KR20100061910A - 벼 품종을 구분하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

벼 품종을 구분하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벼 품종을 구분하기 위한 특이 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1 내지 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 프라이머 세트를 포함하는 벼 품종을 구분하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼 품종을 구분하기 위한 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 벼 품종을 구분하는 방법에 관한 것이다.
벼 품종, 구분, 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 키트

Description

벼 품종을 구분하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도{Specific primers for discriminating rice cultivars, and uses thereof}
본 발명은 벼 품종을 구분하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다.
벼는 밀 다음으로 세계 제2의 식량작물이며 세계 인구의 절반 이상이 쌀을 주식으로 하고 있는 작물로서 아시아에서 90%이상 생산되고 대부분이 아시아에서 소비되고 있다. 한국도 다른 아시아 국가들과 같이 쌀을 주식으로 하고 있으며 또한 해마다 15∼20 품종씩 신품종이 육성, 보급되고 있으나 국내에 보급되고 있는 품종들은 대부분이 특정 품종(일품벼, 주남벼, 동진1호 등)으로 소개되고 있어 국내 소비자의 대부분은 이들 품종에 대한 확인이 불가능한 실정이다. 또한 수출입 개방에 따라 일부 유통업자들은 수입 쌀을 국내산으로 또는 국내산에 수입 쌀을 혼합하여 공급하고 있으며 이러한 불법 유통을 방지하기 위하여 정부에서는 원산지 표기를 제도화하고 있으나 실제 원산지 허위 표기의 적발에는 유통경로의 추적 및 원산지 확인 등의 복잡한 절차를 거쳐야 하는 등 매우 어려움을 겪고 있는 실정이다. 더구나 최근 일부 농촌지역에서 발생하는 수확물의 도난사건 등 벼 품종과 관 련된 고소, 고발 사건에 대한 보다 과학적인 수사기법이 필요한 실정이므로 국내에서 육성되어 재배되고 있는 벼 품종들을 신속하고 간편하게 판별할 수 있는 방법이나 기술의 확립이 절실하다고 하겠다.
최근 벼 유전자원은 유용 형질 보존 및 신품종 창출에 매우 중요한 재료로 이용되고 있는 바 국내 고유 자원과 국외 자원의 수집과 함께 수집된 유전자원의 신속한 종간 및 아종간 품종 판별은 정확한 유전자원관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다.
최근에 여러 가지 DNA 마커를 이용하여 벼 품종을 식별하기 위한 많은 연구가 진행되었다. 지금까지, RAPD(random amplified polymorphic DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism)와 마이크로세틀라이트(microsatellite) 방법이 품종을 식별하는데 사용되어 왔다. 예를 들어, Wang 등은 RFLP(restricted fragment length polymorphism) 마커를 이용하여 품종을 식별하였고(Wang, Z.Y., Tanksley, S.D. 1989 L. Genome. 32, 1113-1118), Ryu는 단백질 모세관 전기영동 방법을 이용하여 품종을 식별하였다 (Ryu, D.J. 1998 J. food science and nutrition. 3, 43-347). 또한, 6개의 마이크로세틀라이트 마커를 사용하여 유전자 지도에서 위치를 확인하는 방법으로 자포니카 벼 51개 품종을 식별하였다(Ji, H.S. et al., 1998 Korean J. Breed. 30, 350-360). RAPD, 마이크로세틀라이트, STS(sequence tagged site), 그리고 PCR (polymerase chain reaction) 방법으로 국내산 40개 품종을 식별하고, 각 방법의 장단점을 비교하여 보고된 바가 있다(Jeong O.Y. et al., Korean 1998 J. Breed. 30, 136-137). RAPD와 마이크로세 틀라이트를 이용하여 31개 벼 품종의 식별을 보여주었고(Kwon, S.J. et al., 1999 Korean J Crop Science 44, 112-116), 화상분석기술을 이용한 벼 품종의 식별 방법을 보고하였다(Kwon, S.J. et al., 1998 Korean J Crop Science 43, 33-34). 그러나 이러한 식별 방법과 이미지 기술은 특이적 단일 밴드를 형성할 수 없으므로 혼합된 품종들로부터 각각의 품종을 식별하기가 어렵고, 분석 결과를 논의하기가 어렵다.
