JP2003164287A - プライマー配列 - Google Patents
プライマー配列Info
- Publication number
- JP2003164287A JP2003164287A JP2001366120A JP2001366120A JP2003164287A JP 2003164287 A JP2003164287 A JP 2003164287A JP 2001366120 A JP2001366120 A JP 2001366120A JP 2001366120 A JP2001366120 A JP 2001366120A JP 2003164287 A JP2003164287 A JP 2003164287A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- sequence listing
- listing
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 47
- 235000019735 Meat-and-bone meal Nutrition 0.000 claims description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 19
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 18
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 claims description 17
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 15
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 15
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 235000020991 processed meat Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000020995 raw meat Nutrition 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 3
- -1 body hair Substances 0.000 claims description 3
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 abstract description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 40
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 18
- 101150030949 atp8 gene Proteins 0.000 description 17
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 16
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 6
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 6
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 101150086947 MT-ATP8 gene Proteins 0.000 description 4
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 4
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000002374 bone meal Substances 0.000 description 2
- 229940036811 bone meal Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000283081 Balaenoptera physalus Species 0.000 description 1
- 241000237519 Bivalvia Species 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 241000555825 Clupeidae Species 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108090000365 Cytochrome-c oxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000276438 Gadus morhua Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 241000283222 Physeter catodon Species 0.000 description 1
- 235000019779 Rapeseed Meal Nutrition 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000020639 clam Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019516 cod Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000004456 rapeseed meal Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 235000019512 sardine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004454 trace mineral analysis Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 動物由来ＤＮＡ配列を特異的に検出する方法
を提供すること。 【解決手段】 ミトコンドリアゲノムのＡＴＰ合成酵素
サブユニット８遺伝子配列に由来するそれぞれの動物特
異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中のＤＮＡを
鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工
程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含
む、動物種識別方法を提供する。
を提供すること。 【解決手段】 ミトコンドリアゲノムのＡＴＰ合成酵素
サブユニット８遺伝子配列に由来するそれぞれの動物特
異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中のＤＮＡを
鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工
程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含
む、動物種識別方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物種識別方法お
よびそれに用いるプライマー対配列に関する。詳細に
は、ミトコンドリアゲノムＡＴＰ合成酵素サブユニット
８遺伝子配列に由来する動物特異的遺伝子配列を増幅す
る工程を含む動物種識別方法、および該増幅工程で使用
されるプライマー対配列に関する。
よびそれに用いるプライマー対配列に関する。詳細に
は、ミトコンドリアゲノムＡＴＰ合成酵素サブユニット
８遺伝子配列に由来する動物特異的遺伝子配列を増幅す
る工程を含む動物種識別方法、および該増幅工程で使用
されるプライマー対配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の牛に由
来する肉骨粉が飼料に添加され、その飼料を与えられた
牛がＢＳＥに罹患し、問題となっている。そして、ＢＳ
Ｅと類似する病気が種々の家畜にも存在する可能性が指
摘されている。そこで、ＢＳＥの発生以来、先端技術を
用いた鋭敏な動物種の検出技術の開発が、必要となって
おり、特に行政上の緊急対応事項となっている。
来する肉骨粉が飼料に添加され、その飼料を与えられた
牛がＢＳＥに罹患し、問題となっている。そして、ＢＳ
Ｅと類似する病気が種々の家畜にも存在する可能性が指
摘されている。そこで、ＢＳＥの発生以来、先端技術を
用いた鋭敏な動物種の検出技術の開発が、必要となって
おり、特に行政上の緊急対応事項となっている。
【０００３】動物種識別については、従来、免疫学的手
法、ならびに核遺伝子を用いる遺伝子識別手法が用いら
れてきた。免疫学的手法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ
法、イムノブロット法が挙げられる。核遺伝子を用いる
遺伝子識別手法としては、例えば、ＰＣＲ法が挙げられ
る。しかし、加熱処理されている肉骨粉などは、タンパ
ク質の変性や核酸の断片化が生じている可能性が高いこ
と、および肉骨粉混入飼料には植物由来成分が多く、動
物由来成分について微量分析が必要であることなど、現
在行われている動物種識別方法には、多くの問題点があ
る。このように加熱処理後サンプルについても実施可能
な、感度が高くかつ有効な検出方法の開発が急務であ
る。
法、ならびに核遺伝子を用いる遺伝子識別手法が用いら
れてきた。免疫学的手法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ
法、イムノブロット法が挙げられる。核遺伝子を用いる
遺伝子識別手法としては、例えば、ＰＣＲ法が挙げられ
る。しかし、加熱処理されている肉骨粉などは、タンパ
ク質の変性や核酸の断片化が生じている可能性が高いこ
と、および肉骨粉混入飼料には植物由来成分が多く、動
物由来成分について微量分析が必要であることなど、現
在行われている動物種識別方法には、多くの問題点があ
る。このように加熱処理後サンプルについても実施可能
な、感度が高くかつ有効な検出方法の開発が急務であ
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、免疫学的手法
あるいは核遺伝子を用いる遺伝子識別手法以外に、微量
混入する動物由来成分の動物種を検出し、同定する方法
が望まれている。特に、家畜あるいはペットに与える飼
料中に、どのような動物の肉あるいは肉骨粉が使用され
ているかを検出することは重要であり、大量に存在する
植物の遺伝子、あるいは他の動物種の遺伝子の中から、
微量存在する特定の動物由来遺伝子のみを検出の対象と
する、感度の高い検出方法が望まれている。
あるいは核遺伝子を用いる遺伝子識別手法以外に、微量
混入する動物由来成分の動物種を検出し、同定する方法
が望まれている。特に、家畜あるいはペットに与える飼
料中に、どのような動物の肉あるいは肉骨粉が使用され
ているかを検出することは重要であり、大量に存在する
植物の遺伝子、あるいは他の動物種の遺伝子の中から、
微量存在する特定の動物由来遺伝子のみを検出の対象と
する、感度の高い検出方法が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】発明者らは、母性遺伝
し、核遺伝子と比較してコピー数の多い、ミトコンドリ
アゲノムに着目し、ミトコンドリア遺伝子を動物種識別
の対象にして検討した。その中で、発明者らは、動物ミ
トコンドリアゲノムに存在するＡＴＰ合成酵素サブユニ
ット８遺伝子（ａｔｐ８遺伝子）が、植物（イネ）ミト
コンドリアゲノムに存在しないことを明らかにして、植
物系の飼料中の微量の動物遺伝子を検出する材料となり
得ること、およびこの動物ミトコンドリアａｔｐ８遺伝
子の特定の配列を利用して動物種を識別できることを見
出し、本発明を完成させた。
し、核遺伝子と比較してコピー数の多い、ミトコンドリ
アゲノムに着目し、ミトコンドリア遺伝子を動物種識別
の対象にして検討した。その中で、発明者らは、動物ミ
トコンドリアゲノムに存在するＡＴＰ合成酵素サブユニ
ット８遺伝子（ａｔｐ８遺伝子）が、植物（イネ）ミト
コンドリアゲノムに存在しないことを明らかにして、植
物系の飼料中の微量の動物遺伝子を検出する材料となり
