CN104789647B - 快速检测动物源性核酸的方法、引物对及试剂盒 - Google Patents

快速检测动物源性核酸的方法、引物对及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测动物源性核酸的方法、引物对及试剂盒，该方法包括：通过引物对，对样本的DNA序列进行PCR反应，获得PCR反应产物，其中，4对引物是根据4条动物源性DNA序列分别设计的，4条动物源性DNA序列分别是：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4；对PCR反应产物进行电泳检测；根据电泳检测的结果，预测样本中是否含有动物源性核酸。通过上述方式，本发明能够快速检测样本中是否含有动物源性成分。

Description

快速检测动物源性核酸的方法、引物对及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种快速检测动物源性核酸的方法、引物对及试剂盒。
背景技术
物种识别技术是现今的DNA条形码技术(DNA Barcoding)。DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的DNA片段，具有通用稳定、不易变异、易扩增且相对较短等特点。DNA条形码技术有效地补充了传统物种鉴定方法，不但对物种鉴定和分类学等基础研究具有重要意义，而且在环境和食品等领域也已发挥广泛的应用价值。
目前，一系列DNA条形码计划正在世界各地进行。在加拿大丘吉尔的北极圈附近地区，科学家对6000种物种进行编目，包括数量惊人的昆虫；在新几内亚，DNA条形码用于了解蝴蝶的进化。这些DNA条形码技术研究热点主要集中在进化树最底层的物种分辨。
但是，上述研究理念对物种区分精度较高，合格DNA条形码序列并不易寻找；在实际环境和食品检测应用中，对物种的精度时常并无具体要求，只需区分进化树上较大分支(如动物与植物、细菌与真菌等)即可；因此上述研究无法实现快速检测样本中是否含有进化树上较大分支的物种。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种快速检测动物源性核酸的方法、引物对及试剂盒，能够快速检测样本中是否含有动物源性成分。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种快速检测动物源性核酸的方法，包括：通过引物对，对样本的DNA序列进行PCR反应，获得PCR反应产物，其中，所述引物对是根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计的，所述四条动物源性DNA序列分别是：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4；对所述PCR反应产物进行电泳检测；根据所述电泳检测的结果，预测所述样本中是否含有动物源性核酸。
其中，所述引物对包括第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物是5'TTCTCCAGGGTACTGTACACGC3'，所述第一反向引物是5'CTCAAAAGAGGGCAGACGCA3'。
其中，所述引物对包括第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物是5'GAAGTCTGTTCTGCTCAAGC3'，所述第二反向引物是5'GGATGCATGAAAACCACTTG3'。
其中，所述引物对包括第三正向引物和第三反向引物，所述第三正向引物是5'CAAAAAGTCCAGTCCCCCCAGC3'，所述第三反向引物是5'AAGGTAAAAAGCAGGAACGC3'。
其中，所述引物对包括第四正向引物和第四反向引物，所述第四正向引物是5'ATGCTGTTTAAGAAAAGGGGGA3'，所述第四反向引物是5'TGCCACTGCCTGAAGATAAC3'。
其中，所述通过引物对，对样本的DNA序列进行PCR反应，获得PCR反应产物的步骤之前，包括：通过文献资料收集动物固有且保守的DNA序列，获得第一DNA序列集合；利用植物基因数据库筛查所述第一DNA序列集合，获得第二DNA序列集合，其中，所述第二DNA序列集合与所述植物基因数据库中的DNA序列完全不匹配；利用动物基因数据库筛查所述第二DNA序列集合，获得第三DNA序列集合，所述第三DNA序列集合与所述动物基因数据库中的DNA序列完全匹配；对所述第三DNA序列进行引物设计并经过验证试验，获得第四DNA序列集合，所述第四DNA序列集合即为包括所述四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上的DNA序列；根据所述四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上动物源性DNA序列，进行引物对的设计。
