
微量存在する特定の動物由来遺伝子のみを検出の対象と
する、感度の高い検出方法が望まれている。
し、核遺伝子と比較してコピー数の多い、ミトコンドリ
アゲノムに着目し、ミトコンドリア遺伝子を動物種識別
の対象にして検討した。その中で、発明者らは、動物ミ
トコンドリアゲノムに存在するATP合成酵素サブユニ
ット8遺伝子(atp8遺伝子)が、植物(イネ)ミト
コンドリアゲノムに存在しないことを明らかにして、植
物系の飼料中の微量の動物遺伝子を検出する材料となり
得ること、およびこの動物ミトコンドリアatp8遺伝
子の特定の配列を利用して動物種を識別できることを見
出し、本発明を完成させた。
ノムのATP合成酵素サブユニット8遺伝子配列に由来
する動物特異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中
のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増
幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する
工程を含む、動物種識別方法を提供する。
であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の
配列番号1の配列と配列表の配列番号2の配列との組み
合わせである。
であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の
配列番号3の配列と配列表の配列番号4の配列との組み
合わせである。
り、より好適には、上記プライマー対は、以下の組み合
わせ:配列表の配列番号7の配列と配列表の配列番号1
1の配列;配列表の配列番号7の配列と配列表の配列番
号10の配列;配列表の配列番号9の配列と配列表の配
列番号11の配列;配列表の配列番号8の配列と配列表
の配列番号10の配列;配列表の配列番号9の配列と配
列表の配列番号10の配列;および、配列表の配列番号
6の配列と配列表の配列番号10の配列;からなる群よ
り選択される組み合わせである。
り、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配列
番号13の配列と配列表の配列番号14の配列との組み
合わせである。
あり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配
列番号17の配列と配列表の配列番号18の配列との組
み合わせである。
り、より好適には、上記プライマー対が、配列表の配列
番号19の配列と配列表の配列番号20の配列との組み
合わせである。
であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の
配列番号23の配列と配列表の配列番号24の配列との
組み合わせである。
肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体
液、乳、肉骨粉、および肉骨粉含有飼料からなる群より
選択される。
と配列表の配列番号2の配列との組み合わせである、哺
乳動物特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
と配列表の配列番号4の配列との組み合わせである、反
芻動物特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
の配列番号7の配列と配列表の配列番号11の配列;配
列表の配列番号7の配列と配列表の配列番号10の配
列;配列表の配列番号9の配列と配列表の配列番号11
の配列;配列表の配列番号8の配列と配列表の配列番号
10の配列;配列表の配列番号9の配列と配列表の配列
番号10の配列;および配列表の配列番号6の配列と配
列表の配列番号10の配列;からなる群より選択される
組み合わせである、ウシ特異的遺伝子配列検出用プライ
マー対を提供する。
列と配列表の配列番号14の配列との組み合わせであ
る、ブタ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
列と配列表の配列番号18の配列との組み合わせであ
る、ヒツジ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供
する。
列と配列表の配列番号20の配列との組み合わせであ
る、ヤギ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
列と配列表の配列番号24の配列との組み合わせであ
る、ニワトリ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提
供する。
物由来の成分を検出する方法を提供し、この方法は、ミ
トコンドリアゲノムのATP合成酵素サブユニット8遺
伝子配列に由来する動物特異的遺伝子配列をプライマー
対とし、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をP
CR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA
断片を検出する工程を含む。
リン酸化(電子伝達系)に必要な酵素類の生合成に必須
であり、ATP合成酵素、シトクロムcオキシダーゼな
どがミトコンドリアDNA上にコードされている。AT
