JP5682075B2 - 動物由来dna検出用プライマー配列 - Google Patents
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Description
(a)DNA配列の検索対象領域を決定する工程;
(b)該領域について該特定の動物種または群のDNA配列のリストを取得し、該特定の動物種または群のDNA配列をマルチプルアラインメントする工程;
(c)該マルチプルアラインメントしたDNA配列から、コンセンサス配列を得る工程;
(d)該領域について該特定の動物種または群とは異なる動植物種または群のDNA配列のリストを取得し、該異なる動植物種または群のDNA配列と該コンセンサス配列とをマルチプルアラインメントする工程;
(e)該工程(d)でマルチプルアラインメントしたDNA配列における任意の塩基長の範囲内で縦列間の塩基を比較して、該範囲のコンセンサス配列をスコアリングする工程であって、該スコアリングが、該コンセンサス配列と異なる塩基について、該範囲の5’または3’末端からの距離、ギャップの有無、および塩基の種類に応じて設定された重みを加算して行われる、工程;
(f)該工程(e)でスコアリングされたコンセンサス配列から、スコアが高いコンセンサス配列を選択する工程;
(g)該工程(f)で選択されたコンセンサス配列の塩基を修正する工程であって、該修正が、該範囲のコンセンサス配列のTm値が任意の温度になるように塩基長を調節し、そして該調節されたコンセンサス配列でホモダイマーを形成しないように塩基を置換することである、工程;
(h)該修正されたコンセンサス配列について、該領域における該コンセンサス配列間の距離が適切な塩基長になるように、対とすべきコンセンサス配列を選択する工程;および
(i)該選択されたコンセンサス配列の対について、特異性および検出感度を確認する工程;
を含む。
(a)DNA配列の検索対象領域を決定する工程;
(b)該領域について該特定の動物種または群のDNA配列のリストを取得し、該特定の動物種または群のDNA配列をマルチプルアラインメントする工程;
(c)該マルチプルアラインメントしたDNA配列から、コンセンサス配列を得る工程;
(d)該領域について該特定の動物種または群とは異なる動植物種または群のDNA配列のリストを取得し、該異なる動植物種または群のDNA配列と該コンセンサス配列とをマルチプルアラインメントする工程;
(e)該工程(d)でマルチプルアラインメントしたDNA配列における任意の塩基長の範囲内で縦列間の塩基を比較して、該範囲のコンセンサス配列をスコアリングする工程であって、該スコアリングが、該コンセンサス配列と異なる塩基について、該範囲の5’または3’末端からの距離、ギャップの有無、および塩基の種類に応じて設定された重みを加算して行われる、工程;
(f)該工程(e)でスコアリングされたコンセンサス配列から、スコアが高いコンセンサス配列を選択する工程;
(g)該工程(f)で選択されたコンセンサス配列の塩基を修正する工程であって、該修正が、該範囲のコンセンサス配列のTm値が任意の温度になるように塩基長を調節し、そして該調節されたコンセンサス配列でホモダイマーを形成しないように塩基を置換することである、工程;
(h)該選択されたコンセンサス配列について、該領域における該コンセンサス配列間の距離が適切な塩基長になるように、対とすべきコンセンサス配列を選択する工程;および
(i)該選択されたコンセンサス配列の対について、特異性および検出感度を確認する工程;
を含む。
まず、工程(a)において、DNA配列の検索対象領域を決定する。検索対象領域としては、目的の特定の動物種または群のDNA配列のどの領域を選択してもよい。以下の工程(b)および(d)において、種々の動物のDNA配列のリストを取得することを考慮すると、多くの動物種または群についてDNA配列が明らかになっているDNA領域が好ましい。本発明においては、核ゲノムDNAよりもコピー数が多くかつ環状で変性に強い点で、ミトコンドリアDNAが好適に用いられる。ミトコンドリアDNA上には、酸化的リン酸化(電子伝達系)に必要な酵素類の生合成に必須である、ATP合成酵素、シトクロムcオキシダーゼなどがコードされている。検索対象とするDNA配列の領域として、このミトコンドリアDNA全体(すなわち、全領域)を選択してもよく、あるいは一部のみを選択してもよい。
次いで、上記工程(a)で選択したDNA配列の領域について、目的の特定の動物種または群のDNA配列のリストを取得して、得られた特定の動物種または群のDNA配列をマルチプルアラインメントする。
次いで、工程(c)では、マルチプルアラインメントしたDNA配列から、コンセンサス配列を得る。コンセンサス配列は、各DNA配列間の相同性に基づいて、例えば、EMBOSS中のコマンド(例えば、CONS)を用いて作成できる。
不一致度1が「5’末端から1番目〜5番目の塩基中にNが0であり、かつ5’末端から6番目〜17番目の塩基中にNが6個以内である場合」とし、
不一致度2が「5’末端から1番目〜7番目の塩基中にNが0であり、かつ5’末端から8番目〜17番目の塩基中にNが3個以内である場合」とし、