得ること、およびこの動物ミトコンドリアａｔｐ８遺伝
子の特定の配列を利用して動物種を識別できることを見
出し、本発明を完成させた。
【０００６】したがって、本発明は、ミトコンドリアゲ
ノムのＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子配列に由来
する動物特異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中
のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増
幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する
工程を含む、動物種識別方法を提供する。
ノムのＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺伝子配列に由来
する動物特異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中
のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増
幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する
工程を含む、動物種識別方法を提供する。
【０００７】好適な実施態様では、上記動物は哺乳動物
であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の
配列番号１の配列と配列表の配列番号２の配列との組み
合わせである。
であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の
配列番号１の配列と配列表の配列番号２の配列との組み
合わせである。
【０００８】好適な実施態様では、上記動物は反芻動物
であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の
配列番号３の配列と配列表の配列番号４の配列との組み
合わせである。
であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の
配列番号３の配列と配列表の配列番号４の配列との組み
合わせである。
【０００９】好適な実施態様では、上記動物はウシであ
り、より好適には、上記プライマー対は、以下の組み合
わせ：配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１
１の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番
号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配
列番号１１の配列；配列表の配列番号８の配列と配列表
の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配
列表の配列番号１０の配列；および、配列表の配列番号
６の配列と配列表の配列番号１０の配列；からなる群よ
り選択される組み合わせである。
り、より好適には、上記プライマー対は、以下の組み合
わせ：配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１
１の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番
号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配
列番号１１の配列；配列表の配列番号８の配列と配列表
の配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配
列表の配列番号１０の配列；および、配列表の配列番号
６の配列と配列表の配列番号１０の配列；からなる群よ
り選択される組み合わせである。
【００１０】好適な実施態様では、上記動物はブタであ
り、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配列
番号１３の配列と配列表の配列番号１４の配列との組み
合わせである。
り、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配列
番号１３の配列と配列表の配列番号１４の配列との組み
合わせである。
【００１１】好適な実施態様では、上記動物はヒツジで
あり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配
列番号１７の配列と配列表の配列番号１８の配列との組
み合わせである。
あり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の配
列番号１７の配列と配列表の配列番号１８の配列との組
み合わせである。
【００１２】好適な実施態様では、上記動物はヤギであ
り、より好適には、上記プライマー対が、配列表の配列
番号１９の配列と配列表の配列番号２０の配列との組み
合わせである。
り、より好適には、上記プライマー対が、配列表の配列
番号１９の配列と配列表の配列番号２０の配列との組み
合わせである。
【００１３】好適な実施態様では、上記動物はニワトリ
であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の
配列番号２３の配列と配列表の配列番号２４の配列との
組み合わせである。
であり、より好適には、上記プライマー対は、配列表の
配列番号２３の配列と配列表の配列番号２４の配列との
組み合わせである。
【００１４】別の好適な実施態様では、上記試料は、生
肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体
液、乳、肉骨粉、および肉骨粉含有飼料からなる群より
選択される。
肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体
液、乳、肉骨粉、および肉骨粉含有飼料からなる群より
選択される。
【００１５】本発明はまた、配列表の配列番号１の配列
と配列表の配列番号２の配列との組み合わせである、哺
乳動物特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
と配列表の配列番号２の配列との組み合わせである、哺
乳動物特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
【００１６】本発明はまた、配列表の配列番号３の配列
と配列表の配列番号４の配列との組み合わせである、反
芻動物特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
と配列表の配列番号４の配列との組み合わせである、反
芻動物特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
【００１７】本発明はまた、以下の組み合わせ：配列表
の配列番号７の配列と配列表の配列番号１１の配列；配
列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１０の配
列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１１
の配列；配列表の配列番号８の配列と配列表の配列番号
１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列
番号１０の配列；および配列表の配列番号６の配列と配
列表の配列番号１０の配列；からなる群より選択される
組み合わせである、ウシ特異的遺伝子配列検出用プライ
マー対を提供する。
の配列番号７の配列と配列表の配列番号１１の配列；配
列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１０の配
列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１１
の配列；配列表の配列番号８の配列と配列表の配列番号
１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列
番号１０の配列；および配列表の配列番号６の配列と配
列表の配列番号１０の配列；からなる群より選択される
組み合わせである、ウシ特異的遺伝子配列検出用プライ
マー対を提供する。
【００１８】本発明はまた、配列表の配列番号１３の配
列と配列表の配列番号１４の配列との組み合わせであ
る、ブタ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
列と配列表の配列番号１４の配列との組み合わせであ
る、ブタ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
【００１９】本発明はまた、配列表の配列番号１７の配
列と配列表の配列番号１８の配列との組み合わせであ
る、ヒツジ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供
する。
列と配列表の配列番号１８の配列との組み合わせであ
る、ヒツジ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供
する。
【００２０】本発明はまた、配列表の配列番号１９の配
列と配列表の配列番号２０の配列との組み合わせであ
る、ヤギ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
列と配列表の配列番号２０の配列との組み合わせであ
る、ヤギ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提供す
る。
【００２１】本発明はまた、配列表の配列番号２３の配
列と配列表の配列番号２４の配列との組み合わせであ
る、ニワトリ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提
供する。
列と配列表の配列番号２４の配列との組み合わせであ
る、ニワトリ特異的遺伝子配列検出用プライマー対を提
供する。
【００２２】本発明はさらに、配合飼料中に含まれる動
物由来の成分を検出する方法を提供し、この方法は、ミ
トコンドリアゲノムのＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺
伝子配列に由来する動物特異的遺伝子配列をプライマー
対とし、試料中のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰ
ＣＲ法により増幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ
断片を検出する工程を含む。
物由来の成分を検出する方法を提供し、この方法は、ミ
トコンドリアゲノムのＡＴＰ合成酵素サブユニット８遺
伝子配列に由来する動物特異的遺伝子配列をプライマー
対とし、試料中のＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰ
ＣＲ法により増幅する工程、および該増幅されたＤＮＡ
断片を検出する工程を含む。
【００２３】
【発明の実施の形態】ミトコンドリアゲノムは、酸化的
リン酸化（電子伝達系）に必要な酵素類の生合成に必須
であり、ＡＴＰ合成酵素、シトクロムｃオキシダーゼな
どがミトコンドリアＤＮＡ上にコードされている。ＡＴ
Ｐ合成酵素は、いくつかのサブユニットから構成されて
おり、上述のように、発明者らは、ＡＴＰ合成酵素サブ
ユニット８遺伝子（ａｔｐ８遺伝子）が、動物ミトコン
ドリアゲノムに存在するが、植物（イネ）ミトコンドリ
アゲノムに存在しないことを見出した。そして、これに
よって、飼料中に植物由来のＤＮＡが大量に存在するに
もかかわらず、動物種を識別できることが可能となっ
た。
リン酸化（電子伝達系）に必要な酵素類の生合成に必須
であり、ＡＴＰ合成酵素、シトクロムｃオキシダーゼな
どがミトコンドリアＤＮＡ上にコードされている。ＡＴ
Ｐ合成酵素は、いくつかのサブユニットから構成されて
おり、上述のように、発明者らは、ＡＴＰ合成酵素サブ
ユニット８遺伝子（ａｔｐ８遺伝子）が、動物ミトコン
ドリアゲノムに存在するが、植物（イネ）ミトコンドリ
アゲノムに存在しないことを見出した。そして、これに
よって、飼料中に植物由来のＤＮＡが大量に存在するに
もかかわらず、動物種を識別できることが可能となっ
た。
【００２４】動物のａｔｐ８遺伝子は、いくつか知られ
ている。例えば、ウシのａｔｐ８遺伝子配列（ウシ）を
基準とし、いくつかの動物種におけるａｔｐ８遺伝子配
