KR101248425B1 - 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 프로브 조성물, 이를 포함하는 ｄｎａ 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법 - Google Patents
고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 프로브 조성물, 이를 포함하는 ｄｎａ 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법에 관한 것으로서, 본 발명의 동물의 분류체계 결정방법은 고래목에 속하는 동물 각 종의 미토콘드리아 DNA를 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 시료의 미토콘드리아 DNA를 PCR 증폭하는 단계와, 고래목에 속하는 동물 각 종의 미토콘드리아 DNA에 대해 특이적으로 결합하고, 서열번호 3의 염기서열 내지 서열번호 14의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들과 이들 폴리뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 DNA 칩에 상기 증폭된 미토콘드리아 DNA를 혼성화시키는 단계와, 상기 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩의 프로브와 혼성화된 반응물을 검출하고 상기 동물이 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 고래목에 속하는 다수의 동물들의 계군 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로써, 염기서열을 분석하지 않고도 분석하고자 하는 고래목에 속하는 다수의 동물들의 유전자형과 그 계군(종 또는 과)을 간편하면서도 신속, 정확하게 판정할 수 있고, 특히 고래목에 속하는 다수의 동물 어종을 한 번의 실험으로 정확하게 유전자형을 분석할 수 있어 상기 동물의 유전자형과 분류체계를 결정하는 방법을 표준화, 자동화할 수 있도록 기술 개발의 적용성을 극대화시킬 수 있으며, 수산자원의 관리 체계를 확립할 수 있고 대량의 시료를 간단하고 쉽게 동정하여 유통체계를 원활히 할 수 있다.
Description
본 발명은 고래목(Order Cetacea/고래 및 돌고래)에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정과 관련하여 고래목에 속하는 동물의 종(species) 또는 과(family)를 간단하고 신속, 정확하게 구별하는 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 고래목에 속하는 동물의 분류체계를 간단하고, 신속 정확하게 결정하기 위해 고래목에 속하는 동물의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 존재하는 단염기다형성(single nucleotide polymorphism)에 근거한 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법을 제공하는 것에 관한 것이다.
고래류(Order Cetacea)는 일생을 바다에서 살아가는 포유동물로 육상포유류와 마찬가지로 정온(온혈)동물이고 털을 가지며 허파로 대기의 공기를 호흡하고 유선에서 분비되는 젖을 먹여 새끼를 기르는 동물이다. 분류학적으로 수염고래류(Mysticeti)와 이빨고래류(Odontoceti)로 나뉘는데, 수염고래류는 윗잇몸에 이빨대신 고래수염판(baleen plates)이 촘촘하게 박혀있어 먹이를 걸러먹는 종류를 말하며 우리바다에서 가장 흔하게 볼 수 있는 밍크고래(minke whales)와 지구상 동물 중 가장 큰 대왕고래(blue whales) 등 15종이 포함된다. 반면 이빨고래류는 말 그대로 이빨이 있는 종류로 종에 따라 이빨의 크기나 모양, 개수 등이 다양하며 어떤 종류는 아래턱에만 이빨을 가진 경우도 있다. 향고래(sperm whales), 범고래(killer whales), 참돌고래(common dolphins), 큰돌고래(bottlenose dolphins), 상괭이(finless porpoises) 등이 이빨고래류에 속하며 전 세계 바다에 80여 종이 서식한다. 우리나라 연안에는 8과 36종의 고래류가 서식하는 것으로 알려져 있는데 수염고래아목(Suborder Mysticeti)에는 긴수염고래과(Family Balaenidae) 1종, 귀신고래과(Family Eschrichtiidae) 1종, 수염고래과(Family Balaenopteridae) 7종이 분포하고 있고, 이빨고래아목(Suborder Odontoceti)에는 향고래과(Family Physeteridae) 1종, 꼬마향고래과(Family Kogiidae) 2종, 부리고래과(Family Ziphidae) 5종, 참돌고래과(Family Delphinidae) 16종, 쇠돌고래과(Family Phocoenidae) 3종이 분포한다.
한편, 고래류는 크기에 따라 분류하기도 하는데 일반적으로 4m보다 크면 고래(whales), 작으면 돌고래(dolphins 또는 porpoises)라고 한다. 돌고래는 다시 주둥이와 이빨 모양을 기준으로 '돌핀(dolphins)'과 '포퍼스(porpoises)'로 나누는데, 우리말로 전자는 참돌고래류 후자는 쇠돌고래류라고 부르고 있다. 참돌고래류는 대부분 주둥이가 부리모양으로 길게 뻗어있고 이빨은 뾰족한 원뿔모양인데 반해 쇠돌고래류는 부리가 없이 뭉툭하고 이빨은 스페이드 모양으로 그 끝이 둥그스름하다.
고래류는 육상의 조상들로부터 약 6천만년 전에 진화하기 시작한 것으로 여겨지며 초기 고래류는 새로운 먹이를 찾아 혹은 포식자를 피하기 위해 바다로 진출했을 것으로 추정된다. 오랜 진화과정을 통해 지느러미 모양으로 변형된 앞다리, 뒷다리의 퇴화, 꼬리지느러미의 발달, 두꺼운 지방층, 잠수 능력 등의 적응을 하게 되었다. 현재 수염고래류와 이빨고래류로 나누고 있는데 대부분의 학자들은 이 두 그룹이 3천만년 전에 사라진 고대고래류(Archaeoceti)에서 분리된 것으로 보고 있다. 고래류의 가장 가까운 친척은 우제류(소, 낙타)이며 최근 유전학적 연구 결과 하마와 가장 가까운 동물임이 밝혀졌다.
