KR100829421B1

KR100829421B1 - 연어 종 또는 계군의 판별 방법과 이에 따른 연어 종 또는계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ칩 및 키트

Info

Publication number: KR100829421B1
Application number: KR1020060039711A
Authority: KR
Inventors: 황승용; 이윤호; 김충곤; 김고은; 정진욱; 윤현규; 서현석; 정다금; 이창현
Original assignee: 한국해양연구원; (주)지노첵
Priority date: 2006-05-02
Filing date: 2006-05-02
Publication date: 2008-05-15
Also published as: KR20070107346A

Abstract

본 발명은 연어 종 또는 계군의 판별 방법과 이에 따른 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 관한 것으로, 특히 연어(salmon)의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물과 서열번호 5 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 및 상기 결합 여부를 확인해서 연어가 속하는 종이나 계군을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 연어 종 또는 계군의 판별 방법에 의하는 경우, 하나의 슬라이드 위에서 다수의 연어 종 또는 계군에 대한 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 검사할 수 있다.

연어, 단염기다형성, 프로브

Description

연어 종 또는 계군의 판별 방법과 이에 따른 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ＤＮＡ칩 및 키트{Identifying Method of Chum Salmon Species or Its Originated Stocks, Polynucleotide Probe, DNA Chip and Kit for Identifying The Same}

도 1은 연어 미토콘드리아 DNA상의 유전자 배열을 나타내는 모식도이고,

도 2 내지 도 6은 본 발명의 바람직한 일실시에에 따라 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단일염기다형성 부위가 포함된 730개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이고,

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 PCR 방법에 의해 증폭된 PCR 산물의 전기영동사진이고,

도 8은 상기 도 2내지 도 6에 나타난 단염기다형성에 근거하여 제작된 올리고뉴크레오티드 프로브를 포함하는 DNA칩의 구조를 도식화한 모식도이고,

도 9a 내지 도 9f는 상기 도 8의 DNA칩을 이용하여 본 발명에 따른 올리고뉴크레오티드 프로브와 다양한 연어의 PCR 증폭산물을 결합시킨 후의 반응 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 연어 종 또는 계군의 판별 방법과 이에 따른 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 관한 것으로, 특히 연어의 각 종과 북태평양 연안국들이 방류하는 연어(chum salmon)의 각 계군을 간단하고 신속, 정확하게 구별하기 위한 것이다. 더욱 상세하게는 연어의 미토콘드리아 DNA COIII-ND3-ND4L 지역에 존재하는 단염기다형성(single nucleotide polymrphism)에 근거한 폴리뉴클레오티드(polynucleotide) 프로브와 이를 포함하는 키트(kit) 및 DNA칩(DNAchip)을 제조하는 것이다.

연어과 어류는 북태평양과 북대서양에 서식하는 냉수성 어종이다. 북태평양의 대표적인 연어 어종으로 연어(chum salmon, Oncorhynchus keta), 곱사연어(pink salmon, O. gorbuscha), 홍연어(sockeye salmon, O. nerka), 왕연어(chinook salmon, O. tshawytscha), 은연어(coho salmon, O. kisutch), 시마연어 (cherry salmon, O. masou masou) 등이 있으며, 북대서양에는 대서양연어(Atlantic salmon, Salmo salar)가 있다. 또한, 연어과 어류 중 육지에 서식하는 대표적인 어종으로서 산천어(ishikawae salmon, O. masou ishikawae), 무지개송어(rainbow trout, O. mykiss) 와 cutthroat 송어(O. clarkii)가 있다. 이들은 대부분 식용으로 널리 이용되고 있어 북태평양과 북대서양 연안국들의 중요한 수산자원으로 평가된다. 한 편, 북태평양과 베링해, 오호츠크해 및 이들 바다로 유입되는 하천에 널리 분포하는 종인 연어(chum salmon, O. keta)는 우리나라, 일본, 러시아, 캐나다, 미국 등이 대량의 치어를 인공적으로 생산하여 방류함으로써 자국의 연어 자원을 증대시키고 있다.

연어를 자원으로 삼는 연안국들은 연어자원의 효율적 관리와 합리적 이용을 위해 노력하며, 연어자원에 대한 주권을 확보하기 위해 과학적, 외교적 노력을 활발히 하고 있다. 그런데, 이와 같은 목적을 달성하기 위해서는 연어 종과 계군의 신속 정확한 판별이 필수적이다.

연어과 어류의 미토콘드리아 DNA상 유전자 배열은 도 1에 제시된 바와 같다. 본 발명의 대상지역인 COIII-ND3-ND4L 지역은 종래의 연구대상이었던 조절부위(control region)와 반대쪽에 위치하며, COIII(CO3) 유전자 3'말단의 203 염기(위치 1-203), tRNA-gly 유전자 70염기(204-273), ND3 유전자 351염기(274-624), tRNA-Arg 유전자 68염기(625-692), ND4L 유전자 5'말단 52염기(693-744)를 포함한다. 현재까지 유전자형에 의한 연어 판별 연구는 조절부위에 한정되어 있었지만, 본 발명자들은 이와는 다른 COIII, ND3 및 ND4L 지역을 대상으로 종과 계군을 구분하는 단염기다형성을 분석하고 이에 근거한 올리고뉴크레오디트 프로브를 고안함으로써 신속 정확하게 연어종과 계군을 판별하는 DNA칩 발명에 이르게 되었다.

연어를 구분하기 위한 방법으로 초기에는 동위효소분석법이 시도되었다(Okazaki, 1981; Winans et al. 1994; Wilmot et al. 1998). 이 방법은 대립형질을 갖고 있는 효소단백질을 전기영동법을 이용하여 젤 상에서 구분하는 것으로서 분해능이 뛰어나지 못하고 동위효소가 충분히 분리되지 못한다는 단점이 있다(Lewontin, 1991).

또 다른 방법으로 제한효소단편다형성(Restriction fragment length polymorphisms, RFLPs)을 이용한 계군 구분이 시도되었다(Cronin et al. 1993; Seeb and Crane, 1999). 그러나, 이 방법 역시 비교 생물의 유전체 전체를 제한효소로 자르고 이를 전기영동으로 분석하여 잘려진 DNA 단편들의 길이 차이를 생물체 간에 서로 비교하는 것이기 때문에 분해능이 떨어진다는 단점이 있다. 이후에는 미니새틀라이트(minisatellite) DNA의 차이를 이용한 연어 종과 계군을 구분하는 방법도 시도되었으나(Beacham, 1996), 이 역시 종과 계군을 일관성 있게, 신속하게 구분하는 데는 문제점이 많다.