列を、ウシとの相同性が最大となるようにアラインした
ものを、図１に示す。図１においては、１：ウシ、２：
アルパカ、３：ネコ、４：イヌ、５：ヤギ（１）、６：
ヤギ（２）、７：ウマ、８：カモシカ、９：マウス、１
０：ウサギ、１１：ラット、１２：ロバ、１３：ヒツ
ジ、１４：シカ、１５：マッコウクジラ、および１６：
ナガスクジラのａｔｐ８遺伝子の遺伝子配列を示す。な
お、図の矢印は、ウシのａｔｐ８構造遺伝子の始まりの
位置を示す。
ている。例えば、ウシのａｔｐ８遺伝子配列（ウシ）を
基準とし、いくつかの動物種におけるａｔｐ８遺伝子配
列を、ウシとの相同性が最大となるようにアラインした
ものを、図１に示す。図１においては、１：ウシ、２：
アルパカ、３：ネコ、４：イヌ、５：ヤギ（１）、６：
ヤギ（２）、７：ウマ、８：カモシカ、９：マウス、１
０：ウサギ、１１：ラット、１２：ロバ、１３：ヒツ
ジ、１４：シカ、１５：マッコウクジラ、および１６：
ナガスクジラのａｔｐ８遺伝子の遺伝子配列を示す。な
お、図の矢印は、ウシのａｔｐ８構造遺伝子の始まりの
位置を示す。
【００２５】また、図２は、ウシ、ニワトリ、およびブ
タのａｔｐ８遺伝子をアラインしたものを示す。
タのａｔｐ８遺伝子をアラインしたものを示す。
【００２６】図１および図２に示すように、ａｔｐ８遺
伝子には遺伝子の多様性がある。この多様性を利用し
て、各種動物における特異的配列を検出することによ
り、各動物種の識別が可能である。
伝子には遺伝子の多様性がある。この多様性を利用し
て、各種動物における特異的配列を検出することによ
り、各動物種の識別が可能である。
【００２７】各種動物を識別するために、それぞれの動
物種に特異的なＤＮＡ配列を検出する方法としては、サ
ザンブロット法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法な
どが挙げられるが、微量のＤＮＡ試料でも検出が可能な
点、および精度を向上させる点で、本発明においてはＰ
ＣＲ法が好ましく用いられる。本発明におけるＰＣＲ
は、目的の動物種に特異的なＤＮＡ配列を含む一対のプ
ライマーを用いて行い、増幅されたＤＮＡ断片を検出す
る。
物種に特異的なＤＮＡ配列を検出する方法としては、サ
ザンブロット法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法な
どが挙げられるが、微量のＤＮＡ試料でも検出が可能な
点、および精度を向上させる点で、本発明においてはＰ
ＣＲ法が好ましく用いられる。本発明におけるＰＣＲ
は、目的の動物種に特異的なＤＮＡ配列を含む一対のプ
ライマーを用いて行い、増幅されたＤＮＡ断片を検出す
る。
【００２８】ＰＣＲ法は、例えば、以下のように行われ
る。まず、ａｔｐ８遺伝子配列中の目的の動物種に特徴
的な配列を有するいくつかの領域から、プライマーとし
て２箇所を選択し、それぞれのプライマーを合成する。
プライマーは、それぞれ約２０ヌクレオチドの長さであ
る。この一対のプライマーを用いて、プライマーに挟ま
れた領域のＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅する。次い
で、増幅されたＤＮＡ断片を含む試料について電気泳動
を行って、該ＤＮＡ断片の有無を検出する。
る。まず、ａｔｐ８遺伝子配列中の目的の動物種に特徴
的な配列を有するいくつかの領域から、プライマーとし
て２箇所を選択し、それぞれのプライマーを合成する。
プライマーは、それぞれ約２０ヌクレオチドの長さであ
る。この一対のプライマーを用いて、プライマーに挟ま
れた領域のＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅する。次い
で、増幅されたＤＮＡ断片を含む試料について電気泳動
を行って、該ＤＮＡ断片の有無を検出する。
【００２９】プライマーは、任意の約２０ヌクレオチド
長さのＤＮＡ配列であり、公知のデータベースの各種動
物のａｔｐ８遺伝子配列のアラインメントに基づいて適
宜選択される。例えば、哺乳動物に特異的な遺伝子の検
出を目的とする場合、哺乳動物間で相同性が高く、か
つ、非哺乳動物とは相同性が低い領域を選択すればよ
く、特定の動物に特異的な遺伝子の検出を目的とする場
合は、その動物に特異的であり、かつ、他の動物とは相
同性の低い領域を選択すればよい。プライマーは、対と
して使用するため、５’側および３’側の２箇所の領域
を選択する。プライマーとして選択可能な領域が２箇所
よりも多い場合は、種々の組み合わせのプライマーを用
い得る。
長さのＤＮＡ配列であり、公知のデータベースの各種動
物のａｔｐ８遺伝子配列のアラインメントに基づいて適
宜選択される。例えば、哺乳動物に特異的な遺伝子の検
出を目的とする場合、哺乳動物間で相同性が高く、か
つ、非哺乳動物とは相同性が低い領域を選択すればよ
く、特定の動物に特異的な遺伝子の検出を目的とする場
合は、その動物に特異的であり、かつ、他の動物とは相
同性の低い領域を選択すればよい。プライマーは、対と
して使用するため、５’側および３’側の２箇所の領域
を選択する。プライマーとして選択可能な領域が２箇所
よりも多い場合は、種々の組み合わせのプライマーを用
い得る。
【００３０】例えば、図３は、ウシのミトコンドリアａ
ｔｐ８遺伝子の配列であり、図中に示す記号は、ウシ特
異的遺伝子を検出するためのプライマーとして用い得る
領域（配列）である。また、哺乳動物を特異的に検出す
るための配列（anicon5（配列番号１）およびanicon3
（配列番号２））と、反芻動物を特異的に検出するため
の配列（rumicon5（配列番号３）およびrumicon3（配列
番号４））も図３に併せて示す。詳細は実施例において
記述するが、例えば、５’側のプライマーとしてanicon
5を、３’側のプライマーとしてanicon3を用いると、哺
乳動物特異的な遺伝子配列を検出できる。同様に、rumi
con5とrumicon3とをプライマーとして用いると、反芻動
物特異的な遺伝子配列を検出できる。また、５’側のプ
ライマーとして、cow5（配列番号５）、cow51（配列番
号６）、cow52（配列番号７）、cow53（配列番号８）、
およびcow54（配列番号９）のいずれかを用い、３’側
のプライマーとして、cow3（配列番号１０）あるいはco
w31（配列番号１１）を用いる。例えば、cow52とcow3
1、cow52とcow3、cow54とcow31、cow53とcow3、cow54と
cow3、およびcow51とcow3の各プライマー対は、ウシ特
異的遺伝子配列を検出できる。
ｔｐ８遺伝子の配列であり、図中に示す記号は、ウシ特
異的遺伝子を検出するためのプライマーとして用い得る
領域（配列）である。また、哺乳動物を特異的に検出す
るための配列（anicon5（配列番号１）およびanicon3
（配列番号２））と、反芻動物を特異的に検出するため
の配列（rumicon5（配列番号３）およびrumicon3（配列
番号４））も図３に併せて示す。詳細は実施例において
記述するが、例えば、５’側のプライマーとしてanicon
5を、３’側のプライマーとしてanicon3を用いると、哺
乳動物特異的な遺伝子配列を検出できる。同様に、rumi
con5とrumicon3とをプライマーとして用いると、反芻動
物特異的な遺伝子配列を検出できる。また、５’側のプ
ライマーとして、cow5（配列番号５）、cow51（配列番
号６）、cow52（配列番号７）、cow53（配列番号８）、
およびcow54（配列番号９）のいずれかを用い、３’側
のプライマーとして、cow3（配列番号１０）あるいはco
w31（配列番号１１）を用いる。例えば、cow52とcow3
1、cow52とcow3、cow54とcow31、cow53とcow3、cow54と
cow3、およびcow51とcow3の各プライマー対は、ウシ特
異的遺伝子配列を検出できる。
【００３１】また、図１および図２に示す四角で囲まれ
た領域は、それぞれの動物種を特異的に検出するための
実験に用いた配列の例を示す。
た領域は、それぞれの動物種を特異的に検出するための
実験に用いた配列の例を示す。
【００３２】プライマーとして選択された領域のＤＮＡ
配列は、通常用いられる方法によって合成される。一般
的には、ＤＮＡ自動合成機を用いて支持体上でヌクレオ
チドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断
を行う。次いで、通常用いられる方法（例えば、カラム
クロマトグラフィー）によって精製して、目的のプライ
マーを得ることができる。
配列は、通常用いられる方法によって合成される。一般
的には、ＤＮＡ自動合成機を用いて支持体上でヌクレオ
チドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断
を行う。次いで、通常用いられる方法（例えば、カラム
クロマトグラフィー）によって精製して、目的のプライ
マーを得ることができる。
【００３３】測定される試料としては、生肉、肉加工食
品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、肉骨
粉、肉骨粉含有飼料などが挙げられる。試料からのミト
コンドリアＤＮＡの抽出は、例えば、以下のように行
う。約５０ｍｇ〜５００ｍｇの試料（例えば、生肉の場
合５０ｍｇ、乾燥粉体試料の場合１００〜５００ｍｇ）
を、約１０倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕
した後、市販の組織細胞ミトコンドリアＤＮＡ抽出キッ
ト（例えば、和光純薬工業製）を用いて抽出する。この
ようなキットは、組織細胞中のゲノムＤＮＡの混入が少
なく、より高純度のミトコンドリアＤＮＡを回収するも
のであり、遠心分離、沈殿採取などによるＤＮＡの抽
出、濃縮操作などを行う。このようにして、試料中に存
在する大量のゲノムＤＮＡの混入が低いミトコンドリア
ＤＮＡを効率的に抽出できる。
品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、肉骨
粉、肉骨粉含有飼料などが挙げられる。試料からのミト
コンドリアＤＮＡの抽出は、例えば、以下のように行
う。約５０ｍｇ〜５００ｍｇの試料（例えば、生肉の場
合５０ｍｇ、乾燥粉体試料の場合１００〜５００ｍｇ）
を、約１０倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕
した後、市販の組織細胞ミトコンドリアＤＮＡ抽出キッ
ト（例えば、和光純薬工業製）を用いて抽出する。この
ようなキットは、組織細胞中のゲノムＤＮＡの混入が少
なく、より高純度のミトコンドリアＤＮＡを回収するも
のであり、遠心分離、沈殿採取などによるＤＮＡの抽
出、濃縮操作などを行う。このようにして、試料中に存
在する大量のゲノムＤＮＡの混入が低いミトコンドリア
ＤＮＡを効率的に抽出できる。
【００３４】プライマーの使用量は、特に制限されない
が、一般的に、約0.4μＭで使用することが好ましい。
が、一般的に、約0.4μＭで使用することが好ましい。
【００３５】前処理した試料について、上記の選択した
プライマー対を用いてＰＣＲを行って、プライマーに挟
まれた領域のＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲは、通常行
われる条件で実施され、各プライマー対についてそれぞ
れ適切な条件を設定する。例えば、まず95℃で９分熱変
性した後、変性：92℃、１分；アニーリング：40〜65
℃、２分；伸長：72℃、２分の反応を、30〜60サイクル
繰り返し、最後に72℃、５分反応させてＰＣＲを終了す
る。ＤＮＡポリメラーゼとしては、通常AmpliTaqGOLDポ
リメラーゼが用いられる。プライマー対によって増幅さ
れたＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）の大きさは、選択された
プライマー対間の塩基数に応じて変動するが、約１２０
〜約１８０ｂｐであり得る。このＰＣＲ産物は、次い
で、上記ＤＮＡ断片を分離できる条件下で、例えば、ア
ガロースゲル電気泳動を行う。
プライマー対を用いてＰＣＲを行って、プライマーに挟
まれた領域のＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲは、通常行
われる条件で実施され、各プライマー対についてそれぞ
れ適切な条件を設定する。例えば、まず95℃で９分熱変
性した後、変性：92℃、１分；アニーリング：40〜65
℃、２分；伸長：72℃、２分の反応を、30〜60サイクル
