KR101131789B1 - 갈치류의 종 또는 원산지 판별 방법과 이에 따른 갈치류의 종 또는 원산지 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 - Google Patents
갈치류의 종 또는 원산지 판별 방법과 이에 따른 갈치류의 종 또는 원산지 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 갈치류의 종 판별 또는 이를 통한 원산지 판별 방법과 이를 위한 갈치 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 대한 것으로, 갈치류에서 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물을, 서열번호 3 내지 서열번호 10의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및, 상기 결합 여부에 따라 상기 갈치류가 속하는 종을 판별하는 단계;를 포함하는 것이 특징이다. 이러한 본 발명은 다양한 갈치류의 종 또는 원산지 간에 구별되는 임의의 DNA 서열을 기반으로, 대상 갈치류의 유전자형에 따라, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별할 수 있고, 이를 통하여 갈치류의 원산지를 구분할 수 있는 효과가 있다.
갈치류, SNP, 프로브
Description
본 발명은 갈치류의 종을 판별하고 이를 통하여 원산지를 구별하기 위한 것으로, 특히 다양한 갈치류의 종 또는 원산지 간에 구별되는 임의의 DNA 서열을 기반으로, 갈치류의 유전자형에 따라 간단하고 신속, 정확하게 종 또는 원산지를 판별할 수 있는 갈치류의 종 또는 원산지 판별 방법과 이에 따른 종 또는 원산지 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 대한 것이다.
국내외 종래의 생물종 분류연구는 형태의 계측형질, 계수형질을 바탕으로 하고 있다.
근래에는 형태형질을 이용한 분류 및 계통연구에 많은 문제점들이 발견되어 분자생 물학적 기법이 활발하게 도입되고 있다. 이 방법은 성체를 중심으로 이루어진 기존의 형태분류의 단점을 보완하는 것으로 발생초기 생물종 혹은 가공된 개체의 경우와 비교할 수 있어 이점으로 작용하고 있다.
하지만, 갈치류에 대하여, 생물다양성 조사를 위한 다양한 생물종을 한번에, 그리고 신속 정확하게 판별할 수 있는 분자 생물학적인 연구는 국내외에서 그 사례를 찾기 어려운 실정이다.
본 발명은 다양한 갈치류의 유전자형에 따라, 갈치의 종 또는 원산지를 구별하여, 간단하고 신속, 정확하게 종 또는 원산지를 판별할 수 있는 방법을 제공하는 것이 목적이다.
또한, 본 발명은 육안으로는 종을 분별하기 힘든 유생, 조미 가공물, 또는 분말가루 등에 대해서, 하나의 슬라이드 위에 갈치류의 시료를 올려 놓는 것만으로도 그 종 또는 원산지를 판별할 수 있는 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩 또는 키트를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간을 크게 단축하면서, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있는 수단을 제공하고자 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 갈치류의 종 또는 원산지 판별 방법은, 갈치류에 속하는 종에서 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물을, 서열번호 3 내지 서열번호 10의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및, 상기 결합 여부에 따라 상기 갈치류에 속하는 종의 원산지 또는 종(species)을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것이 특징이다.
그리고, 본 발명의 다른 실시형태는, 서열번호 3 내지 서열번호 10 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 갈치류의 원산지 또는 종(species) 판별용 프로브일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시형태는 서열번호 3 내지 서열번호 10 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 프로브를 포함하는 갈치류의 원산지 또는 종(species) 판별용 DNA 칩인 것도 가능하다.
이와 함께, 본 발명의 또 다른 실시형태는 갈치류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브와; 상기 갈치류의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 갈치류의 원산지 또는 종(species) 판별용 키트일 수도 있다.
기타 본 발명의 다른 실시형태는 후술하는 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용 및 첨부된 도면에 널리 기재되어 있다.
상기한 본 발명은 다양한 갈치류의 종 또는 원산지 간에 구별되는 임의의 DNA 서열을 기반으로, 대상 갈치류의 유전자형에 따라, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별하며, 이를 통하여 갈치류의 원산지를 구분할 수 있는 효과가 있다.