한편, 유전자 염기서열 분석방법이 발전하면서 염기서열의 차이를 이용하여 연어 종을 구분하고 이들의 유연관계를 밝히는 방법이 발전하였다. 연어과 어류 8종의 미토콘드리아 조절부위 염기서열이 분석되었으며 (Shedlock et. al., 1992), ATP6와 ND3 염기서열도 분석되었다(Domanico와 Phillips, 1995). 그 외 성장호르몬-유형2도 분석되어 연어과 어류의 각 종이 언제 어떠한 경로에 의해 종분화가 이루어 졌는지 조사되었다(McKay et. al., 1996). 또한, 성장호르몬 유형1과 유형2의 인트론도 조사되어 연어과 어류의 속간 관계가 밝혀졌다(Oakley와 Phillips, 1999). 이러한 연구들은 연어과 어류의 종을 구분할 수 있는 염기서열의 차이를 제공한다.

최근에는, 연어 미토콘드리아 DNA 상의 조절부위(control region)에 변이가 많다는 것이 알려지면서(Sato et al. 2001), 이 지역의 염기배열 전체를 분석하고 그 변이(단염기다형성, single nucleotide polymorphisms, SNPs)에 근거하여 계군을 구분하는 방법이 시도되었다(Abe et al., 2002). 이 방법은 염기배열의 일차적인 차이를 비교 척도로 한다는 측면에서 분해능이 높다. 그러나, 분석 대상이 된 조절부위(control region)가 연어의 여러 계군을 구분하기에충분할 만큼 변이가 많지 않은 것으로 드러났다.

따라서, 연어의 계군을 구분하기 위해서는 보다 많은 돌연변이가 있어 분해능이 뛰어난 유전자 마커를 대상으로 염기서열 자료를 축적할 필요가 있으며, 계군간의 염기서열 차이를 신속하게 구분할 수 있는 분석법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로써, 연어(salmon)의 혈액, 세포 및 근육조직으로부터 DNA를 추출하고, 이를 증폭시킨 PCR 산물을 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브와 반응시킴으로써 연어 유전자형을 분석하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

연어의 종을 구분하는 데 있어서도, 염기서열의 차이가 밝혀졌다고 하더라도 이를 신속 정확하게 분석할 수 있는 표준화된 방법이 있으면 많은 시간과 인적 자원, 비용이 줄어들 수 있다. 본 발명에서는 연어 각 종이나 계군에 따른 염기서열의 차이를 정확히 파악하고, 이를 근거로 하여 각 연어 종에 따라 차이가 나도록 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하기 위한 것이며, 이를 포함하는 DNA칩 또는 키트를 이용하여 연어의 종에 따른 염기서열 차이를 신속, 정확하게 분석할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 종과 계군 간에 염기서열 차이가 있는 부위를 포함하는 15개 내지 30개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 프로브와, 이것으로 구성된 DNA칩 그리고 이것들을 포함하는 키트를 제공하는 것이다. 이러한 본 발명에 의해, 하나의 슬라이드 위에서 다수의 연어 종 또는 계군에 대한 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 검사하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명자들은 다양한 연어 종의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 근거로 하여, 연어 각 종 마다 특이적으로 결합할 수 있는 최적의 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하고자 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 연어(salmon)의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA에 대해, 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 일부를 증폭시킬 수 있는 프라이머로, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물과 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 상기 결합 여부를 확인해서 연어가 속하는 종이나 계군을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 연어 종 또는 계군의 판별 방법이다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상기한 바와 같은 연어 종 또는 계군의 판별 방법에 사용되는 것으로써, 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 연속된 염기서열로 이루어진 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브일 수 있다. 나아가, 본 발명은 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 연속된 염기서열로 이루어진 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상기한 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 DNA칩이나 이를 포함하는 키트일 수 있다. 즉, 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 연속된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브와; 상기 연어 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 것으로 서열번호 1 또는 서열번호 2의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머;를 포함하는 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군 판별용 키트가 가능하다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시형태를 첨부된 도면을 참고로 하여, 상세하게 살펴보기로 한다.

본 발명에 따른 연어 종 또는 계군의 판별 방법은 먼저, 연어(salmon)의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계를 거치고, 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계를 거친다. 연어로부터 DNA를 추출하는 것은 추출된 DNA를 분석하여 연어의 종이나 계군을 판별하기 위한 것이기 때문에, 연어의 어느 부분에서 DNA를 추출하든지 또는 어떠한 방법으로 추출되는지는 특별히 제한되지 않는다. 이렇게 추출된 DNA는 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 포함하는 것이 바람직하다. 그리고, 이렇게 추출한 DNA를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 DNA 추출 방법이나 증폭 방법 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백하다.

이어서, 상기 PCR 산물과 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계를 거치는 것이 본 발명의 가장 중요한 특징이다. 이후에, 상기 결합 여부를 확인해서 연어가 속하는 종이나 계군을 판별하는 단계를 포함하나, 이 또한 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되는 모든 결합 여부 확인방법을 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 서열번호 5 내지 서열번호 23의 DNA 서열은 하기의 표 1과 표 1-1 및 표 2에 나타난 바와 같다.

[표 1: 연어 종 판별을 위한 DNA 서열]

연어 종 판정을 위한 DNA 서열
프로브 명칭	DNA 서 열	반응연어종	DNA서열위치
sm05 (서열번호5)	5‘-gac gca gaa aag ttg tct ccc ta-3'	연어	364-386
sm06 (서열번호6)	5'-ccc ctt ggg gtc tgc ccg tct-3'	곱사연어	402-422
sm07 (서열번호7)	5'-tcc tag tat caa tga gta taa gtg ac-3'	홍연어	208-233
sm08 (서열번호8)	5'-gat ttg atc cat tag ggt ccg c-3'	왕연어	395-416
sm09 (서열번호9)	5'-gac cct tta gga tcc gcc cgt-3'	시마연어	402-418
sm10 (서열번호10)	5'-ctc aat acc ccc gcc cta-3'	시마연어	517-534
sm11 (서열번호11)	5'-tgc tgt gct tgc cct cc-3'	산천어	551-568
sm12 (서열번호12)	5'-gac ccc tta ggg tcc gcc cgc-3'	무지개송어	399-420
sm13 (서열번호13)	5'-att tga ccc cct agg atc cg-3'	cutthroat 송어	396-415
sm14 (서열번호14)	5'-aca aat aac gcc cga cgc a-3'	대서양연어	351-369
sm15 (서열번호15)	5'-tag tat taa cgc gta taa gtg-3'	은연어	211-231
sm16 (서열번호16)	5'-tag tat taa cac gta taa gtg-3'	은연어 외 모든 종	211-231
sm17 (서열번호17)	5'-tct att tac tga tga ggc tc-3'	연어 외 모든 종	181-200

[표 1-1: 연어 종 판별을 위한 DNA 서열]