P合成酵素は、いくつかのサブユニットから構成されて
おり、上述のように、発明者らは、ATP合成酵素サブ
ユニット8遺伝子(atp8遺伝子)が、動物ミトコン
ドリアゲノムに存在するが、植物(イネ)ミトコンドリ
アゲノムに存在しないことを見出した。そして、これに
よって、飼料中に植物由来のDNAが大量に存在するに
もかかわらず、動物種を識別できることが可能となっ
た。
ている。例えば、ウシのatp8遺伝子配列(ウシ)を
基準とし、いくつかの動物種におけるatp8遺伝子配
列を、ウシとの相同性が最大となるようにアラインした
ものを、図1に示す。図1においては、1:ウシ、2:
アルパカ、3:ネコ、4:イヌ、5:ヤギ(1)、6:
ヤギ(2)、7:ウマ、8:カモシカ、9:マウス、1
0:ウサギ、11:ラット、12:ロバ、13:ヒツ
ジ、14:シカ、15:マッコウクジラ、および16:
ナガスクジラのatp8遺伝子の遺伝子配列を示す。な
お、図の矢印は、ウシのatp8構造遺伝子の始まりの
位置を示す。
タのatp8遺伝子をアラインしたものを示す。
伝子には遺伝子の多様性がある。この多様性を利用し
て、各種動物における特異的配列を検出することによ
り、各動物種の識別が可能である。
物種に特異的なDNA配列を検出する方法としては、サ
ザンブロット法、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法な
どが挙げられるが、微量のDNA試料でも検出が可能な
点、および精度を向上させる点で、本発明においてはP
CR法が好ましく用いられる。本発明におけるPCR
は、目的の動物種に特異的なDNA配列を含む一対のプ
ライマーを用いて行い、増幅されたDNA断片を検出す
る。
る。まず、atp8遺伝子配列中の目的の動物種に特徴
的な配列を有するいくつかの領域から、プライマーとし
て2箇所を選択し、それぞれのプライマーを合成する。
プライマーは、それぞれ約20ヌクレオチドの長さであ
る。この一対のプライマーを用いて、プライマーに挟ま
れた領域のDNA断片をPCRによって増幅する。次い
で、増幅されたDNA断片を含む試料について電気泳動
を行って、該DNA断片の有無を検出する。
長さのDNA配列であり、公知のデータベースの各種動
物のatp8遺伝子配列のアラインメントに基づいて適
宜選択される。例えば、哺乳動物に特異的な遺伝子の検
出を目的とする場合、哺乳動物間で相同性が高く、か
つ、非哺乳動物とは相同性が低い領域を選択すればよ
く、特定の動物に特異的な遺伝子の検出を目的とする場
合は、その動物に特異的であり、かつ、他の動物とは相
同性の低い領域を選択すればよい。プライマーは、対と
して使用するため、5’側および3’側の2箇所の領域
を選択する。プライマーとして選択可能な領域が2箇所
よりも多い場合は、種々の組み合わせのプライマーを用
い得る。
tp8遺伝子の配列であり、図中に示す記号は、ウシ特
異的遺伝子を検出するためのプライマーとして用い得る
領域(配列)である。また、哺乳動物を特異的に検出す
るための配列(anicon5(配列番号1)およびanicon3
(配列番号2))と、反芻動物を特異的に検出するため
の配列(rumicon5(配列番号3)およびrumicon3(配列
番号4))も図3に併せて示す。詳細は実施例において
記述するが、例えば、5’側のプライマーとしてanicon
5を、3’側のプライマーとしてanicon3を用いると、哺
乳動物特異的な遺伝子配列を検出できる。同様に、rumi
con5とrumicon3とをプライマーとして用いると、反芻動
物特異的な遺伝子配列を検出できる。また、5’側のプ
ライマーとして、cow5(配列番号5)、cow51(配列番
号6)、cow52(配列番号7)、cow53(配列番号8)、
およびcow54(配列番号9)のいずれかを用い、3’側
のプライマーとして、cow3(配列番号10)あるいはco
w31(配列番号11)を用いる。例えば、cow52とcow3
1、cow52とcow3、cow54とcow31、cow53とcow3、cow54と
cow3、およびcow51とcow3の各プライマー対は、ウシ特
異的遺伝子配列を検出できる。
た領域は、それぞれの動物種を特異的に検出するための
実験に用いた配列の例を示す。
配列は、通常用いられる方法によって合成される。一般
的には、DNA自動合成機を用いて支持体上でヌクレオ
チドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断
を行う。次いで、通常用いられる方法(例えば、カラム
クロマトグラフィー)によって精製して、目的のプライ
マーを得ることができる。
品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、肉骨
粉、肉骨粉含有飼料などが挙げられる。試料からのミト
コンドリアDNAの抽出は、例えば、以下のように行
う。約50mg〜500mgの試料(例えば、生肉の場
合50mg、乾燥粉体試料の場合100〜500mg)
を、約10倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕
した後、市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キッ
ト(例えば、和光純薬工業製)を用いて抽出する。この
ようなキットは、組織細胞中のゲノムDNAの混入が少