한국특허등록 제10-0453568호에는 품종판별을 위한 마이크로새틀라이트 마커조합이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0736152호에는 벼에서의 아종 감별용 STS 마커 세트가 개시되어 있으나, 본 발명의 프라이머 세트와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 재현성이 높으며 한국내에서 육성된 대다수 벼 품종, 재래종 및 일부 도입 품종의 판별에 손쉽게 적용할 수 있는 최소의 프라이머 조합을 선발하고 이를 각 품종별 구분에 적용시킴으로서 한국 내에서 재배되는 벼 품종의 구분을 보다 확실히 하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 프라이머 세트를 포함하는 벼 품종을 구분하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼 품종을 구분하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 이용하여 벼 품종을 구분하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 최소 4개 프라이머 세트만으로도 국내 육성 품종을 구분할 수 있으며, 형광 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR을 통하여 PCR 시간을 단축할 수 있으며, 모세관 전기영동을 통하여 유전 분석의 정확성을 제고할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 프라이머 세트를 포함하는 벼 품종을 구분하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 가장 바람직하게는 4개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 서열번호 1 내지 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 동시에 이용하면 벼 품종을 더욱 효율적으로 구분할 수 있다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 8의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있 거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에서, 상기 벼 품종은 주남벼, 남평벼, 오대벼, 화영벼, 추청벼, 화성벼, 일품벼, 태봉벼, 새상주벼, 새추청벼, 동진1호, 새계화벼, 동안벼, 호평벼, 대안벼, 백진주1호, 신운봉1호, 향미벼1호, 오대1호, 흑남벼, 남일벼, 주안1호, 중화벼, 수라벼, 흑진주벼, 향미벼2호, 고품벼, 조생흑찰, 삼광벼, 향남벼, 미향벼 및 흑향벼로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상일 수 있으나, 상기 품종에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 프라이머 세트는 멀티플렉스 (multiplex) PCR에 이용되는 것이 바람직하다. 멀티플렉스 PCR이란 복수의 프라이머 세트를 사용하여 동시에 1개의 반응 튜브 내에서 PCR 증폭하는 방법을 말한다. 각각의 프라이머 세트를 이용하여 각각의 PCR 반응을 수행한 후에, PCR 산물을 합하여 모세관 전기영동을 하는 것도 가능하지만, PCR 시간 및 반응을 단축하기 위해 멀티플렉스 PCR을 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 일반적으로 멀티플렉스 PCR을 수행하는 경우에는 각각의 PCR 반응을 수행하는 경우에 비해 PCR 산물의 생성 효율이 감소하지만, 본 발명의 프라이머 세트의 경우에는 4개의 프라이머 세트를 하나의 튜브에 넣고 멀티플렉스 PCR을 수행해도 각각의 PCR 산물이 제대로 생성됨을 알 수 있었다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 벼 품종을 구분하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라 제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
벼에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼 품종을 구분하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 벼 시료에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스 템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