연어 종 판정을 위한 DNA 서열
프로브 명칭	DNA 서 열	반응연어종	DNA서열위치
sm24(서열번호24)	5‘-gca gag aag tta tcc cc-3'	왕연어	367-383
sm25(서열번호25)	5-atc acc att aca ctg tct gc-3'	은연어	301-320
sm26(서열번호26)	5-tag tta caa caa tca tcg ct-3'	홍연어	280-300
sm27(서열번호27)	5‘-act ctt gga cta att tat gag tg-3'	홍연어	571-593
sm28(서열번호28)	5‘-cca ctg ctg tac ttg ccc tcc tt-3'	시마연어	548-571
sm29(서열번호29)	5'-cca ctg ctg tgc ttg ccc tcc tt-3'	산천어	548-571
sm30(서열번호30)	5'-atg gac cca ggg agg cct tg-3'	대서양연어	591-611
sm31(서열번호31)	5‘-tcc tcc ccc tac cct gag gg-3'	곱사연어	491-510
sm32(서열번호32)	5'-ctt gac act cgt ttg gtc ca-3'	은연어	531-550
sm33(서열번호33)	5‘-cct aac act cgt ctg atc ca-3'	시마연어,산천 어	531-550
sm34(서열번호34)	5‘-gat caa ctc cac acc ccg ac-3'	무지개송어	511-530

[표 2: 연어 계군(유전자형) 판별을 위한 DNA 서열]

연어 계군(유전자형) 판정을 위한 DNA 서열
프로브 명칭	DNA 서열	연어유전자형	DNA서열위치
sm18 (서열번호18)	5'-aat cat tac tat tac cat cac att-3'	C1	291-314
sm19 (서열번호19)	5'-acc cca acc cta aca ctt att t-3'	A1	523-544
sm20 (서열번호20)	5'-tta cta tca ccc tca cat tgt cc-3'	D2	296-318
sm21 (서열번호21)	5'-ccc caa ccc tga cac tta tt-3'	B1, C1, D1, D2	524-543
sm22 (서열번호22)	5'-taa ttt atg aat gaa ccc aag gag-3'	A1, D1, D2	581-604
sm23 (서열번호23)	5'-taa ttt atg agt gaa ccc aag gag-3'	B1, C1	581-604

상기한 표 1과 표 1-1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 서열은 연어의 종을 판별하기 위한 것과 연어 계군을 판별하기 위한 것으로 구분될 수 있다. 이러한 DNA 서열은 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 포함하는 것으로, 연어 종이나 계군을 알고자 하는 대상산물의 일반적인 염기서열을 나타내는 것이다. 각 DNA 서열의 위치도 표시하였다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브는 상기한 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 결합할 수 있도록 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 연어로부터 추출된 DNA를 증폭시킨 PCR 산물을 이용함에 있어서, 상기 PCR 산물의 어느쪽 가닥을 사용하는 것도 가능하므로, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열에 상보적인 염기서열을 가지는 표적대상 PCR 산물과 반응하기 위해서, 본 발명에 따른 프로브는 상기 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중어느 하나의 DNA 서열과 동일한 염기서열을 가지는 것도 가능하다. 본 발명자들은 각 서열번호에 따른 PCR 산물의 DNA 서열과 상보적인 염기서열을 프로브로 이용하였고, 상기 서열번호에 대응하는 각각의 프로브 명칭을 sm5 내지 sm34로 명명하였다.

본 발명자들은 도 2 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 다양한 연어 종의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 하여 연어 각 종 마다 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하였다.

도 2 내지 도 6은 본 발명의 바람직한 일실시에에 따라 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단일염기다형성 부위가 포함된 730개의 염기서열을 연속적으로 도시한 모식도이다. 즉, 도 2는 다양한 연어 종, 구체적으로는 연어(chum salmon, O. keta), 곱사연어(pink salmon, O. gorbuscha), 홍연어(sockeye salmon, O. nerka), 왕연어(chinook salmon, O. tshawytscha), 은연어(coho salmon, O. kisutch), 시마연어(cherry salmon, O. masou masou), 산천어(ishikawae salmon, O. masou ishikawae), 무지개송어(rainbow trout, O. mykiss), cutthroat 송어(O. clarkii)와 대서양연어(atlantic salmon, Salmo salar) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 1번부터 150번 까지의 DNA 서열을 나타낸 것이고, 도 3은 상기 유전자의 151번부터 300번 까지의 DNA 서열, 도 4는 상기 유전자의 301번부터 450번 까지의 DNA 서열, 도 5는 상기 유전자의 451번부터 600번 까지의 DNA 서열, 도 6은 상기 유전자의 601번부터 730번 까지의 DNA 서열을 순차적으로 나타낸 것이다.

여기서, 단염기다형성 부위는 도2 내지 도6에 나타난 바와 같이, 연어(chum salmon)종의 일반적인 염기서열과는 다른 유전자형을 보이는 염기서열 부위를 말하는 것이다. 즉, ".(점)"으로 표시되는 부위는 상기 연어(chum salmon)종의 일반적인 염기서열과 동일한 유전자형을 표시하며, 도 2의 pink 내지 도 6의 atlantic에 나타난 구체적인 A, C, G 또는 T가 단염기다형성(SNP)을 나타내는 부위이다.

도 2 내지 도 6은 본 발명의 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 변이 염기가 포함된 730개 염기서열을 포함하는 게놈 DNA 부분을 나타내는 연결되는 도면이다. 이 연결되는 도면은 대한민국, 일본, 미국, 캐나다 연어의 미코콘드리아 DNA COIII-ND3-ND4L 지역의 730개 염기서열을 분석하여 비교한 것으로서, 이 지역에 특정 연어 종에 독특한 단염기다형성 변이와 계군 특이적 단염기다형성 변이가 다수 존재한다는 것을 보여준다. 지면의 한계상 50개 염기서열 단위로 분절하여 나타내었지만 도2 내지 도6은 순서대로 이어지는 도면을 의미한다. 그 중에서도 상기한 표 1과 표 2에 나타난 DNA 서열 위치 부분이 마이크로어레이 방법에 이용될 폴리뉴클레오티드 프로브로 사용될 수 있는 종 또는 계군 특이적 단염기다형성이 존재하는 지역을 나타낸다.

본 발명자들은 수많은 연구와 노력끝에, 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자에서 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34에 해당하는 각 DNA 서열이 각 연어 종이나 계군을 구별하기에 최적으로 적합하다는 것을 확인하였고, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나와 동일하거나 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 연어의 종 또는 게군을 판별할 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 연어 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 연어 종이나 계군의 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 연어 종이나 계군에는 결합하지 않는 것이 특징이다.

본 발명에서 '다형성(polymorphism)'이란 유전학적으로 결정된 집단내에서 2이상의 대체적 서열 또는 대립형질의 발생을 의미한다. 다형 마커 또는 부위는 발산이 일어나는 위치(locus)이다. 바람직한 마커는 선택된 집단에서 1%이상, 더욱 바람직하기로는 10%또는 20%이상의 발생 빈도를 나타내는 두개 이상의 대립형질을 가진다. 다형성 부위는 단일 염기쌍일 수도 있다.

