JP2005323587A - プライマー配列 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 複数の特定の配列からなる配列の組み合わせである、反芻動物特異的DNA検出用プライマー対、ウシ特異的DNA検出用プライマー対、ブタ特異的DNA検出用プライマー対、魚類特異的DNA検出用プライマー対、鶏特異的DNA検出用プライマー対、ならびに植物特異的DNA検出用プライマー対からなる。
【選択図】 なし
Description
反芻動物、ウシ、およびブタ由来DNA検出用プライマーについては、図1および図2に示す各種動物のatp8遺伝子のDNA配列のアラインメントに基づいて、以下の各実施例に用いるプライマー領域を選択した。また、魚類由来DNA検出用プライマーについては、図7に示す各種動物のatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、プライマー領域を選択した。鶏由来DNA検出用プライマーについては、図8に示す各種動物のatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、プライマー領域を選択した。選択した領域のDNA配列を、DNA自動合成機を用いて合成した。
ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ブタ、ウマ、ウサギ、クジラ、ニワトリ、タラ、サケ、イワシ、カニ、エビ、およびアサリの15種類の肉試料から、ミトコンドリアDNAを以下のように調製した。各肉試料を10倍量の緩衝液(10mM Tris-HCl, pH 7.5、20mM EDTA, pH 7.5)に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キットであるmtDNAエキストラクターCTキット(和光純薬工業製)を用いてDNAを抽出した。
実施例1と同様に調製した15種類のDNA試料を鋳型とし、Fpc-F(配列番号3)とFpc-R(配列番号4)とを、それぞれ5’側および3’側プライマーとして用いて、PCRを行った。PCRの条件は以下の通りである:95℃で9分熱変性した後、変性:92℃、30秒;アニーリング:55℃、30秒;伸長:72℃、30秒の反応を、45サイクル繰り返し、最後に72℃、5分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(DNA断片)を検出した。結果を図4に示す。
家畜用配合飼料(主成分:トウモロコシ、マイロ、グルテンフィード、ふすま、米ぬか、大豆油かす、なたね油かす)に所定の割合でウシ由来の肉骨粉(オーストラリア産)を混合した。得られた飼料を100mgとり、上記実施例1と同様に10倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キット(和光純薬工業製)を用いてミトコンドリアDNAを抽出した。このDNAを鋳型として、哺乳動物由来DNA配列を特異的に検出するプライマー対であるanicon5(配列番号41)とanicon3(配列番号42)(特許文献1参照)、上記実施例1で用いた反芻動物由来DNA配列を特異的に検出するプライマー対であるFpr-F(配列番号1)とFpr-R(配列番号2)、ならびに上記実施例2で用いたウシ由来DNA配列を特異的に検出するプライマー対であるFpc-F(配列番号3)とFpc-R(配列番号4)とを用いて、実施例1と同じ条件でPCRを行った。結果を図5に示す。0.01質量%の肉骨粉が含まれている場合でも、ウシ由来のDNA配列を検出できることが判明した。
実施例1と同様に調製した15種類のDNA試料を鋳型とし、pig5-3(配列番号5)とpig32-2(配列番号6)とを、それぞれ5’側および3’側プライマーとして用いて、PCRを行った。PCRの条件は以下の通りである:95℃で9分熱変性した後、変性:92℃、30秒;アニーリング:60℃、1分;伸長:72℃、1分の反応を、45サイクル繰り返し、最後に72℃、5分反応させた。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色してPCR産物(DNA断片)を検出した。結果を図6に示す。
魚粉に使用される種々の魚類由来の成分を幅広く検出する目的で、図7に示すatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、数箇所のプライマー領域を選択した。図7には、例として、fish5(配列番号7)とfish3-1(配列番号15)ならびにFM5(配列番号12)とFM3(配列番号25)の位置を二重下線で示す。
市販の牛飼育用の配合飼料およびチキンミールに混入した魚粉を検出できるかどうかについて検討した。使用した魚粉の原料は(1)サバおよびサンマ、(2)マグロおよびカツオ、ならびに(3)イワシであり、0.5mmメッシュの網ふるいを通過したものを使用した。配合飼料としては、市販の牛用配合飼料を粉砕器および乳鉢で粉砕し、0.5mmメッシュの網ふるいを通過したものを使用した。なお、配合飼料の配合割合は、以下の表3に示すとおりである。チキンミールは、市販のチキンミールであり、0.5mmメッシュの網ふるいを通過したものを使用した。
鶏由来の成分を幅広く検出する目的で、図8に示すatp8遺伝子およびその近傍のDNA配列のアラインメントに基づいて、数箇所のプライマー領域を選択した。図8には、例として、chick5-1(配列番号32)とchick3-1(配列番号36)の位置を二重下線で示す。
