KR100806208B1 - 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 - Google Patents

홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍어과(Family Rajidae) 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 관한 것으로, 특히 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 및 상기 결합 여부를 확인해서 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법에 의하는 경우, 다수의 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류에 대한 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 검사하여, 상기 어류가 속하는 종(species) 또는 과(family)를 결정할 수 있다.
홍어과, 가오리류, DNA 칩, 단염기다형성, SNP

Description

홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, ＤＮＡ 칩 및 키트{A Polynucleotide probe and ＤＮＡ chip kit for skate and ray species discrimination based on the single nucleotide polymorphisms in the mitochondrial ＤＮＡ COI gene}
도 1은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA상의 유전자 배열을 나타내는 모식도이고,
도 2 내지 도 6은 각각 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA중 COI(Cytochrome c oxidase subunit I) 유전자의 단일염기다형성 부위가 포함된 650여개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이고,
도 7은 상기 도 2내지 6에 나타난 단염기다형성에 근거하여 제작된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 DNA칩의 구조를 도식화한 모식도이고,
도 8a 내지 도 8f는 각각 상기 도 7의 DNA칩을 이용하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브와 다양한 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 PCR 증폭산물을 결합시킨 후의 반응 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 홍어과(Family Rajidae) 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 관한 것으로, 특히 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 종(species) 또는 과(family)를 간단하고 신속, 정확하게 구별하기 위한 것이다. 더욱 상세하게는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 COI 유전자 지역에 존재하는 단염기다형성(single nucleotide polymorphism)에 근거한 폴리뉴클레오티드 프로브와 이를 포함하는 키트를 제조하는 것이다.
홍어과에 속하는 대표적인 어종으로써, 참홍어(R. pulchra)의 특징은 몸통과 머리 부분이 가슴지느러미와 합쳐져서 형성된 넓고 평평한 체반이라는 부위를 가지며, 이 체반의 등쪽 갈색 바탕에 타원형의 큰 점이 두 개가 있다. 주둥이 끝은 가늘고 뾰족하며 눈은 크고 돌출되어 있다. 생식은 난생이며 산란시기는 9월에서 3월, 산란성기는 11월에서 12월이다. 포식성 어류로서 오징어류, 새우류, 게류 등을 주로 먹는다. 특히 한국에서는 상업적 가치가 높은 어종으로 여러 형태의 요리로 식용된다. 이러한 상업적 가치가 높은 어종을 정확히 홍어만을 판별하는 상용화된 기존의 분자 유전자학적 방법은 없으며, 형태학적인 구분으로만 홍어과에 속한 어류를 판별하는 실정이다.
국내외에서 어류의 종 분류 및 계통연구는 지느러미 모양, 비늘, 내주 장기의 특징, 측선, 골격구조 등과 같은 형태 형질, 초기생활사의 특징, 체장에 대한 체폭, 두장, 문장, 안경, 체고 등에 대한 비율과 같은 계측 형질 등을 바탕으로 하고 있다. 근래에는 형태 형질을 이용한 계통연구에 많은 문제점들이 발견되어 분자생물학적 기법이 활발하게 도입되고 있다. 이러한 방법은 주로 성체를 중심으로 이루어지고 있다.
홍어과 어류는 세계적으로 종이 다양하게 분포되고 있는데, 우리나라 연안에는 4속 11종이 서식하는 것으로 기록되어 있다. 학술상 국내에 서식하는 홍어과(family Rajidae) 어류는 다음과 같은 11종이 있다. 즉, 저자가오리(Bathyraja isotrachys), 바닥가오리(Bathyraja bergi), 광동홍어(Dipturus kwangtungensis), 도랑가오리(Dipturus macrocauda), 살홍어(Dipturus tengu), 홍어(Okamejei kenojei), 무늬홍어(Okamejei acutispina), 깨알홍어(Okamejei boesemani), 오동가오리(Okamejei meerdervoortii), 참홍어(Raja pulchra), 고려홍어(Raja koreana)이다. 이외에, 홍어과 어류가 속하는 홍어목에는 상기한 홍어과 이외에도 전기가오리과(2종), 수구리과(2종), 가래상어과(3종), 색가오리과(3종), 흰가오리과(1종), 나비가오리과(1종), 매가오리과(2종) 등이 있다.
이와 같이, 홍어과 어류는 종 내의 형태적 변이가 많아 분류에 어려움이 많을 뿐만 아니라 어업현장에서도 명칭의 혼란이 많다. 예를 들어, 참홍어의 경우는 눈가오리란 명칭으로 사용되기도 한다. 이와 같이 홍어과 어류와 가오리류 어류는 명칭이 많이 혼동이 되고 있다. 현재 홍어과 어류에는 한국명 가오리(바닥가오리, 저자가오리, 도랑가오리, 오동가오리)(즉, 홍어과에 속하는 가오리류)와 홍어(살홍어, 홍어, 깨알홍어, 고려홍어, 참홍어)(즉, 홍어과에 속하는 홍어류) 등으로 혼재되어 있다. 국내에는 홍어과 어류를 제외한 가오리류의 어류, 즉, 색가오리과, 매가오리과, 흰가오리과, 나비가오리과 어류(즉, 홍어과에 속하지 않는 가오리류)는 모두 가오리란 이름을 가지고 있다.
