KR20130048856A - 가루이류 분류를 위한 프로브 조성물, ｄｎａ 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 가루이류 분류방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 담배가루이와 온실가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역에 존재하는 단일염기다형성을 기반으로 유전자형을 분석하여 간단하고, 신속 정확하게 가루이 종류 및/또는 바이오타입 (biotype)을 구별 및 판별할 수 있는 프로브 조성물, DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 가루이류 분류방법에 관한 것이다. 본 발명은 육안으로는 가루이류를 정확히 판별할 수 없는 유생, 가공물 또는 분말 등에 대해서도 하나의 슬라이드 상에서 가루이류의 시료를 로딩하는 것만으로 간단하게 담배가루이와 온실가루이를 분류하고 담배가루이의 바이오타입을 판별할 수 있고, 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간을 크게 단축하면서 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있다.
Description
본 발명은 가루이과 (family Aleyrodidae)에 속하는 가루이 (whitefly) 해충을 분류 및 판별하는 프로브 조성물, DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 가루이류 분류방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 담배가루이와 온실가루이를 분류하고 담배가루이의 바이오타입을 판별하는 프로브 조성물, DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 가루이류 분류방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 담배가루이와 온실가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역에 존재하는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 기반으로 유전자형을 분석하여 간단하고, 신속 정확하게 가루이류의 종류 및/또는 바이오타입 (biotype)을 구별 및 판별할 수 있는 프로브 조성물, DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 가루이류 분류방법에 관한 것이다.
가루이류는 노린재목 (Hemipera) 가루이과 (Aleyrodidae)에 속하는 약 600여종의 기주에서 발생하는 흡즙성 곤충으로서, 정식 학명은 담배가루이 (Bemisia tabaci)와 온실가루이 (Trialeurodes vaporariorum)이다. 담배가루이와 온실가루이는 박과 작물, 가지과 작물, 화훼류 뿐만 아니라 딸기와 잎들깨 등을 가해하는 온실 작물의 주요 해충인데, 오이, 토마토, 관상식물을 포함하는 시설 원예작물의 수량 감소, 감로 집적 및 이차적 그을름병을 유발하여 작물의 생육을 저하시키고 상품 가치를 하락시키며 지역에 따라서는 바이러스병도 전염시킬 수 있다. 따라서 이들 모두는 채소류와 관상식물의 생산에 있어서 심각한 문제점을 유발한다.
특히 담배가루이는 약 1200 종의 가루이 곤충 중에서도 전세계적으로 분포하면서 광범위하게 피해를 주는 해충이다. 담배가루이는 직접 분비하는 분비물에 의해 농작물에 피해를 입힐 뿐만 아니라 베고모바이러스 (Begomovirus)(제미니비리대 (Geminiviridae)), 크리니바이러스(Crinivirus), 칼라바이러스(Carlavirus)(포티비리대(Potyviridae))를 포함하는 100여종 이상의 식물 바이러스를 전염시켜 간접적인 피해도 막대하게 끼친다. 또한 이들의 성충과 유충도 잎 뒷면에 기생하면서 식물체의 즙액을 흡수하여 작물의 생육 억제, 잎의 퇴색 위축, 낙엽, 수량 감소 등의 피해를 주고, 다발 발생 시 벌레에서 배출되는 배설물로 인해 작물의 상품 가치를 감소시키며, 이차적으로 토마토 황화위축병, 담배잎말림병, 토란잎말림병 등 60여종의 바이러스병을 매개하는 것으로 알려져 있다. 실제로 미국에서는 목화의 주요 해충으로 작용하여 연간 5억불 이상의 피해를 주는 것으로 보고되어 있다.
그런데 담배가루이는 기주 선호성, 매개하는 바이러스의 종류 등의 생물학적 특성을 달리하는 개체군 분화가 이루어져 있어, 이를 바이오타입으로 구분하고 있다. 현재까지 B 타입, Q 타입, 및 A 타입 등을 포함하여 24개 바이오타입이 보고되었다. 이중 B 타입과 Q 타입이 생식력이 강하고 농작물에 심각한 바이러스를 매개하고 기주 범위가 넓으며 유기인계 및 피레스로이드계, 카바메이트계 살충제에 저항성을 보이는 등 전세계적으로 가장 심각한 피해를 주고 있다. 우리나라에서도 전국적으로 담배가루이의 발생이 증가 추세에 있으며, 먼저 B 계통의 담배가루이 발견된 이후 2005년에는 Q 계통의 담배가루이가 새로이 발견되기도 하였다. 구체적으로, B 타입과 Q 타입은 형태학적으로 비슷하나 발육기간, 기주 선호성, 바이러스 매개 효율, 살충제 저항성 등의 몇 가지 생물학적 특성에서 차이를 나타낸다.