즉, 본 발명자들은 갈치류의 유전자형으로 구별하기에 가장 적합한 유전자군으로서, 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자를 선택하였고, 거기에 존재하는 특정한 단염기다형성(SNPs) 부위를 찾아내었으며, 이를 바탕으로 다양한 갈치류의 종 또는 원산지 간에 구별되는 DNA 서열을 임의의 만들어, 갈치의 종 또는 원산지 판별을 간단하고 용이하게 하고자 하였다.
또한, 본 발명은 갈치 종 또는 원산지 판별용 프로브, 또는 상기 프로브를 포함하는 DNA 칩이나 키트로 제작되어, 육안으로는 종을 분별하기 힘든 유생, 조미 가공물 또는 분말가루 등에 대해서도, 하나의 슬라이드 위에 시료를 올려놓는 것만으로도 그 종 또는 원산지를 판별할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명에 따른 프로브를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간이 크게 단축되어, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시형태를 첨부된 도면을 참고로 하여, 상세하게 살펴보기로 한다.
본 발명에 따른 갈치류의 종 또는 원산지 판별 방법은, 먼저 갈치류에 속하는 다양한 해양생물 시료에서 DNA를 추출하고, 이렇게 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계를 거친다.
상기 시료에서 DNA를 추출하는 것은 시료의 각 조직 혹은 다양한 가공물 등으로부터 다양한 방법에 의해 DNA를 추출할 수 있고, 이는 추출된 DNA를 분석하여 종을 판별하기 위한 것이기 때문에, 상기 시료의 어느 부위에서 DNA를 추출하는지 또는 어떠한 방법으로 추출하는지는 특별히 제한되지 않는다.
그리고, 이렇게 추출한 DNA를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 DNA 추출방법이나 증폭방법 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백하다.
또한, 본 발명이 대상으로 하는 갈치(hairtail/cutlassfish)류는 농어목 갈치과에 속하는 바닷물고기로서, 정식 학명은 Trichiurus lepturus 이다. 본 발명에 따른 갈치는 바다에서 잡힌 생물 갈치, 조각 형태로 잘려 나와 시장에서 유통 중인 갈치 등을 포함하는 개념이다. 이중 국내산 갈치는 상대적으로 고가에 팔리는데, 소비자의 경우 원산지 정보를 판매자로부터 밖에 얻을 수 없기 때문에, 판매자는 원산지를 속여 부당이득을 취하기도 한다. 이를 방지하기 위한 방법으로 방법으로 본 발명에서는 국내에 유통되고 있는 수입산 갈치(인도, 인도네시아)와 국내산 갈치를 판별할 수 있는 DNAchip을 제작하고자 하였다.
본 발명자들은 갈치류의 유전자형으로 구별하기에 가장 적합한 유전자군으로서, 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자를 선택하였고, 거기에 존재하는 특정한 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 찾아내었으며, 이를 바탕으로 다양한 갈치에서 종 또는 원산지에 따라 구별되는 DNA 서열을 임의로 만들어서, 종 또는 원산지 판별을 간단하고 용이하게 하고자 하였다.
도 1은 갈치류의 미토콘드리아 DNA 상의 유전자 배열을 나타내는 모식도이고, 여기에 도시된 바와 같은 유전자 중에서도, 본 발명은 특별히 COI 유전자 부위에 존재하는 다양한 갈치류의 종 또는 원산지 간에 구별되는 임의의 DNA 서열을 이용한 것이며, 이에 따라 상기 갈치류에서 추출한 DNA는 갈치의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위를 포함하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 '다형성(polymorphism)'이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대립형질의 발생을 의미한다. 다형 마커 또는 부위는 발산이 일어나는 위치(locus)이다. 바람직한 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하기로는 10% 또는 20% 이상의 발생 빈도를 나타내는 두개 이상의 대립 형질을 가진다. 다형성 부위는 단일 염기쌍일 수도 있다.