이와 같은 명칭의 혼란 이외에도 홍어과 어류와 가오리류 어류는 그 형태적 변이가 커서 외국산은 물론 국내산 홍어과 어류 등은 전문가가 아닌 이상 정확한 구별이 어렵고, 계통 유연관계 연구도 여전히 논란이 많다. 그럼에도 불구하고, 이 같은 문제를 해결하기 위한 분자생물학적인 연구는 국내외에서 그 사례를 찾기 어려운 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로써, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 혈액, 세포 및 근육조직으로부터 DNA를 추출하고, 이를 증폭시킨 PCR 산물을 특이적인 폴리뉴클레오티드 프로브와 반응시킴으로써 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 유전자형을 분석하여, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계를 결정하고자 하는 것이다.
이러한 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법에 의하여, 다수의 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류에 대한 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 검사함으로써, 상기 어류가 속하는 종(species) 또는 과(family)를 간단하고 용이하게 결정하는 것이 본 발명의 목적이다.
홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 종 또는 과를 결정하는 데 있어서도, 상기 어류의 일부 염기서열의 차이가 밝혀졌다고 하더라도 이를 신속 정확하게 분석할 수 있는 표준화된 방법이 있으면 많은 시간과 인적 자원, 비용이 줄어들 수 있다. 본 발명에서는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 각 종이나 과에 따른 염기서열의 차이를 정확히 파악하고, 이를 근거로 하여 각 어류의 종 또는 과에 따라 차이가 나는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하기 위한 것이며, 이를 포함하는 DNA칩 또는 키트를 이용하여 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 종 또는 과에 따른 염기서열 차이를 신속, 정확하게 분석할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기와 같이 어류의 종 또는 과 간에 염기서열 차이가 있는 부위를 포함하는 15개 내지 30개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 프로브와, 이것으로 구성된 DNA칩 그리고 이것들을 포함하는 키트를 제공하는 것이다. 이러한 본 발명에 의해, 하나의 슬라이드 위에서 다수의 종 또는 과에 속하는 홍어 등의 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 검사할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명자들은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 다양한 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 근거로 하여, 각 어류 종 마다 특이적으로 결합할 수 있는 최적의 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하고자 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 홍어과(Family Rajidae) 또는 가오리류에 속하는 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 및 상기 결합 여부를 확인해서 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하여 이루어지는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법이다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상기한 바와 같은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법에 사용되는 것으로써, 서열번 호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정용 폴리뉴클레오티드 프로브이다. 나아가, 본 발명은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정용 DNA 칩일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상기한 DNA 칩을 포함하는 키트일 수 있다. 즉, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브와; 상기 어류의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머;를 포함하는 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정용 키트가 가능하다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시형태를 첨부된 도면을 참고로 하여, 상 세하게 살펴보기로 한다.
본 발명에 따른 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법은 먼저, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하고, 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계를 거친다. 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류로부터 DNA를 추출하는 것은 추출된 DNA를 분석하여 상기 어류가 속하는 종이나 과를 판별하기 위한 것이기 때문에, 홍어의 어느 부분에서 DNA를 추출하든지 또는 어떠한 방법으로 추출되는지는 특별히 제한되지 않는다. 그 중에서도 이렇게 추출된 DNA는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome c Oxidase subunit I) 유전자 부위의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 포함하는 것이 바람직하다. 그리고, 이렇게 추출한 DNA를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 DNA 추출 방법이나 증폭 방법 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백하다.
본 발명자들은 다양한 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNPs) 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 하여 상기 어류 각 종 마다 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하였다.
도 1은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA상의 유전자 배열 을 나타내는 모식도이고, 여기에 도시된 상기 미토콘드리아 DNA의 크기는 16972bp 이고, 이 중 상기 COI 유전자는 5475bp-7031bp에 걸쳐 위치하는 것이다.
이어서, 상기 PCR 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 것이 본 발명의 가장 중요한 특징이다. 이후에, 상기 결합 여부를 확인해서 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하나, 이 또한 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되는 모든 결합 여부 확인방법을 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 서열번호 3 내지 서열번호 16의 DNA 서열은 하기의 표 1에 나타난 바와 같다.
