CN102876779B - 一种dhfr的c829t单核苷酸多态性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其特征在于：PCR试剂包括特异性扩增引物SEQNO.1、SEQNO.2，其序列为：SEQNO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC；SEQNO.2：Biotin-AATGTCAAGGACTGGCAAGAG；测序试剂包括特异性测序引物SEQNO.3，其序列为：SEQNO.3：AGTCCCCAGCACCTG。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，采用基因测序技术，可以对DHFR（C829T）多态性位点进行检测。
背景技术
骨髓抑制限制了多种化疗药物的应用，使之难以达到治愈或抑制肿瘤生长的效果，而一些耐药基因是产生骨髓抑制的分子基础，如二氢叶酸还原酶基因 (dihydrofolate reductase，DHFR)。
DHFR是细胞内叶酸代谢的关键酶，分子量为22KD。在还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的参与下，DHFR能催化叶酸变成二氢叶酸，而后者为合成胸嘧啶核苷及嘌呤核苷输送了碳元素，因此DHFR是DNA、RNA及蛋白质等物质合成的其中一种关键酶。此外，DHFR也是抗代谢类抗肿瘤药物氨甲嘌呤（MTX）的靶酶。MTX是一种叶酸类似物，在临床上常用来治疗乳腺癌、急性白血病、淋巴瘤等多种肿瘤。其作用原理是通过竞争性与DHFR的活性位点紧密结合而使其失活，从而导致细胞中四氢叶酸含量下降，细胞DNA合成异常，造成细胞死亡。但是在治疗过程中一些肿瘤细胞很快对其产生耐药性，骨髓抑制的毒副作用也较严重、限制了其疗效。
DHFR基因的SNP是导致肿瘤细胞对MTX产生耐药的一种因素。虽然MTX 可以竞争性地抑制DHFR，但是当MTX和DHFR亲和力下降时，MTX抑制该酶的作用就会明显下降。诸多研究表明在一些耐药细胞中，由于DHFR基因中第829号核苷酸会发生T代替C的突变，即产生CC型（野生纯合型）、CT型（杂合型）、TT 型（突变纯合型）三种基因型，而后两者导致了DHFR蛋白质结构的改变，进而影响DHFR与MTX结合的空间结构，最终引起DHFR和MTX亲和力的下降，提高了细胞的抗药性。吴瑞琼等将含突变mDHFR的逆转录病毒上清转染脐血 CD34+细胞之后进行细胞抗MTX分析，结果发现转导mDHFR耐药基因的脐血干细胞集落形成数明显高于对照组，同时对MTX的抗性提高了约2倍。另有资 料显示将转导有人的突变mDHFR基因的小鼠骨髓移植到荷瘤小鼠后，再使用大剂量MTX治疗，结果表明转导有突变mDHFR基因的小鼠骨髓能耐受大剂量化 疗的冲击治疗，并使44％的小鼠肿瘤完全消退，而对照组小鼠全部死亡。终上所述，正是由于DHFR中一个氨基酸的改变从而使细胞具有对MTX的耐受性。
因此，检测肿瘤患者中DHFR（C829T）的基因型，有助于临床医生制定更具针对性的个体治疗方案，获得较佳效果的同时也减轻患者的经济与身体负担。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，可用于检测DHFR(C829T)位点是否发生突变。
一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其特征在于：
PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NO.1、SEQ NO .2，其序列为：
SEQ NO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，
SEQ NO.2：Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG；
测序试剂包括特异性测序引物SEQ NO.3，其序列为：
SEQ NO.3：AGTCCCCAGCACCTG。
进一步地，所述PCR试剂包括2*PCR Buffer、10mM dNTP、5U/ul Taq 酶、特异性扩增引物SEQ NO.1和SEQ NO .2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70%（V/V）乙醇、变性液、1×Wash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。
所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
（1）提取样本中的DNA
（2）以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物（SEQ NO.1、SEQ NO.2）进行PCR扩增；
（3）将步骤（2）所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化；
（4）将步骤（3）得到的单链纯化产物进行测序；
（5）结果分析。
进一步地，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃ 2min预变性；98℃ 10s、58℃ 30s、68℃ 30s，40个循环；68℃ 5min。
步骤(3) 单链纯化的具体步骤为：将得到的50ul PCR产物与3ul 链亲和素包被的磁珠及47ul 结合缓冲液混合，室温孵育10~15min，期间震荡2~3次，然后使用Vaccuum prep tool 吸取磁珠，将带有磁珠的Vaccuum prep tool先后放进70%（V/V）乙醇、变性液、1×Wash Buffer中清洗10s左右，再将Vaccuum prep tool放入含有49ul 退火缓冲液及1ul 测序引物（SEQ NO3）的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80℃ 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。