고래류의 분류도 다른 생물과 마찬가지로 형태 또는 해부학적 유사성과 이질성 및 지리적 격리에 의한 종 식별로 이루어 졌으나 최근에는 여기에 유전적 차이가 더해진 종 식별이 대세를 이루고 있다. 과거 생물학적으로 종이라 함은 짝짓기를 통해 번식력을 가진 후손을 만들 수 있으면 같은 종으로 취급하였으나 최근에는 분지학적인 종의 의미를 더욱 중요시 여겨 번식력을 가진 후손을 만들 수 있다고 하더라도 오랜 지리적 격리를 통해 유전적 구조가 다른 경우에는 별개의 종으로 취급하는 경향이 강해지고 있다. 따라서 긴수염고래는 북방긴수염고래(northern right whales), 남방긴수염고래(southern right whales) 등 두 종류 혹은 동종의 세 아종으로 분류하다가 최근에 도입된 유전학적 자료를 근거로 지금은 북태평양, 북대서양, 남방긴수염고래 세 종류로 나뉘어진다. 북태평양과 북대서양 긴수염고래가 만나 짝짓기를 할 경우 번식력을 가진 새끼를 낳을 수는 있으나 오랜 시간 동안 지리적으로 이들이 만난 적이 없었으며 따라서 유전적인 교류가 전혀 없었기 때문에 별개의 종으로 보는 것이다. 특히 2008년에 정식 종으로 분류된 오무라고래(Omura's whale)의 경우 외형적인 특징은 브라이드고래와 큰 차이가 없어 종 동정에 논란이 많았으나 유전적 차이로 별개의 종으로 구분하게 되었다. 부리고래과 종류들은 주로 수심이 깊은 원양에 서식하기 때문에 직접 관찰하기 어려운 경우가 많으며 대부분 죽은 사체가 연안으로 떠밀려와 발견되는 경우가 대부분이다. 이러한 경우 대부분 사체가 부패하여 외형적 특징을 알아보기 어렵기 때문에 종을 동정하는데 어려움이 많은 실정이다. 그러나 유전학적 분류 방법의 발달로 종 동정이 간단하게 이루어지고 있으며 이전에 확인되지 않았던 신종을 발견하는 경우도 있다.
한편, 국제포경위원회의 상업포경모라토리엄(1986년) 이후 우리나라에서는 모든 고래류에 대한 포획이 금지되어 있다. 그러나 각종 어구에 혼획된 고래류에 대해서는 소유권을 인정하여 식용으로 활용하도록 허용하고 있다. 따라서 울산, 포항, 부산 등 고래고기 수요가 많은 지역에서는 값비싼 밍크고래고기와 저렴한 돌고래고기의 진위여부에 대한 시비가 발생하기도 하고 불법포획이나 불법수입이 행해지기도 한다. 특히, 유통되고 있는 고래고기의 경우 대부분 삶은 것이어서 전문가가 아니면 어떤 종류인지 파악하기가 매우 어렵다. 이러한 관점에서 고래고기와 돌고래고기 구별과 불법포획 및 불법수입 감시를 위해 빠르고 정확한 고래류의 구별 방법의 제공이 본 발명이 속하는 기술분야에서는 요구되고 있다.
즉, 고래목에 속하는 검사대상 동물들에 대해 일일이 유전자 검사를 할 경우 소요되는 비용에 비해 고래고기 진위 여부 판별이 비효율적일 뿐만아니라 신선도 유지와 신속한 유통을 요구하는 공급자와 소비자의 요구에 부응하여 신속하게 불법포획 및 불법수입 감시를 하기에는 역부족인 문제가 있었다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 값비싼 밍크고래류와 저렴한 돌고래류에 대한 종 판별의 필요성이 대두되고 있으며, 한번의 검사로 고래목에 속하는 검사대상 동물들의 분류체계를 신속하고 간편하면서도 정확하게 판별하는 방법의 제공이 절실히 요구되고 있다고 할 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하는데 그 목적으로 하는 것으로서, 고래목에 속하는 동물들의 분류체계 결정과 관련하여 다수의 고래목에 속하는 동물들의 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 수행함으로써 상기 동물들이 속하는종(species) 또는 과(family) 단위와 같은 분류체계를 간단하고 신속, 정확하게 구별할 수 있는 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 고래목에 속하는 동물들의 각 종이나 과에 따른 일부 염기서열의 차이를 정확히 파악한 후 이를 기반으로 하여 각 동물의 종 또는 과 단위와 같은 분류체계를 신속하면서도 정확하게 판별할 수 있는 표준화된 프로브를 제공하고, 이를 포함하는 DNA 칩 및 키트를 이용하여 고래목에 속하는 동물들의 종 또는 과에 따른 염기서열 차이를 신속, 정확하게 분석할 수 있는 분류체계 결정방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 고래목에 속하는 동물들의 종 또는 과 간에 염기서열 차이가 있는 부위를 포함하는 15개 내지 30개의 연속적인 폴리뉴클레오티드로 구성된 프로브와 이를 포함하는 DNA칩 및 키트를 제공하여 하나의 슬라이드 위에서 다수의 종 또는 과에 속하는 동물들의 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 검사함으로써 고래목에 속하는 동물들의 분류체계 파악에 소요되는 시간과 인적 자원 및 비용을 줄일 수 있는 분류체계 결정방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 고래목에 속하는 동물의 분류체계를 간단하고, 신속 정확하게 결정하기 위해, 고래목에 속하는 다양한 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역의 단염기다형성 부위를 근거로 하여 제작된 최적의 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 고래목에 속하는 동물들의 각 종이나 과에 따른 일부 염기서열의 차이를 정확히 파악하면 이를 기반으로 하여 각 동물의 종 또는 과 단위와 같은 분류체계를 신속하면서도 정확하게 판별할 수 있는 표준화된 프로브를 제공할 수 있고 이에 따라 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 많은 시간과 인적 자원 및 비용을 줄일 수 있음에 주목하여 예의 연구를 거듭한 결과, 다양한 고래목에 속하는 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역의 단염기다형성(SNPs) 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 하여 상기 동물들 각 종 마다 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
구체적으로, 본 발명자들은 고래목에 속하는 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역에서 서열번호 3 내지 서열번호 14에 해당하는 DNA 서열이 상기 각 동물의 종이나 과를 구별하기에 최적으로 적합하다는 것을 확인하였고, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 14와 동일하거나 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 고래목에 속하는 동물의 분류체계를 결정할 수 있음을 확인하였다. 이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기한 동물 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 반응어종이나 과에 속하는 동물의 DNA와는 상보적으로 결합하지만 이외에 다른 종이나 과에 속하는 동물의 DNA와는 상보적으로 결합하지 않는다. 그리고, 본 발명자들은 고래목에 속하는 동물들의 혈액, 세포 또는 근육조직으로부터 DNA를 추출하고, 이를 증폭시킨 PCR 산물을 전술한 특이적인 뉴클레오티드 프로브와 반응시켜 고래목에 속하는 동물들의 유전자형을 분석함으로써 고래목에 속하는 동물의 분류체계를 결정하는 방법을 완성하게 되었다.