其中，所述动物源性DNA序列所对应的物种至少为猪、牛、鸡或鸭。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种引物对，所述引物对是如上所述任一项所述的引物对。
为解决上述技术问题，本发明采用的又一个技术方案是：提供一种快速检测动物源性核酸的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述任一项所述的引物对。
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明通过根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计的引物对，对样本的DNA序列进行PCR反应；对PCR反应产物进行电泳检测；根据电泳检测的结果，确定样本中是否含有动物源性核酸。由于引物对是根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计的，通过这种方式，能够快速检测样本中是否含有动物源性成分。
附图说明
图1是本发明快速检测动物源性核酸的方法一实施方式的流程图；
图2是本发明快速检测动物源性核酸的方法另一实施方式的流程图；
图3是本发明快速检测动物源性核酸的方法质控组电泳检测图；
图4是本发明快速检测动物源性核酸的方法第一引物对PCR反应后产物的电泳检测图；
图5是本发明快速检测动物源性核酸的方法第二引物对PCR反应后产物的电泳检测图；
图6是本发明快速检测动物源性核酸的方法第三引物对PCR反应后产物的电泳检测图；
图7是本发明快速检测动物源性核酸的方法第四引物对PCR反应后产物的电泳检测图；
图8是本发明快速检测动物源性核酸的方法第五引物对PCR反应后产物的电泳检测图；
图9是本发明快速检测动物源性核酸的方法第六引物对PCR反应后产物的电泳检测图；
图10是本发明快速检测动物源性核酸的方法第七引物对PCR反应后产物的电泳检测图；
图11是本发明快速检测动物源性核酸的方法第八引物对PCR反应后产物的电泳检测图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。
参阅图1，图1是本发明快速检测动物源性核酸的方法一实施方式的流程图，包括：
步骤S101：通过引物对，对样本的DNA序列进行PCR反应，获得PCR反应产物，其中，引物对是根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计的，四条动物源性DNA序列分别是：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4。
引物是一小段单链DNA或RNA，是DNA或RNA复制的起始点。一对引物对包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物分别和DNA双链的正向链和反向链结合。
四条动物源性DNA序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4是经过多重筛选验证过的、植物中没有且是动物固有保守的序列。引物对根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计，即可以根据一条动物源性DNA序列设计一对引物对，可以根据两条动物源性DNA序列设计两对引物对，可以根据三条动物源性DNA序列设计三对引物对，可以根据四条动物源性DNA序列设计四对引物对，因此引物对可以是一对或一对以上，利用该一对或一对以上引物对与样本的DNA序列进行PCR反应，通过检测该PCR反应产物，即可预测样本中是否含有动物源性核酸。
SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4的DNA序列如下：
SEQ ID NO：1
tcactgtgcc attttttcat gtgtttctcc agggtactgt acacgctaaa aggcatctta60
caaatttcac atttgtaaac gtccttcccc acctggccat gcgttttcat gtgcctggtg120
agcttgctac tctgggcaca ggcatagttg cacagctcgc atttataagg cctttcgccc180