따라서, 다양한 가루이류를 신속하고 정확하게 분류하고 판별하는 것은 종합적인 해충 관리에서 가장 중요하고 기초적인 요소라고 할 수 있다. 국내 및 국외적으로, 종래의 생물종 분류 연구는 형태의 계측 형질, 계수 형질을 기초로 하여 수행되어 왔다. 근래에는 형태 및 형질을 이용한 분류 및 계통 연구에서 문제점들이 많이 발견되면서 분자생물학적 기법이 활발하게 도입되고 있다. 이러한 분자생물학적 방법은 성체를 중심으로 이루어진 기존의 형태적 분류의 단점을 보완하는 것으로서, 발생 초기의 생물종 또는 가공된 개체의 경우와 비교할 수 있어 이점으로 작용하고 있다.
그러나, 가루이류는 생물다양성 조사를 위하여 수 가지 생물종을 한 번에 또한 신속 정확하게 판별할 수 있는 분자생물학적인 연구가 국내외 모두에서 그 사례를 찾아보기 어려운 실정이었다.
이와 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2011-0104845호에서는 담배가루이의 카르복실에스테라제 2 유전자의 인트론 부위의 길이에서 바이오타입 간 차이가 있는 점을 이용하는 담배가루이의 바이오타입 진단 방법을 개발하여 보고한 바 있었다. 그러나 이 방법은 담배가루이와 온실가루이를 포함하는 가루이류를 속 내지 종 수준으로 판별할 수 있는 것은 아니었다.
이외에도 특정 타겟 유전자의 염기 서열을 비교 분석하거나 제한효소를 처리하여 그 양상을 확인하는 PCR-제한효소 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP) 기법 등을 사용하는 연구들이 보고되었다. 그러나 이러한 염기서열 분석법은 상대적으로 정확하기는 하지만 비용과 시간이 많이 소요되고, 가장 널리 사용되는 PCR-RFLP 기법도 역시 PCR 증폭 이후에 제한효소를 처리해야 하기 때문에 시간이 많이 소요되며 상대적으로 과정이 복잡한 단점이 있다.
또한, 임의의 DNA 단편을 PCR 증폭하여 양상을 분석하는 랜덤 증폭 다형성 DNA 분석(random amplified polymorphic DNA analysis, RAPD-PCR), 마이클로새틀라이드(microsatelite) DNA 분석 등도 이용되기는 하지만, 양상의 분석이 어렵고 복잡한 단점을 여전히 가진다.
이에 본 발명자들은 가루이 해충을 효과적으로 분류할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 가루이류의 유전자형을 구별하는 데 가장 적합한 유전자군으로서 미토콘드리아의 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자를 선택하고 이로부터 가루이류에 특이적인 단일염기 다형성(SNPs) 부위를 찾아내었다. 또한 이들 염기서열을 이용하여 가루이류의 유전자형을 분석할 수 있는 새로운 프라이머들과 프로브들을 제작하였으며, PCR 증폭산물이 마이크로어레이 칩 상에서 각종 가루이류에 특이적인 프로브들과 특이적으로 혼성화되어 담배가루이와 온실가루이 등을 효과적으로 판별하고 나아가 담배가루이의 바이오타입 역시 특이도와 민감도가 높게 구분해낼 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 가루이과 (family Aleyrodidae)에 속하는 담배가루이와 온실가루이를 분류하고 담배가루이의 바이오타입을 판별하는 프로브 조성물, DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 가루이류 분류방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 담배가루이와 온실가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 존재하는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 기반으로 유전자형을 분석하여 간단하고, 신속 정확하게 담배가루이와 온실가루이를 분류하고 담배가루이의 바이오타입을 판별할 수 있는 프로브 조성물, DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 가루이류 분류방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 육안으로는 가루이류를 정확히 판별할 수 없는 유생, 가공물 또는 분말 등에 대해서도 하나의 슬라이드 상에서 가루이류의 시료를 로딩하는 것만으로 간단하게 담배가루이와 온실가루이를 분류하고 담배가루이의 바이오타입을 판별할 수 있고, 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간을 크게 단축하면서 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있는 프로브 조성물, DNA 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 가루이류 분류방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 미토콘드리아 COI (cytochrome oxidase subunit I) 유전자의 단일염기 다형성(SNPs) 부위를 이용하여 가루이류를 분류할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 수많은 연구와 노력을 통하여 가루이류의 COI 유전자 중에서 상기 단일염기 다형성 (SNPs) 부위에 속하는 염기서열을 포함하는 프로브가 가루이류의 종 또는 바이오타입을 구별하기에 가장 적합한 점을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명은 상기 단일염기 다형성 부위에 속하는 염기서열, 즉 서열번호 5 내지 서열번호 11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 사용한다. 이러한 프로브들은 가루이류의 종 또는 바이오타입에 따라 서로 다른 단일염기 다형성 부위를 근거로 하여 제작되기 때문에, 의도한 가루이류에 속하는 PCR 증폭 산물과는 결합하지만 이외에 다른 종 또는 바이오타입에 속하는 가루이류의 PCR 증폭 산물과는 결합하지 않는다.