한편, 본 명세서에서 사용되는 용어인 '다형성(polymorphism)'이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2이상의 대체적 서열 또는 대립형질의 발생을 의미한다. 다형성 마커 또는 부위는 상기 발생이 일어나는 위치(locus)이다. 바람직한 마커는 선택된 집단에서 1%이상, 더욱 바람직하기로는 10% 또는 20%이상의 발생 빈도를 나타내는 두 개 이상의 대립형질을 가진다. 다형성 부위는 단일 염기쌍일 수도 있다.
따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기한 염기서열 이외에 본 발명에 따른 다형성 부위를 하나 이상 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 핵산 단편 또는 그의 상보체도 가능하다. 더불어, 하나의 동물 개체에서 나타나는 한정적 돌연변이와 계군마다 집단적으로 몰려다니는 고래목 동물의 특성을 고려하여, 본 발명에 따른 다형성 부위의 더욱 바람직한 형태는 상기 동물이 속하는 과를 구별하기 위해 상기 다형성 부위가 2개 이상의 개체로부터 동일한 유전자형으로 나타나는 것이 바람직하다. 또한, 상기 본 발명에 따른 다형성 부위는 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2이상의 대체적 서열 또는 대립형질이 발생하는 것을 의미하므로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브는 도 2 내지 도 4에 나타난 다형성 부위의 염기서열과 동일하거나 이에 상보적으로 결합할 수 있는 DNA 서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 것도 가능하다.
따라서, 본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 프로브는, 고래목에 속하는 동물 각 종의 미토콘드리아 DNA의 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고, 서열번호 3의 염기서열 내지 서열번호 14의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들과 이들 폴리뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 프로브에 있어서, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 밍크고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 범고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 브라이드고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 6의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 상괭이의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 7의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 오무라이고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 8 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들과 이들 폴리뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브는 참고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 10의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 큰이빨부리고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 11의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 프레이져돌고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 12의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 향고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 13의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 혹등고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 14의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 흑범고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 프로브는 전술한 다형성 부위를 근거로 하여 서열번호 3 내지 서열번호 14의 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 것이면 어느 것이나 채택가능하다. 바람직하기로는, 상기 프로브는 서열번호 3 내지 서열번호 14의 염기서열에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하여 10개 염기 이상이고 100개 염기 이하의 연속적인 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보체일 수 있고, 더욱 바람직하기로는 10개 염기 이상이고 50개 염기 이하의 연속적인 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보체일 수 있으며, 가장 바람직하기로는 15개 염기 이상이고 30개 염기 이하의 연속적인 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보체일 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩은, 고래목에 속하는 동물 각 종의 미토콘드리아 DNA의 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고, 서열번호 3의 염기서열 내지 서열번호 14의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들과 이들 폴리뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩에 있어서, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 밍크고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 범고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 브라이드고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 6의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 상괭이의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 7의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 오무라이고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 8 내지 서열번호 9의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들과 이들 폴리뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브는 참고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 10의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 큰이빨부리고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 11의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 프레이져돌고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 12의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 향고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 13의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 혹등고래의 미토콘드리아 DNA와, 서열번호 14의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 프로브는 흑범고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3 내지 서열번호 14의 염기서열에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하여 10개 염기 이상이고 100개 염기 이하의 연속적인 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보체일 수 있고, 더욱 바람직하기로는 10개 염기 이상이고 50개 염기 이하의 연속적인 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보체일 수 있으며, 가장 바람직하기로는 15개 염기 이상이고 30개 염기 이하의 연속적인 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보체일 수 있다. 상기 프로브는 동일 기판 상에 마이크로어레이되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 기판은 DNA 칩 제작에 일반적으로 사용되는 유리기판 또는 플라스틱 기판인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 키트는, 전술한 바와 같이 정의된 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩과, 고래목에 속하는 동물 각 종의 미토콘드리아 DNA를 증폭하기 위한 프라이머와, 상기 DNA 칩과 혼성화되는 증폭된 미토콘드리아 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함한다.
본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 키트에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 역방향 프라이머이다.
본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법은,
고래목에 속하는 동물 각 종의 미토콘드리아 DNA를 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 시료의 미토콘드리아 DNA를 PCR 증폭하는 단계와,
전술한 바와 같이 정의된 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩에 상기 증폭된 미토콘드리아 DNA를 혼성화시키는 단계와,
상기 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩의 프로브와 혼성화된 반응물을 검출하고 상기 동물이 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법에서, 상기 DNA 칩에 상기 증폭된 미토콘드리아 DNA를 혼성화시키는 단계는 적어도 1회 이상 많게는 수차례 (특히 3~4회) 반복적으로 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법에서, 상기 프로브와 혼성화된 반응물을 검출하고 상기 동물이 속하는 분류체계를 결정하는 단계에서는 표지물질에 의한 형광 신호 강도를 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 프라이머로서 상기 PCR 증폭에 사용하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 정방향 프라이머로 사용되고, 상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 역방향 프라이머로 사용된다.
한편, 본 발명에 있어서, 표지물질은 특정 형광물질에 제한되지 않음은 물론이고, 형광 검출기로서 확인이 가능한 다양한 형광물질이 사용될 수 있으며 효소학적 발색반응 및 동위원소 표지도 가능하다. 예를 들어, 표지물질은 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS (5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트 (TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드 등일 수 있으며, 형광물질인 Cy3 또는 Cy5인 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 방사성 물질 또는 발광성 물질 등 다양한 표지물질이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 고래목에 속하는 동물들의 혈액, 세포 및 근육조직으로부터 DNA를 추출하고, 이를 증폭시킨 PCR 산물을 특이적인 폴리뉴클레오티드 프로브와 반응시켜 다수의 고래목에 속하는 동물들에 대한 유전자형 분석을 하나의 슬라이드 위에서 간단하고 신속, 정확하게 검사함으로써 상기 동물들의 분류체계, 즉 상기 동물들이 속하는 종(species) 또는 과(family)를 간단하고 용이하게 결정할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따르면, 고래목에 속하는 다수의 동물들의 계군 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로써, 염기서열을 분석하지 않고도 분석하고자 하는 고래목에 속하는 다수의 동물들의 유전자형과 그 계군(종 또는 과)을 간편하면서도 신속, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따라 고래목에 속하는 동물 미토콘드리아 DNA의 COI 영역을 유전자 표지로 사용하면, 종래에 고래목에 속하는 동물의 종이나 과를 판별하는데 존재하였던 문제점을 해결할 수 있으며, 특히 단염기다형성이 많은 것으로 확인된 COI 영역을 분석의 척도로 이용하면 종래기술보다 한 단계 진보된 형태의 유전자 분석법을 제공하여 더욱 효과적으로 유전자형을 판별할 수 있고 분해능도 현저히 증가시킬 수 있다.