gtgtggcttc tcctgtggac agtgagattg ctacagttct tgaagacttt cccacagtac240
tcacaagtgt cgctgcgtct gccctctttt gagctgggcc tgcccgggcc cggaccacta300
atatggggcg tgctccctcc acttcc326
SEQ ID NO：2
tctctgaatg gcagaagtct gttctgctca agcacaaagt atacacagat gtctatatta60
cattcttata ggtttgacag caactgcatg ttgtatctat aaactgtcct ttagcagtga120
cacttcctca atgatgataa gctaatttat gcaactaaat ctcctttgtg cagaaatgaa180
agctaattga gtcattacaa agtaattcag gaaggaatac cttgtataaa ttggcttact240
ttataaatcc ttctcaagtg gttttcatgc atcctaaatg ggactaagca g291
SEQ ID NO：3
cgagatgaaa ttgagacatg gaagaattta ttgcccagaa aattccattc tgctatctga60
ttcaaaaagt ccagtccccc cagcttcgga aaatctattt tccacatttt aataccctgc120
agaacagtcc tcataactca tccgagtgtg ttaagcacag ttttattaga tctgaaacaa180
attttggtgg ggagatacta taggtcatta accatggagt aattttatcc ttgtttccct240
aatgatgcca taatggcgag cgaatttctt aactaaagac caaagaacat tttgaaggtc300
agtttcatct gtgagctcct tcaagcgctt ctcagagaag attggaaaac tcgccgattt360
tttgaagagt cattaataat gtgaaagctg aaagcaccct ccatttgcgt tcctgctttt420
taccttttaa ttttatatcg tccc444
SEQ ID NO：4
acaaaacaga tgctgtttaa gaaaaggggg aacataattt tgtgggcaat gaattaagtg60
tttttgtggc cctctcatcc gtagctagga gcagtttgtg gaccgcgtct gtgaacgcgg120
ctcataattg tttttcacac ataagttatg caaatgagct tttatggcaa ctggcataac180
aattagcatc ctccagcaat attttagcag gttaattgca aaatttctaa attgtacatc240
tgacttgtta attaggcatg acagaggtgg taaaatagtt atcttcaggc agtggcagcc300
aggagctgct tgaaatgcaa agagcaa327
其中，根据四条动物源性DNA序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4设计的4对引物对分别是：
(1)第一正向引物是5'TTCTCCAGGGTACTGTACACGC3'(即SEQ ID NO：5)，第一反向引物是5'CTCAAAAGAGGGCAGACGCA3'(即SEQ ID NO：6)。
(2)第二正向引物是5'GAAGTCTGTTCTGCTCAAGC3'(即SEQ ID NO：7)，第二反向引物是5'GGATGCATGAAAACCACTTG3'(即SEQ ID NO：8)。
(3)第三正向引物是5'CAAAAAGTCCAGTCCCCCCAGC3'(即SEQ ID NO：9)，第三反向引物是5'AAGGTAAAAAGCAGGAACGC3'(即SEQ ID NO：10)。
(4)第四正向引物是5'ATGCTGTTTAAGAAAAGGGGGA3'(即SEQ ID NO：11)，第四反向引物是5'TGCCACTGCCTGAAGATAAC3'(即SEQ ID NO：12)。
通过上述四条引物对中的任意一对或一对以上，对样本的DNA序列进行PCR扩增，对扩增的PCR产物进行检测，即可预测样本中是否含有动物源性核酸。
步骤S102：对PCR反应产物进行电泳检测。