한편, 본 명세서에서 "가루이류"란 성충 뿐만아니라, 알, 유충, 번데기, 유생, 가공물, 또는 분말가루 등을 모두 포함하는 개념으로 사용된다. 또한, 가루이류 시료에서 DNA를 추출하는 것은 시료의 각 조직으로부터 다양한 방법에 의해 수행될 수 있고, 이는 추출된 DNA를 분석하여 종 또는 바이오타입을 판별하기 위한 것이기 때문에 시료의 어느 부위에서 DNA를 추출하는지 또는 어떠한 방법으로 추출하는지 역시 특별히 제한되지 않는다.
그리고, 상기와 같이 추출한 DNA를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 DNA 추출방법이나 증폭방법 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 "다형성 (polymorphism)"이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 둘 이상의 대체가능한 서열 또는 대립 형질의 발생을 의미한다. 다형성 마커 또는 부위는 이와 같은 현상이 일어나는 좌위(locus)이다. 바람직한 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생 빈도를 나타내는 두 개 이상의 대립 형질을 가진다. 다형성 부위는 단일 염기쌍일 수도 있다. 따라서, 본 발명의 가루이류 분류를 위한 올리고뉴클레오티드 프로브는 후술하는 염기서열 이외에 본 발명에 따른 다형성 부위를 하나 이상 포함하여 이루어지는 올리고뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 핵산 단편 또는 그의 상보체도 가능하다
따라서, 본 발명의 일실시예의 가루이류 분류를 위한 프로브 조성물은, 담배가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고 서열번호 9의 염기서열 내지 서열번호 10의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 온실가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고 서열번호 11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브를 포함한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 가루이류 분류를 위한 프로브 조성물은, 담배가루이의 B 타입에 특이적인 프로브로서 서열번호 5의 염기서열 내지 서열번호 6의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 담배가루이의 Q 타입에 특이적인 프로브로서 서열번호 7의 염기서열 내지 서열번호 8의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 가루이류 분류를 위한 DNA 칩은, 담배가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고 서열번호 9의 염기서열 내지 서열번호 10의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 온실가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고 서열번호 11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브를 포함한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 가루이류 분류를 위한 DNA 칩은, 담배가루이의 B 타입에 특이적인 프로브로서 서열번호 5의 염기서열 내지 서열번호 6의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 담배가루이의 Q 타입에 특이적인 프로브로서 서열번호 7의 염기서열 내지 서열번호 8의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 가루이류 분류를 위한 DNA 칩에 있어서, 상기 프로브는 유리 슬라이드와 같은 동일 기판 상에 마이크로어레이될 수 있다. 상기 기판은 DNA 칩 제작에 일반적으로 사용되는 유리기판 또는 플라스틱 기판인 것이 바람직하다. 