步骤（5）结果分析的具体方法是将测序结果与标准序列对比，得到DHFR（C829T）位点的碱基类型。DHFR部分标准序列为：ACTCTTGTCTCTATCAGATA CCATTTATGAGACATTCTTGCTATAACTAAGTGCTTCTCCAAGACCCCAACTGAGTCCCCAGCACCTGCTA C AGTGAGCTGCCATTCCACACCCATCACATGTGGCACTCTTGCCAGTCCTTGACATTGTCGGGCTTTTCACATGTTGGTAATATTTAT。其中下划线部分为829位点。
本发明的有益效果：目前，对于检测DHFR（C829T）多态性的最可靠的方法就是进行测序，而本发明通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性。该方法不但保证了一定的准确性及灵敏度，同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
附图说明
图1是样本A测序图。测序结果为：CTA C AGTGAG，该样本是CC型（野生型），图中红框部分是样本A基因型的判断区。
图2是样本B测序图。测序结果为：CTA C(T) AGTGAG，该样本是CT型（杂合型），图中红框部分是样本B基因型的判断区。
图3是样本C测序图。测序结果为：CTA T AGTGAG，该样本是TT型（突变纯合型），图中红框部分是样本C基因型的判断区。
图4~6分别是样本A、B、C的sanger测序图谱。目的是为验证图1~3的结果，最终发现两种测序检测结果一致。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其中：
(i) PCR扩增试剂：2*PCR Buffer、10mM dNTP、5U/ul Taq 酶、扩增引物（SEQ NO.1、SEQ NO. 2）及灭菌水；SEQ NO1、SEQ NO 2的序列为：
SEQ NO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，
SEQ NO.2：Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG；
(ii) 单链纯化试剂：链亲和素bead、70%（V/V）乙醇、变性液、1×Wash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；
(iii) 测序试剂：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP（dNTP即dATP、dTTP、dCTP、dGTP）及测序引物（SEQ NO.3）。SEQ NO.3序列为：AGTCCCCAGCACCTG。
上述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
（1）提取样本中的DNA
（2）以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物（SEQ NO.1、SEQ NO. 2）进行PCR扩增；
（3）将步骤（2）所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化；
（4）将步骤（3）得到的单链纯化产物进行测序；
（5）结果分析。
通过几百例临床受检样本用本试剂盒中的引物（SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3）进行实时荧光定量PCR，发现其具有较高的扩增稳定性、特异性、灵敏度；同时使用Sanger测序法对相同的受检样本进行测序，结果两类方法的检测结果完全一致，说明本试剂盒具有极高的检测准确性。
实施例2：
本发明试剂盒的具体使用方法：
1、DNA提取
1) 抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5 分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟（若离心机最高转速不允许，可3000rpm离心5min），吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2) 加入20 μl 蛋白酶K 溶液，混匀后加入200 μl 缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
3) 加人200 μl 无水乙醇，充分振荡混匀15 秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3 中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (13,400×g)离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放回收集管中。
5) 向吸附柱CB3 中加入500 μl 缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (13,400×g)离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中。
6) 向吸附柱CB3 中加入700 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (13,400×g)离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中。