도2 내지 도 4는 각각 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 갈치류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 염기서열과 그 위치를 나타내고 있으며, 본 발명자들이 다양한 갈치류의 종 또는 원산지 간에 구별되도록 만들어낸 임의의 DNA 서열을 나타내고 있다. 본 발명자들은 이러한 임의의 DNA 서열을, 본 발명자들이 찾아낸 단염기다형성(SNPs) 부위를 바탕으로 만들어 내었다.
본 발명자들은 수많은 연구와 노력 끝에 갈치 DNA의 COI 유전자 중에서, 갈치류의 종 또는 원산지를 구별하기에 가장 적합한 임의의 DNA 서열을 만들어 내었으며, 이러한 DNA 서열을 포함하는 프로브를 이용함으로써, 갈치류의 종 또는 원산지를 구별할 수 있다는 것을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.
이에 따라, 본 발명은 후술하는 서열번호 3 내지 서열번호 10의 각 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 프로브로 이용한 것이다. 이러한 프로브는 갈치류에 속하는 종 또는 원산지에 따라 다른 DNA 서열을 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 갈치류에 속하는 PCR 시료 산물과는 결합하지만 이외에 다른 종 또는 원산지에 속하는 갈치류의 그것과는 결합하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 서열번호 3 내지 서열번호 10의 DNA 서열은 하기의 표 1에 나타낸 바와 같다.
[표 1: 국내에 유통되는 주요 갈치류의 종 또는 원산지 판정을 위한 DNA 서열]
| 국내에 유통되는 주요 갈치의 종 판정을 위한 DNA서열 | |||
| 프로브 명칭 | DNA서열 | 반응어종 | DNA 서열 위치 |
| R1(서열번호 3) | AGGAATCTCTTCCATCTTGGGCG | 국내/일본/중국(Trichiurus japonicus) | 409-431 |
| R2(서열번호 4) | ACCCAGTTTCAAACCCCTCTGTT | 국내/일본/중국(Trichiurus japonicus) | 479-501 |
| R3(서열번호 5) | TTACAATACTCCTAACTGACCGA | 국내/일본/중국(Trichiurus japonicus) | 567-589 |
| R4(서열번호 6) | TAACTATCTTCTCCCTCCATCTG | 인도(Trichiurus sp.) | 384-406 |
| R5(서열번호 7) | CCAATTTCAAACCCCCTTGTTCG | 인도(Trichiurus sp.) | 481-503 |
| R6(서열번호 8) | ACTTATTCCCCTGATGATTGGGG | 인도네시아(Trichiurus lepturus) | 193-215 |
| R7(서열번호 9) | CTGTTCGTGTGATCAGTGCTAAT | 인도네시아(Trichiurus lepturus) | 497-519 |
| R8(서열번호 10) | TGCTTCTAACTGACCGCAATCTT | 인도네시아(Trichiurus lepturus) | 573-595 |
본 발명은 상기 서열번호 3 내지 서열번호 10의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하도록 다수의 프로브를 제작할 수 있고, 이러한 프로브 중 적어도 하나 이상을 상기에서 얻은 PCR 산물과 결합시킴으로서, 그 결합 여부에 따라 갈치류의 종 또는 원산지를 판별할 수 있는 것이다.
즉, 본 발명에 있어서, 상기 결합 여부에 따라 상기 갈치류가 속하는 종의 원산지를 판별하는 것은, 서열번호 3, 4 및 5의 염기서열을 포함하는 프로브와 결합하는 경우에는 대한민국, 일본 또는 중국을 원산지로 판별하고, 서열번호 6, 및 7의 염기서열을 포함하는 프로브와 결합하는 경우에는 인도산으로 판별하며, 서열번호 8, 9 및 10의 염기서열을 포함하는 프로브와 결합하는 경우에는 인도네시아산으로 판별하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 프로브는 갈치류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위에 존재하는 서열번호 3 내지 서열번호 10의 각 DNA 서열과 결합하고, 상기 결합은 상기 갈치류의 종 또는 원산지에 따라 다르게 이루어지는 것이 바람직하다.
예를 들어, 상기 결합이 상기 갈치류의 종 또는 원산지에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브는 대한민국, 일본 또는 중국산 갈치(Trichiurus japonicus) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 409-431번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 4의 프로브는 대한민국, 일본 또는 중국산 갈치 종의 479-501번째 DNA 서열, 서열 5의 경우는 대한민국, 일본 또는 중국산 갈치 종의 567-589번째 DNA 서열, 서열 6의 경우는 인도산 갈치(Trichiurus sp.) 종의 384-406번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 인도산 갈치 종의 481-503번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 인도네시아산 갈치(Trichiurus lepturus) 종의 193-215번째 DNA 서열, 서열번호 9의 경우는 인도네시아산 갈치 종의 497-519번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 인도네시아산 갈치 종의 573-595번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
나아가, 상술한 본 발명에서, 상기 PCR 산물을 프로브에 결합시키는 단계는 적어도 2회 이상 수행되는 것이 바람직한데, 이와 같이 상기 결합을 확인하는 단계 이전에, 추출된 DNA와 본 발명에 따른 프로브의 결합 과정을 반복적으로 수행한다면, 상기 결합을 더욱 확실히 하여 프로브와 대상 DNA 산물의 결합을 더욱 견고히 할 수 있기 때문이다.
한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 상술한 갈치류의 종 또는 원산지 판별 방법에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은, 서열번호 1 내지 서열번호 2 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 3종의 갈치류에서 DNA 시료를 채취하고, 이를 증폭시켜서 PCR 산물을 증폭시키는데 있어서, 상기 갈치류의 종 또는 원산지에 적합한 특별한 염기서열을 상기 증폭을 위한 프라이머로 사용하는 것이다. 이러한 특정한 프라이머는 갈치류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의, 종 또는 원산지 간에 구별되는 DNA 서열에 부합하는 것으로써, 상기 추출한 DNA를 더욱 우수하게 증폭시킬 수 있다.
예를 들어, 상기 갈치류에 속하는 종이 대한민국, 일본 또는 중국산 갈치(Trichiurus japonicus) 종, 인도산 갈치(Trichiurus sp.) 종 및 인도네시아산 갈치(Trichiurus lepturus) 종으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 경우에는, 하기 표 2에 기재된 서열번호 1과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머를 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이용하는 것이 바람직하다.
[표 2: 갈치류 판별을 위한 프라이머 서열]
| 프라이머 | 염기서열 |
| 전위 프라이머(서열번호 1) | TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC |
| 후위 프라이머(서열번호 2) | TAGACTTCTGGGTGGCCAAACAATCA |
상기한 바와 같이, 본 발명은 서열번호 3 내지 서열번호 10의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 이용하는 것이 특징이고, 이에 따라 본 발명의 다른 실시형태는 상기한 프로브, 이러한 프로브를 포함하는 DNA 칩 및 키트일 수 있다. 상기 DNA 칩 및 키트에는 프로브와의 결합 및 검출의 정확성을 높이기 위하여, 특정한 염기서열로 표시되는 별도의 위치마커(position marker)가 추가로 고정되어 있는 것도 가능하다.
이러한 본 발명은 DNA 마이크로어레이 기술에 따라 하나의 슬라이드 위에서 다수의 갈치류의 종 또는 원산지를 동시에 판별할 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 칩 및 키트는 상기한 프로브를 포함하여, 종 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로서, 염기서열을 분석하기 않고도 분석하고자 하는 갈치류의 유전자형과 그 종 또는 원산지를 신속히 판정할 수 있는 효용성을 가지고 있다. 또한 상기 갈치류에 속하는 갈치 종 또는 원산지를 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 상기 갈치류의 유전자형과 종 또는 원산지를 판별하는 방법을 표준화 및 자동화하는 것도 가능하다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이고, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 서열번호 1 내지 2의 프라이머의 합성
먼저, 갈치류에서 추출한 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머를 합성하였다. 본 실시예에서 사용한 갈치류와 이에 따른 프라이머는 상기 표 2에 나타난 것과 동일한 갈치류 및 이에 따른 프라이머를 사용하였다. 프라이머는 독일의 Metabion 사에 의뢰하여 합성하였다.
대칭 또는 비대칭 PCR에 사용하는 역방향(앤티센스) 프라이머는 교잡화 반응 후에 형광을 확인하기 위하여, 말단에 로다민, cy3, cy5를 부착시켜서 제작하거나 바이오틴을 부착시켰고, 교잡화 반응 후 Syreptavidin-Cyanine과 결합하도록 제작하여 사용하였다.
실시예 2: 갈치류의 DNA 추출과 PCR 반응
대한민국, 일본 또는 중국산 갈치(Trichiurus japonicus) 종, 인도산 갈치(Trichiurus sp.) 종 및 인도네시아산 갈치(Trichiurus lepturus) 종의 DNA는 독일 QIAGEN사의 DNeasy tissue kit을 사용하여 추출하였다.
상기 실시예 1에 따른 프라이머를 이용하여, 하기의 표 3과 같은 조건의 방법으로 PCR 반응을 DNA Engine(MJ Research사, 미국)에서 시행하였다.
[표 3: 프라이머 정상 증폭 확인 조건]
| 반응조성 | 반응 조건 | |
| 멸균증류수 11.5ul 10X buffer 2ul 2mM dNTP 1ul 10uM forward 1ul 10uM reverse 1ul 1unit Hot start Taq 0.5ul 정제 DNA 2ul |
94℃, 4분 | 1 cycle |
| 94℃, 30초 55℃, 30초 72℃, 45초 |
35 cycle |
|
| 72℃, 10분 |
1 cycle |
|
PCR이 끝난 후, PCR 산물 10㎕에 젤 로딩 버터(0.2% orange G, 0.25% xylene cyanol FF, 60% glycerol) 2㎕를 넣고 1㎍/㎖ ethidium bromide가 함유된 2% 아가로스젤에서 전기영동한 후 UV transilluminator가 부착된 Image analyzer(HITACHI, 일본)에서 PCR 밴드를 확인하였다.
실시예 3: 서열번호 3 내지 11의 프로브 제작
본 실시예에서는 3종 각각의 갈치류에 대한 프로브를 합성하였다. 교잡화 반응을 위한 프로브의 서열정보는 상기 표 1에 나타낸 것과 같다.
먼저, 알데히드 작용기가 처리되어 있는 글라스 위에, 상기한 서열정보를 가지는 폴리뉴클레오티드의 5'말단에 아미노 링크를 수식하고, 교잡화 반응시 슬라이드 글라스 위에 집적되어 있는 프로브 간의 공간적인 방해를 최소화시키기 위하여, 10-20 개의 올리고(dT)를 부가하여 본 발명에 따른 프로브를 완성하였다. 본 발명에서 사용한 프로브는 독일의 Metabion 사에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 4: DNA 칩 제작
올리고뉴클레오티드 칩을 제작하기 위하여, 상기 실시예 3에 따라 CSS-100 Silylatied Slide(Cell Associate사, 미국) 상에 50μM의 농도로 아미도 링크가 수 식되어 있는 프로브와 동일한 양의 3X SSC를 혼합하여 집적하였고, 이를 16 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 슬라이드를 0.1% SDS로 5분간 2회 세척한 후, 증류수로 5분간 2회 세척하였다.
소디움 보로하이드리드(1.3g NaBH4 375ml. PBS 125ml, 100% EtOH)에 제작된 칩을 5분간 반응시킨 후, 끓는 증류수에서 3분간 반응시킨 다음 진공 원심분리기에서 800rpm의 속도로 10분간 건조시켰다.
한 장의 슬라이드에서 다수의 시료 반응을 위해 perfusion chamber(BioGrace, 미국)로 분리한 후 실험 전까지 실온의 암소에서 보관하였다.
이렇게 제작된 DNA 칩을 3가지 형태로 도 5에 예시적으로 나타내었다. 도 5는 각각 본 발명에 따른 프로브를 포함하는 DNA 칩의 구조를 도식화한 모식도이다.
실시예 5: 교잡화 반응
상기 실시예 2에 따라 로다민, cy3, cy5 또는 바이오틴으로 결합된 PCR 산물을 교잡화 용액(3X SSC, 0.25% SDS)과 1:9의 비율로 혼합하였다. 형광반응을 일으키기 위하여 바이오틴을 사용한 경우 Syreptavidin-Cyanine을 1㎍/㎖의 농도로 첨가하여 반응시켰다.
그리고, 준비된 교잡화 용액을 상기 실시예 4의 DNA 칩이 포함된 chamber에 도포하여 55℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
그런 다음, 1X SSC, 0.1% SDS에서 5분 동안 일차 세척 후, 1X SSC에서 3분간 2차 세척을 실시하였다. 세척된 슬라이드는 원심분리기에서 800rpm의 속도로 10분간 건조하였다.
실험 결과의 확인은 LuxScan-10K/A(CapitalBio, 중국) 스캐너를 사용하여 형광값을 측정하여 유전자형을 분석하였고, 그 결과는 도 6 내지 도 11에 나타낸 바와 같다.
도 6 내지 도 11은 각각 본 발명에 따른 프로브와 갈치의 PCR 증폭산물을 결합시킨 결과사진이다.
여기서, 도 6 내지 도 11은 각각 도 5에 따른 형태의 DNA 칩 구조에서, 본 발명에 따른 프로브와 갈치의 PCR 증폭산물을 결합시킨 결과이다. 즉, 도 6은 국내 군산 갈치, 도 7은 국내 제주도 갈치, 도 8은 일본산 갈치, 도 9는 중국산 갈치, 도 10은 인도산 갈치, 도 11은 인도네시아산 갈치에 대한 결과이다.
여기에 도시된 것과 같이, 본 발명에 의하는 경우 해당 생물 종 또는 원산지에 따 라 형광 표지가 다르게 나타나므로, 이에 따라 해당 종 또는 원산지를 판별할 수 있음을 확인할 수 있다.
한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 일실시예에 관하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 명백한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 갈치류의 미토콘드리아 DNA 상의 유전자 배열을 예시적으로 나타내는 모식도이고,
도 2 내지 도 4는 각각 본 발명에 따른 갈치류의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I) 유전자의 단일염기다형성 부위가 포함된 연속된 염기서열을 예시적으로 나타내는 모식도이고,
도 5는 본 발명에 따른 프로브를 포함하는 DNA 칩의 구조를 예시적으로 도식화한 모식도이고,
도 6 내지 도 10은 각각 도 5에 따른 형태의 DNA 칩 구조에서, 본 발명에 따른 프로브와 갈치류의 PCR 증폭산물을 결합시킨 결과 사진이다.
<110> Korea Ocean Research & Development Institute
Genocheck
<120> Identifying Method of origin and species about hairtails,
Polynucleotide Probe, DNA Chip and Kit for Identifying The Same
<130> 0001
<160> 10
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 1
tcaaccaacc acaaagacat tggcac 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 2
tagacttctg ggtggccaaa caatca 26
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Trichiurus japonicus
<220>
<221> gene
<222> Complement((1)..(23))
<223> 409~431
<400> 3
aggaatctct tccatcttgg gcg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Trichiurus japonicus
<220>
<221> gene
<222> Complement((1)..(23))
<223> 479~501
<400> 4
acccagtttc aaacccctct gtt 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Trichiurus japonicus
<220>
<221> gene
<222> Complement((1)..(23))
<223> 567~589
<400> 5
ttacaatact cctaactgac cga 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Trichiurus sp.
<220>
<221> gene
<222> Complement((1)..(23))
<223> 384~406
<400> 6
taactatctt ctccctccat ctg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Trichiurus sp.
<220>
<221> gene
<222> Complement((1)..(23))
<223> 481~503
<400> 7
ccaatttcaa acccccttgt tcg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Trichiurus lepturus
<220>
<221> gene
<222> Complement((1)..(23))
<223> 193~215
<400> 8
acttattccc ctgatgattg ggg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Trichiurus lepturus
<220>
<221> gene
<222> Complement((1)..(23))
<223> 497~519
<400> 9
ctgttcgtgt gatcagtgct aat 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Trichiurus lepturus
<220>
<221> gene
<222> Complement((1)..(23))
<223> 573~595
<400> 10
tgcttctaac tgaccgcaat ctt 23
Claims (13)
- 갈치류에 속하는 종에서 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계;상기 PCR 산물을, 서열번호 3 내지 서열번호 10의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및,상기 결합 여부에 따라 상기 갈치류에 속하는 종의 원산지 또는 종(species)을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 갈치류의 원산지 또는 종(species) 판별 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 갈치류에 속하는 종은 대한민국, 일본 또는 중국산 갈치(Trichiurus japonicus) 종, 인도산 갈치(Trichiurus sp.) 종 및 인도네시아산 갈치(Trichiurus lepturus) 종으로 이루어진 군에서 적어도 하나 이상이 선택된 것을 특징으로 하는 갈치류의 원산지 또는 종 판별 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 결합 여부에 따라 상기 갈치류에 속하는 종의 원산지를 판별하는 것은,서열번호 3, 4 및 5의 염기서열을 포함하는 프로브와 결합하는 경우에는 대한민국, 일본 또는 중국을 원산지로 판별하고, 서열번호 6, 및 7의 염기서열을 포함하는 프로브와 결합하는 경우에는 인도산으로 판별하며, 서열번호 8, 9 및 10의 염기서열을 포함하는 프로브와 결합하는 경우에는 인도네시아산으로 판별하는 것을 특징으로 하는 갈치류의 원산지 또는 종 판별 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 프로브는 상기 갈치류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위와 결합하고, 상기 결합은 상기 갈치류의 종에 따라 다르게 이루어지는 것을 특징으로 하는 갈치류의 원산지 또는 종 판별 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 결합이 상기 갈치류의 종에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브는 대한민국, 일본 또는 중국산 갈치(Trichiurus japonicus) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 409-431번 째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 4의 프로브는 대한민국, 일본 또는 중국산 갈치 종의 479-501번째 DNA 서열, 서열 5의 경우는 대한민국, 일본 또는 중국산 갈치 종의 567-589번째 DNA 서열, 서열 6의 경우는 인도산 갈치(Trichiurus sp.) 종의 384-406번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 인도산 갈치 종의 481-503번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 인도네시아산 갈치(Trichiurus lepturus) 종의 193-215번째 DNA 서열, 서열번호 9의 경우는 인도네시아산 갈치 종의 497-519번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 인도네시아산 갈치 종의 573-595번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 갈치류의 원산지 또는 종 판별 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 PCR 산물을 프로브에 결합시키는 단계는 적어도 2회 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 갈치류의 원산지 또는 종 판별 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은, 서열번호 1 과 서열번호 2 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 하는 갈치류의 원산지 또는 종 판별 방법.
- 서열번호 3 내지 서열번호 10 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 갈치류의 원산지 또는 종(species) 판별용 프로브.
- 서열번호 3 내지 서열번호 10 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 프로브를 포함하는 갈치류의 원산지 또는 종(species) 판별용 DNA 칩.
- 제10항에 있어서, 위치 마커(position marker)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 갈치류의 원산지 또는 종 판별용 DNA 칩.
- 갈치류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브와;상기 갈치류의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 갈치류의 원산지 또는 종(species) 판별용 키트.
- 제12항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 2 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머인 것을 특징으로 하는 갈치류의 원산지 또는 종 판별용 키트.
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