繰り返し、最後に72℃、５分反応させてＰＣＲを終了す
る。ＤＮＡポリメラーゼとしては、通常AmpliTaqGOLDポ
リメラーゼが用いられる。プライマー対によって増幅さ
れたＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）の大きさは、選択された
プライマー対間の塩基数に応じて変動するが、約１２０
〜約１８０ｂｐであり得る。このＰＣＲ産物は、次い
で、上記ＤＮＡ断片を分離できる条件下で、例えば、ア
ガロースゲル電気泳動を行う。
【００３６】電気泳動したゲル上のＤＮＡ断片は、当業
者が通常用いるエチジウムブロマイド染色、蛍光検出、
サザンハイブリダイゼーションなどの検出手段によって
検出され得る。
者が通常用いるエチジウムブロマイド染色、蛍光検出、
サザンハイブリダイゼーションなどの検出手段によって
検出され得る。
【００３７】このようにして、試料中に目的の動物種由
来のＤＮＡが存在していれば、増幅されたＤＮＡ断片が
ゲル上で検出され得る。検出限界は、用いるプライマー
対の種類および組み合わせ、試料の量、ＰＣＲ条件、検
出方法などの種々のファクターによって異なり得る。適
切な条件を選択すれば、微量の試料においても、高感度
でＤＮＡの存在を検出することができる。例えば、適切
な条件を選択すれば、試料がウシ由来の肉骨粉を含む配
合飼料である場合、特定のウシ特異的なプライマー対を
用いて、0.001重量％の牛肉骨粉の混入でさえも検出す
ることが可能である。
来のＤＮＡが存在していれば、増幅されたＤＮＡ断片が
ゲル上で検出され得る。検出限界は、用いるプライマー
対の種類および組み合わせ、試料の量、ＰＣＲ条件、検
出方法などの種々のファクターによって異なり得る。適
切な条件を選択すれば、微量の試料においても、高感度
でＤＮＡの存在を検出することができる。例えば、適切
な条件を選択すれば、試料がウシ由来の肉骨粉を含む配
合飼料である場合、特定のウシ特異的なプライマー対を
用いて、0.001重量％の牛肉骨粉の混入でさえも検出す
ることが可能である。
【００３８】なお、以下に述べる実施例においては、プ
ライマー配列が特定されて示されているが、本発明はそ
の例に限定されることを意図していない。そのプライマ
ー配列を含み、あるいはその配列において１または２以
上の塩基配列の置換を含み、ハイブリダイズの条件を変
えることによって、目的のＤＮＡとハイブリダイズし
得、特定の動物種を特異的に検出し得る配列もまた、本
発明の範囲に含まれることはいうまでもない。
ライマー配列が特定されて示されているが、本発明はそ
の例に限定されることを意図していない。そのプライマ
ー配列を含み、あるいはその配列において１または２以
上の塩基配列の置換を含み、ハイブリダイズの条件を変
えることによって、目的のＤＮＡとハイブリダイズし
得、特定の動物種を特異的に検出し得る配列もまた、本
発明の範囲に含まれることはいうまでもない。
【００３９】
【実施例】（プライマーの合成）図１および図２に示す
各種動物のａｔｐ８遺伝子配列のアラインメントに基づ
いて、以下の各実施例または比較例に用いるプライマー
領域を選択した。選択した領域のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ
自動合成機を用いて合成した。
各種動物のａｔｐ８遺伝子配列のアラインメントに基づ
いて、以下の各実施例または比較例に用いるプライマー
領域を選択した。選択した領域のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ
自動合成機を用いて合成した。
【００４０】（実施例１：哺乳動物由来ＤＮＡ配列の特
異的検出）肉牛、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウ
サギ、クジラ、ニワトリ、タラ、サケ、イワシ、カニ、
エビ、およびアサリの１５種類の肉試料から、ミトコン
ドリアＤＮＡを以下のように調製した。各肉試料を１０
倍量の緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 7.5、20mM EDTA, pH
7.5）に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組
織細胞ミトコンドリアＤＮＡ抽出キット（和光純薬工業
製）を用いてＤＮＡを抽出した。
異的検出）肉牛、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウ
サギ、クジラ、ニワトリ、タラ、サケ、イワシ、カニ、
エビ、およびアサリの１５種類の肉試料から、ミトコン
ドリアＤＮＡを以下のように調製した。各肉試料を１０
倍量の緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 7.5、20mM EDTA, pH
7.5）に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組
織細胞ミトコンドリアＤＮＡ抽出キット（和光純薬工業
製）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００４１】それぞれのＤＮＡ試料を鋳型とし、anicon
5（配列番号１）とanicon3（配列番号２）とを、それぞ
れ５’側および３’側プライマーとして用いて、ＰＣＲ
を行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである：反応緩衝
液（10mM Tris-HCl, pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、
0.001%(W/V)ゼラチン）；95℃で９分熱変性した後、変
性：92℃、１分；アニーリング：50℃、２分；伸長：72
℃、２分の反応を４５サイクル繰り返し、最後に72℃、
５分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動
を行い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（Ｄ
ＮＡ断片）を検出した。結果を図４に示す。図中のＭは
分子量マーカーである。
5（配列番号１）とanicon3（配列番号２）とを、それぞ
れ５’側および３’側プライマーとして用いて、ＰＣＲ
を行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである：反応緩衝
液（10mM Tris-HCl, pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、
0.001%(W/V)ゼラチン）；95℃で９分熱変性した後、変
性：92℃、１分；アニーリング：50℃、２分；伸長：72
℃、２分の反応を４５サイクル繰り返し、最後に72℃、
５分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動
を行い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（Ｄ
ＮＡ断片）を検出した。結果を図４に示す。図中のＭは
分子量マーカーである。
【００４２】図４から明らかなように、anicon5（配列
番号１）およびanicon3（配列番号２）をプライマーと
して用いて、それぞれの動物由来のＤＮＡを鋳型とする
ＰＣＲにより、哺乳動物においてのみ、増幅されたＤＮ
Ａ断片の生成が認められた（矢印のバンド位置）。すな
わち、anicon5（配列番号１）およびanicon3（配列番号
２）をプライマー対とすることにより、種々の動物肉試
料の中から、哺乳動物由来のＤＮＡのみを特異的に検出
できることが示された。したがって、anicon5（配列番
号１）とanicon3（配列番号２）との組み合わせは、哺
乳動物に属する動物種を特異的に検出するプライマー対
である。図３に、哺乳動物検出のためのプライマーとし
て用い得る領域を示した。
番号１）およびanicon3（配列番号２）をプライマーと
して用いて、それぞれの動物由来のＤＮＡを鋳型とする
ＰＣＲにより、哺乳動物においてのみ、増幅されたＤＮ
Ａ断片の生成が認められた（矢印のバンド位置）。すな
わち、anicon5（配列番号１）およびanicon3（配列番号
２）をプライマー対とすることにより、種々の動物肉試
料の中から、哺乳動物由来のＤＮＡのみを特異的に検出
できることが示された。したがって、anicon5（配列番
号１）とanicon3（配列番号２）との組み合わせは、哺
乳動物に属する動物種を特異的に検出するプライマー対
である。図３に、哺乳動物検出のためのプライマーとし
て用い得る領域を示した。
【００４３】（実施例２：反芻動物由来ＤＮＡ配列の特
異的検出）実施例１と同様に調製した１５種類のＤＮＡ
試料を鋳型とし、rumicon5（配列番号３）とrumicon3
（配列番号４）とを、それぞれ５’側および３’側プラ
イマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は
以下の通りである：95℃で９分熱変性した後、変性：92
℃、１分；アニーリング：45℃、２分；伸長：72℃、２
分の反応を、４５サイクル繰り返し、最後に72℃、５分
反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行
い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（ＤＮＡ
断片）を検出した。結果を図５に示す。
異的検出）実施例１と同様に調製した１５種類のＤＮＡ
試料を鋳型とし、rumicon5（配列番号３）とrumicon3
（配列番号４）とを、それぞれ５’側および３’側プラ
イマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は
以下の通りである：95℃で９分熱変性した後、変性：92
℃、１分；アニーリング：45℃、２分；伸長：72℃、２
分の反応を、４５サイクル繰り返し、最後に72℃、５分
反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行
い、エチジウムブロマイド染色してＰＣＲ産物（ＤＮＡ
断片）を検出した。結果を図５に示す。
【００４４】図５は、rumicon5（配列番号３）およびru
micon3（配列番号４）をプライマーとして用いて、それ
ぞれの動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、反
芻動物である肉牛、乳牛、ヒツジ、およびヤギに由来す
るＤＮＡ断片が生成することが認められた（矢印のバン
ド位置）。一方、反芻動物に属さない動物のＤＮＡから
は、ＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）は検出できなかった。す
なわち、rumicon5およびrumicon3をプライマー対とする
ことにより、種々の動物肉試料の中から、反芻動物由来
のＤＮＡのみを特異的に検出できることが示された。し
たがって、rumicon5（配列番号３）とrumicon3（配列番
号４）との組み合わせは、反芻動物由来の動物種を特異
的に検出するプライマー対である。図３に、反芻動物検
出のためにプライマーとして用い得る領域を示した。
micon3（配列番号４）をプライマーとして用いて、それ
ぞれの動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、反
芻動物である肉牛、乳牛、ヒツジ、およびヤギに由来す
るＤＮＡ断片が生成することが認められた（矢印のバン
ド位置）。一方、反芻動物に属さない動物のＤＮＡから
は、ＰＣＲ産物（ＤＮＡ断片）は検出できなかった。す
なわち、rumicon5およびrumicon3をプライマー対とする
ことにより、種々の動物肉試料の中から、反芻動物由来
のＤＮＡのみを特異的に検出できることが示された。し
たがって、rumicon5（配列番号３）とrumicon3（配列番
号４）との組み合わせは、反芻動物由来の動物種を特異
的に検出するプライマー対である。図３に、反芻動物検
出のためにプライマーとして用い得る領域を示した。
【００４５】なお、rumicon5（配列番号３）におけるｒ
は、ｇとａとのミックスであり、ｋはｇとｔとのミック
スである。すなわち、rumicon5（配列番号３）は混合プ
ライマーであるが、それぞれが単独で使用され得ること
は当業者に明白である。
は、ｇとａとのミックスであり、ｋはｇとｔとのミック