[표 1: 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 판별을 위한 DNA 서열]
홍어과/가오리류 종 판정을 위한 DNA 서열
프로브 명칭 DNA 서열 반응 어종 DNA 서열 위치
R1 (서열번호 3) 5'-TTA ACT TCA TCA CCA CAA TTA T-3' 홍어과 438-459
R2 (서열번호 4) 5'-TGA TCA ATT CTT GTT ACA AC-3' 홍어과 509-527
R3 (서열번호 5) 5'-TAG ACC TGA CAA TTT TCT CCC TT-3' 홍어 381-400
R4 (서열번호 6) 5'-CTT TGA TCC AGC TGG AGG AGG-3' 고려홍어 610-630
R5 (서열번호 7) 5'-CAT CAC TAT ATT ACT CAC GGA TCG-3' 광동홍어 568-591
R6 (서열번호 8) 5'-CCC TGC CAG TAC TAG CAG C-3' 무늬홍어 546-564
R7 (서열번호 9) 5'-TAT GGC CCT CCC AGT CCT A-3' 참홍어 541-559
R8 (서열번호 10) 5'-CAT TAC TAT GCT TCT CAC AGA TCG-3' 노랑가오리 568-591
R9 (서열번호 11) 5'-CCT CTC GTT ACC TGT ATT AGC AG-3' 목탁가오리 541-563
R10 (서열번호 12) 5'-GCT CTC TCT TCC TGT TTT AGC-3' 흰가오리 541-561
R11 (서열번호 13) 5'-TCC ATC CTC ATT ACA ACA ATC-3' 흑가오리 512-532
R12 (서열번호 14) 5'-CCC TGT CCT TGC AGC CG-3' 두툽상어 550-566
R13 (서열번호 15) 5'-CAG CAG GAA TCA CAA TAC TCC T-3' 박쥐가오리 561-582
R14 (서열번호 16) 5'-TTT GAC CCC GCA GGA GGA GGT GA-3' 오동가오리 611-633
상기한 표 1에 나타난 바와 같은 본 발명에 따른 DNA 서열은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계를 결정하기 위한 것으로, 상기 어류가 홍어과에 속하는 어류인지 여부를 결정하기 위한 것이거나 상기 어류가 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 중 어떤 종에 해당하는 어류인지를 결정하기 위한 것이다. 이러한 DNA 서열은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNPs) 부위를 포함하는 것으로써, 상기 어류의 반응어종에 따라 구분될 수 있는 염기서열의 일부를 나타내는 것이다. 각 DNA 서열의 위치도 표시하였다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기한 서열번호 3 내지 서열번호 16의 DNA 서열과 결합할 수 있도록 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 어류로부터 추출된 DNA를 증폭시킨 PCR 산물을 이용함에 있어서, 상기 PCR 산물의 어느쪽 가닥을 사용하는 것도 가능하므로, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 16의 DNA 서열에 상보적인 염기서열을 가지는 표적대상 PCR 산물과 반응하기 위해서, 본 발명에 따른 프로브는 상기 서열번호 3 내지 서열번호 16의 DNA 서열과 동일한 염기서열을 가지는 것도 가능하다. 본 발명자들은 각 서열번호에 따른 PCR 산물의 DNA 서열과 상보적인 염기서열을 프로브로 이용하였고, 상기 서열번호에 대응하는 각각의 프로브 명칭을 R1 내지 R14로 명명하였다.
도 2 내지 도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단일염기다형성 부위가 포함된 650여개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이다. 즉, 도 2는 다양한 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 종, 구체적으로는 홍어과(가오리류 포함)에 속하는 일반적인 어류, 홍어(Okamejei kenojei), 고려홍어(Raja koreana), 광동홍어(Dipturus kwangtungensis), 무늬홍어(Okamejei acutispina), 참홍어(Raja pulchra), 노랑가오리(Dasyatis akajei), 목탁가오리(Platyrhina sinensis), 흰가오리(Urolophus aurantiacus), 두툽상어(Scyliorhinus torazame), 박쥐가오리(Aetobatus flagellum), 오동가오리(Okamejei meerdervoortii), 흑가오리(Dasyatis matsubarai) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 1번부터 150번 까지의 DNA 서열을 나타낸 것이고, 도 3은 상기 유전자의 151번부터 300번 까지의 DNA 서열, 도 4는 상기 유전자의 301번부터 450번 까지의 DNA 서열, 도 5는 상기 유전자의 451번부터 600번 까지의 DNA 서열, 도 6은 상기 유전자의 601번부터 655번 까지의 DNA 서열을 순차적으로 나타낸 것이다.
도 2 내지 도 6에서 홍어과에 해당하는 염기서열은 홍어과(가오리류 포함)에 속하는 일반적인 어류 종의 염기서열일 수 있고, 상기 홍어과 중에서도 대표적인 홍어(Okamejei kenojei)의 염기서열인 것도 가능하다. 여기서, 단염기다형성 부위는 도 2 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 홍어과(가오리류 포함)에 속하는 일반적인 어류 종의 염기서열과는 다른 유전자형을 보이는 염기서열 부위를 말하는 것이다. 즉, ".(점)"으로 표시되는 부위는 상기 홍어과에 해당하는 염기서열과 동일한 유전자형을 표시하며, 도 2의 무늬홍어 내지 도 6의 두툽상어에 해당하는 염기서열에 나타난 구체적인 A, C, G 또는 T가 단염기다형성(SNP)을 나타내는 부위이다.