따라서, 본 발명은 상기한 염기서열 이외에 본 발명에 따른 다형성 부위를 하나 이상 포함하여 이루어지는 뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 핵산 단편 또는 그의 상보체도 가능하다. 더불어, 하나의 연어 개체에서 나타나는 한정적 돌연변이와 계군마다 집단적으로 몰려다니는 연어의 특성을 고려하여, 본 발명에 따른 다형성 부 위의 더욱 바람직한 형태는 연어 계군간의 구별을 위해 상기 다형성 부위가 2개 이상의 개체로부터 동일한 유전자형으로 나타나는 것이 바람직하다. 또한, 상기 본 발명에 따른 다형성 부위는 유전학적으로 결정된 집단내에서 2이상의 대체적 서열 또는 대립형질이 발생하는 것을 의미하는바, 상술한 바와 같이 도 2 내지 도 6에 나타난 다형성 부위의 염기서열과 동일하거나 이에 상보적으로 결합할 수 있는 DNA서열을 포함하는 염기서열로 이루어지는 것도 가능하다.

이와 같은 다형성 부위를 근거로 하여, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브는 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 것이면 어느 것이나 본 발명에 해당한다. 바람직하기로는, 상기 DNA 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하여 10개 이상이고 100개 이하의 연속적인 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보체일 수 있고, 더욱 바람직하기로는 10개 이상이고 50개 이하의 것이고, 가장 바람직하기로는 15개 이상이고 30개 이하의 것일 수 있다.

이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 연어로부터 추출된 대상 DNA 또는 상기 추출된 DNA를 증폭시킨 PCR 산물과 결합하는데 있어서, 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 단염기다형성 부위와 결합하는데, 상기 결합은 연어 종 또는 계군에 따라 다르게 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이렇게 본 발명은 프로브와 대상 산물의 결합여부에 따라 연어의 종 또는 계군을 판별하는데, 본 발 명에 따른 프로브로 분석 가능한 연어의 종과 계군을 하기의 표 3과 표 4에 예시적으로 나타내었다.

[표 3: 분석 가능한 연어 종]

분석 가능한 연어 종
연어과 (salmon)	연어(chum salmon, O. keta)
	곱사연어(pink salmon, O. gorbuscha)
	홍연어(sockeye salmon, O. nerka)
	왕연어(chinook salmon, O. tshawytscha)
	은연어(coho salmon, O. kisutch)
	시마연어(cherry salmon, O. masou masou)
	산천어(ishikawae salmon, O. masou ishikawae)
	무지개송어(rainbow trout, O. mykiss)
	cutthroat 송어(O. clarkii)
	대서양연어(atlantic salmon, Salmo salar)

[표 4: 분석 가능한 연어(chum salmon) 계군]

분석 가능한 연어(chum salmon) 계군 (유전자형)
연어(chum salmon)	한국과 일본 계군 (유전자형 A1)
	캐나다, 알래스카, 러시아 계군 (유전자형 B1)
	미국 계군 (유전자형 C1)
	한국과 일본 계군 (유전자형 D1)
	한국 계군 (유전자형 D2)

상기한 표 3과 표 4에, 분석 가능한 연어 종이라 함은 연어의 종류를 말하는 것이고, 분석 가능한 연어 계군이라 함은 상기한 연어 종 중에서 연어(chum salmon) 종에 해당하는 연어의 계군을 의미한다. 특별히 상기 연어(chum salmon) 종의 계군은 A1, B1, C1, D1 및 D2 유전자형으로 구분하였고, 이러한 유전자형은 상술한 표 2에 나타난 연어유전자형과 같은 의미를 표시한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브는 연어로부터 추출된 대상 DNA 또는 상기 추출된 DNA를 증폭시킨 PCR 산물과 결합하는데 있어서, 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 단염기다형성 부위와 결합하는데, 상기 결합은 연어 종 또는 계군에 따라 다르게 이루어지는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 결합이 연어 종 또는 계군에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 상기한 표 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 프로브(이것은 서열번호 5의 DNA 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 의미함, 이하 각 서열번호에서도 같음)가 연어(chum salmon, O. keta) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 364-386번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 6의 경우는 곱사연어(pink salmon, O. gorbuscha) 종의 402-422번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 홍연어(sockeye salmon, O. nerka) 종의 208-233번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 왕연어(chinook salmon, O. tshawytscha) 종의 395-416번째 DNA 서열, 서열번호 9의 경우는 시마연어(cherry salmon, O. masou masou) 종의 402-418번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 시마연어(cherry salmon, O. masou masou) 종의 517-534번째 DNA 서열, 서열번호 11의 경우는 산천어(ishikawae salmon, O. masou ishikawae) 종의 551-568번째 DNA 서열, 서열번호 12의 경우는 무지개송어(rainbow trout, O. mykiss) 종의 399-420번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 cutthroat 송어(O. clarkii) 종의 396-415번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 대서양연어(atlantic salmon, Salmo salar) 종의 351-369번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 은연어(coho salmon, O. kisutch) 종의 211-231째 DNA 서열, 서열번호 16의 경우는 은연어(coho salmon, O. kisutch) 외 모든 종의 211-231번째 DNA 서열, 서열번호 17의 경우는 연어(chum salmon, O. keta) 외 모든 종의 181-200번째 DNA 서열, 서열번호 24의 경우는 왕연어 종의 367-383번째 DNA 서열, 서열번호 25의 경우는 은연어 종의 301-320번째 DNA 서열, 서열번호 26의 경우는 홍연어 종의 280-300번째 DNA 서열, 서열번호 27의 경우는 홍연어 종의 571-593번째 DNA 서열, 서열번호 28의 경우는 시마연어 종의 548-571번째 DNA 서열, 서열번호 29의 경우는 산천어 종의 548-571번째 DNA 서열, 서열번호 30의 경우는 대서양연어 종의 591-611번째 DNA 서열, 서열번호 31의 경우는 곱사연어 종의 491-510번째 DNA 서열, 서열번호 32의 경우는 은연어 종의 531-550번째 DNA 서열, 서열번호 33의 경우는 시마연어와 산천어 종의 531-550번째 DNA 서열, 서열번호 34의 경우는 무지개송어 종의 511-530번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이 중에서, 상기 서열번호 16의 경우에 은연어(coho salmon, O. kisutch) 외 모든 종의 DNA 서열과 특이적으로 결합한다는 것은 표 3에 나타나 있는 분석 가능한 연어 종 중에서 은연어(coho salmon, O. kisutch)를 제외한 모든 연어 종, 즉 연어(chum salmon, O. keta), 곱사연어(pink salmon, O. gorbuscha), 홍연어(sockeye salmon, O. nerka), 왕연어(chinook salmon, O. tshawytscha), 시마연어(cherry salmon, O. masou masou), 산천어(ishikawae salmon, O. masou ishikawae), 무지개송어(rainbow trout, O. mykiss), cutthroat 송어(O. clarkii) 및 대서양연어(atlantic salmon, Salmo salar)와 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 이와 유사하게 상기 서열번호 17의 경우에 연어(chum salmon, O. keta) 외 모든 종의 DNA 서열과 특이적으로 결합한다는 것은 표 3에 나타나 있는 분석 가능한 연어 종 중에서 연어(chum salmon, O. keta)를 제외한 모든 연어 종, 즉 곱사연어(pink salmon, O. gorbuscha), 홍연어(sockeye salmon, O. nerka), 왕연어(chinook salmon, O. tshawytscha), 은연어(coho salmon, O. kisutch), 시마연어(cherry salmon, O. masou masou), 산천어(ishikawae salmon, O. masou ishikawae), 무지개송어(rainbow trout, O. mykiss), cutthroat 송어(O. clarkii) 및 대서양연어(atlantic salmon, Salmo salar)와 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 프로브가 연어로부터 추출된 대상 DNA 또는 상기 추출된 DNA를 증폭시킨 PCR 산물과 결합하는데 있어서, 상기 결합이 연어 종 또는 계군에 따라 다르게 이루어진다는 것의 다른 의미는 상기한 여러가지 연어 종 중에서 연어(chum salmon, O. keta) 종의 계군을 판별하기 위한 것이다. 즉, 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 프로브가 미국 계군(C1형)에 속하는 연어(chum salmon)의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 291-314번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 19의 경우는 한국과 일본 계군(A1형)의 523-544번째 DNA 서열, 서열번호 20의 경우는 한국계군(D2형)의 296-318번째 DNA 서열, 서열번호 21의 경우는 캐나다, 알래스카 및 러시아 계군(B1형)과 미국 계군(C1형), 한국과 일본 계군(D1형), 한국 계군(D2형)의 524-543번째 DNA 서열, 서열번호 22의 경우는 한국과 일본 계군(A1형), 한국과 일본 계군(D1형), 한국 계군(D2형)의 581-604번째 DNA 서열, 서열번호 23의 경우는 캐나다, 알래스카 및 러시아 계군(B1형)과 미국 계군(C1형)의 581-604번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 것도 가능하다.

본 발명은 이와 같이 다양한 연어 종에 있어서, 단일염기다형성 부위를 가지는 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열을 이용한 것으로써, 상기 DNA 서열과 동일하거나 이에 상보적으로(complementary) 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 우리가 알고자 하는 연어의 DNA 추출물(정확히는 PCR 산물)과 결합시키는 것이 특징이다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 연어 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되어, 의도한 연어 종이나 계군의 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 연어 종이나 계군에는 결합하지 않는 것을 특징으로 하기 때문에, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계는 적어도 1회 이상 수행되는 것이 바람직하다. 그 중에서도 상기 결합을 확인하는 단계 이전에 추출된 DNA와 본 발명에 따른 프로브의 결합을 반복적으로 수행한다면, 상기 결합 과정을 더욱 확실히 하여 프로브와 대상 DNA 산물의 결합을 더욱 견고히 할 수 있다. 또한, 상기 결합을 확 인하는 단계 이후에 추출된 DNA와 본 발명에 따른 프로브의 결합을 반복적으로 수행하면 다양한 프로브를 이용하여 중접적으로 판별 결과 예측 할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계는 적어도 1회 이상 많게는 수차례(특히 3~4회) 반복적으로 수행되는 것도 바람직하다.

본 발명의 다른 특징은 연어(salmon)의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계를 거치고, 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머로 사용하거나, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

즉, 연어에서 추출한 DNA를 증폭시키는데 있어서, 특정한 프라이머를 사용하는 것이다. 이 특정한 프라이머는 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열에 부합하는 것으로써, 상기 추출한 DNA를 더욱 우수하게 증폭시킬 수 있다. 이를 위해 연어의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 추출된 DNA는 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 추출된 DNA를 PCR로 증폭시키기 위해 사용된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 하기의 표 5에 나타난 바와 같다.

[표 5: 연어 종 판별을 위한 프라이머]

연어 종 판별을 위한 프라이머 염기 서열
프라이머		염기서열	염기서열위치
연 어	(서열번호 1)	5‘-tga tat tga cac ttt gta gac gt -3’	136-158
	(서열번호 2)	5‘-tga tac tga cac ttt gta gac gt -3’	136-158
	(서열번호 3)	5‘-aag ggt ctt gtt ttg gac t -3’	649-629
	(서열번호 4)	5‘-aag ggt ctt att ttg gac t -3’	649-629

상기한 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PCR 과정에서 사용되는 프라이머 또한, 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열에 최적으로 적합하도록 형성된 것이다. 이것은 다양한 연어 종이나 계군에 상관없이 가장 공통된 염기서열을 기초로 하여 제작된 것이다. 본 발명자들은 도 2 내지 도 6에 나타난 다양한 연어 종의 DNA 서열과 SNP를 조사, 분석한 뒤에, 상기한 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 염기서열을 사용할때, PCR 산물을 가장 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.

구체적으로는, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머로 사용하여, 도 2에 나타난 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 136-158번 위치에 결합시킨다. 역방향 프라이머로는 서열번호 3 또는 서열 번호 4의 DNA 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드나 상기 DNA 서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 도 6에 나타난 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 649-629번 위치에 결합시키는 것이다. 그러면, 다양한 연어 종이나 계군에 상관없이 연어 미토콘드리아 DNA 추출물은 PCR 방법에 의해 빠짐없이 증폭될 것이고, 이에 따라 증폭된 PCR 산물의 개수도 현저히 증가시킬 수 있는 효과가 있다.

이와 더불어, 본 발명은 PCR 산물과 본 발명에 따른 프로브를 결합시킨 뒤에 행해지는 교잡화 반응 확인을 위해, 상기 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머에는 로다민(rhodamine), cy3, cy5 또는 바이오틴이 부착되어 있고, 상기 결합 여부를 확인하는 것은 상기 로다민, cy3, cy5 또는 바이오틴에 의해 발현되는 형광을 감지하여 결합 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군의 판별 방법도 가능하다. 구체적으로, 상기의 확인 단계는 로다민, CY3, CY5를 이용하거나 바이오틴과 결합하는 Syreptavidin-Cyanine을 이용하고, 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 결과를 분석함으로서 유전자형 판정을 편리하게 진행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상술한 바와 같은 연어 종 또는 계군의 판별 방법에 사용되는 것으로써, 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 연속된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브이다. 나아가, 본 발명은 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 연속된 염기서열로 이루어진 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 DNA 칩일 수 있다. 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 글라스 위의 기질에 고정화 되어 있는 형태가 바람직하다.

본 발명에서는 DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 하나의 슬라이드 위에서 다수의 연어 종 판별을 동시에 수행할 수 있다. 연어 종을 판별 할 수 있는 20여개의 프로브를 화학 작용기가 처리된 하나의 글라스 슬라이드위에 다수의 구역을 설정하여 집적시켰으며, 대칭 또는 비대칭 PCR법을 이용하여 얻어진 형광물질 표지를 가지고 표적 유전자 서열의 교잡화 반응을 확인함으로써 정확한 연어 종을 구분할 수 있는 것이다.

이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 상술한 바와 같이 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 연속된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하여, 연어 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 연어 종이나 계군의 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 연어 종이나 계군에는 결합하지 않는 것이 특징이다. 이에 따라, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나와 동일하거나 이에 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 연어의 종 또는 계군을 판별할 수 있는 것이다.

이와 더불어, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위한 다른 실시형태는 상술한 바와 같은 연어 종 또는 계군의 판별 방법에 사용되는 연어 종 또는 계군 판별용 키트일 수 있다.

즉, 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 연속된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브와; 상기 연어 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머;를 포함하는 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군 판별용 키트일 수 있고, 이 경우 상기 프라이머는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머이거나 서열번호 3 또는 서열번호 4의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머인 것이 바람직하다.

이러한 연어 종 또는 계군 판별용 키트는 상기한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용 하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 계군 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로써, 염기서열을 분석하지 않고도 연어의 유전자형과 그 계군을 신속히 판정할 수 있는 효용성을 가지고 있다. 또한, 다수의 연어 어종을 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 연어 유전자형과 계군방법을 표준화, 자동화할 수 있도록 기술 개발의 적용성을 극대화 시켰다. 즉, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 데 걸리는 시간을 크게 단축시켰으며, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 처리할 수 있는 효과가 있다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 연어 종 판별을 위한 프라이머의 합성 및 염기서열

먼저, 연어로부터 추출한 DNA를 증폭시키키 위한 프라이머를 합성하였다. 본 발명에 있어서, 대칭 또는 비대칭 PCR에 사용한 프라이머는 상기한 표 5에 나타난 것과 같다.

대칭 또는 비대칭 PCR에 사용하는 역방향(앤티센스) 프라이머는 교잡화 반응 후에 형광을 확인하기 위하여, 말단에 로다민, cy3, cy5를 부착시켜서 제작하거나 바이 오틴을 부착시켰고, 교잡화 반응 후 Syreptavidin-Cyanine과 결합하도록 제작하여 사용하였다. 본 발명에서 사용한 프라이머는 독일의 Metabion사에 의뢰하여 합성하였다.

실시예 2 : 연어 DNA 추출과 대칭 또는 비대칭 PCR 반응

1) 연어 DNA는 Qiagen 사의 DNeasy tissue kit를 사용하여 추출하였다.

2) 하기의 표 6과 같은 조건의 방법으로 대칭 PCR 반응을 DNA Engine(MJ Research사, 미국)에서 시행하였다.

3) 하기의 표 7과 같은 조건의 방법으로 비대칭 PCR 반응을 DNA Engine(MJ Research사, 미국)에서 시행하였다.

4) PCR이 끝난 후, PCR 산물 5ul에 젤 로딩 버퍼(0.2% orange G, 0.25% xylene cyanol FF, 60% glycerol) 1ul를 넣고 1ug/ml ethidium bromide가 함유된 2% 아가로스 젤에서 전기영동 한 후 UV transilluminator가 부착된 Image analyzer (HITACHI, 일본)에서 PCR 밴드를 확인하였다(도 7 참조). 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 PCR 방법에 의해 증폭된 PCR 산물의 전기영동사진이다.

[표 6: 연어 대칭 PCR 반응 조건]

연어 대칭 PCR 반응 조건
반응 조성물 조건		반응 온도 조건
10X buffer	2.0ul	95도, 5.0분	1회
2.5mM dNTP mix	1.0ul	95도, 5.0분	1회
10pmol 정방향(센스)프라이머	1.0ul	94도, 15초 53도, 45초 72도, 30초	35회
10pmol 역방향(앤티센스)프라이머	1.0ul
5U Taq	0.2ul
추출된 DNA	1.0ul
멸균 증류수	13.8ul	72도, 5.0분	1회
합 계	20.0ul	72도, 5.0분	1회

[표 7: 연어 비대칭 PCR 반응 조건]

연어 비대칭 PCR 반응 조건
반응 조성물 조건		반응 온도 조건
10X buffer	2.0ul	95도, 5.0분	1회
2.5mM dNTP mix	1.0ul	95도, 5.0분	1회
10pmol 정방향(센스)프라이머	1.0ul	94도, 15초 53도, 45초 72도, 30초	35회
10pmol 역방향(앤티센스)프라이머	1.0ul
5U Taq	0.2ul
추출된 DNA	1.0ul
멸균 증류수	13.8ul	72도, 5.0분	1회
합 계	20.0ul	72도, 5.0분	1회

실시예 3 : 연어 종 판별 DNA칩 제작을 위한 프로브 합성 및 염기서열

본 발명에 따른 프로브를 DNA칩으로 제작하기 위해 고정화 시키는 것이다. 먼저, 알데히드 작용기가 처리되어 있는 글라스 위에 본 발명에 따른 프로브를 공유결합을 시키기 위하여 선택된 프로브의 5‘ 말단에 마이노 링크를 수식하고, 교잡화 반응시 글라스 슬라이드 위에 집적되어 있는 프로브간의 공간적인 방해를 최소화 시키기 위하여 10-20개의 올리고(dT)를 부착한 다음, 상기한 표 1, 표 2에 나타난 바와 같은 염기서열(DNA 서열과 상보적인 서열)을 부가하여 합성하였다. 합성은 독일의 Metabion사에 의뢰하여 실시하였다. 이때 만들어진 프로브의 염기서열은 상기한 표 3에 나타낸 것 같이 총 10종의 서로 다른 연어과 어류의 유전자 형과 표 4에 나타낸 것과 같이 총 5가지의 연어 계군 유전자형으로 구분하였다.

실시예 4 : 연어 종 판별 칩의 제작

1) 올리고뉴크레오티드 칩을 제작하기 위해 CSS-100 Silylated Slides(cell associate사, 미국) 상에 50pmole의 농도로 아미노 링크가 수식되어 있는 프로브와 동일한 양의 3X SSC를 잘 혼합하여 집적하였고, 이를 16시간 동안 실온에서 반응 시킨다. 반응이 완료된 슬라이드를 0.2% SDS로 5분간 2회 세척한 후, 증류수로 5분간 2회 세척하였다.

2) 소디움 보로하이드리드(1.3g NaBH₄ 375ml PBS, 125ml 100% EtOH)에 슬라이드를 5분간 반응시킨 후 끓는 증류수에서 3분간 반응 시킨 후, 진공 원심분리기에서 800rpm의 속도로 10분간 건조하였다.

3) 한 장의 슬라이드에서 다수의 시료 반응을 위해서 perfusion chamber(BioGrace, 미국)로 분리한 후 실험 전까지 실온의 암소에서 보관하였다.

이렇게 제작된 DNA 칩을 도 8에 예시적으로 나타내었다. 도 8은 상기 도 2내지 도 6에 나타난 단염기다형성에 근거하여 제작된 올리고뉴크레오티드 프로브를 포함하는 DNA칩의 구조를 도식화한 모식도이다.

실시예 5 : 교잡화 반응

1) 로다민, cy3, cy5 또는 바이오틴으로 결합된 PCR 산물을 교잡화 용액(3X SSC, 0.25% SDS)과 1:9의 비율로 혼합하였다. 형광반응을 일으키기 위하여 바이오틴을 사용한 경우 Syreptavidin-Cyanine을 1ug/ml 농도로 첨가하여 반응시켰다.

2) 준비된 교잡화 용액을 chmaber에 도포하여 60도에서 1시간 동안 반응시켰다.

3) 1X SSC, 0.1%SDS에서 5분동안 일차 세척 후 0.1X SSC에서 3분간 이차 세척을 실시 하였다.

4) 세척된 슬라이드는 원심분리기에서 800rpm의 속도로 10분간 건조하였다.

5) 실험 결과의 확인은 LuxScan-10K/A (CapitalBio, 중국) 스캐너를 사용하여 형광값을 측정하여 유전자형을 분석하였고, 그 결과는 도 9a 내지 도 9f에 나타내었다.

도 9a 내지 도 9f는 상기 도 8의 DNA칩을 이용하여 본 발명에 따른 올리고뉴크레오티드 프로브와 다양한 연어의 PCR 증폭산물을 결합시킨 후의 반응 결과를 나타내는 사진이며, 여기서 도 9a는 연어(chum), 도 9b는 곱사연어, 도 9c는 무지개송어, 도 9d는 시마연어, 도 9e는 산천어, 도 9f는 대서양연어에 대한 결과이다. 여기에 도시된 것과 같이, 본 발명에 의하는 경우 연어 종이나 계군에 따라 형광 표지가 다르게 나타나므로, 이에 따라 연어 종 또는 계군을 판별할 수 있음을 확인하였다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진에게 명백한 것이다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따르면, 연어(salmon)의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물과 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계; 및 상기 결합 여부를 확인해서 연어가 속하는 종이나 계군을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 연어 종 또는 계군의 판별 방법을 제공할 수 있다.

이러한 본 발명에 의하는 경우, 하나의 슬라이드 위에서 다수의 연어 종 또는 계군에 대한 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 검사할 수 있는 효과가 있다. 본 발명에 따라 연어 미토콘드리아 DNA COIII-ND3-ND4L 지역을 유전자 표지로 사용하면, 종래에 연어 유전자형과 소속 계군을 판별하는 지금까지의 방법이 가졌던 낮은 분해능의 문제점을 해결 할 수 있다. 종래와 같이, 미토콘드리아 DNA 조절부위(control region)를 유전자 표지로 이용하는 것보다 본 발명에 따라 단염기다형성이 더 많은 것으로 확인된 COIII-ND3-ND4L 지역을 분석의 척도로 이용하면, 종래기술보다 한 단계 진보된 형태의 유전자 분석법을 제공하여, 더욱 효과적으로 유전자형을 판별할 수 있고, 분해능도 현저히 증가시킬 수 있다.

본 발명자들은 다양한 연어 종의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 하여 연어 각 종 마다 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작할 수 있게 되었다. 이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 연어 각 종의 단염기다형성(SNP) 부위를 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 연어 종이나 계군의 DNA와는 결합하지만 이외에 다른 연어 종이나 계군에는 결합하지 않는 것이 특징이다.

본 발명자들은 수많은 연구와 노력끝에, 연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자에서 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나에 해당하는 DNA 서열이 각 연어 종이나 계군을 구별하기에 최적으로 적합하다는 것을 확인하였고, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 연어의 종 또는 게군을 판별할 수 있음을 알 수 있었다.

그리고, 본 발명에 따라 상기한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 계군 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로써, 염기서열을 분석하지 않고도 연어의 유전자형과 그 계군을 신속히 판정할 수 있는 적용성을 갖고 있다. 또한, 다수의 연어 어종을 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 연어 유전자형과 계군방법을 표준화, 자동화할 수 있도록 기술 개발의 적용성을 극대화 시켰다. 즉, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 데 걸리는 시간을 크게 단축시켰으며, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 처리할 수 있는 효과가 있다.

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연어(salmon)의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계;

상기 추출한 DNA에 대해, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계;

상기 PCR 산물과 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 24 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계;

상기 결합 여부를 확인해서 연어가 속하는 종이나 계군을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 연어 종 또는 계군의 판별 방법에 있어서,

상기 결합은 연어 종 또는 계군에 따라 다르게 이루어지는 것으로, 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 프로브는 연어(chum salmon, O. keta) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 364-386번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 6의 경우는 곱사연어(pink salmon, O. gorbuscha) 종의 402-422번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 홍연어(sockeye salmon, O. nerka) 종의 208-233번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 왕연어(chinook salmon, O. tshawytscha) 종의 395-416번째 DNA 서열, 서열번호 9의 경우는 시마연어(cherry salmon, O. masou masou) 종의 402-418번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 시마연어(cherry salmon, O. masou masou) 종의 517-534번째 DNA 서열, 서열번호 11의 경우는 산천어(ishikawae salmon, O. masou ishikawae) 종의 551-568번째 DNA 서열, 서열번호 12의 경우는 무지개송어(rainbow trout, O. mykiss) 종의 399-420번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 cutthroat 송어(O. clarkii) 종의 396-415번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 대서양연어(atlantic salmon, Salmo salar) 종의 351-369번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 은연어(coho salmon, O. kisutch) 종의 211-231째 DNA 서열, 서열번호 24의 경우는 왕연어 종의 367-383번째 DNA 서열, 서열번호 25의 경우는 은연어 종의 301-320번째 DNA 서열, 서열번호 26의 경우는 홍연어 종의 280-300번째 DNA 서열, 서열번호 27의 경우는 홍연어 종의 571-593번째 DNA 서열, 서열번호 28의 경우는 시마연어 종의 548-571번째 DNA 서열, 서열번호 29의 경우는 산천어 종의 548-571번째 DNA 서열, 서열번호 30의 경우는 대서양연어 종의 591-611번째 DNA 서열, 서열번호 31의 경우는 곱사연어 종의 491-510번째 DNA 서열, 서열번호 32의 경우는 은연어 종의 531-550번째 DNA 서열, 서열번호 33의 경우는 시마연어와 산천어 종의 531-550번째 DNA 서열, 서열번호 34의 경우는 무지개송어 종의 511-530번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군의 판별 방법.
연어(salmon)의 혈액, 세포 또는 조직으로부터 DNA를 추출하는 단계;

상기 추출한 DNA에 대해, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계;

상기 PCR 산물과 서열번호 18 내지 서열번호 23 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 프로브를 결합시키는 단계;