スである。すなわち、rumicon5（配列番号３）は混合プ
ライマーであるが、それぞれが単独で使用され得ること
は当業者に明白である。
【００４６】（実施例３：ウシ由来ＤＮＡ配列の特異的
検出）表１に記載の種々のプライマー対を用いて、ウシ
由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、
ヤギ、ブタおよびニワトリの肉から調製したＤＮＡを鋳
型として、アニーリングの条件を表１の条件とした以外
は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。結果を図６〜
８に示す。
検出）表１に記載の種々のプライマー対を用いて、ウシ
由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、
ヤギ、ブタおよびニワトリの肉から調製したＤＮＡを鋳
型として、アニーリングの条件を表１の条件とした以外
は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。結果を図６〜
８に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】図６に示す結果は、cow51（配列番号６）
およびcow3（配列番号１０）をプライマー対として用い
た場合に、ウシ由来の肉から得られるＰＣＲ産物（ＤＮ
Ａ断片）と同じ大きさのＤＮＡ断片が、ヒツジ、ヤギ、
ブタおよびニワトリのＤＮＡを鋳型とした場合には生じ
なかったことを示す。図７のcow52とcow3との組み合わ
せ、および図８のcow52とcow31との組み合わせは、他の
動物種で類似するＤＮＡ断片が検出されていない点で、
特にウシ特異的検出に適切なプライマー対であることが
わかる。一方、図７に示すように、cow5（配列番号５）
およびcow31（配列番号１１）のプライマー対を用いた
場合に、ヒツジにおいて、わずかにウシのＤＮＡを鋳型
として得られるＤＮＡ断片と同じ大きさのバンドが見ら
れた。同様に、図８では、cow51（配列番号６）およびc
ow31（配列番号１１）のプライマー対、ならびにcow53
（配列番号８）およびcow31（配列番号１１）のプライ
マー対を用いた場合にも、ウシのＤＮＡを鋳型として得
られるＤＮＡ断片と同じ大きさのバンドが見られた。し
たがって、これらのプライマー対は、ウシ特異的な検出
をするには、適切な組み合わせではない。
およびcow3（配列番号１０）をプライマー対として用い
た場合に、ウシ由来の肉から得られるＰＣＲ産物（ＤＮ
Ａ断片）と同じ大きさのＤＮＡ断片が、ヒツジ、ヤギ、
ブタおよびニワトリのＤＮＡを鋳型とした場合には生じ
なかったことを示す。図７のcow52とcow3との組み合わ
せ、および図８のcow52とcow31との組み合わせは、他の
動物種で類似するＤＮＡ断片が検出されていない点で、
特にウシ特異的検出に適切なプライマー対であることが
わかる。一方、図７に示すように、cow5（配列番号５）
およびcow31（配列番号１１）のプライマー対を用いた
場合に、ヒツジにおいて、わずかにウシのＤＮＡを鋳型
として得られるＤＮＡ断片と同じ大きさのバンドが見ら
れた。同様に、図８では、cow51（配列番号６）およびc
ow31（配列番号１１）のプライマー対、ならびにcow53
（配列番号８）およびcow31（配列番号１１）のプライ
マー対を用いた場合にも、ウシのＤＮＡを鋳型として得
られるＤＮＡ断片と同じ大きさのバンドが見られた。し
たがって、これらのプライマー対は、ウシ特異的な検出
をするには、適切な組み合わせではない。
【００４９】（実施例４：ブタ由来ＤＮＡ配列の特異的
検出）表２に記載の種々のプライマー対を用いて、ブタ
由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、
ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製したＤＮＡを
鋳型として、アニーリングの温度を表２の温度に変えた
以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。
検出）表２に記載の種々のプライマー対を用いて、ブタ
由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツジ、
ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製したＤＮＡを
鋳型として、アニーリングの温度を表２の温度に変えた
以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。
【００５０】
【表２】
【００５１】pig51（配列番号１３）とpig3（配列番号
１４）とをプライマー対として用いた結果を図９に示
す。図９から明らかなように、ブタ肉由来試料において
のみ、ＤＮＡ断片を検出した（矢印のバンド位置）。し
たがって、このプライマー対は、ブタ由来ＤＮＡ配列の
特異的検出に有用である。なお、図に示していないが、
pig5（配列番号１２）とpig3（配列番号１４）；pig5
（配列番号１２）とpig31（配列番号１５）；pig5（配
列番号１２）とpig32（配列番号１６）；pig51（配列番
号１３）とpig31（配列番号１５）；pig51（配列番号１
３）とpig32（配列番号１６）との組み合わせは、いず
れも特異的検出には適切ではなかった。
１４）とをプライマー対として用いた結果を図９に示
す。図９から明らかなように、ブタ肉由来試料において
のみ、ＤＮＡ断片を検出した（矢印のバンド位置）。し
たがって、このプライマー対は、ブタ由来ＤＮＡ配列の
特異的検出に有用である。なお、図に示していないが、
pig5（配列番号１２）とpig3（配列番号１４）；pig5
（配列番号１２）とpig31（配列番号１５）；pig5（配
列番号１２）とpig32（配列番号１６）；pig51（配列番
号１３）とpig31（配列番号１５）；pig51（配列番号１
３）とpig32（配列番号１６）との組み合わせは、いず
れも特異的検出には適切ではなかった。
【００５２】（実施例５：ヒツジ由来ＤＮＡ配列の特異
的検出）sheep5（配列番号１７）とsheep3（配列番号１
８）とを、それぞれ５’側および３’側プライマーとし
て、ヒツジ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウ
シ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製
したＤＮＡを鋳型として、アニーリングの条件を46℃、
２分とした以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行っ
た。結果を図１０に示す。
的検出）sheep5（配列番号１７）とsheep3（配列番号１
８）とを、それぞれ５’側および３’側プライマーとし
て、ヒツジ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウ
シ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製
したＤＮＡを鋳型として、アニーリングの条件を46℃、
２分とした以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行っ
た。結果を図１０に示す。
【００５３】この結果、sheep5（配列番号１７）とshee
p3（配列番号１８）とをプライマー対として用いること
により、ヒツジ由来ＤＮＡ配列の特異的検出が可能とな
ることが示された。
p3（配列番号１８）とをプライマー対として用いること
により、ヒツジ由来ＤＮＡ配列の特異的検出が可能とな
ることが示された。
【００５４】（実施例６：ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的
検出）goat5（配列番号１９）とgoat3（配列番号２０）
とを、それぞれ５’側および３’側プライマーとして用
いて、ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウ
シ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製
したＤＮＡを鋳型として、アニーリングの条件を46℃、
２分とした以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行っ
た。結果を図１０に示す。
検出）goat5（配列番号１９）とgoat3（配列番号２０）
とを、それぞれ５’側および３’側プライマーとして用
いて、ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウ
シ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製
したＤＮＡを鋳型として、アニーリングの条件を46℃、
２分とした以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行っ
た。結果を図１０に示す。
【００５５】この結果、goat5（配列番号１９）とgoat3
（配列番号２０）とをプライマー対として用いることに
より、ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的検出が可能となるこ
とが示された。
（配列番号２０）とをプライマー対として用いることに
より、ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的検出が可能となるこ
とが示された。
【００５６】また、goat5（配列番号１９）とgoat31
（配列番号２１）とをプライマー対とし、アニーリング
の条件を54℃、２分とした以外は、上記と同様にＰＣＲ
を行ったところ、ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的検出には
適切ではなかった（図示せず）。
（配列番号２１）とをプライマー対とし、アニーリング
の条件を54℃、２分とした以外は、上記と同様にＰＣＲ
を行ったところ、ヤギ由来ＤＮＡ配列の特異的検出には
適切ではなかった（図示せず）。
【００５７】（実施例７：ニワトリ由来ＤＮＡ配列の特
異的検出）表３に記載の種々のプライマー対を、それぞ
れ５’側および３’側プライマーとして用いて、ニワト
リ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツ
ジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製したＤＮ
Ａを鋳型として、アニーリングの条件を表３に記載の条
件とした以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。
chick5（配列番号２２）とchick3（配列番号２４）とを
プライマー対として用いた場合の結果を図１１に示す。
異的検出）表３に記載の種々のプライマー対を、それぞ
れ５’側および３’側プライマーとして用いて、ニワト
リ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を試みた。ウシ、ヒツ
ジ、ヤギ、ブタ、およびニワトリの肉から調製したＤＮ
Ａを鋳型として、アニーリングの条件を表３に記載の条
件とした以外は、実施例１と同条件でＰＣＲを行った。
chick5（配列番号２２）とchick3（配列番号２４）とを
プライマー対として用いた場合の結果を図１１に示す。
【００５８】
【表３】
【００５９】図１１から明らかなように、chick5（配列
番号２２）とchick3（配列番号２４）とをプライマー対
として用いることにより、ニワトリ由来ＤＮＡ配列の特
異的検出が可能である（矢印のバンド位置）。
番号２２）とchick3（配列番号２４）とをプライマー対
として用いることにより、ニワトリ由来ＤＮＡ配列の特
異的検出が可能である（矢印のバンド位置）。
【００６０】chick51（配列番号２３）とchick3（配列
番号２４）、chick5（配列番号２２）とchick31（配列
番号２５）、およびchick51（配列番号２３）とchick31
（配列番号２５）の、それぞれのプライマー対を用いた
ときは、ニワトリ由来ＤＮＡ配列の特異的検出には適切
ではなかった（図示せず）。
番号２４）、chick5（配列番号２２）とchick31（配列
番号２５）、およびchick51（配列番号２３）とchick31
（配列番号２５）の、それぞれのプライマー対を用いた