도 2 내지 도 6은 각각 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA중 COI(Cytochrome c oxidase subunit I) 유전자의 단일염기다형성 부위가 포함된 650여개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이다. 이 연결되는 도면은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미코콘드리아 DNA COI 지역의 650여개 염기서열을 분석하여 비교한 것으로서, 이 지역에 특정 어류 종에 독특한 단염기다형성 변이와 계군 특이적 단염기다형성 변이가 다수 존재한다는 것을 보여준다. 지면의 한계상 50개 염기서열 단위로 분절하여 나타내었지만 도2 내지 도6은 순서대로 이어지는 도면을 의미한다. 그 중에서도 상기한 표 1에 나타난 DNA 서열의 위치 지역이 본 발명에 따라 마이크로어레이 방법에 이용될 폴리뉴클레오티드 프로브로 사용될 수 있는 종 또는 과 특이적 단염기다형성이 존재하는 지역이다.
본 발명자들은 수많은 연구와 노력끝에, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자에서 서열번호 3 내지 서열번호 16에 해당하는 DNA 서열이 상기 각 어류의 종이나 과를 구별하기에 최적으로 적합하다는 것을 확인하였고, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 16과 동일하거나 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계를 결정할 수 있음을 확인하였다. 이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기한 어류 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 반응어종이나 과에 속하는 어류의 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 종이나 과에 속하는 어류의 그것과는 결합하지 않는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 '다형성(polymorphism)'이란 유전학적으로 결정된 집단내에서 2이상의 대체적 서열 또는 대립형질의 발생을 의미한다. 다형 마커 또는 부위는 발산이 일어나는 위치(locus)이다. 바람직한 마커는 선택된 집단에서 1%이상, 더욱 바람직하기로는 10%또는 20%이상의 발생 빈도를 나타내는 두개 이상의 대립형질을 가진다. 다형성 부위는 단일 염기쌍일 수도 있다.
따라서, 본 발명은 상기한 염기서열 이외에 본 발명에 따른 다형성 부위를 하나 이상 포함하여 이루어지는 뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 핵산 단편 또는 그의 상보체도 가능하다. 더불어, 하나의 어류 개체에서 나타나는 한정적 돌연변이와 계군마다 집단적으로 몰려다니는 홍어과 어류의 특성을 고려하여, 본 발명에 따른 다형성 부위의 더욱 바람직한 형태는 상기 어류가 속하는 과를 구별하기 위해 상기 다형성 부위가 2개 이상의 개체로부터 동일한 유전자형으로 나타나는 것이 바람직하다. 또한, 상기 본 발명에 따른 다형성 부위는 유전학적으로 결정된 집단내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대립형질이 발생하는 것을 의미하는바, 상술한 바와 같이 도 2 내지 도 6에 나타난 다형성 부위의 염기서열과 동일하거나 이에 상보적으 로 결합할 수 있는 DNA서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 것도 가능하다.
이와 같은 다형성 부위를 근거로 하여, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브는 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 것이면 어느 것이나 본 발명에 해당한다. 바람직하기로는, 상기 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하여 10개 이상이고 100개 이하의 연속적인 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보체일 수 있고, 더욱 바람직하기로는 10개 이상이고 50개 이하의 것이고, 가장 바람직하기로는 15개 이상이고 30개 이하의 것일 수 있다.
이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류로부터 추출된 대상 DNA 또는 상기 DNA를 증폭시킨 PCR 산물과 결합하는데 있어서, 상기 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위에 있는 단염기다형성 부위를 특징으로 하여 결합하는데, 상기 결합은 상기 어류가 속하는 분류체계, 즉 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 종 또는 상기 어류가 속하는 과에 따라 다르게 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이렇게 본 발명은 프로브와 대상 산물의 결합여부에 따라 상기 어류의 종 또는 과를 판별하는데, 본 발명에 따른 프로브로 분석 가능한 어류의 종 또는 과는 상기한 표 1의 반응어종에 기재된 바와 같다.
상기한 표 1에서 반응어종이라 함은 본 발명에 따른 DNA 염기서열이 특징적으로 결 합할 수 있는 홍어의 종류 또는 그러한 홍어들을 포함하는 홍어과를 의미하는 것이다. 다시 말해서, 표 1에 기재된 서열정보 3 또는 4에 해당하는 DNA 염기서열은 홍어과에 속하는 어류와는 결합하지만, 홍어과에 속하지 않는 가오리류에 해당하는 어류와는 반응하지 않는 것이다. 또한, 서열정보 5 내지 16에 해당하는 DNA 염기서열은 표 1에 기재된 반응어종의 DNA 추출물과는 결합하지만, 상기한 반응어종이 아닌 다른 어종과는 결합하지 않는 것이다. 이에 따라, 상기한 본 발명에 있어서, 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 것은, 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4에 해당하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 경우 상기 어류가 홍어과에 속하는지 여부를 판별하는 것이고, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 경우 상기 어류가 속하는 종을 판별하는 것임을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 결합이 상기 어류가 속하는 분류체계에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 상기한 표 1에 나타난 바와 같이, 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 프로브(이것은 서열번호 5의 DNA 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 의미함, 이하 각 서열번호에서도 같음)가 홍어(Okamejei kenojei) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 381-400번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것이거나, 서열번호 6의 경우는 고려홍어(Raja koreana) 종의 610-630번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 광동홍어(Dipturus kwangtungensis) 종의 568-591번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 무늬홍어(Okamejei acutispina) 종의 546-564 번째 DNA 서열, 서열번호 9의 경우는 참홍어(Raja pulchra) 종의 541-559번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 노랑가오리(Dasyatis akajei) 종의 568-591번째 DNA 서열, 서열번호 11의 경우는 목탁가오리(Platyrhina sinensis) 종의 541-563번째 DNA 서열, 서열번호 12의 경우는 흰가오리(Urolophus aurantiacus) 종의 541-561번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 흑가오리(Dasyatis matsubarai) 종의 512-532번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 두툽상어(Scyliorhinus torazame) 종의 550-556번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 박쥐가오리(Aetobatus flagellum) 종의 561-582번째 DNA 서열, 또는 서열번호 16의 경우는 오동가오리(Okamejei meerdervoortii) 종의 611-633번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브가 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류로부터 추출된 대상 DNA 또는 상기 추출된 DNA를 증폭시킨 PCR 산물과 결합하는데 있어서, 상기 결합이 상기 어류가 속하는 분류체계에 따라 다르게 이루어진다는 것의 다른 의미는 상기 어류가 홍어과에 속하는 것인 경우에만 결합한다는 것이다. 즉, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 프로브가 홍어과에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 438-459번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것이거나, 또는 서열번호 4의 경우는 홍어과에 속하는 어류의 509-527번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 것이 가능하다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 다양한 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 종에 있어서, 단일염기다형성 부위를 가지는 서열번호 5 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열을 이용한 것으로써, 상기 DNA 서열과 동일하거나 이에 상보적으로(complementary) 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 우리가 알고자 하는 어류의 DNA 추출물(정확히는 PCR 산물)과 결합시키는 것이 특징이다.
이와 같이, 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되어, 의도한 어류 종이나 과에 해당하는 어류의 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 종이나 과에 속하는 그것과는 결합하지 않는 것을 특징으로 하기 때문에, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계는 적어도 1회 이상 수행되는 것이 바람직하다. 이에 따라, 상기 결합을 확인하는 단계 이전에, 추출된 DNA와 본 발명에 따른 프로브의 결합을 반복적으로 수행한다면, 상기 결합 과정을 더욱 확실히 하여 프로브와 대상 DNA 산물의 결합을 더욱 견고히 할 수 있다. 또한, 상기 결합을 확인하는 단계 이후에, 추출된 DNA와 본 발명에 따른 프로브의 결합을 반복적으로 수행하면 다양한 프로브를 이용하여 중첩적으로 판별 결과 예측 할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계는 적어도 1회 이상 많게는 수차례(특히 3~4회) 반복적으로 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 실시예는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계를 거치고, 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은 서열번호 1의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머로 사용하거나, 서열번호 2의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류에서 추출한 DNA를 증폭시키는데 있어서, 특정한 프라이머를 사용하는 것이다. 이 특정한 프라이머는 상기 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열에 부합하는 것으로써, 상기 추출한 DNA를 더욱 우수하게 증폭시킬 수 있다. 이를 위해 상기와 같이 혈액, 세포 또는 조직으로부터 추출된 DNA는 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 추출된 DNA를 PCR로 증폭시키기 위해 사용된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 하기의 표 2에 나타난 바와 같다.
[표 2: 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 판별을 위한 프라이머]
프 라 이 머 염 기 서 열 위치
정방향 프라이머(서열번호1) TCA GCC ATC TTA CCT GTG GC 5460-5479bp
역방향 프라이머(서열번호2) GGG TGT CCG AAG AAT CAG AA 6177-6196bp
상기한 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PCR 과정에서 사용되는 프라이머 또한, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열에 최적으로 적합하도록 형성된 것이다. 여기서, 상기 정방향 프라이머는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중에서 5475bp-7031bp에 걸쳐 위치하는 COI 유전자의 5460-5479bp 지역에 결합하는 것이고, 상기 역방향 프라이머는 상기 COI 유전자의 6177-6196bp 지역에 결합하는 것이다.
이것은 다양한 어류 종이나 계군에 상관없이 가장 공통된 염기서열을 기초로 하여 제작된 것이다. 본 발명자들은 도 2 내지 도 6에 나타난 다양한 어류 종의 DNA 서열과 SNP를 조사, 분석한 뒤에, 상기한 서열번호 1 과 서열번호 2로 이루어진 염기서열을 사용할때, PCR 산물을 가장 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다. 즉, 다양한 어류 종이나 과에 상관없이 미토콘드리아 DNA 추출물은 PCR 방법에 의해 빠짐없이 증폭될 것이고, 이에 따라 증폭된 PCR 산물의 개수도 현저히 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
이와 더불어, 본 발명은 PCR 산물과 본 발명에 따른 프로브를 결합시킨 뒤에 행해 지는 교잡화 반응 확인을 위해, 상기 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머에는 로다민(rhodamine), cy3, cy5 또는 바이오틴이 부착되어 있고, 상기 결합 여부를 확인하는 것은 상기 로다민, cy3, cy5 또는 바이오틴에 의해 발현되는 형광을 감지하여 결합 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 홍어 종 판별 방법도 가능하다. 구체적으로, 상기의 확인 단계는 로다민, CY3, CY5를 이용하거나 바이오틴과 결합하는 Syreptavidin-Cyanine을 이용하고, 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 결과를 분석함으로서 유전자형 판정을 편리하게 진행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상술한 바와 같은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법에 사용되는 것으로써, 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정용 폴리뉴클레오티드 프로브이다. 나아가, 본 발명은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정용 DNA 칩일 수 있다. 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 글라스 위의 기질에 고정화 되어 있는 형태가 바람직하다.
본 발명에서는 DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 하나의 슬라이드 위에서 다수의 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계를 동시에 결정할 수 있다. 상기한 어류가 속하는 종 또는 과를 판별 할 수 있는 20여개의 프로브를 화학 작용기가 처리된 하나의 글라스 슬라이드위에 다수의 구역을 설정하여 집적시켰으며, 대칭 또는 비대칭 PCR법을 이용하여 얻어진 형광물질 표지를 가지고 표적 유전자 서열의 교잡화 반응을 확인함으로써 정확한 홍어 종을 구분할 수 있는 것이다.
이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 상술한 바와 같이 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하여, 상기한 어류 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 어류의 대상산물 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 어류의 그것과는 결합하지 않는 것이 특징이다. 이에 따라, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 16과 동일하거나 이에 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 홍어의 종을 판별할 수 있는 것이다.
이와 더불어, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상술한 바와 같은 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법에 사용되는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정용 키트일 수 있다.
즉, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브와; 상기 어류의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머;를 포함하는 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정용 키트일 수 있다.
이러한 분류체계 결정용 키트는 상기한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 계군 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로써, 염기서열을 분석하지 않고도 분석하고자 하는 어류의 유전자형과 그 계군을 신속히 판정할 수 있는 효용성을 가지고 있다. 또한, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 다수의 어류 어종을 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 상기 어류의 유전자형과 분류체계를 결정하는 방법을 표준화, 자동화할 수 있도록 기술 개발의 적용성을 극대화 시켰다. 즉, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 데 걸리는 시간을 크게 단축시켰으며, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 처리할 수 있는 효과가 있다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 추출된 DNA의 증폭을 위한 프라이머 준비
다양한 홍어과 또는 가오리류로부터 추출한 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머를 합성하였다. 본 발명에 따른 PCR 방법에서 사용한 프라이머는 상기한 표 1에 나타난 것과 같다. 본 발명에서 사용한 프라이머는 독일의 METABION사에 의뢰하여 준비하였다.
실시예 2: 어종에 따른 프로브 준비
홍어과 또는 가오리류의 특이 변이를 확인하기 위한 프로브를 합성하였다. 본 발명에 있어서 교잡화 반응에 사용한 프로브의 서열정보는 상기한 표 1에 나타난 것과 같다. 본 발명에서 프로브를 DNA칩으로 제작하기 위해 알데히드 작용기가 처리되어 이는 글라스 위에 본 발명에 따른 프로브를 공유결합을 시키기 위하여 선택된 프로브의 5' 말단에 아미노 링크를 수식하고, 교잡화 반응시 글라스 슬라이드 위에 집적되어 있는 프로브 간의 공간적인 방해를 최소화시키기 위하여 10-20개의 올리고(dT)를 부가하여 합성하였다. 본 발명에서 사용한 프로브는 독일의 METABION사에 의뢰하여 준비하였다.
실시예 3 : DNA 추출과 PCR 반응
1) 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 DNA는 독일 QIAGEN사의 DNeasy tissue kit을 사용하여 추출하였다.
2) 하기의 표 3와 같은 조건의 방법으로 PCR 반응을 DNA Engine(MJ Research사, 미국)에서 시행하였다.
3) PCR이 끝난 후, PCR 산물 10ul에 젤 로딩 버퍼 (0.2% orange G, 0.25% xylene cyanol FF, 60% glycerol) 2ul를 넣고 1ug/ml ethidium bromide가 함유된 2% 아가로스 젤에서 전기영동 한 후 UV transilluminator가 부착된 Image analyzer (HITACHI, 일본)에서 PCR 밴드를 확인하였다.