상기 결합 여부를 확인해서 연어가 속하는 종이나 계군을 판별하는 단계;를 포함하여 이루어지는 연어 종 또는 계군의 판별 방법에 있어서,

상기 결합은 연어 종 또는 계군에 따라 다르게 이루어지는 것으로, 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 프로브는 미국 계군(C1형)에 속하는 연어(chum salmon)의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 291-314번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 19의 경우는 한국과 일본 계군(A1형)의 523-544번째 DNA 서열, 서열번호 20의 경우는 한국계군(D2형)의 296-318번째 DNA 서열, 서열번호 21의 경우는 캐나다, 알래스카 및 러시아 계군(B1형)과 미국 계군(C1형), 한국과 일본 계군(D1형), 한국 계군(D2형)의 524-543번째 DNA 서열, 서열번호 22의 경우는 한국과 일본 계군(A1형), 한국과 일본 계군(D1형), 한국 계군(D2형)의 581-604번째 DNA 서열, 서열번호 23의 경우는 캐나다, 알래스카 및 러시아 계군(B1형)과 미국 계군(C1형)의 581-604번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군의 판별 방법.
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제5항 또는 제6항에 따른 연어 종 또는 계군의 판별 방법에 사용되는 것으로써, 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 연속된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브.
연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 연속된 염기서열로 이루어진 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하며,

상기 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 프로브는 연어(chum salmon, O. keta) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 364-386번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 6의 경우는 곱사연어(pink salmon, O. gorbuscha) 종의 402-422번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 홍연어(sockeye salmon, O. nerka) 종의 208-233번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 왕연어(chinook salmon, O. tshawytscha) 종의 395-416번째 DNA 서열, 서열번호 9의 경우는 시마연어(cherry salmon, O. masou masou) 종의 402-418번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 시마연어(cherry salmon, O. masou masou) 종의 517-534번째 DNA 서열, 서열번호 11의 경우는 산천어(ishikawae salmon, O. masou ishikawae) 종의 551-568번째 DNA 서열, 서열번호 12의 경우는 무지개송어(rainbow trout, O. mykiss) 종의 399-420번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 cutthroat 송어(O. clarkii) 종의 396-415번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 대서양연어(atlantic salmon, Salmo salar) 종의 351-369번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 은연어(coho salmon, O. kisutch) 종의 211-231째 DNA 서열, 서열번호 24의 경우는 왕연어 종의 367-383번째 DNA 서열, 서열번호 25의 경우는 은연어 종의 301-320번째 DNA 서열, 서열번호 26의 경우는 홍연어 종의 280-300번째 DNA 서열, 서열번호 27의 경우는 홍연어 종의 571-593번째 DNA 서열, 서열번호 28의 경우는 시마연어 종의 548-571번째 DNA 서열, 서열번호 29의 경우는 산천어 종의 548-571번째 DNA 서열, 서열번호 30의 경우는 대서양연어 종의 591-611번째 DNA 서열, 서열번호 31의 경우는 곱사연어 종의 491-510번째 DNA 서열, 서열번호 32의 경우는 은연어 종의 531-550번째 DNA 서열, 서열번호 33의 경우는 시마연어와 산천어 종의 531-550번째 DNA 서열, 서열번호 34의 경우는 무지개송어 종의 511-530번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고,

상기 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 프로브는 미국 계군(C1형)에 속하는 연어(chum salmon)의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 291-314번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 19의 경우는 한국과 일본 계군(A1형)의 523-544번째 DNA 서열, 서열번호 20의 경우는 한국계군(D2형)의 296-318번째 DNA 서열, 서열번호 21의 경우는 캐나다, 알래스카 및 러시아 계군(B1형)과 미국 계군(C1형), 한국과 일본 계군(D1형), 한국 계군(D2형)의 524-543번째 DNA 서열, 서열번호 22의 경우는 한국과 일본 계군(A1형), 한국과 일본 계군(D1형), 한국 계군(D2형)의 581-604번째 DNA 서열, 서열번호 23의 경우는 캐나다, 알래스카 및 러시아 계군(B1형)과 미국 계군(C1형)의 581-604번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군 판별용 DNA 칩.
연어 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자의 단염기다형성(SNP) 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 5 내지 서열번호 15 및 서열번호 18 내지 서열번호 34 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 연속된 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브와;

상기 연어 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 것으로 서열번호 1 또는 서열번호 2의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하며,

상기 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 프로브는 연어(chum salmon, O. keta) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 364-386번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 6의 경우는 곱사연어(pink salmon, O. gorbuscha) 종의 402-422번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 홍연어(sockeye salmon, O. nerka) 종의 208-233번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 왕연어(chinook salmon, O. tshawytscha) 종의 395-416번째 DNA 서열, 서열번호 9의 경우는 시마연어(cherry salmon, O. masou masou) 종의 402-418번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 시마연어(cherry salmon, O. masou masou) 종의 517-534번째 DNA 서열, 서열번호 11의 경우는 산천어(ishikawae salmon, O. masou ishikawae) 종의 551-568번째 DNA 서열, 서열번호 12의 경우는 무지개송어(rainbow trout, O. mykiss) 종의 399-420번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 cutthroat 송어(O. clarkii) 종의 396-415번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 대서양연어(atlantic salmon, Salmo salar) 종의 351-369번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 은연어(coho salmon, O. kisutch) 종의 211-231째 DNA 서열, 서열번호 24의 경우는 왕연어 종의 367-383번째 DNA 서열, 서열번호 25의 경우는 은연어 종의 301-320번째 DNA 서열, 서열번호 26의 경우는 홍연어 종의 280-300번째 DNA 서열, 서열번호 27의 경우는 홍연어 종의 571-593번째 DNA 서열, 서열번호 28의 경우는 시마연어 종의 548-571번째 DNA 서열, 서열번호 29의 경우는 산천어 종의 548-571번째 DNA 서열, 서열번호 30의 경우는 대서양연어 종의 591-611번째 DNA 서열, 서열번호 31의 경우는 곱사연어 종의 491-510번째 DNA 서열, 서열번호 32의 경우는 은연어 종의 531-550번째 DNA 서열, 서열번호 33의 경우는 시마연어와 산천어 종의 531-550번째 DNA 서열, 서열번호 34의 경우는 무지개송어 종의 511-530번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고,

상기 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 프로브는 미국 계군(C1형)에 속하는 연어(chum salmon)의 미토콘드리아 DNA 중 COIII-ND3-ND4L 유전자 부위의 291-314번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 19의 경우는 한국과 일본 계군(A1형)의 523-544번째 DNA 서열, 서열번호 20의 경우는 한국계군(D2형)의 296-318번째 DNA 서열, 서열번호 21의 경우는 캐나다, 알래스카 및 러시아 계군(B1형)과 미국 계군(C1형), 한국과 일본 계군(D1형), 한국 계군(D2형)의 524-543번째 DNA 서열, 서열번호 22의 경우는 한국과 일본 계군(A1형), 한국과 일본 계군(D1형), 한국 계군(D2형)의 581-604번째 DNA 서열, 서열번호 23의 경우는 캐나다, 알래스카 및 러시아 계군(B1형)과 미국 계군(C1형)의 581-604번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 연어 종 또는 계군 판별용 키트.
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