또한, 상기 프로브가 마이크로어레이된 DNA 칩에는 프로브와의 혼성화 및 검출의 정확성을 높일 수 있도록 특정한 염기서열로 표시되는 위치 마커(position marker)를 추가적으로 고정시키는 것도 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 가루이류 분류방법은, (a) 가루이류로부터 미토콘드리아 COI 유전자의 단일염기 다형성(SNP) 부위를 증폭시킨 PCR 증폭산물을 얻는 단계와, (b) 상기 PCR 증폭산물을 가루이류에 특이적인 프로브들과 혼성화시키는 단계와, (c) 상기 혼성화 여부에 따라 담배가루이인지 온실가루이인지 여부 및/또는 담배가루이의 바이오타입을 판별하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 가루이류 분류방법에 있어서, 담배가루이 판별을 위해, 미토콘드리아의 COI 유전자의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드들로서 서열번호 9의 염기서열 내지 서열번호 10의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 PCR 증폭산물과 혼성화되고, 온실가루이 판별을 위해, 미토콘드리아의 COI 유전자의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서 서열번호 11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브가 상기 PCR 증폭산물과 혼성화되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 가루이류 분류방법에 있어서, 담배가루이의 바이오타입 B 타입의 판별을 위해, 서열번호 5의 염기서열 내지 서열번호 6의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 PCR 증폭산물과 혼성화되고, 담배가루이의 바이오타입 Q 타입의 판별을 위해, 서열번호 7의 염기서열 내지 서열번호 8의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 PCR 증폭산물과 혼성화되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 가루이류 분류를 위한 PCR 증폭키트는, 담배가루이로부터 미토콘드리아 COI 유전자의 SNP 부위를 증폭시키기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍, 온실가루이로부터 미토콘드리아 COI 유전자의 SNP 부위를 증폭시키기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 포함한다.
또한, 본 발명은 미토콘드리아 COI 유전자의 단일염기 다형성 부위를 이용하여 가루이류를 분류할 수 있는 검사 키트를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 본 발명의 일실시예의 가루이류를 분류할 수 있는 검사 키트는, 전술한 바와 같이 정의된 DNA 칩과, 담배가루이로부터 미토콘드리아 COI 유전자의 SNP 부위를 증폭시키기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍, 및 온실가루이로부터 미토콘드리아 COI 유전자의 SNP 부위를 증폭시키기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍과, 상기 DNA 칩과 혼성화되는 증폭된 유전자 산물을 검출하기 위한 표지수단을 포함한다.
한편, 본 발명에 있어서, 표지물질은 특정 형광물질에 제한되지 않음은 물론이고, 형광 검출기로서 확인이 가능한 다양한 형광물질이 사용될 수 있으며 효소학적 발색반응 및 동위원소 표지도 가능하다. 예를 들어, 표지물질은 Cy5, Cy3, 비오틴-결합물질, EDANS (5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트 (TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드 등일 수 있으며, 형광물질인 Cy3 또는 Cy5인 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질, 방사성 물질 또는 발광성 물질 등 다양한 표지물질이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면 담배가루이와 온실가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 영역에 존재하는 단일염기다형성을 기반으로 유전자형을 분석하여 간단하고, 신속 정확하게 담배가루이와 온실가루이를 분류하고 담배가루이의 바이오타입을 판별할 수 있다.
또한, 본 발명은 가루이류 분류를 위한 프로브 조성물, DNA 칩 및 키트로 제작될 경우 육안으로는 가루이류를 정확히 판별할 수 없는 유생, 가공물 또는 분말 등에 대해서도 하나의 슬라이드 상에서 가루이류의 시료를 로딩하는 것만으로 간단하게 담배가루이와 온실가루이를 분류하고 담배가루이의 바이오타입을 판별할 수 있다.
또한, 본 발명의 가루이류 분류를 위한 프로브를 마이크로어레이하는 방법을 활용하면, 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간을 크게 단축하면서 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있는 장점이 있다.
따라서, 본 발명은 마이크로어레이 DNA 칩 기술에 따라 하나의 슬라이드 위에서 다수의 가루이 종 또는 바이오타입을 동시에 한 번의 실험으로 정확하게 유전자형을 분석할 수 있어, 가루이류의 유전자형과 종 또는 바이오타입을 판별하는 방법을 표준화 및 자동화할 수 있는 가능성도 열어준다.
