CN102337337A

CN102337337A - 一对鹅源性成分pcr检测用引物

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Publication number: CN102337337A
Application number: CN2011102904806A
Authority: CN
Inventors: 宗卉; 汪燕玲; 曹琛福; 陶虹; 刘建利; 吕建强; 花群义; 卢体康; 秦智锋
Original assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2011-09-28
Filing date: 2011-09-28
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及一种用于检测鹅源性成分的检测方法，尤其涉及一对用于检测鹅细胞线粒体核苷酸序列的引物。本发明旨在鉴定饲料、食品等产品中是否含有鹅源性成分。通过设计特异性扩增引物，利用PCR技术检测遗传上相对独立，没有重复序列，生物个体内无组织特异性的线粒体DNA，建立了鹅源性成分PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定鹅源性成分的目的。

Description

一对鹅源性成分PCR检测用引物

技术领域

本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及一种用于检测鹅源性成分的检测方法，尤其涉及一对用于检测鹅细胞线粒体核苷酸序列的引物。

背景技术

鉴别检测畜、禽源性成分技术是肉食品和饲料出入境海关、贸易、检验检疫中关键定性技术，涉及到肉食品加工业、畜牧养殖业、饲料业、检验检疫部门及其相关管理部门等领域。但是对于鹅的品种鉴定，以及产品中是否含有鹅源性成分还无快速、准确、可靠的检测方法。

利用本发明引物进行的PCR扩增目的片段是线粒体DNA序列。线粒体DNA是高等动物唯一的核外遗传物质，是一个比较理想的用于物种鉴别检测的靶基因序列，其主要原因是：(1)在所有组织细胞中均含有大量的线粒体，可以获得大量的mtDNA，mtDNA在不同的物种间具有高度的变异性；每个动物细胞中存在许多拷贝的线粒体基因组，在采取相同体积的DNA样品进行PCR检测时，线粒体基因组的模板数大大高于细胞核基因组的模板数，这就大大提高了PCR检测的灵敏度。(2)mtDNA主要以编码序列构成，种内的异质基因很少。(3)不同种类的动物线粒体基因组序列虽然高度同源，存在高度保守区域，但也存在一定的变异区域。

发明内容

本发明的目的在于提供一对检测鹅源性成分的引物。以解决准确、快速、可靠的用PCR技术鉴定鹅源性成分。

本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现：

1.设计引物：用于检测鹅源性成分的引物是根据线粒体DNA中高度保守的D-Loop区序列进行设计，具体引物序列如下：

上游引物F：5’-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3’；

下游引物R：5’-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3’。

2.提取样品DNA：采用氯仿抽提法或商业DNA提取试剂盒提取样品DNA。

3.采用步骤1设计的引物进行PCR扩增：PCR反应体系为25μL，包括2.5μL 10×PCRBuffer(含Mg2+20mmol/L)，3μL dNTPs(2.5mmol/L)，1μLTaq酶(2U/μL)，上下游引物F/R各3μL(终浓度为1.2μM)，DNA模板2μL，超纯水补至25μL。可采用商业化的PCR反应母液。PCR反应程序为：预变性94℃5min；然后94℃50sec，65℃40sec，72℃40sec循环35次；72℃3min。反应完成后在4℃下保存。

4.电泳检测：PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。若动物产品和饲料中含有鹅源性成分，则在电泳图304bp位置处出现扩增目的条带。

本发明的有益效果是，对活动物、食用性动物产品、非食用性动物产品、动物源性饲料及饲料添加剂等进行品种鉴定。利用本发明的引物采用PCR方法可以有效检出动物产品和饲料中的鹅源性成分，并进行鉴别检测，其扩增目的条带长度为304bp，检测最低限为0.01％。

附图说明：

图1鹅引物特异性PCR检测电泳图

图中M.Marker 2000；1.鹅、2.火鸡、3.鸭、4.鹌鹑、5.鸽、6.鸵鸟、7.鸡、8.马、9.牛、10.羊、11.猪、12.狗、13.驴、14.猫、15.鱼；16.空白对照

图2鹅引物灵敏度PCR检测电泳图

图中M：marker DL2000；1：100％(鹅DNA)；2：50％；3：10％；

4：5％；5：1％；6：0.1％；7：0.01％；8：空白

具体实施方式：

以下据所示最佳实施例对本发明作进一步详述。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

1.引物的设计：根据NCBI中已经发表的鹅线粒体基因组序列(登录号为：EU571957)在D-Loop区设计一对引物，序列如下：

上游引物F：5’-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3’；

下游引物R：5’-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3’。

2.样品总DNA的提取

采用氯仿抽提法或商业DNA提取试剂盒，提取鹅、火鸡、鸭、鹌鹑、鸵鸟、鸽、鸡、马、牛、羊、猪、驴、狗、猫、鱼的基因组DNA，提取的基因组DNA均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD₂₆₀/OD₂₈₀值均为1.8左右，说明DNA纯度较高符合PCR扩增要求。

3.鹅源性成分PCR扩增

利用步骤1设计的特异性引物，以鹅DNA等为模板进行PCR扩增。

3.1PCR反应体系为25μL，包括2.5μL 10×PCR Buffer(含Mg²⁺20mmol/L)，3μL dNTPs(2.5mmol/L)，1μLTaq酶(2U/μL)，上下游引物F/R各3μL(终浓度为1.2μM)，DNA模板2μL，超纯水补至25μL。可采用商业化的PCR反应母液。

3.2PCR反应程序为：预变性94℃5min；然后94℃50sec，65℃40sec，72℃40sec循环35次；72℃3min。反应完成后在4℃下保存。

4.电泳检测：PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

5.引物的特异性验证

利用所设计鉴别检测鹅源性成分的特异性引物，分别以鹅、火鸡、鸭、鹌鹑、鸵鸟、鸽、鸡、马、牛、羊、猪、驴、狗、猫、鱼的总DNA为模板，按上述3进行PCR反应，验证引物的特异性。经电泳检测，结果如图1所示，1号样品在304bp位置处出现目的扩增条带，其它样品没有鹅源性成分DNA，则无目的扩增条带，显示上述引物有良好的特异性。

6.PCR的灵敏度验证

将研磨成粉末的鹅肉骨粉样品用鱼肉粉末稀释(100g/100g)，至鹅成分样品含量分别为100.00、50.00、10.00、1.00、0.10、0.01g/100g，提取DNA，按上述3进行PCR反应，经电泳检测结果如图2。可知其检测低限至少可达0.01％纯鹅肉样DNA浓度，该引物的灵敏度可达0.01％纯鹅肉样品。

Claims

1.一对用于检测鹅源性成分的引物，其特征在于所述的引物序列包括：

上游引物F：5’-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3’；

下游引物R：5’-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3’。