CN103451184A

CN103451184A - 麦二叉蚜特异性ss-coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103451184A
Application number: CN2013104283857A
Authority: CN
Inventors: 王倩; 杨帆; 陆宴辉; 杨益众
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2033-09-18
Also published as: CN103451184B

Abstract

本发明涉及麦二叉蚜特异性SS-COI引物以及含有该引物的检测试剂盒，根据麦二叉蚜特有的mtDNA序列，设计了一对麦二叉蚜特异性SS-COI引物LFSgF和LFSgR（SEQ ID No.1和2），该对引物仅对麦二叉蚜具有特异性扩增能力，扩增产物大小为203bp，质粒浓度检出限为9.62E+03，DNA浓度检出限为0.341ng/μL。本发明采用SS-COIPCR技术，提高了检测准确性，节约了检测时间，适于基层推广应用。

Description

麦二叉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及麦二叉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。

背景技术

麦二叉蚜Schizaphis graminum（Rondani）属半翅目蚜科，全国均有分布。其寄主植物有小麦、大麦、燕麦、高粱、水稻、狗尾草、莎草等禾本科植物。麦二叉蚜常在麦类叶片正、反两面或基部叶鞘内外吸食汁液，致麦苗黄枯或伏地不能拔节，严重的麦株不能正常抽穗，直接影响产量，此外还可传播小麦黄矮病。

麦二叉蚜在田间有多种捕食性天敌（如瓢虫、草蛉、蜘蛛等），天敌的保护和利用是麦二叉蚜防治的重要措施。明确不同时期、不同种类捕食性天敌对麦二叉蚜种群的控制作用，对于天敌保育利用以及其他防治措施的实施均具有指导意义。但通过传统的天敌捕食作用研究方法，不能准确评估天敌对每种蚜虫的控害作用。

Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNA COI技术基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点，为准确评价天敌对猎物的捕食作用开辟了新途径。

发明内容

本发明的目的是提供麦二叉蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。

为了实现本发明目的，本发明根据麦二叉蚜的线粒体DNA序列，设计一对麦二叉蚜特异性SS-COI引物，其包括：

正向引物LFSgF：5′-CATTATCTAATAATATTGCTCATAAC-3’

反向引物LFSgR：5’-TGATAAAATTAATAAAATAGCTGTG-3’。

本发明还提供含有引物LFSgF和LFSgR的用于检测麦二叉蚜的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供所述引物LFSgF和LFSgR，以及含有引物LFSgF和LFSgR的试剂盒在检测麦二叉蚜中的应用。

本发明还提供一种麦二叉蚜的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：

1）提取样品DNA；

2）以步骤1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物LFSgF和LFSgR进行PCR扩增反应；

3）分析PCR产物。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为203bp的DNA扩增条带（SEQ ID No.3），则判定样品为麦二叉蚜。

本发明根据GenBank中公布的麦二叉蚜COI（JX966075）的一段基因序列，设计一对特异性引物，该引物特异性强，只对麦二叉蚜具有扩增能力，而对我国华北棉区内棉田中的主要昆虫无扩增产物。采用本发明提供的方法和引物检测麦二叉蚜，准确性高，可扩增出203bp大小的片段。采用SS-COI PCR技术检测麦二叉蚜，是对RAPD技术、RFLP技术和mtDNA COI检测技术的补充和改进，SS-COI PCR检测技术操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为9.62E+03，DNA浓度检出限为0.341ng/μL。

附图说明

图1为本发明实施例1中麦二叉蚜特异性引物LFSgF/LFSgR的PCR检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-114为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。

图2为本发明实施例2中麦二叉蚜特异性引物LFSgF/LFSgR的DNA浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准5000bp ladder；1-12为模板DNA浓度341.8ng/μL依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。

图3为本发明实施例2中麦二叉蚜特异性引物LFSgF/LFSgR的质粒浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-8为模板质粒浓度9.62E+10依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 引物LFSgF/LFSgR对麦二叉蚜的扩增效果

1）麦二叉蚜基因组的制备

将单头蚜虫放入1.5mL离心管中将其磨碎，用TIANamp GenomicDNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（天根生物有限公司，北京）提取单头蚜虫基因组。将DNA溶液储于-20℃备用，进行PCR扩增时吸取1μL溶液作为DNA模板。

（2）合成检测麦二叉蚜的特异性SS-COI引物

特异性SS-COI引物序列如下：

LFSgF:5′-CATTATCTAATAATATTGCTCATAAC-3′（SEQ ID No.1）

LFSgR:5′-TGATAAAATTAATAAAATAGCTGTG-3′（SEQ ID No.2）

2）PCR扩增

反应体系为20μL，包括：10×EasyTaq缓冲液2.0μL、dNTP（2.5mM）0.4μL、EasyTaq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、正、反向引物（10μM）各0.4μL、模板DNA1.0μL、ddH₂O15.6μL。

3）PCR扩增程序

94℃预变性4min；94℃ 30sec，54℃ 30sec，72℃ 30sec，45个循环；最后72℃延伸1sec。

4）PCR产物鉴定

取6μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中，根据扩增产物的大小判定。

5）结果

利用引物LFSgF/LFSgR，以麦二叉蚜DNA为模板，以麦二叉蚜同域的59种其他昆虫（见表1）为对照进行Species-Specific-COI PCR扩增，结果如图1所示，7、8泳道对应的麦二叉蚜扩增出了203bp的目的条带，说明根据麦二叉蚜线粒体DNA设计的Species-Specific-COI PCR扩增引物的特异性强。回收上述203bp的目的条带，进行测序，其序列如SEQ IDNo.3所示。

表1 引物特异性检测中所涉及的昆虫种类

实施例2 引物LFSgF/LFSgR对麦二叉蚜最低检出量的测定

1）麦二叉蚜模板基因组的制备

1）麦二叉蚜模板DNA的制备

按实施例1提取单头麦二叉蚜基因组DNA，然后原模板溶液以10倍进行递减梯度稀释至检测不出条带，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中，反应体系同实施例1中的描述。

利用引物LFSgF/LFSgR做最低检出量的测定，以不同稀释倍数的麦二叉蚜基因组DNA为模板进行PCR扩增，DNA浓度检出限为0.341ng/μL（图2）。

2）麦二叉蚜质粒的制备

按实施案例1对麦二叉蚜基因组DNA进行扩增，扩增完毕后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。利用Axygen琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收PCR产物，PCR产物经胶回收后克隆于pEasy-T3载体上（按试剂盒说明操作），重组质粒转化Trans1-T1感受态细胞，然后涂布于含有Ampicillin/X-gal/IPTG的LB平板上，37℃倒置培养15小时。经蓝白斑筛选后，挑取10个阳性克隆在含Amp的LB液体培养基中培养过夜，第二天用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，然后提取的质粒以10倍进行递减梯度稀释至检测不出条带，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中，反应体系同实施例1中的描述。

利用引物LFSgF/LFSgR做最低检出量的测定，以不同稀释倍数的麦二叉蚜质粒浓度进行PCR扩增，模板质粒浓度检出限（拷贝数）为9.62E+03（图3）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.麦二叉蚜特异性SS-COI引物，其特征在于，其包括：

正向引物LFSgF：5′-CATTATCTAATAATATTGCTCATAAC-3’

反向引物LFSgR：5’-TGATAAAATTAATAAAATAGCTGTG-3’。

2.含有权利要求1所述引物的用于检测麦二叉蚜的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

5.权利要求1所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测麦二叉蚜中的应用。

6.麦二叉蚜的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取样品DNA；

3）分析PCR产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，共45个循环；72℃1秒。