상기 표적 서열 또는 핵산의 증폭은 멀티플렉스 (multiplex) PCR을 통해 수행될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 형광 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR을 수행할 수 있다. 멀티플렉스 PCR을 수행하면 PCR 시간 및 반응을 단축할 수 있는 장점이 있다. 상기 멀티플렉스 PCR에서 초기 변성, 변성, 어닐링, 연장은 통상적인 조건에 따라 수행할 수 있다. 그러나, 최종 연장(final extension) 반응은 60℃에서 30분 동안 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입 되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 모세관 전기영동을 수행하는 것이다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. DNA 추출
본 발명에 이용된 벼 품종은 식량작물과학원에서 분양받은 원원종급의 순수한 벼를 사용하였다. DNA를 추출하기 위하여 조곡상태의 벼에서 외영과 내영을 제거한 다음 현미를 만들고, 그 현미에서 호분층을 제거한 후 백미상태로 만든 다음 게놈(genomic) DNA를 추출하였다. DNA 추출은 하기와 같이 실시하였다. 종자 또는 백미 1-2립을 유산지에 넣어서 곱게 마쇄한 후, 1.5ml 또는 2ml 튜브에 넣고, 냉동 보관하였다. 추출 버퍼 (350㎕)를 첨가하고, 2㎕ proteinase K(25㎍/㎕)를 첨가 후 잘 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 여기에 동일 부피의 2% CTAB (350㎕)를 첨가 후 잘 혼합하였다. 상기 혼합물을 65℃ 항온수조에서 15분간 반응시키면서 5분마다 가볍게 inverting 하여 잘 섞이게 하였다. 여기에, PCI 용액 (phenol:chloroform:isoamylalcohol = 25:24:1)을 350㎕ 첨가한 후, 10분간 inverting하면서 잘 혼합하고, 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 새로운 튜브에 옮기고, 옮긴 상등액의 2/3 부피의 이소프로판올 (500㎕)이나 2배 부피의 EtOH를 첨가하고 천천히 잘 섞어서 DNA를 응축시키며, 가능한 한 많은 DNA를 회수하기 위하여 -20℃ 냉동실에 2~3시간 두었다가 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 원심분리 후, 상등액을 버리고 70% cold EtOH (300-500㎕)로 세척 후 12,000rpm에서 3~5분간 원심분리하고 EtOH를 제거한 후, DNA 펠렛을 건조시키고, 100㎕ TE 버퍼 또는 멸균수에 DNA를 녹여, -20℃, 95% EtOH을 200㎕를 넣어 DNA를 엉기게 하고, 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하 여 DNA를 침전시켰다. EtOH를 버리고 DNA 덩어리를 70% EtOH에 한번 세척 후 DNA 덩어리를 말린 후, 200㎕의 TE 버퍼 또는 멸균수를 넣고 DNA를 녹인후 DNA 양을 점검하여 10-15㎍/㎕ 농도로 희석하여 PCR에 사용하였다.
2. PCR 반응 및 형광 프라이머 합성
PCR 반응에서 최종 부피는 20㎕로 조정하였으며, 게놈 DNA 2㎕, PCR 버퍼 2㎕, dNTPs 1.6㎕, Taq polymerase 0.1㎕, 4쌍의 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 1 내지 8)를 각각 0.4㎕씩 넣었으며, 나머지는 증류수로 보충하였다. PCR 사이클은 초기 DNA 변성을 위해 95℃ 5분의 1 사이클, DNA 증폭은 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분의 35 사이클과 최종 연장(Extension)은 60℃ 30분 1 사이클로 하였으며, 반응후 4℃에서 저장하였다. 모든 PCR은 Px2 Thermal Cycler(ABi)를 사용하였다.
OSR20, RM249, RM206, RM207의 프라이머의 서열 정보는 하기 표 1 에 나타내었으며, 각각 blue, green, yellow, red의 형광물질을 첨가하여 합성하였다.
표 1. 사용된 프라이머의 형광 및 서열
프라이머(형광) 구분 서열(5'→3')
OSR20(Blue) 정방향 GGAAGAGGAGAGAAAGATGTGTGTCG (서열번호 1)
역방향 TCAACAGACACACCGCCACCGC (서열번호 2)
RM249(Green) 정방향 GGCGTAAAGGTTTTGCATGT (서열번호 3)
역방향 ATGATGCCATGAAGGTCAGC (서열번호 4)
RM206(Yellow) 정방향 CCCATGCGTTTAACTATTCT (서열번호 5)
역방향 CGTTCCATCGATCCGTATGG (서열번호 6)
RM207(Red) 정방향 CCATTCGTGAGAAGATCTGA (서열번호 7)
역방향 CACCTCATCCTCGTAACGCC (서열번호 8)
3. PCR 산물의 ABi Sequencer 반응
PCR 과정을 끝낸 PCR 산물을 증류수로 10배 희석하였다. 희석액에 Hi-Di 9㎕와 Liz-500 size marker (ABi, 미국)를 0.05㎕ 첨가한 후 94℃에 2분간 반응시키고 ABi Sequencer (ABi, 미국)에 치상하여 모세관 전기영동을 실시하였다.