ときは、ニワトリ由来ＤＮＡ配列の特異的検出には適切
ではなかった（図示せず）。
【００６１】（実施例８：配合飼料中の哺乳動物由来Ｄ
ＮＡ配列の検出）家畜用配合飼料（主成分：トウモロコ
シ、マイロ、グルテンフィード、ふすま、米ぬか、大豆
油かす、なたね油かす）に所定の割合でウシ由来の肉骨
粉（オーストラリア産）を混合した。得られた飼料を５
００ｍｇとり、上記実施例１と同様に１０倍量の緩衝液
に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞
ミトコンドリアＤＮＡ抽出キット（和光純薬工業製）を
用いてミトコンドリアＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを
鋳型として、実施例１で用いた哺乳動物由来ＤＮＡ配列
を特異的に検出するプライマー対であるanicon5（配列
番号１）とanicon3（配列番号２）とを用いて、実施例
１と同じ条件でＰＣＲを行った。結果を図１２に示す。
肉骨粉が０．０１重量％含まれている場合でも、哺乳動
物由来のＤＮＡ配列を検出できることが判明した。
ＮＡ配列の検出）家畜用配合飼料（主成分：トウモロコ
シ、マイロ、グルテンフィード、ふすま、米ぬか、大豆
油かす、なたね油かす）に所定の割合でウシ由来の肉骨
粉（オーストラリア産）を混合した。得られた飼料を５
００ｍｇとり、上記実施例１と同様に１０倍量の緩衝液
に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞
ミトコンドリアＤＮＡ抽出キット（和光純薬工業製）を
用いてミトコンドリアＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを
鋳型として、実施例１で用いた哺乳動物由来ＤＮＡ配列
を特異的に検出するプライマー対であるanicon5（配列
番号１）とanicon3（配列番号２）とを用いて、実施例
１と同じ条件でＰＣＲを行った。結果を図１２に示す。
肉骨粉が０．０１重量％含まれている場合でも、哺乳動
物由来のＤＮＡ配列を検出できることが判明した。
【００６２】（実施例９：配合飼料中の反芻動物由来Ｄ
ＮＡ配列の検出）実施例８と同様に配合飼料から抽出し
たＤＮＡを鋳型として、実施例２で用いた反芻動物由来
のＤＮＡ配列を特異的に検出するrumicon5（配列番号
３）およびrumicon3（配列番号４）のプライマー対を用
いて、実施例２と同様の条件でＰＣＲを行った。結果を
図１３に示す。肉骨粉が０．１〜１重量％含まれている
場合でも、反芻動物由来のＤＮＡ配列を検出できること
が判明した。
ＮＡ配列の検出）実施例８と同様に配合飼料から抽出し
たＤＮＡを鋳型として、実施例２で用いた反芻動物由来
のＤＮＡ配列を特異的に検出するrumicon5（配列番号
３）およびrumicon3（配列番号４）のプライマー対を用
いて、実施例２と同様の条件でＰＣＲを行った。結果を
図１３に示す。肉骨粉が０．１〜１重量％含まれている
場合でも、反芻動物由来のＤＮＡ配列を検出できること
が判明した。
【００６３】（実施例１０：配合飼料中のウシ由来ＤＮ
Ａ配列の検出）実施例８と同様に配合飼料から抽出した
ＤＮＡを鋳型として、実施例３で用いたウシ特異的プラ
イマー対であるcow52（配列番号７）およびcow31（配列
番号１１）を用いて、実施例３と同様の条件でＰＣＲを
行った。結果を図１４に示す。肉骨粉がわずか０．００
１重量％しか含まれていない場合でも、ウシ由来のＤＮ
Ａ配列を検出できることが判明した。
Ａ配列の検出）実施例８と同様に配合飼料から抽出した
ＤＮＡを鋳型として、実施例３で用いたウシ特異的プラ
イマー対であるcow52（配列番号７）およびcow31（配列
番号１１）を用いて、実施例３と同様の条件でＰＣＲを
行った。結果を図１４に示す。肉骨粉がわずか０．００
１重量％しか含まれていない場合でも、ウシ由来のＤＮ
Ａ配列を検出できることが判明した。
【００６４】
【発明の効果】本発明の方法を用いると、試料中の微量
の動物由来ＤＮＡ配列を高感度で検出することができ
る。そのため、例えば、飼料中にわずかに混入された肉
骨粉の動物種の識別も可能である。特に、家畜用配合飼
料に微量のウシ肉骨粉が混入している場合も検出可能で
ある。
の動物由来ＤＮＡ配列を高感度で検出することができ
る。そのため、例えば、飼料中にわずかに混入された肉
骨粉の動物種の識別も可能である。特に、家畜用配合飼
料に微量のウシ肉骨粉が混入している場合も検出可能で
ある。
【００６５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> National Institute of Agrobiological Sciences
<110> Independent Administrative Institution Fertilizer and Feed Inspect
ion Station
<120> Primer sequences
<130> P101N07219
<160> 25
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aactagacac gtcaacatga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aggtaaataa attttcgttc 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acrtcaacrt gactkaca 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tctggrttgt grtaraagt 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gtcaacatga ctgacaatg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agacacgtca acatgactg 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
atgatcttat caatattctt g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gacatgccgc aactagacac g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ctctccttgg tgacatgccg 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ttttaatatt tttgttggtg tc 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tcaaggggtg ttttgtttta a 21
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atgattcatt acaattac 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
tgccacaact agatacatct 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ttatttctca aggggtgc 18
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tgagttcaat tgattctggg c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
tgtttttgag ttttgagttc a 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
aattctatca atatttttag t 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ctcaaggagt attttgtttc 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gccacaacta gacacatcr 19
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
tctcaagggg tgttatgc 18
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
ttctgggttg tggtagaagt c 21
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
catcatactc ctaacttg 18
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
cctaacttga ttcaccttct c 21
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
tttaggttca tggtcagg 18
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
gttcatggtc aggttcaggg g 21
【図１】種々の動物由来ミトコンドリアａｔｐ８遺伝子
の配列アラインメントを示す図である。
の配列アラインメントを示す図である。
【図２】ニワトリ、ウシ、およびブタのミトコンドリア
ａｔｐ８遺伝子の配列アラインメントを示す図である。
ａｔｐ８遺伝子の配列アラインメントを示す図である。
【図３】ウシ由来ＤＮＡ配列の特異的検出を行うために
用いたプライマーの、ミトコンドリアａｔｐ８遺伝子上
での位置関係を示す図である。
用いたプライマーの、ミトコンドリアａｔｐ８遺伝子上
での位置関係を示す図である。
【図４】哺乳動物特異的配列を有するプライマー対（an
icon5およびanicon3）を用いて、各種動物由来のＤＮＡ
を鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す
写真である。
icon5およびanicon3）を用いて、各種動物由来のＤＮＡ
を鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す
写真である。
【図５】反芻動物特異的配列を有するプライマー対（ru
micon5およびrumicon3）を用いて、各種動物由来のＤＮ
Ａを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示
す写真である。
micon5およびrumicon3）を用いて、各種動物由来のＤＮ
Ａを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示
す写真である。
【図６】ウシ特異的配列を有するプライマー対（cow3お
よびcow51）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型と
するＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真であ
る。
よびcow51）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型と
するＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真であ
る。
【図７】種々のウシ特異的配列を有するプライマー対を
用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行
った後の電気泳動の結果を示す写真である。
用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行
った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図８】種々のウシ特異的配列を有するプライマー対を
用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行
った後の電気泳動の結果を示す写真である。
用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行
った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図９】ブタ特異的配列を有するプライマー対（pig51