なく、より高純度のミトコンドリアDNAを回収するも
のであり、遠心分離、沈殿採取などによるDNAの抽
出、濃縮操作などを行う。このようにして、試料中に存
在する大量のゲノムDNAの混入が低いミトコンドリア
DNAを効率的に抽出できる。
が、一般的に、約0.4μMで使用することが好ましい。
プライマー対を用いてPCRを行って、プライマーに挟
まれた領域のDNA断片を増幅する。PCRは、通常行
われる条件で実施され、各プライマー対についてそれぞ
れ適切な条件を設定する。例えば、まず95℃で9分熱変
性した後、変性:92℃、1分;アニーリング:40〜65
℃、2分;伸長:72℃、2分の反応を、30〜60サイクル
繰り返し、最後に72℃、5分反応させてPCRを終了す
る。DNAポリメラーゼとしては、通常AmpliTaqGOLDポ
リメラーゼが用いられる。プライマー対によって増幅さ
れたPCR産物(DNA断片)の大きさは、選択された
プライマー対間の塩基数に応じて変動するが、約120
〜約180bpであり得る。このPCR産物は、次い
で、上記DNA断片を分離できる条件下で、例えば、ア
ガロースゲル電気泳動を行う。
者が通常用いるエチジウムブロマイド染色、蛍光検出、
サザンハイブリダイゼーションなどの検出手段によって
検出され得る。
来のDNAが存在していれば、増幅されたDNA断片が
ゲル上で検出され得る。検出限界は、用いるプライマー
対の種類および組み合わせ、試料の量、PCR条件、検
出方法などの種々のファクターによって異なり得る。適
切な条件を選択すれば、微量の試料においても、高感度
でDNAの存在を検出することができる。例えば、適切
な条件を選択すれば、試料がウシ由来の肉骨粉を含む配
合飼料である場合、特定のウシ特異的なプライマー対を
用いて、0.001重量%の牛肉骨粉の混入でさえも検出す
ることが可能である。
ライマー配列が特定されて示されているが、本発明はそ
の例に限定されることを意図していない。そのプライマ
ー配列を含み、あるいはその配列において1または2以
上の塩基配列の置換を含み、ハイブリダイズの条件を変
えることによって、目的のDNAとハイブリダイズし
得、特定の動物種を特異的に検出し得る配列もまた、本
発明の範囲に含まれることはいうまでもない。
各種動物のatp8遺伝子配列のアラインメントに基づ
いて、以下の各実施例または比較例に用いるプライマー
領域を選択した。選択した領域のDNA配列を、DNA
自動合成機を用いて合成した。
異的検出)肉牛、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウ
サギ、クジラ、ニワトリ、タラ、サケ、イワシ、カニ、
エビ、およびアサリの15種類の肉試料から、ミトコン
ドリアDNAを以下のように調製した。各肉試料を10
倍量の緩衝液(10mM Tris-HCl, pH 7.5、20mM EDTA, pH
7.5)に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組
織細胞ミトコンドリアDNA抽出キット(和光純薬工業
製)を用いてDNAを抽出した。
5(配列番号1)とanicon3(配列番号2)とを、それぞ
れ5’側および3’側プライマーとして用いて、PCR
を行った。PCRの条件は以下の通りである:反応緩衝
液(10mM Tris-HCl, pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、
0.001%(W/V)ゼラチン);95℃で9分熱変性した後、変
性:92℃、1分;アニーリング:50℃、2分;伸長:72
℃、2分の反応を45サイクル繰り返し、最後に72℃、
5分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動
を行い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(D
NA断片)を検出した。結果を図4に示す。図中のMは
分子量マーカーである。
番号1)およびanicon3(配列番号2)をプライマーと
して用いて、それぞれの動物由来のDNAを鋳型とする
PCRにより、哺乳動物においてのみ、増幅されたDN
A断片の生成が認められた(矢印のバンド位置)。すな
わち、anicon5(配列番号1)およびanicon3(配列番号
2)をプライマー対とすることにより、種々の動物肉試
料の中から、哺乳動物由来のDNAのみを特異的に検出
できることが示された。したがって、anicon5(配列番
号1)とanicon3(配列番号2)との組み合わせは、哺
乳動物に属する動物種を特異的に検出するプライマー対
である。図3に、哺乳動物検出のためのプライマーとし
て用い得る領域を示した。
異的検出)実施例1と同様に調製した15種類のDNA
試料を鋳型とし、rumicon5(配列番号3)とrumicon3
(配列番号4)とを、それぞれ5’側および3’側プラ
イマーとして用いて、PCRを行った。PCRの条件は
以下の通りである:95℃で9分熱変性した後、変性:92
℃、1分;アニーリング:45℃、2分;伸長:72℃、2
分の反応を、45サイクル繰り返し、最後に72℃、5分
反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行
い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(DNA