不一致度3が「5’末端から1番目〜9番目の塩基中にNが0であり、かつ5’末端から10番目〜17番目の塩基中にNが6個以内である場合」と定義される。この場合は、5’末端から18番目〜25番目の塩基中のNの数はいくつであっても許容される。通常は、不一致度2を指定する。
次に、上記工程(a)で選択したDNA配列の領域について、特定の動物種または群とは異なる動植物種または群のDNA配列のリストを取得し、該異なる動植物種または群のDNA配列と該コンセンサス配列とをマルチプルアラインメントする。
工程(e)では、上記工程(d)でマルチプルアラインメントしたDNA配列における任意の塩基長の範囲内で縦列間の塩基を比較する。任意の塩基長は、プライマーとして適切な塩基長であり得る。通常、15〜30塩基長、好ましくは17〜25塩基長である。上記のコンセンサス配列をスコアリングする。上記コンセンサス配列の種々の位置の任意の塩基長の範囲において、このコンセンサス配列の塩基と、マルチプルアラインメントしたDNA配列の塩基とを縦列間で比較する。比較した場合、各塩基について、塩基の一致または不一致、ギャップなどの差異が見出される。
上記工程(e)でスコアリングされたコンセンサス配列から、スコアが高いコンセンサス配列を選択する。例えば、末端5塩基について、上記のようなスコアを設定した場合、スコア1以上、好ましくはスコア5以上、より好ましくはスコア10以上の配列が選択される。5’または3’側のいずれか一方のみのスコアが高い場合は、フォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれかの候補となり得、両方とも高いスコアを有する場合は、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの両方の候補となり得る。また、上記のように、条件付きで用いられ得る配列も、同様に選択され得る。このような選択も、任意の適切なプログラムを組むことによって行われ得る。
次に、上記工程(f)で選択されたコンセンサス配列の塩基を修正する。修正は、この範囲のコンセンサス配列のTm値が任意の温度になるように塩基長を調節し、そしてこの調節されたコンセンサス配列でホモダイマーを形成しないように塩基を置換する。
工程(h)では、修正されたコンセンサス配列について、該領域における該コンセンサス配列間の距離が適切な塩基長になるように、対とすべきコンセンサス配列を選択する。例えば、取得したプライマーを用いて検出する試料が、加熱処理後の肉由来製品である場合、DNAは切断されて比較的短い。そのため、プライマーによって増幅されるDNAの塩基長は、好ましくは約50〜500bp、より好ましくは約60〜300bp、さらに好ましくは約70〜200bpであり得る。したがって、候補として選択されたコンセンサス配列間の距離も、好ましくは約50〜500bp、より好ましくは約60〜300bp、さらに好ましくは約70〜200bp、特に好ましくは約75〜170bpであり得る。この場合、フォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれか一方のプライマーの特異性が高ければよいので、対として選択される配列は、必ずしも上記工程(f)で選択されたコンセンサス配列である必要はない。
工程(i)では、上記工程(h)で選択されたコンセンサス配列の対について、特異性および検出感度を確認する。このコンセンサス配列は、プライマー候補である。
(実施例1−1:反芻動物特異的DNA検出用プライマーの設計)
検索対象とするDNA配列の領域をミトコンドリアDNAとした。GenBankから、反芻動物のミトコンドリアDNA配列について20種類のID番号のリストを取得した(V00654、AY526085、AY676859、AY676871、AB074964、AF492351、AY676857、AY126697、DQ985076、EF035447、AB245427、AB245426、AB211429、AB218689、AB210267、AY702618、AF533441、AY225986、AF527537、およびAF010406)。EMBOSSをインストールしたコンピュータにおいて、この20種のID番号のリストを入力してDNA配列を取得し、マルチプルアラインメントして、反芻動物についてのコンセンサス配列を作成した。ここでは、厳密と緩いものとの2種のコンセンサス配列を作成した。
上記実施例1−1で得られたコンセンサス配列(スコア8以上)について、BLASTによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、DNA自動合成機を用いて合成した。ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、クジラ、トリ、サケ、カレイ、アジ、タラ、サバ、サンマ、ニジマス、カツオ、イワシ、マグロ、カニ、アサリ、エビ、およびイカの各肉試料から、ミトコンドリアDNAを以下のように調製した。各肉試料を10倍量の緩衝液(10mM Tris−HCl,pH7.5、20mM EDTA,pH7.5)に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キットであるmtDNAエキストラクターCTキット(和光純薬工業製)を用いてDNAを抽出した。