上記実施例6で用いた市販の牛飼育用の配合飼料中に、市販のチキンミールを10、1、0.1、0.01、または0.001質量%含む試料を調製した。これらの試料および無添加の試料について、上記実施例5と同様にDNAを抽出し、chick5-1(配列番号32)とchick3-1(配列番号36)とのプライマー対を用いてPCRを行った。
Claims (27)
- 配列表の配列番号1の配列と配列表の配列番号2の配列との組み合わせである、反芻動物特異的DNA検出用プライマー対。
- 前記反芻動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、およびシカからなる群より選択される、請求項1に記載のプライマー対。
- 配列表の配列番号3の配列と配列表の配列番号4の配列との組み合わせである、ウシ特異的DNA検出用プライマー対。
- 配列表の配列番号5の配列と配列表の配列番号6の配列との組み合わせである、ブタ特異的DNA検出用プライマー対。
- 配列表の配列番号7、8、9、10、11、12、13、および14の配列からなる群より選択される配列と、配列表の配列番号15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、および31の配列からなる群より選択される配列との組み合わせである、魚類特異的DNA検出用プライマー対。
- 前記魚類が、アジ、イワシ、カタクチイワシ、カツオ、サケ、サバ、サンマ、スケソウダラ、ニジマス、およびマグロからなる群より選択される、請求項5に記載のプライマー対。
- 配列表の配列番号32、33、34、および35の配列からなる群より選択される配列と、配列表の配列番号36、37、および38の配列からなる群より選択される配列との組み合わせである、鶏特異的DNA検出用プライマー対。
- 前記鶏が、ニワトリおよびウズラからなる群より選択される、請求項7に記載のプライマー対。
- 配列表の配列番号39の配列と配列表の配列番号40の配列との組み合わせである、植物特異的DNA検出用プライマー対。
- 試料中の反芻動物由来の成分を検出する方法であって、請求項1に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、方法。
- 前記試料が、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 試料中のウシ由来の成分を検出する方法であって、請求項3に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、方法。
- 前記試料が、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 試料中のブタ由来の成分を検出する方法であって、請求項4に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、方法。
- 前記試料が、生肉、肉加工食品、肉加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
- 試料中の魚類由来の成分を検出する方法であって、請求項5に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、方法。
- 前記試料が、生魚、魚加工食品、魚加工品含有食品、血液、体液、魚粉、フィッシュソリュブル、だし粕、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 試料中の鶏由来の成分を検出する方法であって、請求項7に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、方法。
- 前記試料が、生肉、鶏肉加工食品、鶏肉加工品含有食品、血液、体液、羽毛、肉骨粉、骨粉、チキンミール、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、および飼料添加物からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
- 請求項1または2に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、動物種識別方法。
- 請求項3に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、動物種識別方法。
- 請求項4に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、動物種識別方法。
- 請求項5または6に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、動物種識別方法。
- 請求項7または8に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、動物種識別方法。
- 請求項9に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含む、植物由来成分の検出方法。
- 請求項1から8に記載のプライマー対および配列表の配列番号41の配列と配列表の配列番号42の配列との組み合わせである哺乳動物特異的DNA検出用プライマー対のうちの少なくとも1つのプライマー対を含む、動物由来成分検出用キット。
- さらに、請求項9に記載の植物特異的DNA検出用プライマー対を含む、請求項26に記載のキット。
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