실시예 1: 본 발명의 프라이머 세트의 디자인
인터넷 Database(http://www.gramene.org/)에서 여러 마커들의 서열 정보를 획득하고, 해당 품종을 스크리닝하면서 allele 가 특이적으로 많은 마커들로 축소하였다. Gradient PCR을 통하여 55℃에서 Annealing이 잘 일어나는지를 검사하였다 (이는 멀티플렉스 PCR을 하기 위하여 Annealing 온도를 하나로 고정해야 하기 때문이다). "Primer-3" 프로그램을 이용하여 서열을 약간 변형하였다 (55℃에서 반응이 잘 일어날 수 있도록). 각 프라이머에 형광을 붙여서 최종적으로 품종 구분에 가장 적합한 4개의 프라이머를 선발하였다.
실시예 2: 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 벼 품종별 멀티플렉스 PCR 분석
상기 실시예 1에서 디자인한 프라이머 세트를 이용하여 국내 육성 일반벼 품종 32개에 대해 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.
ABi Sequencer에서 표현되는 그래프 중 삼광벼를 도 1과 같이 예시하였다. 혼합된 4가지 프라이머 세트들이 각각의 형광색을 나타내면서 프라이머별로 고유위 치에서 표시됨을 알 수 있다. 도 1에서 오렌지 색은 표준 Size marker를 나타내고, 노란색으로 형광된 RM206은 화면상에서 쉽게 눈에 뛸 수 있도록 하기 위하여 검은색으로 표시되도록 하였다.
Size marker의 비율에 따라 삼광벼에 대한 4개 프라이머의 Genotyping size는 OSR20 (193bp), RM249 (126bp), RM206 (150bp), 그리고 RM207 (119bp)임을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 방법으로 국내육성 32개 품종의 고유의 Genotyping size를 모두 검정하였으며, 검정 결과를 하기 표 2에 표시하였다.
표 2. 프라이머별 품종간 PCR 산물 크기(bp)
Figure 112008082561903-PAT00001
표 2(계속)
Figure 112008082561903-PAT00002
표 2(계속)
Figure 112008082561903-PAT00003
표 2(계속)
Figure 112008082561903-PAT00004
이들 품종간에는 서로 간섭 현상이 없어서 4개의 프라이머 세트를 동시에 혼합하여 분석가능하고, 이로 인한 시간과 비용을 줄인 신속한 품종구분이 가능하였다.
도 1은 삼광벼의 고유 genotyping size를 나타낸 그림이다.
<110> Gyeongsangbuk-Do Provincial Agricultural Technology Administration <120> Specific primers for discriminating rice cultivars, and uses thereof <130> PN08241 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSR20 forward primer <400> 1 ggaagaggag agaaagatgt gtgtcg 26 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSR20 reverse primer <400> 2 tcaacagaca caccgccacc gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM249 forward primer <400> 3 ggcgtaaagg ttttgcatgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM249 reverse primer <400> 4 atgatgccat gaaggtcagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM206 forward primer <400> 5 cccatgcgtt taactattct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM206 reverse primer <400> 6 cgttccatcg atccgtatgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM207 forward primer <400> 7 ccattcgtga gaagatctga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM207 reverse primer <400> 8 cacctcatcc tcgtaacgcc 20

Claims (10)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 프라이머 세트를 포함하는 벼 품종을 구분하기 위한 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 벼 품종을 구분하기 위한 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 벼 품종은 주남벼, 남평벼, 오대벼, 화영벼, 추청벼, 화성벼, 일품벼, 태봉벼, 새상주벼, 새추청벼, 동진1호, 새계화벼, 동안벼, 호평벼, 대안벼, 백진주1호, 신운봉1호, 향미벼1호, 오대1호, 흑남벼, 남일벼, 주안1호, 중화벼, 수라벼, 흑진주벼, 향미벼2호, 고품벼, 조생흑찰, 삼광벼, 향남벼, 미향벼 및 흑향벼로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상인 것을 특징으로 하는 벼 품종을 구분하기 위한 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서, 멀티플렉스 (multiplex) PCR에 이용되는 것을 특징으로 하는 벼 품종을 구분하기 위한 프라이머 세트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 벼 품종을 구분하기 위한 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  7. 벼에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼 품종을 구분하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 표적 서열의 증폭은 멀티플렉스 (multiplex) PCR을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR의 최종 연장(final extension)은 60℃에서 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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