뿐만아니라, 본 발명은 가루이 해충을 간단하고도 신속, 정확하게 판별할 수 있어 해충의 효과적인 박멸과 농업 생산성 향상 등에 널리 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 가루이류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단일염기 다형성 부위를 포함하는 가루이류의 미토콘드리아 DNA 상의 유전자 배열을 예시적으로 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 담배가루이 B 타입의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단일염기 다형성 부위가 포함된 연속적인 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 담배가루이 Q 타입의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단일염기 다형성 부위가 포함된 연속적인 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 온실가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단일염기 다형성 부위가 포함된 연속적인 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 마이크로어레이 DNA 칩의 레이아웃을 나타낸 것이다.
도 6은 담배가루이 B 타입의 PCR 증폭산물을 본 발명의 마이크로어레이 DNA 칩에 혼성화시킨 후 확인한 DNA 칩의 형광이미지 사진이다.
도 7은 담배가루이 Q 타입의 PCR 증폭산물을 본 발명의 마이크로어레이 DNA 칩에 혼성화시킨 후 확인한 DNA 칩의 형광이미지 사진이다.
도 8은 온실가루이의 PCR 증폭산물을 본 발명의 마이크로어레이 DNA 칩에 혼성화시킨 후 확인한 DNA 칩의 형광이미지 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 담배가루이 B 타입의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단일염기 다형성 부위가 포함된 연속적인 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 담배가루이 Q 타입의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단일염기 다형성 부위가 포함된 연속적인 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 온실가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단일염기 다형성 부위가 포함된 연속적인 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 마이크로어레이 DNA 칩의 레이아웃을 나타낸 것이다.
도 6은 담배가루이 B 타입의 PCR 증폭산물을 본 발명의 마이크로어레이 DNA 칩에 혼성화시킨 후 확인한 DNA 칩의 형광이미지 사진이다.
도 7은 담배가루이 Q 타입의 PCR 증폭산물을 본 발명의 마이크로어레이 DNA 칩에 혼성화시킨 후 확인한 DNA 칩의 형광이미지 사진이다.
도 8은 온실가루이의 PCR 증폭산물을 본 발명의 마이크로어레이 DNA 칩에 혼성화시킨 후 확인한 DNA 칩의 형광이미지 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
1: 서열번호 1 내지 서열번호 4의
프라이머의
제작
먼저 본 실시예에서는 가루이류에서 추출한 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머를 합성하였다. 실시예 1에서는 하기 표 1에 나타난 바와 같은 각각의 가루이류에 따른 프라이머들을 사용하였다. 이들 프라이머는 한국의 바이오니아社(대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다.
상기 표 1에 기재된 바와 같은 대칭 또는 비대칭 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 사용하는 전위 방향 (센스) 프라이머 및 후위 방향 (안티센스) 프라이머는 혼성화 (hybridization) 반응을 시킨 이후에 형광으로 확인할 수 있도록 말단에 로다민, cy3, 또는 cy5를 부착시켜서 제작하거나 비오틴(biotin)을 부착시켰으며, 비오틴을 부착시킨 경우에는 혼성화 반응 이후에 스트렙타비딘-사이아닌 (Streptavidin-Cyanine)과 결합하도록 하여 사용하였다.
이러한 특정한 프라이머는 가루이류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단일염기 다형성 부위의 DNA 서열에 부합하는 것으로서, 가루이류 시료에서 추출한 DNA를 더욱 우수하게 증폭시킬 수 있다. 담배가루이 시료에서 DNA를 증폭하기 위해서는 표 1에 기재된 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 사용하였고, 온실가루이 시료에서 DNA를 증폭하기 위해서는 표 1에 기재된 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머쌍을 사용하였다.
실시예
2:
가루이류의
DNA
추출 및
PCR
증폭반응
담배가루이(Bemisia tabaci), 온실가루이 (Trialeurodes vaporariorum) 및 담배가루이의 각종 바이오타입을 포함하는 가루이류의 DNA는 독일 퀴아젠사 (QIAGEN)의 DNeasy blood & tissue kit를 사용하여 추출하였다.
그리고, 상기 실시예 1에서 제작한 프라이머들을 사용하여 하기에 나타낸 표 2과 같은 조건 하에서 PCR 증폭반응을 DNA 엔진 (DNA Engine)(일본 타카라사 (Takara))을 사용하여 수행하였다.