およびpig3）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型と
するＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真であ
る。
およびpig3）を用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型と
するＰＣＲを行った後の電気泳動の結果を示す写真であ
る。
【図１０】ヒツジ特異的配列を有するプライマー対（sh
eep5およびsheep3）およびヤギ特異的配列を有するプラ
イマー対（goat5およびgoat3）を用いて、各種動物由来
のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結
果を示す写真である。
eep5およびsheep3）およびヤギ特異的配列を有するプラ
イマー対（goat5およびgoat3）を用いて、各種動物由来
のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動の結
果を示す写真である。
【図１１】ニワトリ特異的配列を有するプライマー対を
用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行
った後の電気泳動の結果を示す写真である。
用いて、各種動物由来のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行
った後の電気泳動の結果を示す写真である。
【図１２】ウシ肉骨粉含有家畜用配合飼料における、哺
乳動物特異的プライマー対によるＤＮＡ検出の結果を示
す電気泳動写真である。
乳動物特異的プライマー対によるＤＮＡ検出の結果を示
す電気泳動写真である。
【図１３】ウシ肉骨粉含有家畜用配合飼料における、反
芻動物特異的プライマー対によるＤＮＡ検出の結果を示
す電気泳動写真である。
芻動物特異的プライマー対によるＤＮＡ検出の結果を示
す電気泳動写真である。
【図１４】ウシ肉骨粉含有家畜用配合飼料における、ウ
シ特異的プライマー対によるＤＮＡ検出の結果を示す電
気泳動写真である。
シ特異的プライマー対によるＤＮＡ検出の結果を示す電
気泳動写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA07 CA01 HA19
4B063 QA13 QQ44 QQ59 QR32 QR40
QR62 QS16 QS25
Claims (24)
- 【請求項１】 ミトコンドリアゲノムのＡＴＰ合成酵素
サブユニット８遺伝子配列に由来する動物特異的遺伝子
配列をプライマー対とし、試料中のＤＮＡを鋳型とし
て、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工程、および
該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含む、動物種
識別方法。 - 【請求項２】 前記動物が哺乳動物である、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 前記プライマー対が、配列表の配列番号
１の配列と配列表の配列番号２の配列との組み合わせで
ある、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記動物が反芻動物である、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項５】 前記プライマー対が、配列表の配列番号
３の配列と配列表の配列番号４の配列との組み合わせで
ある、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記動物がウシである、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項７】 前記プライマー対が、以下の組み合わ
せ：配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号１１
の配列；配列表の配列番号７の配列と配列表の配列番号
１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列表の配列
番号１１の配列；配列表の配列番号８の配列と配列表の
配列番号１０の配列；配列表の配列番号９の配列と配列
表の配列番号１０の配列；および、配列表の配列番号６
の配列と配列表の配列番号１０の配列；からなる群より
選択される組み合わせである、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記動物がブタである、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項９】 前記プライマー対が、配列表の配列番号
１３の配列と配列表の配列番号１４の配列との組み合わ
せである、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記動物がヒツジである、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項１１】 前記プライマー対が、配列表の配列番
号１７の配列と配列表の配列番号１８の配列との組み合
わせである、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記動物がヤギである、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１３】 前記プライマー対が、配列表の配列番
号１９の配列と配列表の配列番号２０の配列との組み合
わせである、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記動物がニワトリである、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記プライマー対が、配列表の配列番
号２３の配列と配列表の配列番号２４の配列との組み合
わせである、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記試料が、生肉、肉加工食品、肉加
工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、肉骨粉、および
肉骨粉含有飼料からなる群より選択される、請求項１か
ら１５のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項１７】 配列表の配列番号１の配列と配列表の
配列番号２の配列との組み合わせである、哺乳動物特異
的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項１８】 配列表の配列番号３の配列と配列表の
配列番号４の配列との組み合わせである、反芻動物特異
的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項１９】 以下の組み合わせ：配列表の配列番号
７の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列表の配列
番号７の配列と配列表の配列番号１０の配列；配列表の
配列番号９の配列と配列表の配列番号１１の配列；配列
表の配列番号８の配列と配列表の配列番号１０の配列；
配列表の配列番号９の配列と配列表の配列番号１０の配
列；および配列表の配列番号６の配列と配列表の配列番
号１０の配列；からなる群より選択される組み合わせで
ある、ウシ特異的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項２０】 配列表の配列番号１３の配列と配列表
の配列番号１４の配列との組み合わせである、ブタ特異
的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項２１】 配列表の配列番号１７の配列と配列表
の配列番号１８の配列との組み合わせである、ヒツジ特
異的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項２２】 配列表の配列番号１９の配列と配列表
の配列番号２０の配列との組み合わせである、ヤギ特異
的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項２３】 配列表の配列番号２３の配列と配列表
の配列番号２４の配列との組み合わせである、ニワトリ
特異的遺伝子配列検出用プライマー対。 - 【請求項２４】 配合飼料中に含まれる動物由来の成分
を検出する方法であって、ミトコンドリアゲノムのＡＴ
Ｐ合成酵素サブユニット８遺伝子配列に由来する動物特
異的遺伝子配列をプライマー対とし、試料中のＤＮＡを
鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する工
程、および該増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程を含
む、方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001366120A JP4117370B2 (ja) | 2001-11-30 | 2001-11-30 | プライマー配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001366120A JP4117370B2 (ja) | 2001-11-30 | 2001-11-30 | プライマー配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003164287A true JP2003164287A (ja) | 2003-06-10 |
| JP4117370B2 JP4117370B2 (ja) | 2008-07-16 |
Family
ID=19176063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001366120A Expired - Lifetime JP4117370B2 (ja) | 2001-11-30 | 2001-11-30 | プライマー配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4117370B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005323587A (ja) * | 2004-04-12 | 2005-11-24 | Fertilizer & Feed Inspection Station | プライマー配列 |
| DE102005038214A1 (de) * | 2005-08-12 | 2007-02-15 | Universität Zürich | Verfahren und Kit zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs |
| JP2007222042A (ja) * | 2006-02-22 | 2007-09-06 | Nippon Meat Packers Inc | 試料中の鶏由来成分の検出方法 |
| JP2009195226A (ja) * | 2008-01-25 | 2009-09-03 | Food & Agricultural Materials Inspection Center | 動物由来ｄｎａ検出用プライマー配列 |
| WO2009157750A1 (en) * | 2008-06-26 | 2009-12-30 | Universiti Putra Malaysia | A method for identifying a pork content in a food |
| JP2011045384A (ja) * | 2004-04-12 | 2011-03-10 | Food & Agricultural Materials Inspection Center | プライマー配列 |
| US8158772B2 (en) * | 2004-04-16 | 2012-04-17 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Oligonucleotide sequences that identify species of animal |
-
2001