뿐만아니라, 본 발명에 따르면, 고래목에 속하는 다수의 동물 어종에 대해 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 상기 동물의 유전자형과 분류체계를 결정하는 방법을 표준화, 자동화할 수 있도록 기술 개발의 적용성을 극대화시킬 수 있다. 즉, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 데 걸리는 시간을 크게 단축시킬 수 있고 다량의 시료를 짧은 시간 내에 처리할 수 있어 고래목에 속하는 동물들의 분류체계 파악에 소요되는 시간과 인적 자원 및 비용을 줄일 수 있는 효과가 있다.
추가로, 본 발명에 따르면, 단염기다형성 부위에 근거한 분자생물학적인 기법을 이용하여 우리나라의 중요 어자원 중의 하나인 고래목에 속하는 동물들의 종 또는 과를 판별함으로써, 수산자원의 관리 체계를 확립할 수 있고 대량의 시료를 간단하고 쉽게 동정하여 유통체계를 원활히 할 수 있다.
도 1은 고래목에 속하는 동물들의 미토콘드리아 DNA상의 유전자 배열을 나타내는 모식도이다.
도 2 내지 도 4는 고래목에 속하는 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역의 단염기다형성 부위가 포함된 446개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 도 2 내지 도 4에 나타난 단염기다형성에 근거하여 제작된 고래목에 속하는 각 동물에 대해 특이적인 프로브 W1 내지 프로브 W12의 위치 및 이들이 마이크로어레이 칩에 집적된 상태를 나타내는 도면이다.
도 6a 내지 6k는 본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법에 있어서, 검체의 미토콘드리아 DNA 증폭산물을 고래목에 속하는 각 동물에 대해 특이적인 프로브 W1 내지 프로브 W12가 마이크로어레이된 DNA 칩에 혼성화한 후 형광스캐너로 확인한 DNA 칩의 형광이미지 사진이다.
도 2 내지 도 4는 고래목에 속하는 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역의 단염기다형성 부위가 포함된 446개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 도 2 내지 도 4에 나타난 단염기다형성에 근거하여 제작된 고래목에 속하는 각 동물에 대해 특이적인 프로브 W1 내지 프로브 W12의 위치 및 이들이 마이크로어레이 칩에 집적된 상태를 나타내는 도면이다.
도 6a 내지 6k는 본 발명의 일실시예의 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법에 있어서, 검체의 미토콘드리아 DNA 증폭산물을 고래목에 속하는 각 동물에 대해 특이적인 프로브 W1 내지 프로브 W12가 마이크로어레이된 DNA 칩에 혼성화한 후 형광스캐너로 확인한 DNA 칩의 형광이미지 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예 1: 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 프로브의 설계
우선, 본 발명의 일실시예에 따른 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정 방법에 있어서는 고래목에 속하는 동물들의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하고, 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계를 거친다. 고래목에 속하는 동물들로부터 DNA를 추출하는 것은 추출된 DNA를 분석하여 상기 동물들이 속하는 종이나 과를 판별하기 위한 것이기 때문에, 고래의 어느 부분에서 DNA를 추출하든지 또는 어떠한 방법으로 추출되는지는 특별히 제한되지 않는다. 그 중에서도 추출된 DNA는 고래목에 속하는 동물의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 포함하는 것이 바람직하다. 그리고, 추출한 DNA를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 DNA 추출 방법이나 증폭 방법 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백하다.
도 1은 고래목에 속하는 동물의 미토콘드리아 DNA상의 유전자 배열을 나타내는 모식도이고, 여기에 도시된 상기 미토콘드리아 DNA의 크기는 16416bp이고, 이 중 COI 유전자는 5371bp-6921bp에 걸쳐 위치한다. 이어서, 상기 PCR 증폭 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 것이 본 발명의 일실시예의 가장 중요한 특징이다. 이후에, 상기 결합 여부를 확인하여 상기 동물이 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하나, 이 또한 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되는 모든 결합 여부 확인방법을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 서열번호 3 내지 서열번호 14의 DNA 서열은 하기의 표 1에 나타난 바와 같다.
| 고래목 종 판정을 위한 DNA 서열 | |||
| 프로브 명칭 | DNA 서열 | 반응 종 | DNA 서열위치 |
| W1(서열번호 3) | 5'-TAG TAG TAA AAA AGA AGG AGG AAG T-3' | 밍크고래 | 193-218 |
| W2(서열번호 4) | 5'-TTA ATA GTA GGA AGG AAG GGG GAA G-3' | 범고래 | 194-219 |
| W3(서열번호 5) | 5'-GGA GCC ATC AAT TTC ATT AC-3' | 브라이드고래 | 359-378 |
| W4(서열번호 6) | 5'-TCA GTT ACC AAA CCC TCC GAT-3' | 상괭이 | 104-124 |
| W5(서열번호 7) | 5'-CCT GCT ATG ACA CAG TAT CAA-3' | 오무라이고래 | 402-422 |
| W6(서열번호 8) | 5'-CCC GCC ATA ACC CAG TAT C-3' | 참고래 | 401-419 |
| W7(서열번호 9) | 5'-CAG TAT CAA ACT CCT CTT TTC-3 | 413-433 | |
| W8(서열번호 10) | 5'-GGC TAT ATC GGG TGA TCC A-3' | 큰이빨부리고래 | 142-160 |
| W9(서열번호 11) | 5'-CCT TGG AGC TAT TAA CTT TAT CA CA-3' | 프레이져돌고래 | 357-380 |
| W10(서열번호 12) | 5'-TAA AAC CCC CAG CCA TAA CTC AAT A-3' | 향고래 | 395-418 |
| W11(서열번호 13) | 5'-CAA TAT CAG ACC CCT CTT TTC GTA TGA-3' | 혹등고래 | 413-439 |
| W12(서열번호 14) | 5'-TGC TAT CAG TAG CAG AAA GGA-3' | 흑범고래 | 203-223 |
상기 표 1에 나타난 바와 같은 본 발명의 일실시예에 따른 염기서열은 고래목에 속하는 동물의 분류체계를 결정하기 위한 것으로, 상기 동물이 고래목에 속하는 동물인지 여부를 결정하기 위한 것이거나 상기 동물이 고래목에 속하는 동물 중 어떤 종에 해당하는 동물인지를 결정하기 위한 것이다. 이러한 염기서열은 고래목에 속하는 동물의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNPs) 부위를 포함하는 것으로서, 상기 동물의 반응어종에 따라 구분될 수 있는 염기서열의 일부를 나타내는 것이다. 상기 표 1에서는 서열번호 3 내지 서열번호 14의 염기서열이 미토콘드리아 DNA 상에 위치하는 영역도 표시하였다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기 서열번호 3 내지 서열번호 14의 염기서열과 결합할 수 있도록 상기 염기서열과 상보적인 염기서열을 가지는 것이 바람직하다.
또한, 상기 동물로부터 추출된 DNA를 증폭시킨 PCR 산물을 이용함에 있어서, 상기 PCR 산물의 어느쪽 가닥을 사용하는 것도 가능하다. 따라서, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 14의 염기서열에 상보적인 염기서열을 가지는 표적대상 PCR 증폭산물과 반응하기 위해서, 본 발명의 일실시예에 따른 프로브는 상기 서열번호 3 내지 서열번호 14의 염기서열과 동일한 염기서열을 가지는 것도 가능하다. 본 발명자들은 서열번호 3 내지 서열번호 14의 염기서열에 대응하는 각각의 프로브 명칭을 W1 내지 W12로 명명하였다.
도 2 내지 도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 고래목에 속하는 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성 부위가 포함된 446개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이다. 도 2는 다양한 고래목에 속하는 동물 종, 구체적으로는 고래목(Order Cetacea)에 속하는 일반적인 동물인 밍크고래(Balaenoptera acutorostrata), 범고래(Orcinus orca), 브라이드고래(Balaenoptera edeni), 상괭이(Neophocaena phocaenoides), 오무라이고래(Balaenoptera omurai), 참고래(Balaenoptera physalus), 큰이빨부리고래(Mesoplodon stejnegeri), 프레이져돌고래(Lagenodelphis hosei), 향고래(Physeter macrocephalus), 혹등고래(Megaptera novaeangliae) 및 흑범고래(Pseudorca crassidens)의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 1번부터 150번까지의 DNA 서열을 나타낸 것이고, 도 3은 상기 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 151번부터 300번까지의 DNA 서열을 나타낸 것이며, 도 4는 상기 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 301번부터 446번까지의 DNA 서열을 순차적으로 나타낸 것이다.
여기서, 단염기다형성 부위는 도 2 내지 도 4에 나타난 바와 같이, 고래목에 속하는 일반적인 동물 종(본 발명의 일실시예에서는 밍크고래)의 염기서열을 기준으로 할 때 이와는 다른 유전자형을 보이는 염기서열 부위를 말하는 것이다. 즉, 도 2 내지 도 4에서 범고래 내지 흑범고래에 해당하는 염기서열에서 ".(점)"으로 표시된 것은 상기 밍크고래의 염기서열과 동일한 유전자형을 표시하며, A, C, G 또는 T로 표시된 것이 해당 동물 종의 단염기다형성(SNP) 부위이다.
도 2 내지 도 4는 각각 고래목에 속하는 동물의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c oxidase subunit I) 유전자 영역의 단염기다형성 부위가 포함된 446개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이다. 이러한 연결되는 도면들은 고래목에 속하는 동물의 미코콘드리아 DNA 중 COI 영역의 446개 염기서열을 분석하여 비교한 것으로서, 이 영역에 특정 동물 종에 독특한 단염기다형성 변이와 계군 특이적 단염기다형성 변이가 다수 존재한다는 것을 보여준다. 지면의 한계상 50개 염기서열 단위로 분절하여 나타내었지만 도 2 내지 도 4는 순서대로 이어지는 도면을 의미한다. 그 중에서도 상기 표 1에 표시된 DNA 서열의 위치 영역이 본 발명의 일실시예에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브로 사용될 수 있는 종 또는 과 특이적인 단염기다형성이 존재하는 영역이다.
이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 고래목에 속하는 동물들로부터 추출된 대상 DNA 또는 상기 DNA를 증폭시킨 PCR 산물과 결합하는데 있어서, 상기 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역에 있는 단염기다형성 부위에 특이적으로 결합하고, 상기 결합은 상기 동물들이 속하는 분류체계, 즉 고래목에 속하는 동물들의 종 또는 상기 동물들이 속하는 과에 따라 다르게 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이와 같이 본 발명은 프로브와 대상 산물의 결합 여부에 따라 상기 동물의 종 또는 과를 판별하며 본 발명에 따른 프로브로 분석 가능한 동물의 종 또는 과는 상기 표 1의 반응어종에 기재된 바와 같다.
상기 표 1의 반응어종이라 함은 본 발명의 일실시예에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브의 염기서열이 특이적으로 결합할 수 있는 "미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역의 단염기다형성 부위"를 갖는 고래의 종류 또는 이러한 고래들을 포함하는 고래목을 의미하는 것이다. 즉, 서열번호 3 내지 서열번호 14에 해당하는 DNA 염기서열은 상기 표 1에 기재된 반응어종의 DNA 추출물과는 결합하지만, 상기한 반응어종이 아닌 다른 어종과는 결합하지 않는 것이다. 따라서, 서열번호 3 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브를 상기 표 1에 기재된 반응어종의 DNA 추출물 또는 이의 증폭산물과 혼성화시키는 경우 상기 동물이 속하는 종 또는 과를 판별할 수 있는 것이다.
구체적으로, 상기 결합이 상기 동물이 속하는 분류체계에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 프로브(이는 서열번호 3의 염기서열 및 이에 상보적인 염기서열 모두를 포함함; 이하의 각 서열번호에서도 같은 의미임)가 밍크고래(Balaenoptera acutorostrata)종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역의 193-218번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것이거나, 서열번호 4의 경우는 범고래(Orcinus orca)종의 COI 유전자 영역의 194-219번째 DNA 서열, 서열번호 5의 경우는 브라이드고래(Balaenoptera edeni)종의 COI 유전자 영역의 359-378번째 DNA 서열, 서열번호 6의 경우는 상괭이(Neophocaena phocaenoides)종의 COI 유전자 영역의 104-124번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 오무라이고래(Balaenoptera omurai)종의 COI 유전자 영역의 402-422번째 DNA 서열, 서열번호 8 및 서열번호 9의 경우는 각각 참고래(Balaenoptera physalus)종의 COI 유전자 영역의 401-419번째 DNA 서열 및 413-433번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 큰이빨부리고래(Mesoplodon stejnegeri)종의 COI 유전자 영역의 142-160번째 DNA 서열, 서열번호 11의 경우는 프레이져돌고래(Lagenodelphis hosei)종의 COI 유전자 영역의 357-380번째 DNA 서열, 서열번호 12의 경우는 향고래(Physeter macrocephalus)종의 COI 유전자 영역의 395-418번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 혹등고래(Megaptera novaeangliae)종의 COI 유전자 영역의 413-439번째 DNA 서열, 또는 서열번호 14의 경우는 흑범고래(Pseudorca crassidens)종의 COI 유전자 영역의 203-223번째 DNA 서열과 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브가 고래목에 속하는 동물로부터 추출된 대상 DNA 또는 상기 추출된 DNA를 증폭시킨 PCR 산물과 결합하는데 있어서, 상기 결합이 상기 동물이 속하는 분류체계에 따라 다르게 이루어진다는 것의 다른 의미는 상기 동물이 고래목에 속하는 것인 경우에만 결합한다는 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 다양한 고래목에 속하는 동물 종에 있어서, 단염기다형성 부위를 가지는 서열번호 3 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 염기서열을 이용한 것으로서, 상기 염기서열과 동일하거나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 검사대상이 되는 동물의 DNA 추출물 내지는 PCR 증폭산물과 결합시키는 것이 특징이다. 이와 같이, 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 고래목에 속하는 동물 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되어, 의도한 동물 종이나 과에 해당하는 동물의 DNA와는 특이적으로 결합하지만 이외에 다른 종이나 과에 속하는 동물의 DNA와는 결합하지 않는 것을 특징으로 하기 때문에, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 검사대상이 되는 동물의 DNA 추출물 내지는 PCR 증폭산물과 혼성화시키는 단계는 적어도 1회 이상 수행되는 것이 바람직하다.
따라서, 상기 결합을 확인하는 단계 이전에, 추출된 DNA (PCR 증폭산물)와 본 발명에 따른 프로브의 혼성화 반응을 반복적으로 수행하면 프로브와 검사대상 동물의 DNA 증폭 산물의 결합을 더욱 견고히 할 수 있다. 또한, 상기 결합을 확인하는 단계 이후에, 추출된 DNA (PCR 증폭산물)와 본 발명에 따른 프로브의 혼성화 반응을 반복적으로 수행하면 다양한 프로브를 이용하여 중첩적으로 판별결과를 예측할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 추출된 DNA (PCR 증폭산물)와 혼성화시키는 단계는 적어도 1회 이상 많게는 수차례 (특히 3~4회) 반복적으로 수행되는 것이 바람직하다.
실시예 2: 고래목에 속하는 동물 종에 따른 프로브 준비
실시예 1에 따라 설계된 고래목에 속하는 동물 종의 특이적 변이를 확인하기 위한 프로브를 준비하였다. 본 발명에서 사용한 프로브는 바이오니아(Bioneer Inc., Daejon, Korea)에 의뢰하여 준비하였다. 혼성화 반응에 사용되는 프로브의 서열정보는 표 1에 나타난 것과 같다. 이와 같이 제작된 프로브들은 유리 슬라이드와 같은 칩의 2차원적인 표면에 고정하여 집적할 때 프로브 간 공간적 방해 경감을 위해서 8-20개의 올리고(dT)로 이루어진 스페이서를 5' 방향으로 부가하였으며, 알데히드 작용기가 처리된 유리 슬라이드에 공유결합시키기 위해 5' 말단에 아미노 링커(aminolinker)를 부가하였다.
실시예 3: 추출된 DNA의 증폭을 위한 프라이머 준비
본 실시예에서는 고래목에 속하는 동물들의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계를 거치고, 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는다. 상기 추출된 DNA는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머로 사용하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 역방향 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행함으로써 증폭될 수 있다.
즉, 본 실시예에서는 고래목에 속하는 동물들에서 추출한 DNA를 증폭시키는데 있어서, 특정한 프라이머를 사용한다. 이러한 특정한 프라이머는 상기 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역의 단염기다형성(SNP) 부위의 염기서열에 부합하는 것으로서, 상기 추출한 DNA를 더욱 우수하게 증폭시킬 수 있다. 이를 위해 전술한 바와 같이 혈액, 세포 또는 조직으로부터 추출된 DNA는 COI 유전자 영역의 단염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 것이 바람직하다. 본 실시예에서 추출된 DNA를 PCR로 증폭시키기 위해 사용된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 하기의 표 2에 나타난 바와 같다.
| 프라이머 | 염기서열 |
| 정방향 프라이머 (서열번호 1) |
5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAA CCA ACC ACA AAG ACA TTG GCA C-3' |
| 역방향 프라이머 (서열번호 2) |
5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACA CTT CAG GGT GAC CGA AGA ATC AGA A-3' |
상기 표 2에 표시된 프라이머들은 다양한 고래목에 속하는 동물들로부터 추출한 DNA, 특히 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역의 단염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 DNA를 최적으로 증폭할 수 있도록 설계된 것이다. 본 발명에서 사용한 프라이머들은 바이오니아(Bioneer Inc., Daejon, Korea)에 의뢰하여 준비하였다.
상기 프라이머들은 다양한 동물 종이나 계군에 상관없이 가장 공통된 염기서열을 기초로 하여 제작된 것이다. 본 발명자들은 도 2 내지 도 4에 도시된 다양한 동물 종의 DNA 서열과 SNP를 조사 및 분석한 결과, 서열번호 1과 서열번호 2로 이루어진 프라이머 쌍을 사용할 때 PCR 산물을 가장 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다. 즉, 상기 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭과정을 수행할 경우 다양한 동물 종이나 과에 상관없이 미토콘드리아 DNA 추출물을 빠짐없이 증폭할 수 있고, 이에 따라 증폭된 PCR 산물의 개수도 현저히 증가시킬 수 있다.
또한, PCR 산물 증폭과 본 발명에 따른 프로브를 혼성화시킨 뒤에 양자 간의 결합 여부 확인을 위해, 상기 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머에는 로다민(rhodamine), cy3, cy5 또는 비오틴과 같은 표지물질이 부착될 수 있다. 따라서, 혼성화 반응 후 로다민, cy3, cy5 또는 비오틴과 같은 표지물질에 의해 발생하는 검출신호, 예를 들어 형광신호를 감지하여 PCR 산물 증폭과 프로브의 결합 여부를 확인할 수 있다. 구체적으로, 상기 결합 여부 확인 단계에서는 표지물질로서 로다민, cy3 또는 cy5를 사용하거나 비오틴과 결합하는 스트렙타비딘-시아닌(Streptavidin-Cyanine)을 사용하고, 혼성화 반응 후에는 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 검출신호를 분석함으로써 유전자형 판정을 편리하게 진행할 수 있다.
실시예 4: DNA 추출과 PCR 증폭 반응의 수행
1) 고래목에 속하는 동물들의 DNA는 일본 TOYOBO사의 자동화된 DNA 추출 시스템(automated DNA extraction system)인 Mag-Extractor MFX-2100을 사용하여 추출하였다.
2) 그런 다음, 하기의 표 3과 같은 조건 하에서 PCR 반응을 DNA Engine(MJ Research사, 미국)에서 수행하였다.
3) PCR 증폭반응이 끝난 후, PCR 증폭산물 8㎕에 젤 로딩 버퍼 (0.2% orange G, 0.25% xylene cyanol FF, 60% glycerol) 2㎕를 넣고 1㎍/㎖ 에티듐 브로바이드(ethidium bromide)가 함유된 2% 아가로스 젤에서 전기영동을 수행한 후 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)가 장착된 이미지 분석기(Image analyzer) (HITACHI, 일본)를 이용하여 PCR 밴드를 확인하였다.
| 반응 조성 | 반응조건 | |
| 멸균증류수 6㎕ | 95℃, 11분 | 1 사이클(cycle) |
| 2X PCR 믹스(mix) 10㎕ | ||
| 10μM 정방향 프라이머 1㎕ | 94℃, 1분 | 35 사이클(cycles) |
| 10μM 역방향 프라이머 1㎕ | 50℃, 1분 | |
| 5M 베타인(betaine) 1㎕ | 72℃, 1분 | |
| 정제 DNA 1㎕ | 72℃, 5분 | 1 사이클(cycle) |
실시예 5: 종 또는 과 판별을 위한 칩 제작
본 실시예에서는 고래목에 속하는 동물들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로서, 서열번호 3 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 염기서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브들을 포함하는 고래목에 속하는 동물들의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩을 제작한다. 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브들은 글라스 슬라이드 위의 기질에 고정화되어 있는 형태가 바람직하다.
본 실시예에서는 DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 하나의 슬라이드 위에서 다수의 고래목에 속하는 동물들의 분류체계를 동시에 결정할 수 있다. 즉, 상기 동물들이 속하는 종 또는 과를 판별할 수 있는 실시예 1의 표 1에 정의된 12개의 프로브들(W1 내지 W12 프로브들)을 알데히드와 같은 화학 작용기가 처리된 하나의 글라스 슬라이드 위에 다수의 구역을 설정하여 집적시켜 DNA 칩을 제작한 후, 대칭 또는 비대칭 PCR 증폭 반응을 통해 얻어진 상기 동물들의 "COI 유전자 영역의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열"을 포함하는 표지된 PCR 증폭산물을 상기 DNA 칩 상의 프로브들과 반응시켜 혼성화 반응을 확인함으로써 정확한 고래 종을 구분할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브 마이크로어레이(oligonucleotide microarray) DNA 칩(chip)은 당업계에 널리 알려진 제작방법에 따라 제작하였다. 즉, 기판 표면에 알데히드가 부착된 유리재질 또는 플라스틱 재질의 마이크로어레이용 칩 기판 위에 상기 프로브들(W1 내지 W12 프로브들)을 당업계에 널리 알려진 마이크로어레이 장비를 이용하여 찍어서 DNA 칩을 제작하였다. 구체적으로 고래목에 속하는 동물의 분류체계를 결정하기 위한 DNA 칩 제작과정은 다음과 같다.
1) 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 DNA 칩을 제작하기 위해 CSS-80 실리레이티드 슬라이드(Silylated Slide)(CELL Associate사, 미국)상에 50μM의 농도로 아미노 링크가 수식되어 있는 상기 실시예 1 및 2에 따라 준비된 프로브와 동일한 양의 3X SSC를 혼합하여 집적하였고, 이를 16시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 슬라이드를 0.1% SDS로 5분간 2회 세척한 후, 증류수로 5분간 2회 세척하였다.
2) 그런 다음, 슬라이드 상에 반응되지 않고 잔존하는 알데히드를 환원시키기 위해 환원제인 소디움 보로하이드리드(1.3g NaBH4 375㎖, PBS 125㎖, 80% EtOH)에 상기 1)의 과정에서 얻은 슬라이드 칩을 5분간 반응시키고, 끓는 증류수에서 3분간 반응시킨 후, 진공 원심분리기에서 800rpm의 속도로 8분간 건조하였다.
3) 혼성화 실험에 있어서 한 장의 슬라이드에서 다수의 시료 반응을 위하여 상기 2)의 과정에서 얻은 슬라이드 칩을 관류 챔버(perfusion chamber)(BioGrace, 미국)로 커버하여 분리한 후 실험 전까지 실온의 암소에서 보관하였다.