7) 向吸附柱CB3 中加入500 μl 漂洗液PW，12,000 rpm (13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
8) 将吸附柱CB3 放回收集管中，12,000 rpm(13,400×g)离心2 分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
9) 将吸附柱CB3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 分钟，12,000 rpm (13,400×g)离心2 分钟，将溶液收集到离心管中。
2、PCR扩增
一例样本的总PCR体系为50ul：2*PCR Buffer 25ul、10mM dNTP 10ul、引物SEQ NO.1和SEQ NO.2各1.75ul、5U/ul Taq 酶 1ul、灭菌水9ul、DNA模板2.5ul。
PCR反应程序：94℃ 2min预变性；98℃ 10s，58℃ 30s，68℃ 30s，38个循环；68℃ 5min。
3、单链纯化
将得到的50ul PCR产物与3ul 链亲和素磁珠（bead）及47ul 结合缓冲液混合，室温孵育10~15min，期间震荡2~3次，以免bead下沉。然后使用Vaccuum prep workstation 中的Vaccuum prep tool 吸取bead，将带有bead的Vaccuum prep tool先后放进70%（V/V）乙醇、变性液（Denaturation Solution）、1×Wash Buffer中清洗10s左右，再将Vaccuum prep tool放入含有49ul 退火缓冲液及1ul 测序引物（SEQ NO3）的96孔板中，释放bead，将该96孔板放置于80℃ 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。
4、结果分析。
具体方法为：测序结果与标准序列对比，得到DHFR（C829T）位点的碱基类型。DHFR部分标准序列为：ACTCTTGTCTCTATCAGATACCATTTATGAGACATTCTT GCTATAACTAAGTGCTTCTCCAAGACCCCAACTGAGTCCCCAGCACCTGCTA C AGTGAGCTGCCATTCCACACCCATCACATGTGGCACTCTTGCCAGTCCTTGACATTGTCGGGCTTTTCACATGTTGGTAATATTTAT。其中下划线部分为829位点。
实施例3
临床样品检测
取待检的临床样品A、B、C,按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
PCR产物纯化后进行测序，将所得序列与标准序列比对，判断结果。
样品A的测序结果图如图1所示，测序结果为：CTA C AGTGAG，该样本是CC型（野生型），图中红框部分是样本A基因型的判断区。
样品B的测序结果图如图2所示，测序结果为：CTA C(T) AGTGAG，该样本是CT型（杂合型），图中红框部分是样本B基因型的判断区。
样品C的测序结果图如图3所示，测序结果为：CTA T AGTGAG，该样本是TT型（突变纯合型），图中红框部分是样本C基因型的判断区。
图4~6分别是样本A、B、C的sanger测序图谱。目的是为验证图1~3的结果，最终发现两种测序检测结果一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actaagtgct tctccaagac c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aatgtcaagg actggcaaga g 21
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agtccccagc acctg 15
<210> 4
<211> 179
<212> DNA
<213> DHFR（C829T）
<400> 4
actcttgtct ctatcagata ccatttatga gacattcttg ctataactaa gtgcttctcc 60
aagaccccaa ctgagtcccc agcacctgct acagtgagct gccattccac acccatcaca 120
tgtggcactc ttgccagtcc ttgacattgt cgggcttttc acatgttggt aatatttat 179
Claims (2)
1.一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其特征在于：
PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NO.1、SEQ NO .2，其序列为：
SEQ NO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，
SEQ NO.2：Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG；
测序试剂包括特异性测序引物SEQ NO.3，其序列为：
SEQ NO.3：AGTCCCCAGCACCTG。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂包括2*PCR Buffer、10mM dNTP、5U/μl Taq 酶、特异性扩增引物SEQ NO.1和SEQ NO .2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70%V/V乙醇、变性液、1×Wash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。
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