[표 3: 프라이머 정상 증폭 확인 조건]
반응 조성 반응 조건
멸균증류수 11.5ul 10X buffer 2ul 2mM dNTP 1ul 10uM 전위 프라이머 1ul (또는 1uM 전위 프라이머) 1ul 10uM 역위 프라이머 1ul Hot start Taq 0.5 unit 정제 DNA 2ul 94℃, 15분 1 cycle
94℃, 20초 50℃, 10초 72℃, 30초 38 cycles
72℃, 5분 1 cycle
실시예 4 : 종 또는 과 판별을 위한 칩 제작
1)올리고뉴클레오티드 칩을 제작하기 위해 CSS-100 Silylated Slide(Cell Associate사, 미국)상에 50uM의 농도로 아미노 링크가 수식되어 있는 상기 실시예 2에 따라 준비된 프로브와 동일한 양의 3X SSC를 혼합하여 집적하였고, 이를 16시간 동안 실온에서 반응시킨다. 반응이 완료된 슬라이드를 0.1% SDS로 5분간 2회 세척한 후, 증류수로 5분간 2회 세척하였다.
2)소디움 보로하이드리드(1.3g NaBH4 375ml, PBS 125ml, 100% EtOH)에 제작된 칩을 5분간 반응시킨 후 끓는 증류수에서 3분간 반응 시킨 후, 진공 원심분리기에서 800rpm의 속도로 10분간 건조하였다.
3)한 장의 슬라이드에서 다수의 시료 반응을 위하여 perfusion chamber(BioGrace, 미국)로 분리한 후 실험 전까지 실온의 암소에서 보관하였다.
이렇게 제작된 DNA칩을 도 7에 예시적으로 나타내었다. 도 7은 상기 도 2 내지 도 6에 나타난 단염기다형성에 근거하여 제작된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 DNA칩의 구조를 도식화한 모식도이다.
실시예 5 : 교잡화 반응
1) 로다민, cy3, cy5 또는 바이오틴으로 결합된 PCR 산물을 교잡화 용액(3X SSC, 0.25% SDS)과 1:9의 비율로 혼합하였다. 형광반응을 일으키기 위하여 바이오틴을 사용한 경우 Syreptavidin-Cyanine을 1ug/ml 농도로 첨가하여 반응시켰다.
2) 준비된 교잡화 용액을 chmaber에 도포하여 60도에서 1시간 동안 반응시켰다.
3) 1X SSC, 0.1%SDS에서 5분 동안 일차 세척 후 0.1X SSC에서 3분간 이차 세척을 실시하였다.
4) 세척된 슬라이드는 원심분리기에서 800rpm의 속도로 10분간 건조하였다.
5) 실험 결과의 확인은 LuxScan-10K/A (CapitalBio, 중국) 스캐너를 사용하여 형광값을 측정하여 유전자형을 분석하였고, 그 결과는 도 8a 내지 도 8f에 나타내었다.
도 8a 내지 도 8f는 상기 도 7의 DNA칩을 이용하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브와 다양한 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 PCR 증폭산물을 교잡화한 후의 반응 결과를 나타내는 사진이며, 여기서 도 8a는 홍어, 도 8b는 고려홍어, 도 8c는 광동홍어, 도 8d는 무늬홍어, 도 8e는 참홍어, 도 8f는 흰가오리에 대한 결과이다. 여기에 도시된 것과 같이, 본 발명에 의하는 경우 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 종류에 따라 형광 표지가 다르게 나타나므로, 이에 따라 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어종의 종을 판별할 수 있음을 확인하였다.
한편, 상기에서 본 발명을 특정의 바람직한 실시 예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 이에게는 명백한 것이다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따르면, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 혈액, 세포 및 근육조직으로부터 DNA를 추출하고, 이를 증폭시킨 PCR 산물을 특이적인 폴리뉴클레오티드 프로브와 반응시킴으로써 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 유전자형을 분석하여, 상기 어류의 분류체계를 결정할 수 있는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법을 제공할 수 있다.
이러한 분류체계 결정 방법에 의하는 경우, 다수의 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류에 대한 유전자형 분석을 하나의 슬라이드 위에서 간단하고 신속, 정확하게 검사함으로써, 상기 어류가 속하는 종(species) 또는 과(family)를 간단하고 용이하게 결정할 수 있는 효과가 있다. 본 발명에 따라 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 미토콘드리아 DNA의 COI 지역을 유전자 표지로 사용하면, 종래에 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 종이나 과를 판별하는데 존재하였던 문제점을 해결 할 수 있다. 본 발명에 따라 단염기다형성이 많은 것으로 확인된 COI 지역을 분석의 척도로 이용하면, 종래기술보다 한 단계 진보된 형태의 유전자 분석법을 제공하여, 더욱 효과적으로 유전자형을 판별할 수 있고, 분해능도 현저히 증가시킬 수 있다.
본 발명자들은 다양한 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 하여 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 각 종 마다 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작할 수 있게 되었다. 이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 어류의 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 종이나 과에 속하는 어류의 그것과는 결합하지 않는 것이 특징이다.
본 발명자들은 수많은 연구와 노력끝에, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자에서 서열번호 3 내지 서열번호 16에 해당하는 DNA 서열이 각 홍어 등의 종이나 과를 구별하기에 최적으로 적합하다는 것을 확인하였고, 상기 서열번호 3 내지 서열번호 16의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 홍어 등의 종 또는 과를 판별할 수 있음을 알 수 있었다.
그리고, 본 발명에 따라 상기한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 계군 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로써, 염기서열을 분석하지 않고도 홍어 등의 유전자형과 이것이 속하는 종 또는 과를 신속하게 판정할 수 있는 적용성을 갖고 있다. 또한, 다수의 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류 어종을 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 홍어 등의 유전자형과 분류계통 결정방법을 표준화, 자동화할 수 있도록 기술 개발의 적용성을 극대화 시켰다. 즉, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 데 걸리는 시간을 크게 단축시켰으며, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 처리할 수 있는 효과가 있다.
나아가, 본 발명에 따라 단염기다형성 부위에 근거한 분자생물학적인 기법을 이용하여 우리나라의 중요 어자원 중의 하나인 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 종 또는 과를 판별함으로써, 수산자원의 관리 체계를 확립할 수 있고 대량의 시료를 간단하고 쉽게 동정하여 유통체계를 원활히 할 수 있다.
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  5. 홍어과(Family Rajidae) 또는 가오리류에 속하는 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출한 DNA에 대해, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머로, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계;
    상기 PCR 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 및
    상기 결합 여부를 확인해서 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 것은,
    상기 서열번호 3 또는 서열번호 4에 해당하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 경우 상기 어류가 홍어과에 속하는지 여부를 판별하는 것이며,
    상기 서열번호 5 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 경우 상기 어류가 속하는 종을 판별하는 것임을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법.
  6. 홍어과(Family Rajidae) 또는 가오리류에 속하는 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출한 DNA에 대해, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머로, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계;
    상기 PCR 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 및
    상기 결합 여부를 확인해서 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 단염기다형성 부위와 결합하는 것이며, 상기 결합은 상기 어류가 속하는 분류체계에 따라 다르게 이루어지는 것으로,
    서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 프로브가 홍어(Okamejei kenojei) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 381-400번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것이거나, 서열번호 6의 경우는 고려홍어(Raja koreana) 종의 610-630번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 광동홍어(Dipturus kwangtungensis) 종의 568-591번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 무늬홍어(Okamejei acutispina) 종의 546-564번째 DNA 서열, 서열번호 9의 경우는 참홍어(Raja pulchra) 종의 541-559번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 노랑가오리(Dasyatis akajei) 종의 568-591번째 DNA 서열, 서열번호 11의 경우는 목탁가오리(Platyrhina sinensis) 종의 541-563번째 DNA 서열, 서열번호 12의 경우는 흰가오리(Urolophus aurantiacus) 종의 541-561번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 흑가오리(Dasyatis matsubarai) 종의 512-532번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 두툽상어(Scyliorhinus torazame) 종의 550-556번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 박쥐가오리(Aetobatus flagellum) 종의 561-582번째 DNA 서열, 또는 서열번호 16의 경우는 오동가오리(Okamejei meerdervoortii) 종의 611-633번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법.
  7. 홍어과(Family Rajidae) 또는 가오리류에 속하는 어류의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출한 DNA에 대해, 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머로, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계;
    상기 PCR 산물과 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 및
    상기 결합 여부를 확인해서 상기 어류가 속하는 분류체계를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 단염기다형성 부위와 결합하는 것이며, 상기 결합은 상기 어류가 속하는 분류체계에 따라 다르게 이루어지는 것으로,
    서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 프로브가 홍어과에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 438-459번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것이거나, 또는 서열번호 4의 경우는 홍어과에 속하는 어류의 509-527번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계는 적어도 1회 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법.
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은 서열번호 1의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머로 사용하거나, 서열번호 2의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머에는 로다 민(rhodamine), cy3, cy5 또는 바이오틴이 부착되어 있고, 상기 결합 여부를 확인하는 것은 상기 로다민, cy3, cy5 또는 바이오틴에 의해 발현되는 형광을 감지하여 결합 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법.
  11. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 어류의 분류체계 결정 방법에 사용되는 것으로써, 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정용 폴리뉴클레오티드 프로브.
  12. 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정용 DNA 칩.
  13. 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브와;
    상기 어류의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 것으로, 상기 COI 유전자 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머;를 포함하는 것을 특징으로 하는 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정용 키트.
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