步骤S103：根据电泳检测的结果，预测样本中是否含有动物源性核酸。
如果引物对是一对或一对以上，对PCR反应产物进行电泳检测，如果出现一个或一个以上的阳性结果，均可以预测样本中含有动物源性核酸，如果没有出现阳性结果，则可以预测样本中不含有动物源性核酸。
其中，动物源性DNA序列所对应的物种至少为猪、牛、鸡或鸭。
本发明实施方式通过根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计的引物对，对样本的DNA序列进行PCR反应；对PCR反应产物进行电泳检测；根据电泳检测的结果，确定样本中是否含有动物源性核酸。由于引物对是根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计的，通过这种方式，能够快速检测样本中是否含有动物源性成分。
参阅图2，图2是本发明快速检测动物源性核酸的方法另一实施方式的流程图，本实施方式和图1的实施方式基本相同，相同之处请参见图1以及相应的文字说明，不同之处在于本实施方式还包括步骤S201至步骤S205，具体内容如下：
步骤S201：通过文献资料收集动物固有且保守的DNA序列，获得第一DNA序列集合。
步骤S202：利用植物基因数据库筛查第一DNA序列集合，获得第二DNA序列集合，其中，第二DNA序列集合与植物基因数据库中的DNA序列完全不匹配。
步骤S203：利用动物基因数据库筛查第二DNA序列集合，获得第三DNA序列集合，第三DNA序列集合与动物基因数据库中的DNA序列完全匹配。
例如：上述步骤S201至步骤S203在实际应用中的一个具体过程包括如下步骤：
1)通过文献资料，查找在动物中固有且保守的候选序列，候选序列总条数为481(即第一DNA序列集合)；
2)新建一个文件，补充候选序列信息：包含序列ID、长度、染色体ID、起始位置、终止位置；
3)将第2)步补充信息所获得的候选序列按染色体分隔成不同的小文件，以染色体命名，如origin.chr$i；
4)从美国国立生物技术信息中心NCBI中获取参考序列hg16，命名为chr$i.fa；
5)依据第4)步参考序列hg16的信息，将第3)步的小文件相应的碱基信息补充完整，命名为chr$i.seq；
6)将第5)步得到的chr$i.seq文件转换成fasta格式，文件名为chr$i.seq.fa，以便后续步骤的数据库比对；
7)将第6)步的chr$i.seq.fa整合成一个大文件all.chr.seq.fa，方便比对；
8)将第7)步的文件与千种植物数据库(http://www.bioinfodata.org/ Blast4OneKP/)进行比对，得到比对结果文件blast_1.txt；
9)对blast_1.txt进行筛选，获得65条(即第二DNA序列集合)与千种植物数据库完全不匹配的序列(即blast结果显示No hitsfound的序列)，将其输出，文件命名为no_hits.query；
10)根据no_hits.query中的序列编号(序列ID)补全碱基信息，并整合成一个大文件no_hits.fa；
11)将no_hits.fa与NCBI的动物全基因组数据库进行blast比对；
12)将no_hits.fa与NCBI的植物全基因组数据库进行blast比对，进行再次验证，结果显示65条序列与所有植物均无匹配；
13)根据动物比对结果，从65条序列中挑选了8条DNA序列(即为第三DNA序列集合)，8条动物源性DNA序列比对的结果如下表1所示：
表1
其中，blast比对的网址是：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？ PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome，涉及参数只有Program Selection这一块，即Optimize for：选择Somewhat similar seqeunce(blastn)，其它的参数为默认参数。
在blast比对选取8条DNA序列的时候，选择序列的主要标准是：
1、在牛、猪、羊、鸡、大鼠选定物种中匹配度尽量高；
2、优先考虑牛、猪、大鼠的匹配度，其次是羊和鸡；斑马鱼数据只供参考，不作选定指标之用；
3、在匹配度满足条件的情况下，选择与选定物种匹配区域最多的序列，匹配区域最多即同一条序列可能在某物种基因组的多个区域均能比对上。
步骤S204：对第三DNA序列进行引物设计并经过验证试验，获得第四DNA序列集合，第四DNA序列集合即为包括四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上的DNA序列。
步骤S205：根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上动物源性DNA序列，进行引物对的设计。
根据引物的设计原则，采用专用的引物设计软件(例如：Primer Premier&Oligo)根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上动物源性DNA序列进行引物设计。
其中，根据四条动物源性DNA序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4设计的4对引物对分别是：
(1)第一正向引物是5'TTCTCCAGGGTACTGTACACGC3'，第一反向引物是5'CTCAAAAGAGGGCAGACGCA3'。
(2)第二正向引物是5'GAAGTCTGTTCTGCTCAAGC3'，第二反向引物是5'GGATGCATGAAAACCACTTG3'。
(3)第三正向引物是5'CAAAAAGTCCAGTCCCCCCAGC3'，第三反向引物是5'AAGGTAAAAAGCAGGAACGC3'。
(4)第四正向引物是5'ATGCTGTTTAAGAAAAGGGGGA3'，第四反向引物是5'TGCCACTGCCTGAAGATAAC3'。
步骤S206：通过引物对，对样本的DNA序列进行PCR反应，获得PCR反应产物，其中，4对引物是根据四条动物源性DNA序列分别设计的，四条动物源性DNA序列分别是：SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：4。
步骤S207：对PCR反应产物进行电泳检测。
步骤S208：根据电泳检测的结果，预测样本中是否含有动物源性核酸。
上述步骤S204至步骤S208在实际应用中的一个具体过程包括如下步骤：
四个被测样本来自动物肌肉组织(鸡肝、牛肉、鸭肉、猪肉)，另七个样本来自植物种子(辣椒、油菜、黄豆、向日葵、玉米、小麦、大麦)。
第一部分：提取样本的DNA：
A.动物肌肉组织DNA提取操作流程：
本操作采用Magen D3121-02#HiPure Tissue DNA Mini Kit试剂盒进行提取。
1)称取约30mg动物肌肉组织，然后将该称取的动物肌肉组织置于
1.5mL离心管中；
2)在上述1.5mL离心管中加入230μL组织总蛋白裂解液ATL(Tissue TotalProtein Lysis Buffer Solution)和20μL蛋白酶K(Proteinase K)溶液，使用与离心管匹配的研磨棒将组织研碎；
3)将上述经过步骤2)的1.5mL离心管置于55℃的水浴中，放置30-60分钟，直至管内组织块消失；
4)在上述经过步骤3)的1.5mL离心管中加入10μL浓度为50mg/mL的RNA酶溶液(Rnase Solution)，并混和均匀，然后将该1.5mL离心管放置在室温或37℃水浴锅中，并放置15-60分钟；
5)将上述经过步骤4)的1.5mL离心管置于离心机离心，离心的转速是10,000rpm，离心时间是5分钟，将离心后的上清液转移至新的1.5mL离心管中；
6)在上述步骤5)新的1.5mL离心管中加入250μLDL(试剂盒中的代号)溶液，然后将该1.5mL离心管置于离心机中高速涡旋30秒，以混和均匀，接着将该1.5mL离心管置于70℃水浴中，放置10分钟；
7)在上述经过步骤6)的1.5mL离心管中加入250μL无水乙醇，将该1.5mL离心管置于离心机中高速涡旋30秒，以混和均匀；
8)将上述步骤7)获得的混合液转移至HiPure gDNA Mini柱中，在10,000rpm的转速下离心1分钟；
9)在上述步骤8)的HiPure gDNA Mini柱中加入500μL乙醇稀释的GW1(试剂盒中的代号)溶液，然后继续在10,000rpm的转速下离心1分钟；
10)在上述步骤9)的HiPure gDNA Mini柱中加入650μL乙醇稀释的GW2(试剂盒中的代号)溶液，然后继续在10,000rpm的转速下离心1分钟；
11)在上述步骤10)的HiPure gDNA Mini柱中再加入650μL乙醇稀释的GW2(试剂盒中的代号)溶液，然后继续在10,000rpm的转速下离心1分钟；
12)将滤液扔掉后，将柱子再在10,000rpm的转速下离心2分钟；
13)将上述柱子装在新的1.5mL离心管中，然后加入50-100μL预热至70℃的洗脱缓冲液(Elution Buffer)或TE缓冲液(Buffer TE)至柱子的膜中央，静置3分钟后，在10,000rpm的转速下离心1分钟；
14)在上述经过步骤13)的柱子中再次加入50-100μL预热至70℃的洗脱缓冲液(Elution Buffer)或TE缓冲液(Buffer TE)至柱子的膜中央，静置3分钟后，在10,000rpm的转速下离心1分钟；
15)收集经过步骤14)的DNA洗脱液，在2-8℃中保存DNA洗脱液，如果长期保存DNA洗脱液，需要置于-20℃中。
B.植物种子DNA提取操作流程：
本操作采用Magen D3161-02#HiPure Plant DNA Kits试剂盒进行提取。
1)称取适量植物干燥种子，然后将称取的植物干燥种子置于研钵中快速研磨成粉末，并将该粉末转移至2.0mL离心管中；
2)在经过步骤1)的2.0mL离心管中立即加入相应体积的缓冲液PTL、100μL浓度为1.62mol/L的DTT溶液和相应体积的RNase Solution溶液；
3)使经过步骤2)的2.0mL离心管剧烈涡旋，以便于样品充分分散；
4)将经过步骤3)的2.0mL离心管置于65℃的金属浴中，并混和均匀，持续30分钟；
5)将经过上述步骤4)的2.0mL离心管在室温下、12,000rpm的转速下离心5分钟；
6)将经过上述步骤5)的上清液转移至新的2.0mL离心管中，收集的上清液的体积为900-1000μL；
7)在上述新的2.0mL离心管中加入与上述收集的上清液相同体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)溶液，并使该2.0mL离心管涡旋30秒；
8)将上述经过步骤7)的2.0mL离心管在室温下，12,000rpm的转速下离心5分钟；
9)将经过步骤8)离心后的上清液转移至新的2.0mL离心管中；
10)在经过步骤9)的新的2.0mL离心管中加入与上述上清液同等体积的缓冲液PBD，并使该2.0mL离心管涡旋30秒；
11)将经过步骤10)的混合液(<700μL)转移至柱子(试剂盒中配置)中，在8,000rpm的转速下离心30-60秒；
12)在上述经过步骤11)的柱子中加入500μL用无水乙醇稀释的GW1(试剂盒中的代号)溶液，在8,000rpm的转速下离心30-60秒；
13)在上述经过步骤12)的柱子中加入650μL用无水乙醇稀释的GW2(试剂盒中的代号)溶液，在8,000rpm的转速下离心30-60秒；
14)在上述经过步骤13)的柱子中再次加入650μL用无水乙醇稀释的GW2(试剂盒中的代号)溶液，在8,000rpm的转速下离心30-60秒；
15)将滤液扔掉后，将柱子再在12,000rpm的转速下离心2分钟；
16)将上述柱子转移至新的1.5mL离心管中，往柱子膜中央加入50μL预热到65℃的Elution Buffer，静置3分钟，在10,000rpm的转速下离心1分钟；
17)收集经过步骤16)的DNA洗脱液，将DNA洗脱液保存于-20℃中。
C.核酸质量检测：
1)纯度检测方法：采用分光光度法，用NanoDrop分光光度计检测。
2)浓度检测方法：采用Qubit荧光光度计(Qubit Fluorometer)检测。
3)完整性检测方法：琼脂糖凝胶电泳。
第二部分：PCR实验：
1)PCR反应体系：本实施方式采用30μL普通的PCR反应体系，按试剂盒说明书配制PCR反应体系，试剂盒是TaKaRa Ex(Takara Code：RR001A)。如表2所示：
表2
2)PCR反应条件：95℃的起始温度下，预变性5分钟，此后按98℃变性10秒、60℃退火30秒以及72℃延伸60秒的顺序循环25次，其后在72℃下延伸10分钟，于4℃结束反应。PCR仪器型号为：TC-96/G/H(b)A，杭州博日科技有限公司生产。
第三部分：琼脂糖凝胶电泳实验：
实验条件是：采用DL2000Marker(TaKaRa公司)，Marker上样量为6uL，样品上样量为10uL，凝胶浓度为2.0％，电压为100V，电泳时间为120分钟，EB浸泡染色时间为10分钟。结束后，于紫外灯下观察并拍照。
第四部分：PCR产物纯化实验：
在此次实验操作中，纯化实验采用QIAquick PCR Purification Kit Protocol试剂盒。
简要实验步骤如下：
1)向PCR产物中加入五倍体积的PBI溶液，用移液器吹打均匀后，转入纯化柱中，体积不能超过700ul；
注：PBI溶液为加了pH指示剂的PB(试剂盒中的代码)溶液；PB溶液与pH指示剂体积比为250:1。
2)将纯化柱在8000rpm的转速下离心30秒；
3)丢弃管内废液，加730ul PE(试剂盒中的代码)溶液至纯化柱内；
4)将纯化柱在8000rpm的转速下离心30秒；
5)丢弃管内废液，将纯化柱在12000rpm的转速下空转离心2分钟；
6)用移液器轻抵纯化柱内壁旋转一圈，吸去残留PE，然后将纯化柱转移至一新离心管内，并在室温下晾3分钟；
7)将一定体积的洗脱缓冲液Elution Buffer加至纯化柱的吸附膜上，保持5分钟，以便于溶解DNA；
8)将纯化柱在12000rpm的转速下离心2分钟，收集滤液即得到PCR纯化产物。
第五部分：测序验证：
将上述第四部分中纯化后的PCR产物取20uL，递交给基因测序公司进行测序。
说明：
1)该验证实验所用被试动物样本有：鸡肝、牛肉、鸭肉、猪肉；
2)该验证实验所用被试植物样本有：辣椒种子、油菜种子、大豆种子、葵花种子、玉米种子、小麦种子、水稻种子；
3)所有动物样本按本申请中所述动物核酸提取方法提取DNA，所有植物样本按申请中所述植物方法提取DNA；
4)该验证实验所用阳性对照为人DNA；
5)为了保证实验中提取出的核酸确实具有活性，防止出现假阴性结果，所有被试样本均做质控对照，即对每种核酸均另外设计引物，结果显示该核酸可扩增，如图3所示，说明该核酸具有活性，且核酸中没有能明显干扰PCR结果的抑制剂；
质控组各物种样本引物信息如表3：
表3
6)用8条候选出来的动物源性DNA序列(即第三DNA序列集合)的8对引物对用于验证实验(动物、植物被试样本、阳性对照、阴性对照)；
第一正向引物和第一反向引物(第一引物对1R/1F)所组成的引物对对被试动物样本鸡肝、牛肉、鸭肉、猪肉，被试植物样本辣椒种子、油菜种子、大豆种子、葵花种子、玉米种子、小麦种子、水稻种子PCR扩增后的电泳图如图4所示。
第二正向引物和第二反向引物(第二引物对2R/2F)所组成的引物对对被试动物样本鸡肝、牛肉、鸭肉、猪肉，被试植物样本辣椒种子、油菜种子、大豆种子、葵花种子、玉米种子、小麦种子、水稻种子PCR扩增后的电泳图如图5所示。
第三正向引物和第三反向引物(第三引物对3R/3F)所组成的引物对对被试动物样本鸡肝、牛肉、鸭肉、猪肉，被试植物样本辣椒种子、油菜种子、大豆种子、葵花种子、玉米种子、小麦种子、水稻种子PCR扩增后的电泳图如图6所示。
第四正向引物和第四反向引物(第四引物对4R/4F)所组成的引物对对被试动物样本鸡肝、牛肉、鸭肉、猪肉，被试植物样本辣椒种子、油菜种子、大豆种子、葵花种子、玉米种子、小麦种子、水稻种子PCR扩增后的电泳图如图7所示。
第五正向引物和第五反向引物(第五引物对5R/5F)所组成的引物对对被试动物样本鸡肝、牛肉、鸭肉、猪肉，被试植物样本辣椒种子、油菜种子、大豆种子、葵花种子、玉米种子、小麦种子、水稻种子PCR扩增后的电泳图如图8所示。
第六正向引物和第六反向引物(第六引物对6R/6F)所组成的引物对对被试动物样本鸡肝、牛肉、鸭肉、猪肉，被试植物样本辣椒种子、油菜种子、大豆种子、葵花种子、玉米种子、小麦种子、水稻种子PCR扩增后的电泳图如图9所示。
第七正向引物和第七反向引物(第七引物对7R/7F)所组成的引物对对被试动物样本鸡肝、牛肉、鸭肉、猪肉，被试植物样本辣椒种子、油菜种子、大豆种子、葵花种子、玉米种子、小麦种子、水稻种子PCR扩增后的电泳图如图10所示。
第八正向引物和第八反向引物(第八引物对8R/8F)所组成的引物对对被试动物样本鸡肝、牛肉、鸭肉、猪肉，被试植物样本辣椒种子、油菜种子、大豆种子、葵花种子、玉米种子、小麦种子、水稻种子PCR扩增后的电泳图如图11所示。
若PCR扩增反应后，根据琼脂糖凝胶电泳的结果，判断出所扩增目的片段为阳性，则认为该试验样品内包含动物源性核酸(阳性结果)，该动物源性指向物种范围至少为猪、牛、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠；若根据琼脂糖凝胶电泳，判断出所扩增目的片段为阴性，则认为该试验样品内不包含动物源性核酸(阴性结果)，该动物源性指向物种范围至少为猪、牛、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠。待测样品含有动物源性核酸的结果判定依据为：阳性对照样品结果为阳性，阴性对照及空白对照样品结果为阴性。
上述实验结果表明：本申请中通过生物信息学手段从大量序列中筛选出的8条动物源性DNA序列，经过试验验证，其中4条动物源性DNA序列获得良好的区分结果，可用于模糊区分动物和植物，分别是SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4。
待检样通过4对引物对中的一对或以上进行PCR扩增后的产物，经过检测，只要检测到4条动物源性中任何一个动物源性通用目的片段，则检测结果为阳性，其中，4条动物源性DNA序列的大小分别为326bp、291bp、444bp、327bp。