断片)を検出した。結果を図5に示す。
micon3(配列番号4)をプライマーとして用いて、それ
ぞれの動物由来のDNAを鋳型とするPCRにより、反
芻動物である肉牛、乳牛、ヒツジ、およびヤギに由来す
るDNA断片が生成することが認められた(矢印のバン
ド位置)。一方、反芻動物に属さない動物のDNAから
は、PCR産物(DNA断片)は検出できなかった。す
なわち、rumicon5およびrumicon3をプライマー対とする
ことにより、種々の動物肉試料の中から、反芻動物由来
のDNAのみを特異的に検出できることが示された。し
たがって、rumicon5(配列番号3)とrumicon3(配列番
号4)との組み合わせは、反芻動物由来の動物種を特異
的に検出するプライマー対である。図3に、反芻動物検
出のためにプライマーとして用い得る領域を示した。
は、gとaとのミックスであり、kはgとtとのミック
スである。すなわち、rumicon5(配列番号3)は混合プ
ライマーであるが、それぞれが単独で使用され得ること
は当業者に明白である。
検出)表1に記載の種々のプライマー対を用いて、ウシ
由来DNA配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、
ヤギ、ブタおよびニワトリの肉から調製したDNAを鋳
型として、アニーリングの条件を表1の条件とした以外
は、実施例1と同条件でPCRを行った。結果を図6〜
8に示す。
およびcow3(配列番号10)をプライマー対として用い
た場合に、ウシ由来の肉から得られるPCR産物(DN
A断片)と同じ大きさのDNA断片が、ヒツジ、ヤギ、
ブタおよびニワトリのDNAを鋳型とした場合には生じ
なかったことを示す。図7のcow52とcow3との組み合わ
せ、および図8のcow52とcow31との組み合わせは、他の
動物種で類似するDNA断片が検出されていない点で、
特にウシ特異的検出に適切なプライマー対であることが
わかる。一方、図7に示すように、cow5(配列番号5)
およびcow31(配列番号11)のプライマー対を用いた
場合に、ヒツジにおいて、わずかにウシのDNAを鋳型
として得られるDNA断片と同じ大きさのバンドが見ら
れた。同様に、図8では、cow51(配列番号6)およびc
ow31(配列番号11)のプライマー対、ならびにcow53
(配列番号8)およびcow31(配列番号11)のプライ
マー対を用いた場合にも、ウシのDNAを鋳型として得
られるDNA断片と同じ大きさのバンドが見られた。し
たがって、これらのプライマー対は、ウシ特異的な検出
をするには、適切な組み合わせではない。
検出)表2に記載の種々のプライマー対を用いて、ブタ
由来DNA配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、
ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製したDNAを
鋳型として、アニーリングの温度を表2の温度に変えた
以外は、実施例1と同条件でPCRを行った。
14)とをプライマー対として用いた結果を図9に示
す。図9から明らかなように、ブタ肉由来試料において
のみ、DNA断片を検出した(矢印のバンド位置)。し
たがって、このプライマー対は、ブタ由来DNA配列の
特異的検出に有用である。なお、図に示していないが、
pig5(配列番号12)とpig3(配列番号14);pig5
(配列番号12)とpig31(配列番号15);pig5(配
列番号12)とpig32(配列番号16);pig51(配列番
号13)とpig31(配列番号15);pig51(配列番号1
3)とpig32(配列番号16)との組み合わせは、いず
れも特異的検出には適切ではなかった。
的検出)sheep5(配列番号17)とsheep3(配列番号1
8)とを、それぞれ5’側および3’側プライマーとし
て、ヒツジ由来DNA配列の特異的検出を試みた。ウ
シ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製
したDNAを鋳型として、アニーリングの条件を46℃、
2分とした以外は、実施例1と同条件でPCRを行っ
た。結果を図10に示す。
p3(配列番号18)とをプライマー対として用いること
により、ヒツジ由来DNA配列の特異的検出が可能とな
ることが示された。
検出)goat5(配列番号19)とgoat3(配列番号20)
とを、それぞれ5’側および3’側プライマーとして用
いて、ヤギ由来DNA配列の特異的検出を試みた。ウ
シ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製
したDNAを鋳型として、アニーリングの条件を46℃、
2分とした以外は、実施例1と同条件でPCRを行っ
た。結果を図10に示す。
(配列番号20)とをプライマー対として用いることに
より、ヤギ由来DNA配列の特異的検出が可能となるこ
とが示された。
(配列番号21)とをプライマー対とし、アニーリング
の条件を54℃、2分とした以外は、上記と同様にPCR
を行ったところ、ヤギ由来DNA配列の特異的検出には
適切ではなかった(図示せず)。
異的検出)表3に記載の種々のプライマー対を、それぞ
れ5’側および3’側プライマーとして用いて、ニワト
リ由来DNA配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツ
ジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製したDN
Aを鋳型として、アニーリングの条件を表3に記載の条
件とした以外は、実施例1と同条件でPCRを行った。
chick5(配列番号22)とchick3(配列番号24)とを
プライマー対として用いた場合の結果を図11に示す。
番号22)とchick3(配列番号24)とをプライマー対
として用いることにより、ニワトリ由来DNA配列の特
異的検出が可能である(矢印のバンド位置)。
番号24)、chick5(配列番号22)とchick31(配列
番号25)、およびchick51(配列番号23)とchick31
(配列番号25)の、それぞれのプライマー対を用いた
ときは、ニワトリ由来DNA配列の特異的検出には適切
ではなかった(図示せず)。
NA配列の検出)家畜用配合飼料(主成分:トウモロコ
シ、マイロ、グルテンフィード、ふすま、米ぬか、大豆
油かす、なたね油かす)に所定の割合でウシ由来の肉骨
粉(オーストラリア産)を混合した。得られた飼料を5
00mgとり、上記実施例1と同様に10倍量の緩衝液
に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞
ミトコンドリアDNA抽出キット(和光純薬工業製)を
用いてミトコンドリアDNAを抽出した。このDNAを
鋳型として、実施例1で用いた哺乳動物由来DNA配列
を特異的に検出するプライマー対であるanicon5(配列
番号1)とanicon3(配列番号2)とを用いて、実施例
1と同じ条件でPCRを行った。結果を図12に示す。
肉骨粉が0.01重量%含まれている場合でも、哺乳動
物由来のDNA配列を検出できることが判明した。
NA配列の検出)実施例8と同様に配合飼料から抽出し
たDNAを鋳型として、実施例2で用いた反芻動物由来
のDNA配列を特異的に検出するrumicon5(配列番号
3)およびrumicon3(配列番号4)のプライマー対を用
いて、実施例2と同様の条件でPCRを行った。結果を
図13に示す。肉骨粉が0.1〜1重量%含まれている
場合でも、反芻動物由来のDNA配列を検出できること
が判明した。
A配列の検出)実施例8と同様に配合飼料から抽出した
DNAを鋳型として、実施例3で用いたウシ特異的プラ
イマー対であるcow52(配列番号7)およびcow31(配列
番号11)を用いて、実施例3と同様の条件でPCRを
行った。結果を図14に示す。肉骨粉がわずか0.00
1重量%しか含まれていない場合でも、ウシ由来のDN
A配列を検出できることが判明した。
の動物由来DNA配列を高感度で検出することができ
る。そのため、例えば、飼料中にわずかに混入された肉
骨粉の動物種の識別も可能である。特に、家畜用配合飼
料に微量のウシ肉骨粉が混入している場合も検出可能で
ある。
の配列アラインメントを示す図である。
atp8遺伝子の配列アラインメントを示す図である。
用いたプライマーの、ミトコンドリアatp8遺伝子上
での位置関係を示す図である。
icon5およびanicon3)を用いて、各種動物由来のDNA
を鋳型とするPCRを行った後の電気泳動の結果を示す
写真である。
micon5およびrumicon3)を用いて、各種動物由来のDN
Aを鋳型とするPCRを行った後の電気泳動の結果を示
す写真である。
よびcow51)を用いて、各種動物由来のDNAを鋳型と
するPCRを行った後の電気泳動の結果を示す写真であ
る。
用いて、各種動物由来のDNAを鋳型とするPCRを行
った後の電気泳動の結果を示す写真である。
用いて、各種動物由来のDNAを鋳型とするPCRを行
った後の電気泳動の結果を示す写真である。
およびpig3)を用いて、各種動物由来のDNAを鋳型と
するPCRを行った後の電気泳動の結果を示す写真であ
る。
eep5およびsheep3)およびヤギ特異的配列を有するプラ
イマー対(goat5およびgoat3)を用いて、各種動物由来
のDNAを鋳型とするPCRを行った後の電気泳動の結
果を示す写真である。
用いて、各種動物由来のDNAを鋳型とするPCRを行
った後の電気泳動の結果を示す写真である。
乳動物特異的プライマー対によるDNA検出の結果を示
す電気泳動写真である。
芻動物特異的プライマー対によるDNA検出の結果を示
す電気泳動写真である。
シ特異的プライマー対によるDNA検出の結果を示す電
気泳動写真である。
Claims (24)
- 【請求項1】 ミトコンドリアゲノムのATP合成酵素
サブユニット8遺伝子配列に由来する動物特異的遺伝子
配列をプライマー対とし、試料中のDNAを鋳型とし
て、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および
該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、動物種
識別方法。 - 【請求項2】 前記動物が哺乳動物である、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項3】 前記プライマー対が、配列表の配列番号
1の配列と配列表の配列番号2の配列との組み合わせで
ある、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記動物が反芻動物である、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項5】 前記プライマー対が、配列表の配列番号