상기와 같은 조건 하에서 PCR 증폭반응이 끝난 후, PCR 증폭산물 3㎕에 젤 로딩 버퍼(0.2% orange G, 0.25% xylene cyanol FF, 60% glycerol) 2㎕를 넣고 1㎍/㎖ 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)가 함유된 2% 아가로스젤에서 전기영동한 후 UV 트랜스일루미네이터 (UV transilluminator)가 부착된 이미지 애널라이저(Image analyzer)(HITACHI, 일본)에서 PCR 증폭산물의 밴드를 확인하였다.
실시예
3:
가루이류에 대해
특이적인
프로브의
제작
본 실시예에서는 각각의 가루이류에 대해 특이적인 프로브들을 합성하였다. 혼성화 반응을 위한 프로브의 서열정보는 하기 표 3에 나타낸 것과 같다.
| 프로브 명칭 | DNA 서열 | 방향 | 반응종 | DNA 서열위치 |
| R1(서열번호5) | CAATAAACCCTAGAATACCAATAG | (후위방향) 안티센스 |
담배가루이 B 타입 | 11-34 |
| R2(서열번호6) | GCAATAATTATAGTGGCTGAAG | (후위방향) 안티센스 |
담배가루이 B 타입 | 92-113 |
| R3(서열번호7) | CAATAAACCCTAAGATACCAATAGT | (후위방향) 안티센스 |
담배가루이 Q 타입 | 10-34 |
| R4(서열번호8) | ATCTAGTATGGAACAAAATTTCTTC | (전위방향) 센스 |
담배가루이 Q 타입 | 518-542 |
| R5(서열번호9) | GAGTATCTACATCTATTCCAACTG | (후위방향) 안티센스 |
담배가루이 | 56-79 |
| R6(서열번호10) | TTGGTGTCTCAATTTTATATCATGTT | (전위방향) 센스 |
담배가루이 | 406-431 |
| R7(서열번호11) | AACCCCAACACACCGATAGT | (후위방향) 안티센스 |
온실가루이 | 134-153 |
후술하는 바와 같이 가루이류 시료의 PCR 증폭산물과 상기 프로브의 혼성화 여부에 따라 가루이류가 속하는 종 또는 바이오타입을 판별함에 있어서, PCR 증폭산물이 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프로브들과 결합하는 경우에는 담배가루이 B 타입으로 구분되고, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프로브들과 결합하는 경우에는 담배가루이 Q 타입으로 구분되며, 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프로브와 결합하는 경우에는 온실가루이로 구분된다.
구체적으로, 본 발명에 따른 프로브들은 가루이류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 단일염기 다형성 부위와 결합하고, 후술하는 바와 같은 혼성화과정은 가루이류의 종 또는 바이오타입에 따라 차별적으로 수행될 수 있다. 실제로, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프로브는 담배가루이 B 타입의 미토콘드리아 COI 유전자 부위의 11-34번째 또는 92-113번째 염기서열과 각각 특이적으로 결합하고, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프로브는 담배가루이 Q 타입의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 10-34번째 또는 518-542번째 염기서열과 각각 특이적으로 결합하며, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프로브는 담배가루이 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 56-79번째 또는 406-431번째 염기서열과 각각 특이적으로 결합하고, 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프로브는 온실가루이 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 134-153번째 염기서열과 특이적으로 결합하게 된다.
한편, 상기 프로브는 15 내지 30개의 연속된 염기서열로 구성되는 것이 바람직하며, 가루이류로부터의 PCR 증폭산물을 상기 프로브와 결합시키는 단계는 적어도 2회 이상 반복되는 것이 바람직하다. 이 경우 프로브와 PCR 증폭산물의 결합을 더욱 견고히 할 수 있다.
실시예
4:
마이크로어레이
칩의 제작
마이크로어레이된 DNA 칩의 제작은 당업자에게 널리 알려진 방법을 사용하여 수행된다.
먼저, 알데히드 작용기가 처리되어 있는 글라스 위에 실시예 3의 각각의 프로브 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 아미노 링크를 수식한 다음, 혼성화 반응 시 슬라이드 글라스 위에 집적되어 있는 프로브 간의 공간적인 방해를 최소화시키도록 10 내지 20 개의 올리고(dT)를 부가하여 본 발명의 실시예에서 사용하는 프로브들을 완성하였다. 본 발명의 프로브들은 한국 바이오니아사(대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다.