ウシ、シカ、およびヒツジのミトコンドリアDNAについて、予め抽出DNAの濃度を測定した。次いで、PCRチューブあたり1.0ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng(1.0pg)、0.0001ng(0.1pg)、および0.00001ng(0.01pg)のDNAを加えて、ペア1のプライマー対(5D2と3D5との組み合わせ)を用いてPCRを行った。電気泳動写真を図3に示す。その結果、0.1pgのDNAを含む場合でも、電気泳動のバンドはシグナル強度が強く、非常に高感度で検出可能であった。
種々の魚粉、チキンミール、フェザーミール、ポークチキンミール、および家畜用配合飼料について、反芻動物特異的DNAの検出を検討した。100mgとり、上記実施例1−2と同様に10倍量の緩衝液に懸濁し、ビーズ破砕法で破砕した後、市販の組織細胞ミトコンドリアDNA抽出キット(和光純薬工業製)を用いてミトコンドリアDNAを抽出した。このDNAを鋳型として、反芻動物特異的DNA検出用プライマー対(ペア1:5D2と3D5との組み合わせ)を用いて、実施例1−2と同じ条件でPCRを行った。結果を図4に示す。反芻動物由来成分を含まない飼料(レーン1〜12および14〜18)では201bpのバンドは検出されなかったが、ウシ由来成分を含むレーン13の配合飼料については、201bpバンドを検出できた。また、配合飼料にウシ肉骨粉を添加して、種々の濃度のウシ肉骨粉を含む試料を調製した。上記実施例1−2と同様の手順でこれらの試料からミトコンドリアDNAを抽出し、ペア1のプライマー対(5D2と3D5との組み合わせ)を用いて検出感度を確認した。その結果、0.01%(w/w)添加まで検出可能であることがわかった(図5)。
(実施例3−1:ブタ特異的DNA検出用プライマーの設計)
検索対象とするDNA配列の領域をミトコンドリアDNAとし、上記実施例1−1と同様の手順で、ブタ特異的DNA検出用プライマーを設計した。GenBankから、ブタのミトコンドリアDNA配列について40種類のID番号のリストを取得した。また、ブタ以外の動物種のミトコンドリアDNAについても33種類のID番号のリストを取得した。ID番号のリストを以下の表4に示す。
上記実施例3−1で得られたコンセンサス配列(スコア8以上)について、BLASTによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、DNA自動合成機を用いて合成した。6種類のブタの肉試料から、上記実施例1−2と同様の手順でミトコンドリアDNAを調製した。これらの抽出DNAおよび市販のブタミトコンドリアDNA(テキサスジェノミクスジャパン製)を鋳型として、上記実施例1−2と同様にPCRを行った。その結果、以下の表6に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた(図6を参照)。
ブタミトコンドリアDNA(株式会社テキサスジェノミクスジャパン製:濃度10ng/μL)を用いて、PCRチューブあたり1.0ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、および0.0001ngのDNAを加え、上記と同様にPCRを行って、種々のプライマー対について検出感度を検討した。その結果、ペアI(PigATP6-5.3とPigATP6-3.9との組み合わせ)を用いた場合は、0.0001ngのDNAを含む場合でも、電気泳動のバンドはシグナル強度が強く、非常に高感度で検出可能であった(図8)。また、ペアIII(PIG 5HとPIG 3Hとの組み合わせ)の場合も、同様に0.0001ngのDNAを含む場合でも検出可能であった。さらに、ペアIV(PIG 5JとPIG 3Jとの組み合わせ)の場合は、0.1ngのDNAを含む場合まで検出可能であった。
配合飼料中に、種々の量のブタ肉骨粉を添加して、種々の濃度のブタ肉骨粉を含む試料を調製した。上記実施例と同様の手順で、これらの試料からミトコンドリアDNAを抽出し、上記のプライマー対を用いて検出した。その結果、ペアI(PigATP6-5.3とPigATP6-3.9との組み合わせ)を用いた場合は、0.01%(w/w)のブタ肉骨粉を含む場合でさえも検出可能であった(図9)。また、ペアIII(PIG 5HとPIG 3Hとの組み合わせ)の場合は、0.1%(w/w)添加まで検出可能であり、そしてペアIV(PIG 5JとPIG 3Jとの組み合わせ)の場合は、1.0%(w/w)添加まで検出可能であった。
(実施例5−1:クジラ・イルカ類特異的DNA検出用プライマーの設計)
検索対象とするDNA配列の領域をミトコンドリアDNAとし、上記実施例1−1と同様の手順で、クジラ・イルカ類特異的DNA検出用プライマーを設計した。GenBankから、クジラ・イルカ類のミトコンドリアDNA配列について9種類のID番号のリストを取得した。また、クジラ・イルカ類以外の動物種のミトコンドリアDNAについても18種類のID番号のリストを取得した。ID番号のリストを以下の表7に示す。