이와 같이 제작된 마이크로어레이 DNA 칩의 레이아웃은 도 5에 예시적으로 나타내었다. 도 5은 도 2 내지 도 4에 도시된 단염기다형성에 근거하여 제작된 올리고뉴클레오티드 프로브들을 포함하는 DNA칩의 구조를 도식화한 모식도이다.
실시예 6: 혼성화 반응 수행 및 고래목에 속하는 동물들의 분류체계 확인
1) 로다민, cy3, cy5 또는 비오틴 등으로 표지된 PCR 증폭 산물을 혼성화 용액(3X SSC, 0.25% SDS)과 1:9의 비율로 혼합하였다. 형광반응을 일으키기 위하여 비오틴을 사용한 경우에는 스트렙타비딘-시아닌(Streptavidin-Cyanine)을 1㎍/㎖ 농도로 첨가하여 반응시켰다.
2) 상기 1)의 과정에서 준비된 혼성화 용액을 관류 챔버(perfusion chamber)에 도입하여 DNA 칩 상에서 60℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
3) 1X SSC, 0.1% SDS에서 5분 동안 1차 세척 후 0.1X SSC에서 3분간 2차 세척을 실시하였다.
4) 세척된 슬라이드는 원심분리기에서 800rpm의 속도로 8분간 건조하였다.
5) 실험 결과의 확인은 GenePix 4000B(Axon Instrument, 미국) 스캐너를 사용하여 형광값을 측정하여 유전자형을 분석하였고, 그 결과는 도 6a 내지 도 6k에 나타내었다.
도 6a 내지 도 6k는 각각 도 5의 DNA 칩을 이용하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브와 다양한 고래목에 속하는 동물의 PCR 증폭산물을 혼성화한 후의 반응 결과를 나타내는 사진이다. 도 6a는 밍크고래, 도 6b는 범고래, 도 6c는 브라이드고래, 도 6d는 상괭이, 도 6e는 오무라이고래, 도 6f는 참고래, 도 6g는 큰이빨부리고래, 도 6h는 프레이져돌고래, 도 6i는 향고래, 도 6j는 혹등고래, 그리고 도 6k는 흑범고래에 대한 결과이다. 도 6a 내지 도 6k에 도시된 것과 같이, 본 발명의 방법을 이용하면 고래목에 속하는 동물들의 종류에 따라 형광 표지가 다르게 나타나므로, 이에 따라 고래목에 속하는 동물들의 종이나 과를 판별할 수 있음을 확인하였다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA
GENOCHECK CO.,LTD.
<120> Probes for determining phylogenetic classification of animals
belonging to Cetacea, phylogenetic classification DNA chip and
kit, and phylogenetic classification method using the same
<130> P10-0223KR
<160> 14
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplifying mt.DNA COI region
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtca accaaccaca aagacattgg cac 43
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplifying mt.DNA COI region
<400> 2
caggaaacag ctatgacact tcagggtgac cgaagaatca gaa 43
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W1 probe
<400> 3
tagtagtaaa aaagaaggag gaagt 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W2 probe
<400> 4
ttaatagtag gaaggaaggg ggaag 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W3 probe
<400> 5
ggagccatca atttcattac 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W4 probe
<400> 6
tcagttacca aaccctccga t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W5 probe
<400> 7
cctgctatga cacagtatca a 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W6 probe
<400> 8
cccgccataa cccagtatc 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W7 probe
<400> 9
cagtatcaaa ctcctctttt c 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W8 probe
<400> 10
ggctatatcg ggtgatcca 19
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W9 probe
<400> 11
ccttggagct attaacttta tcaca 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W10 probe
<400> 12
taaaaccccc agccataact caata 25
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 13
caatatcaga cccctctttt cgtatga 27
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> W12 probe
<400> 14
tgctatcagt agcagaaagg a 21
Claims (15)
- 고래목에 속하는 동물 각 종의 미토콘드리아 DNA의 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고,
밍크고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
범고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
브라이드고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
상괭이의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
오무라이고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
참고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
참고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
큰이빨부리고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
프레이져돌고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
향고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
혹등고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
흑범고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브를 포함하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 프로브 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 프로브의 길이는 15개 염기 이상이고 30개 염기 이하인 것을 특징으로 하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 프로브 조성물. - 고래목에 속하는 동물 각 종의 미토콘드리아 DNA의 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고,
밍크고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
범고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
브라이드고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
상괭이의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
오무라이고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
참고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
참고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
큰이빨부리고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
프레이져돌고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
향고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
혹등고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브와,
흑범고래의 미토콘드리아 DNA와 특이적으로 결합하는 프로브로서, 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브를 포함하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩. - 삭제
- 제4항에 있어서,
상기 프로브의 길이는 15개 염기 이상이고 30개 염기 이하인 것을 특징으로 하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩. - 제4항에 있어서,
상기 프로브는 동일 기판 상에 마이크로어레이되어 있는 것을 특징으로 하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩. - 청구항 제4항에 정의된 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩과,
고래목에 속하는 동물 각 종의 미토콘드리아 DNA를 증폭하기 위한 프라이머와,
상기 DNA 칩과 혼성화되는 증폭된 미토콘드리아 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 키트. - 제8항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 키트. - 제9항에 있어서,
상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 역방향 프라이머인 것을 특징으로 하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 키트. - 고래목에 속하는 동물 각 종의 미토콘드리아 DNA를 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 시료의 미토콘드리아 DNA를 PCR 증폭하는 단계와,
청구항 제4항에 정의된 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩에 상기 증폭된 미토콘드리아 DNA를 혼성화시키는 단계와,
상기 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 DNA 칩의 프로브와 혼성화된 반응물을 검출하고 상기 동물이 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법. - 제11항에 있어서,
상기 DNA 칩에 상기 증폭된 미토콘드리아 DNA를 혼성화시키는 단계는 3회 내지 4회 반복하는 것을 특징으로 하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법. - 제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 프로브와 혼성화된 반응물을 검출하고 상기 동물이 속하는 분류체계를 결정하는 단계에서는 표지물질에 의한 형광 신호 강도를 측정하는 것을 특징으로 하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법. - 제11항 또는 제12항에 있어서,
서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 프라이머로서 상기 PCR 증폭에 사용하는 것을 특징으로 하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법. - 제14항에 있어서,
상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 정방향 프라이머로 사용되고, 상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 역방향 프라이머로 사용되는 것을 특징으로 하는 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법.
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