그리고, 상기 제작된 올리고뉴클레오티드 프로브들이 고정된 마이크로어레이 칩을 제작하기 위하여, CSS-100 시릴화된 슬라이드[Silylated Slide, 셀 어소시에이트사(Cel Associate), 미국] 상에 50μM의 농도로 아미노 링크가 수식되어 있는 프로브와 동일한 양의 3X SSC 용액을 혼합하여 집적하였고, 이를 16시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 다음 슬라이드를 0.1% SDS로 5분 동안 1회 세척하였고, 증류수로 5분 동안 2회 세척하였다. 상기 제작된 칩을 소디움 보로하이드리드 (1.3g NaBH4 375ml, PBS 125ml, 100% EtOH)와 5분 동안 반응시킨 다음, 증류수로 5분 동안 2회 세척하였고 800rpm으로 5분 동안 원심분리하였다.
제작된 마이크로어레이 칩은 4개의 서브-어레이로 구분하고, 혼성화 실험에 있어서 준비된 마이크로어레이 칩이 독립적으로 반응을 진행할 수 있도록 CoverWell 관류 체임버(perfusion chamber)(Grace-Bio Labs, 미국)로 커버하였다. 최종적으로 제작된 마이크로어레이 칩의 구성(레이아웃)은 도 5에 도시된 바와 같다.
실시예
5:
혼성화
반응
실시예 1 및 실시예 2에 따라 증폭된 로다민, cy3, cy5 또는 비오틴이 결합된 PCR 증폭산물을 혼성화 용액(3X SSC, 0.25% SDS)과 1:9의 비율로 혼합하였다. 형광 반응을 유도하도록 비오틴을 사용한 경우에는 스트렙타비딘-사이아닌을 1㎍/㎖의 농도로 첨가하였다.
그리고, 준비된 혼성화 용액을 실시예 4에서 제작한 DNA 칩이 포함된 체임버에 도포하여 55℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 1X SSC, 0.1% SDS 용액에서 5분 동안 1차 세척하였고 다시 1X SSC 용액에서 5분 동안 세척하였다. 이후 추가로 0.1X SSC 용액에서 5분 동안 세척하였다. 세척된 슬라이드는 원심분리기에서 800rpm의 속도로 5분 동안 건조시켰다.
혼성화 결과를 확인하기 위하여, 반응이 완료된 마이크로어레이 칩의 혼성화 신호(형광 신호)는 Genepix 4000B (미국 액손 인스트루먼트사 (Axon Instrument))를 이용하여 PMT(Photomultiplier Tube) 450, 레이저 전력(Laser power) 100%, 5㎛ 해상도(resolution)로 스캔하여 형광 이미지를 저장한 다음, 각각의 프로브의 양성 및 음성 신호를 형광값으로 판단하였다. 형광 강도 데이터는 GenePix Pro 4.1 소프트웨어(Axon instrument, USA)를 사용하여 분석되었고, 국지적인 배경값은 각 스팟의 평균값에서 감산되었다. 모든 프로브들은 이중으로 스폿팅되어 타겟 프로브들의 신호 강도들은 2개의 스폿의 평균값으로부터 계산되었다.
도 6 내지 도 8은 각각 본 발명에 따른 프로브와 가루이류의 PCR 증폭산물을 결합시킨 결과사진이다. 여기서, 도 6 내지 도 8은 각각 도 5에 도시된 바와 같은 형태의 DNA 칩에서, 본 발명에 따른 프로브와 가루이류의 PCR 증폭산물을 결합시킨 후 확인한 형광이미지 사진이다. 즉, 도 6은 담배가루이 B 타입, 도 7은 담배가루이 Q타입, 도 8은 온실가루이에 대한 혼성화 반응 결과이다.
따라서, 프로브 신호 데이터의 분석 후, 본 발명의 마이크로어레이 칩은 가루이류 해충의 해당 종 또는 바이오타입에 따라 형광 표지가 다르게 나타나는 것을 분명하게 관찰할 수 있었다. 그러므로, 본 발명은 가루이 해충의 종 또는 바이오타입을 특이도 및 민감도 높게 판별하는 데 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> GENOCHECK CO.,LTD.
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discriminating whiteflies, and method for discriminating
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<130> P11-0261KR
<160> 11
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
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<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
tttactgcac tttctgccac atta 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
tgattttttg gtcatcctga ggtgta 26
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 5
caataaaccc tagaatacca atag 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 7
caataaaccc taagatacca atagt 25
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 8
atctagtatg gaacaaaatt tcttc 25
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
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ttggtgtctc aattttatat catgtt 26
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 11
aaccccaaca caccgatagt 20
Claims (10)
- 담배가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고 서열번호 9의 염기서열 내지 서열번호 10의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
온실가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고 서열번호 11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브를 포함하는 가루이류 분류를 위한 프로브 조성물. - 제1항에 있어서,
담배가루이의 B 타입에 특이적인 프로브로서 서열번호 5의 염기서열 내지 서열번호 6의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
담배가루이의 Q 타입에 특이적인 프로브로서 서열번호 7의 염기서열 내지 서열번호 8의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 더 포함하는 가루이류 분류를 위한 프로브 조성물. - 담배가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고 서열번호 9의 염기서열 내지 서열번호 10의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
온실가루이의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 영역에 대해 특이적으로 결합하고 서열번호 11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브를 포함하는 가루이류 분류를 위한 DNA 칩. - 제3항에 있어서,
담배가루이의 B 타입에 특이적인 프로브로서 서열번호 5의 염기서열 내지 서열번호 6의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와,
담배가루이의 Q 타입에 특이적인 프로브로서 서열번호 7의 염기서열 내지 서열번호 8의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 더 포함하는 가루이류 분류를 위한 DNA 칩. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 프로브는 동일 기판 상에 마이크로어레이되는 것을 특징으로 하는 가루이류 분류를 위한 DNA 칩. - (a) 가루이류로부터 미토콘드리아 COI 유전자의 단일염기 다형성(SNP) 부위를 증폭시킨 PCR 증폭산물을 얻는 단계와,
(b) 상기 PCR 증폭산물을 가루이류에 특이적인 프로브들과 혼성화시키는 단계와,
(c) 상기 혼성화 여부에 따라 담배가루이인지 온실가루이인지 여부 및/또는 담배가루이의 바이오타입을 판별하는 단계를 포함하는 가루이류 분류방법. - 제6항에 있어서,
담배가루이 판별을 위해, 미토콘드리아의 COI 유전자의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드들로서 서열번호 9의 염기서열 내지 서열번호 10의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 PCR 증폭산물과 혼성화되고,
온실가루이 판별을 위해, 미토콘드리아의 COI 유전자의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서 서열번호 11의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브가 상기 PCR 증폭산물과 혼성화되는 것을 특징으로 하는 가루이류 분류방법. - 제6항 또는 제7항에 있어서,
담배가루이의 바이오타입 B 타입의 판별을 위해, 서열번호 5의 염기서열 내지 서열번호 6의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 PCR 증폭산물과 혼성화되고,
담배가루이의 바이오타입 Q 타입의 판별을 위해, 서열번호 7의 염기서열 내지 서열번호 8의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브가 상기 PCR 증폭산물과 혼성화되는 것을 특징으로 하는 가루이류 분류방법. - 담배가루이로부터 미토콘드리아 COI 유전자의 SNP 부위를 증폭시키기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍, 온실가루이로부터 미토콘드리아 COI 유전자의 SNP 부위를 증폭시키기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 포함하는 가루이류 분류를 위한 PCR 증폭키트.
- 제3항 또는 제4항에 정의된 DNA 칩과,
담배가루이로부터 미토콘드리아 COI 유전자의 SNP 부위를 증폭시키기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍, 및 온실가루이로부터 미토콘드리아 COI 유전자의 SNP 부위를 증폭시키기 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍과,
상기 DNA 칩과 혼성화되는 증폭된 유전자 산물을 검출하기 위한 표지수단을 포함하는 가루이류를 분류할 수 있는 검사 키트.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020110113737A KR101334054B1 (ko) | 2011-11-03 | 2011-11-03 | 가루이류 분류를 위한 프로브 조성물, ｄｎａ 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 가루이류 분류방법 |
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