3の配列と配列表の配列番号4の配列との組み合わせで
ある、請求項4に記載の方法。 - 【請求項6】 前記動物がウシである、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項7】 前記プライマー対が、以下の組み合わ
せ:配列表の配列番号7の配列と配列表の配列番号11
の配列;配列表の配列番号7の配列と配列表の配列番号
10の配列;配列表の配列番号9の配列と配列表の配列
番号11の配列;配列表の配列番号8の配列と配列表の
配列番号10の配列;配列表の配列番号9の配列と配列
表の配列番号10の配列;および、配列表の配列番号6
の配列と配列表の配列番号10の配列;からなる群より
選択される組み合わせである、請求項6に記載の方法。 - 【請求項8】 前記動物がブタである、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項9】 前記プライマー対が、配列表の配列番号
13の配列と配列表の配列番号14の配列との組み合わ
せである、請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 前記動物がヒツジである、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項11】 前記プライマー対が、配列表の配列番
号17の配列と配列表の配列番号18の配列との組み合
わせである、請求項10に記載の方法。 - 【請求項12】 前記動物がヤギである、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項13】 前記プライマー対が、配列表の配列番
号19の配列と配列表の配列番号20の配列との組み合
わせである、請求項12に記載の方法。 - 【請求項14】 前記動物がニワトリである、請求項1
に記載の方法。 - 【請求項15】 前記プライマー対が、配列表の配列番
号23の配列と配列表の配列番号24の配列との組み合
わせである、請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 前記試料が、生肉、肉加工食品、肉加
工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、肉骨粉、および
肉骨粉含有飼料からなる群より選択される、請求項1か
ら15のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項17】 配列表の配列番号1の配列と配列表の
配列番号2の配列との組み合わせである、哺乳動物特異
的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項18】 配列表の配列番号3の配列と配列表の
配列番号4の配列との組み合わせである、反芻動物特異
的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項19】 以下の組み合わせ:配列表の配列番号
7の配列と配列表の配列番号11の配列;配列表の配列
番号7の配列と配列表の配列番号10の配列;配列表の
配列番号9の配列と配列表の配列番号11の配列;配列
表の配列番号8の配列と配列表の配列番号10の配列;
配列表の配列番号9の配列と配列表の配列番号10の配
列;および配列表の配列番号6の配列と配列表の配列番
号10の配列;からなる群より選択される組み合わせで
ある、ウシ特異的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項20】 配列表の配列番号13の配列と配列表
の配列番号14の配列との組み合わせである、ブタ特異
的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項21】 配列表の配列番号17の配列と配列表
の配列番号18の配列との組み合わせである、ヒツジ特
異的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項22】 配列表の配列番号19の配列と配列表
の配列番号20の配列との組み合わせである、ヤギ特異
的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項23】 配列表の配列番号23の配列と配列表
の配列番号24の配列との組み合わせである、ニワトリ
特異的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項24】 配合飼料中に含まれる動物由来の成分
を検出する方法であって、ミトコンドリアゲノムのAT
P合成酵素サブユニット8遺伝子配列に由来する動物特
異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中のDNAを
鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工
程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含
む、方法。
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