上記実施例5−1で得られたコンセンサス配列について、BLASTによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、DNA自動合成機を用いて合成した。5種類のクジラ・イルカ類の肉試料から、上記実施例1−2と同様の手順でミトコンドリアDNAを調製した。これらの抽出DNAを鋳型として、上記実施例1−2と同様にPCRを行った。その結果、以下の表9に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた。
(実施例6−1:シカ特異的DNA検出用プライマーの設計)
検索対象とするDNA配列の領域をミトコンドリアDNAとし、上記実施例1−1と同様の手順で、シカ特異的DNA検出用プライマーを設計した。GenBankから、シカのミトコンドリアDNA配列について10種類のID番号のリストを取得した。また、シカ以外の動物種のミトコンドリアDNAについても21種類のID番号のリストを取得した。ID番号のリストを以下の表10に示す。
上記実施例6−1で得られたコンセンサス配列について、BLASTによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、DNA自動合成機を用いて合成した。2種類のシカの肉試料から、上記実施例1−2と同様の手順でミトコンドリアDNAを調製した。これらの抽出DNAを鋳型として、上記実施例1−2と同様にPCRを行った。その結果、以下の表12に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた。
(実施例7−1:ヒツジ特異的DNA検出用プライマーの設計)
検索対象とするDNA配列の領域をミトコンドリアDNAとし、上記実施例1−1と同様の手順で、ヒツジ特異的DNA検出用プライマーを設計した。GenBankから、ヒツジのミトコンドリアDNA配列について2種類のID番号のリストを取得した。また、ヒツジ以外の動物種のミトコンドリアDNAについても29種類のID番号のリストを取得した。ID番号のリストを以下の表13に示す。
上記実施例7−1で得られたコンセンサス配列について、BLASTによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、DNA自動合成機を用いて合成した。1種類のヒツジの肉試料から、上記実施例1−2と同様の手順でミトコンドリアDNAを調製した。この抽出DNAを鋳型として、上記実施例1−2と同様にPCRを行った。その結果、以下の表15に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた。
(実施例8−1:ヤギ特異的DNA検出用プライマーの設計)
検索対象とするDNA配列の領域をミトコンドリアDNAとし、上記実施例1−1と同様の手順で、ヤギ特異的DNA検出用プライマーを設計した。GenBankから、ヤギのミトコンドリアDNA配列について1種類のID番号のリストを取得した。また、ヤギ以外の動物種のミトコンドリアDNAについても30種類のID番号のリストを取得した。ID番号のリストを以下の表16に示す。
上記実施例8−1で得られたコンセンサス配列について、BLASTによって特異性の確認を行った。このうち特異性の良好なプライマーとしての配列を、DNA自動合成機を用いて合成した。1種類のヤギの肉試料から、上記実施例1−2と同様の手順でミトコンドリアDNAを調製した。この抽出DNAを鋳型として、上記実施例1−2と同様にPCRを行った。その結果、以下の表18に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを用いた場合に、非常に高い特異性および検出感度を得ることができた。
Claims (3)
- 配列表の配列番号9の配列からなるプライマーと配列表の配列番号10の配列からなるプライマーとの組み合わせ;配列表の配列番号11の配列からなるプライマーと配列表の配列番号12の配列からなるプライマーとの組み合わせ;配列表の配列番号13の配列からなるプライマーと配列表の配列番号14の配列からなるプライマーとの組み合わせ;または配列表の配列番号15の配列からなるプライマーと配列表の配列番号16の配列からなるプライマーとの組み合わせである、ブタ特異的DNA検出用プライマー対。
- 試料中の特定の動物種または群由来の成分を検出する方法であって、請求項1に記載のプライマー対を用い、試料中のDNAを鋳型として、DNA断片をPCR法により増幅する工程、および該増幅されたDNA断片を検出する工程を含み、特定の動物種または群が、ブタである、方法。
- 前記試料が、生肉、生魚、肉加工食品、魚加工食品、肉加工品含有食品、魚加工品含有食品、血液、体毛、体液、乳、乳加工品、肉骨粉、骨粉、魚粉、フィッシュソリュブル、だし粕、ならびにこれらを含有する飼料、肥料、ペットフード、および飼料添加物からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
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