上面的第四和第五部分是为了进一步验证PCR扩增的产物阳性结果中的DNA序列是否是四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上。经过最终的测序验证，结果表明：PCR扩增的产物阳性结果中的DNA序列是四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上。
本发明实施方式通过根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计的引物对，对样本的DNA序列进行PCR反应；对PCR反应产物进行电泳检测；根据电泳检测的结果，确定样本中是否含有动物源性核酸。由于引物对是根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计的，通过这种方式，能够快速检测样本中是否含有动物源性成分。
本发明还提供了一种引物对，引物对是根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计的，四条动物源性DNA序列分别是：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4。
其中，引物对是如上所述的任何引物对，在此不再一一赘叙。
本发明还提供快一种速检测动物源性核酸的试剂盒，该试剂盒包括引物对，引物对是根据四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上进行设计的，四条动物源性DNA序列分别是：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4。其中，引物对是如上所述的任何引物对，在此不再一一赘叙。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种快速检测动物源性核酸的方法，其特征在于，包括：
通过根据四条动物源性DNA序列中的任一条设计的引物对，对样本的DNA序列进行PCR反应，获得PCR反应产物，其中，所述四条动物源性DNA序列分别是：SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：4，其中，所述动物源性DNA序列所对应的物种为猪、牛、羊、鸡、鸭、大鼠中的一种或两种以上的组合；
对所述PCR反应产物进行电泳检测；
根据所述电泳检测的结果，预测所述样本中是否含有动物源性核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物对包括第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物是5'GAAGTCTGTTCTGCTCAAGC3'，所述第二反向引物是5'GGATGCATGAAAACCACTTG3'。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物对包括第三正向引物和第三反向引物，所述第三正向引物是5'CAAAAAGTCCAGTCCCCCCAGC3'，所述第三反向引物是5'AAGGTAAAAAGCAGGAACGC3'。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物对包括第四正向引物和第四反向引物，所述第四正向引物是5'ATGCTGTTTAAGAAAAGGGGGA3'，所述第四反向引物是5'TGCCACTGCCTGAAGATAAC3'。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通过根据四条动物源性DNA序列中的任一条设计的引物对，对样本的DNA序列进行PCR反应，获得PCR反应产物的步骤之前，包括：
通过文献资料收集动物固有且保守的DNA序列，获得第一DNA序列集合；
利用植物基因数据库筛查所述第一DNA序列集合，获得第二DNA序列集合，其中，所述第二DNA序列集合与所述植物基因数据库中的DNA序列完全不匹配；
利用动物基因数据库筛查所述第二DNA序列集合，获得第三DNA序列集合，所述第三DNA序列集合与所述动物基因数据库中的DNA序列完全匹配；
对所述第三DNA序列进行引物设计并经过实验验证，获得第四DNA序列集合，所述第四DNA序列集合即为包括所述四条动物源性DNA序列中的一条或一条以上的DNA序列。
6.一种引物对，其特征在于，所述引物对是权利要求2至4任一项所述的方法中的引物对。
7.一种快速检测动物源性核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求6所述的引物对。
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