- 2001-11-30 JP JP2001366120A patent/JP4117370B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011045384A (ja) * | 2004-04-12 | 2011-03-10 | Food & Agricultural Materials Inspection Center | プライマー配列 |
| JP2013039130A (ja) * | 2004-04-12 | 2013-02-28 | Food & Agricultural Materials Inspection Center | プライマー配列 |
| JP2013009678A (ja) * | 2004-04-12 | 2013-01-17 | Food & Agricultural Materials Inspection Center | プライマー配列 |
| JP2005323587A (ja) * | 2004-04-12 | 2005-11-24 | Fertilizer & Feed Inspection Station | プライマー配列 |
| JP2011045383A (ja) * | 2004-04-12 | 2011-03-10 | Food & Agricultural Materials Inspection Center | プライマー配列 |
| US8158772B2 (en) * | 2004-04-16 | 2012-04-17 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Oligonucleotide sequences that identify species of animal |
| WO2007019945A3 (de) * | 2005-08-12 | 2007-07-12 | Univ Zuerich | Verfahren und kit zur detektion von anteilen bovinen gewebes in unter zersetzenden bedingungen hergestellten produkten tierischen ursprungs |
| WO2007019945A2 (de) * | 2005-08-12 | 2007-02-22 | Universität Zürich | Verfahren und kit zur detektion von anteilen bovinen gewebes in unter zersetzenden bedingungen hergestellten produkten tierischen ursprungs |
| DE102005038214A1 (de) * | 2005-08-12 | 2007-02-15 | Universität Zürich | Verfahren und Kit zur Detektion von Anteilen bovinen Gewebes in unter zersetzenden Bedingungen hergestellten Produkten tierischen Ursprungs |
| JP2007222042A (ja) * | 2006-02-22 | 2007-09-06 | Nippon Meat Packers Inc | 試料中の鶏由来成分の検出方法 |
| JP2009195226A (ja) * | 2008-01-25 | 2009-09-03 | Food & Agricultural Materials Inspection Center | 動物由来ｄｎａ検出用プライマー配列 |
| JP2014000090A (ja) * | 2008-01-25 | 2014-01-09 | Food & Agricultural Materials Inspection Center | 動物由来ｄｎａ検出用プライマー配列 |
| JP2014000091A (ja) * | 2008-01-25 | 2014-01-09 | Food & Agricultural Materials Inspection Center | 動物由来ｄｎａ検出用プライマー配列 |
| JP2010530763A (ja) * | 2008-06-26 | 2010-09-16 | ユニヴェルシティ プトラ マレーシア | 食品中のブタ肉含有を特定する方法 |
| WO2009157750A1 (en) * | 2008-06-26 | 2009-12-30 | Universiti Putra Malaysia | A method for identifying a pork content in a food |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4117370B2 (ja) | 2008-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100184078A1 (en) | Oligonucleotide sequences that identify species of animal | |
| Colgan et al. | Development of a DNA-based assay for species identification in meat and bone meal | |
| Girish et al. | A rapid method for authentication of Buffalo (Bubalus bubalis) meat by Alkaline Lysis method of DNA extraction and species specific polymerase chain reaction | |
| Natonek-Wiśniewska et al. | The species identification of bovine, porcine, ovine and chicken components in animal meals, feeds and their ingredients, based on COX I analysis and ribosomal DNA sequences | |
| Shapiro et al. | Molecular detection of Coxiella burnetii in raw meat intended for pet consumption | |
| Liu et al. | A multiplex PCR assay mediated by universal primers for the detection of adulterated meat in mutton | |
| Kusama et al. | Development of primers for detection of meat and bone meal in ruminant feed and identification of the animal of origin | |
| JP4117370B2 (ja) | プライマー配列 | |
| Jakaria et al. | Discovery of SNPs and indel 11-bp of the myostatin gene and its association with the double-muscled phenotype in Belgian blue crossbred cattle | |
| JP5682074B2 (ja) | 動物由来ｄｎａ検出用プライマー配列 | |
| JP5564739B2 (ja) | プライマー配列 | |
| Heers et al. | Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay—A rapid detection tool for identifying red fox (Vulpes vulpes) DNA in the carcasses of harbour porpoises (Phocoena phocoena) | |
| Zhang et al. | Codeposition of dNTPs detection for rapid LAMP‐based sexing of bovine embryos | |
| JP4854211B2 (ja) | プライマー配列 | |
| Jaayid | Rapid and sensitive identification of horse and donkey meat in Iraqi markets using SSR and PCR-RFLP based on mitochondrial DNA cytochrome b gene | |
| JP2011045383A6 (ja) | プライマー配列 | |
| Tao et al. | A simple, affordable, and rapid visual CRISPR-based field test for sex determination of earlier porcine embryos and pork products | |
| Hamadalahmad et al. | Genetic similarity comparison between some Iranian and Middle Eastern sheep breeds using mitochondrial control region sequencing | |
| CA2461899C (en) | Oligonucleotide sequences that identify species of animal | |
| KR101764128B1 (ko) | 식품 중 새우 원료의 진위 여부 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 식품 중 새우 원료의 진위 여부를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 키트 | |
| Sudheer et al. | Molecular detection of meat species in primary by-Products of sheep and Goats | |
| Sikdar et al. | Multi-OMICS and molecular biology perspective in Buffalo genome | |
| Ahmed et al. | Detection of species-specific genetic markers in farm animals by RFLP analysis of cytochrome b gene | |
| Pu et al. | Rapid, visual and highly sensitive sexing of bovine embryos by recombinase polymerase amplification with CFI staining | |
| Venkatesh et al. | Rapid DNA extraction from dried milk spots: application in non-invasive detection of the A1/A2 variants of beta casein in cow |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060207 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060406 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20070713 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20070816 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070816 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080115 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4117370 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |