CN107345243A - 检测白血病二氢叶酸还原酶融合基因的方法、引物及试剂盒 - Google Patents

检测白血病二氢叶酸还原酶融合基因的方法、引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了引物对和探针组合，本发明还提供了所述的引物对和探针组合在筛选治疗白血病的药物中的应用；本发明同时还提供了含有该引物对和探针组合的试剂盒及应用，以及基于引物对和探针组合或试剂盒的筛选治疗白血病的药物的方法和系统。经实验证明，本发明的引物对和探针组合特异性好、灵敏度高、检测效率高，且基于该引物对和探针组合建立的二氢叶酸还原酶融合基因和GAPDH内参基因的双重荧光PCR方法重复性好、高通量、灵敏、准确和快速，为白血病的用药筛选及预后判定提供了更有效的方法。

Description

检测白血病二氢叶酸还原酶融合基因的方法、引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测白血病二氢叶酸还原酶融合 基因的方法、引物及试剂盒。
背景技术
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，由于克隆的白血病细胞在 骨髓和其它造血组织中大量增殖累积，使正常造血功能受到抑制，同时浸 润其它组织和器官。白血病主要表现有白血病细胞的增生与浸润。非特异 性病变则为出血及组织营养不良和坏死、继发感染等。白血病细胞的增生 和浸润主要发生在骨髓及其他造血组织中，也可出现在全身其它组织中， 致使正常的红系细胞、巨核系细胞显著减少。骨髓中可因某些白血病细胞增生明显活跃或极度活跃，而呈灰红色或黄绿色。淋巴组织也可被白血病 细胞浸润，后期则淋巴结肿大，部分白血病患者有明显中枢神经系统白血 病改变，或者为血管内白细胞郁滞、血管周围白细胞增生。最易发生白血 病浸润的脏器是肾、肺、心脏及胸腺、睾丸等，临床表现为贫血、出血、 感染以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。
既往细胞形态学分型的诊断符合率及正确率受检测者主观成分影响较 大，近两年白血病分子特征的研究取得了明显进展，尤其是对染色体易位 形成融合基因，有一些已作为诊断不同类型白血病的分子生物学特异性标 志和确定诊断的唯一依据，通过对白血病相关融合基因进行检测，不仅可 以为白血病诊断、分型、临床治疗和预后判断提供重要依据，同时也是白 血病微小残留病的检测基础。融合基因的检测对白血病的诊断意义重大， 能评价白血病的急性程度、克隆特性及分型，使白血病的诊断分型更加科 学化和规范化；可检出1×106个有核细胞中的一个白血病细胞，在白血病 的早期诊断方面有着其它方法无可比拟的特异性和敏感性。细胞遗传学分 型与疾病的预后关系密切，因此融合基因的检测对于指导临床个性化治疗 方案的选择和判断预后具有十分重要的意义，初治时可指导科学合理选择 长期治疗方案，避免不必要的治疗不足或过度治疗。
甲氨蝶呤是临床上治疗各型急性白血病，尤其是急性淋巴细胞性白血 病常用到的抗肿瘤药物。甲氨蝶呤作为一种叶酸还原酶抑制剂，主要抑制 二氢叶酸还原酶而使二氢叶酸不能还原成有生理活性的四氢叶酸，从而使 嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成过程中一碳基团的转移作用受阻，导 致DNA的生物合成受到抑制，从而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。该药选 择性地作用于细胞分裂的S期。
DHFR是甲氨蝶呤作用的靶目标，甲氨蝶呤抗肿瘤作用的基本原理是 竞争性结合DHFR，使二氢叶酸不能被还原成四氢叶酸。研究表明，DHFR 基因突变所导致DHFR构型改变，致使其与甲氨蝶呤结合的亲和力减弱， 这可能是DHFR相关的甲氨蝶呤治疗疗效和耐药的重要原因。基因变异的 不同导致肿瘤治疗反应的不同，这提示DHFR基因的检测可作为白血病治 疗监测和随访的指标。我们新近的研究显示，白血病患者中DHFR-Chr7融 合基因的检出预示着甲氨蝶呤化疗药物疗效不佳或者容易耐药，宜选用其 它药物治疗。
融合基因检测常用的方法主要包括白血病细胞染色体核型分析、染色 体荧光原位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)技术。在实际操作中，染 色体核型分析常常受到检测技术条件和人为操作因素的影响，荧光原位杂 交技术结果较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费 时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读也存在较大的 主观性，因而一定程度上限制了这些方法的应用。而聚合酶链式反应(PCR) 技术中常见的实时荧光定量PCR方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交 法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI染料法中使用的SYBR GreenI 由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过 观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种重复性好、高通量、灵敏、准确 和快速的筛选治疗白血病的药物的方法和系统，本发明还提供了用于该方 法和系统的重复性好、特异性好、灵敏度高、检测效率高和适用范围广的 引物对和探针组合，以及含有该引物对和探针组合的试剂盒及其应用。
本发明一方面提供了引物对和探针组合，包括两组引物对和两条探针， 所述两组引物对包括第一引物对和第二引物对，所述两条探针包括第一探 针和第二探针，所述第一探针与第一引物对相对应，所述第二探针与第二 引物对相对应，所述第一引物对包含SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所 示的核苷酸序列，所述第一探针包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列； 所述第二引物对包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列， 所述第二探针包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
本发明第二方面提供了所述的引物对和探针组合在筛选治疗白血病的 药物中的应用。
本发明第三方面提供了一种试剂盒，包括所述的引物对和探针组合。
在一优选例中，还包括荧光定量PCR扩增试剂。
在一优选例中，所述荧光定量PCR扩增试剂包括来自Roche公司的 货号为#6402682001的FastStart Essential Probes Master试剂盒中的试剂 FastStartEssential Probes Master Mix(2×)。
在一优选例中，还包括总RNA提取试剂。
在一优选例中，所述总RNA提取试剂包括红细胞裂解液、TRIZOL、 氯仿、异丙醇和乙醇中的至少一种。
在一优选例中，还包括逆转录试剂。
在一优选例中，所述逆转录试剂包括来自北京全式金生物技术有限公 司的货号为提AU311-03的TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix Kit中所包含的试剂。
在一优选例中，还包括阳性对照、阴性对照和空白对照。
在一优选例中，所述阳性对照为含有二氢叶酸还原酶融合基因和 GAPDH内参基因的溶液；所述阴性对照为不含二氢叶酸还原酶融合基因 但含有GAPDH内参基因的溶液；所述空白对照为生理盐水或去离子水。
本发明第四方面提供了所述的试剂盒在筛选治疗白血病的药物中的应 用。
本发明第五方面提供了一种筛选治疗白血病的药物的方法，包括：
提取从白血病患者分离出的生物样品中的核酸样本；
采用上述的引物对和探针组合对所述核酸样本进行荧光定量PCR反 应；
以及基于荧光定量PCR反应的结果，判断所述白血病患者对应的药物 治疗是否适用。
在一优选例中，所述提取所述生物样品中的核酸样本是从生物样品中 提取RNA样本，然后对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA 样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
在一优选例中，所述判断所述白血病患者对应的药物治疗是否适用的 标准为：
当荧光定量PCR反应的结果显示二氢叶酸还原酶融合基因呈阳性时， 则表示不适用甲氨蝶呤的药物治疗；当荧光定量PCR反应的结果显示二氢 叶酸还原酶融合基因呈阴性时，则表示适用甲氨蝶呤的药物治疗。
在一优选例中，所述荧光定量PCR反应的反应体系如下：
FastStart Essential Probes Master Mix(2×)12.5μl
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2 终浓度均为0.8μM
SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5 终浓度均为0.8μM
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6 终浓度均为0.4μM
cDNA模板 2ng
加超纯水补足体系至25μl；
所述FastStart Essential Probes Master Mix(2×)为Roche公司的货号为 #6402682001的FastStart Essential Probes Master试剂盒中的试剂。
在一优选例中，所述荧光定量PCR反应程序如下：95℃ 10min，1个 循环；95℃10s，60℃ 30s(收集荧光)，45个循环；40℃ 10s，1个循环。
本发明第六方面提供了一种筛选治疗白血病的药物的系统，包括：
核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取从白血病患者分离出的生 物样品中的核酸样本；
荧光定量PCR装置，所述荧光定量PCR装置与所述核酸提取装置相 连，适用于采用上述的引物对和探针组合对所述核酸样本进行荧光定量 PCR反应；以及
判断装置，所述判断装置与所述荧光定量PCR装置相连，以便基于荧 光定量PCR反应的结果，判断所述白血病患者对应的药物治疗是否适用。
在一优选例中，所述核酸提取装置进一步包括：
RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从生物样品中提取RNA样本； 以及
逆转录单元，所述逆转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述 RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所 述核酸样本。
在一优选例中，所述判断所述白血病患者对应的药物治疗是否适用的 标准为：
当荧光定量PCR反应的结果显示二氢叶酸还原酶融合基因呈阳性时， 则表示不适用甲氨蝶呤的药物治疗；当荧光定量PCR反应的结果显示二氢 叶酸还原酶融合基因呈阴性时，则表示适用甲氨蝶呤的药物治疗。
在一优选例中，所述荧光定量PCR反应的反应体系如下：
FastStart Essential Probes Master Mix(2×)12.5μl，引物SEQ ID NO： 1和SEQ ID NO：2的终浓度均为0.8μM，引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的终浓度均为0.8μM，探针SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6的终 浓度均为0.4μM，cDNA模板2ng，加超纯水补足体系至25μl。
在一优选例中，所述荧光定量PCR反应程序如下：95℃ 10min，1个 循环；95℃10s，60℃ 30s(收集荧光)，45个循环；40℃ 10s，1个循环。
本发明的“所述第一探针与第一引物对相对应，所述第二探针与第二 引物对相对应”中的“相对应”指的是第一探针与第一引物对可以单独配套 使用，同理，第二探针与第二引物对也可以单独配套使用。
本发明的生物样品为包含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或 为质粒，或为DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、 mRNA或cDNA片段的试剂。当生物样品为DNA、cDNA或cDNA片段， 或为含有DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或为质粒时，将其直接作为核酸样本与所述引物和探针对进行实时荧光PCR反应；当生物样品为含有 DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为mRNA，或为含有mRNA的 试剂时，将其转化为DNA、cDNA或cDNA片段的核酸样本再与所述引物和 探针进行实时荧光PCR反应。
本发明中的“DHFR-Chr7”代表二氢叶酸还原酶-7号染色体融合基因， 也简称二氢叶酸还原酶融合基因。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明针对白血病二氢叶酸还原酶融合基因和GAPDH内参基因 设计的多条多重引物、探针进行了大量筛选，综合其特异性、灵敏度、配 对复合扩增的相互影响、以及不同引物探针组合与荧光PCR扩增试剂盒的 适配性，最终筛选出特异性好、灵敏度高、重复性好、适用性广且可同时 检测白血病二氢叶酸还原酶融合基因和GAPDH内参基因的引物对和探针 组合。
(2)本发明针对在前述引物对和探针组合的基础上建立了白血病二 氢叶酸还原酶融合基因和GAPDH内参基因的双重荧光PCR检测方法，可 同时对二氢叶酸还原酶融合基因和GAPDH内参基因进行定性和定量检 测，且重复性好、高通量、灵敏、准确和快速，为白血病的用药筛选及预 后判定提供了更有效的方法。
具体实施方式
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施 例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体 技术或条件的，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册 (Sambrook J&Russell DW，Molecularcloning：a laboratory manual，2001)， 或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了引物对和探针组合及其应用。
引物对和探针组合的筛选方法为：针对白血病二氢叶酸还原酶融合基 因和GAPDH内参基因，设计不同的引物和探针组合并进行了优化筛选， 综合其稳定性、特异性、灵敏度、配对复合扩增的相互影响、以及不同引 物探针组合与荧光PCR扩增试剂盒的适配性，最终筛选出特异性好、重复 性好且灵敏度高的如下可同时检测白血病二氢叶酸还原酶融合基因和GAP DH内参基因的双重荧光PCR的引物对和探针组合。
所述二氢叶酸还原酶融合基因片段如下：
TTATGCTACCTTTGCACGGTTAGGGTACCGCGGCCGTTACATATGTCACTGGGCAGGCGGTGCCTCTAATACTGGTAATGCTAGAGGTGATGTTTTTGGTAAACAGGCGGGGTAAGATTTGCCGAGTTCCTTTTACTTTTTTTAACCTTTCCTTATAAGCATGCCTGTGTTGGGTTAACAGTATGGGTAGCACCGGTTTGTCTAAAACCAGCCACTCTCT(SEQ ID NO：7)。
所述GAPDH内参基因片段如下：
TGGTATCGTGGAAGGACTCATGACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGAT GGCCGCGGGGCTCTCCAGAACATCATC(SEQ ID NO：8)
所述的引物对和探针组合的核苷酸序列如下：
DHFR-Chr7-F：：5’-ACCTTTGCACGGTTAGGGTA-3’(SEQ ID N O：1)；
DHFR-Chr7-R：5’-TTTAGACAAACCGGTGCTACC-3’(SEQ ID NO：2)；
DHFR-Chr7的探针序列为：5’-FAM-CCGCGGCCGTTACATATGTC ACTGGG-TAMRA-3’(SEQID NO：3)
GAPDH-F：5’-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3’(SEQ ID NO： 4)；
GAPDH-R：5’-GATGATGTTCTGGAGAGCCC-3’(SEQ ID NO： 5)；
GAPDH的探针序列为：5’-HEX-CCATGCCATCACTGCCACCC-T AMRA-3’(SEQ ID NO：6)
其中HEX、FAM为荧光基团，TAMRA为淬灭基团。
利用上述引物对和探针可同时针对白血病二氢叶酸还原酶融合基因和 GAPDH内参基因进行双重荧光PCR扩增。
在应用上，上述引物对和探针组合可应用于筛选治疗白血病的药物上； 还可以用来制备筛选治疗白血病的药物的产品。
实施例2
本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：
(1)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO： 4、SEQ ID NO：5和SEQID NO：6(来自实施例1)；
(2)总RNA提取试剂；
(3)逆转录试剂；
(4)荧光定量PCR扩增试剂；
(5)阳性对照、阴性对照和空白对照。
所述总RNA提取试剂包括红细胞裂解液、TRIZOL、氯仿、异丙醇和 乙醇。
所述逆转录试剂包括来自北京全式金生物技术有限公司的货号为提 AU311-03的TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit中所包含的试剂。
所述荧光定量PCR扩增试剂包括来自Roche公司的货号为 #6402682001的FastStart Essential Probes Master试剂盒中的试剂FastStart Essential ProbesMaster Mix(2×)。
所述阳性对照为含有二氢叶酸还原酶融合基因和GAPDH内参基因的 溶液；所述阴性对照为不含二氢叶酸还原酶融合基因但含有GAPDH内参 基因的溶液；所述空白对照为生理盐水或去离子水。
实验证明，上述总RNA提取试剂、逆转录试剂、荧光定量PCR扩增试 剂以及与SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ I D NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的联合使用，效果更加优 越，具体表现在特异性强、重复性好和灵敏度高。
在应用上，上述试剂盒可应用于筛选治疗白血病的药物上；还可以用 来制备筛选治疗白血病的药物的产品。
实施例3
本实施例提供了一种检测或辅助检测白血病二氢叶酸还原酶融合基因 和GAPDH内参基因的方法，例如根据双重荧光PCR扩增的结果判断生物 样品是否含有白血病二氢叶酸还原酶融合基因，该方法使用了实施例1的 引物对和探针组合或实施例2的试剂盒。
上述方法包括如下步骤：
步骤一：总RNA的提取
在15ml离心管中加入5ml红细胞裂解液，取EDTA-Na2抗凝血(待测 样本)2ml加入离心管中，轻轻混匀，室温静置10分钟，600×g离心5 min，去掉上清，再加入2ml红细胞裂解液，轻轻重悬沉淀，室温静置5 min，600×g离心5min，去掉上清，向管中加入1ml TRIzol，吹打混 匀，使沉淀完全溶解，室温放置5min后，加入0.2ml氯仿，振荡混匀， 将溶液全部转移到1.5ml离心管中，4℃13000×g离心10min，吸取上清 并转移到新的离心管中，加入等体积异丙醇后，充分振荡，室温静置10m in，4℃13000×g离心10min，去上清，轻轻加入1ml 75％的乙醇，4℃1 3000×g离心10min，小心去上清，室温干燥10-15min，加入20μl RN ase-free水，冰上放置10min溶解沉淀，得到总RNA。
步骤二：cDNA的合成
使用北京全式金生物技术有限公司的货号为AU311-03的TransScript- Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit的试剂 盒并按照其说明书将总RNA逆转录成cDNA，并除去基因组DNA。
步骤三：双重荧光PCR扩增
以cDNA为模板，采用引物对和探针进行双重荧光PCR扩增，同时设 置阳性对照、阴性对照和空白对照。所述阳性对照为含有二氢叶酸还原酶 融合基因和GAPDH内参基因的溶液；所述阴性对照为不含二氢叶酸还原 酶融合基因但含有GAPDH内参基因的溶液；所述空白对照为生理盐水或 去离子水。
双重荧光PCR扩增反应体系：FastStart Essential Probes Master Mix (2×)12.5μl，引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的终浓度均为 0.8μM，引物SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5的终浓度均为0.8μM， 探针SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6的终浓度均为0.4μM，cDNA模板2μl(浓度为1ng/μl)，加超纯水补足体系至25μl。阳性对照、阴性对 照和空白对照的模板的用量均为2μl。
双重荧光PCR扩增反应条件：95℃ 10min，1个循环；95℃ 10s，6 0℃ 30s(收集荧光)，45个循环；40℃ 10s，1个循环。
双重荧光PCR扩增反应在Roche公司的96实时荧光定量 PCR仪上进行，探针检测模式为FAM(483-533)和HEX(523-568)组合。
步骤四：双重荧光PCR扩增产物的荧光检测
在每个循环的58℃30s阶段结束后收集FAM和HEX的荧光信号。
所述双重荧光PCR扩增的结果判断的标准如下：
将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，只有当待测样本的内参 基因GAPDH结果阳性时，检测结果才认为有效。
阳性结果判定：FAM通道和HEX通道都有扩增曲线，且Ct值均小于或 等于38.0。
阴性结果判定：HEX通道有扩增曲线且Ct值≤38.0，FAM通道Ct 值＞38.0。
如果HEX通道无扩增曲线，或Ct值＞38.0，需重新进行检测。
所述阳性对照、阴性对照和空白对照的双重荧光PCR扩增的结果应与 表1所示一致，以进一步证明待测样品的检测结果的可信度。
表1
实施例4
本实施例对实施例3建立的检测或辅助检测白血病二氢叶酸还原酶融 合基因和GAPDH内参基因的方法进行了特异性和重复性验证，所用的供试 材料如下：白血病患者抗凝血83例样本。
对白血病患者抗凝血83例样本分别进行总RNA的提取、cDNA的合 成、双重荧光PCR扩增以及双重荧光PCR扩增产物的荧光检测，各步骤 均按照实施例3的方法进行，每个样本做3次重复，每次实验均包括一份 阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。
结果分析：
实施例3建立的检测或辅助检测白血病二氢叶酸还原酶融合基因和 GAPDH内参基因的方法检测的实验结果表明：批内和批间重复性好，检 测结果Ct值的变异系数＜10％。而且在83例样本中，本发明实施例3的方 法测得白血病二氢叶酸还原酶融合基因呈阳性的患者有9例，将这9例患 者的cDNA用DHFR-Chr7融合基因的上下游引物(SEQ ID NO：1和SEQID NO：2)做普通PCR，然后送测序公司做Sanger测序，测序结果与本发明实 施例3的方法测得的结果的一致性为100％，且临床病例资料分析表明，在83例患者中正好只有这9例患者用甲氨蝶呤治疗后疗效不佳，预后不良， 结果与本发明实施例3的方法测得的结果一致，因此本发明实施例3的方 法可用于白血病的用药筛选及预后判定，为临床诊断和治疗提供分子诊断 依据。
综上，本发明建立的检测或辅助检测白血病二氢叶酸还原酶融合基因 和GAPDH内参基因的方法能有效检测二氢叶酸还原酶融合基因和 GAPDH内参基因，特异性和重复性好，可用于白血病的用药筛选及预后 判定，为临床诊断和治疗提供分子诊断依据。
实施例5
本实施例对实施例3建立的检测或辅助检测白血病二氢叶酸还原酶融 合基因的方法进行了灵敏度验证。分别提取经实施例4检测的白血病二氢叶 酸还原酶融合基因呈阳性的患者的外周血淋巴细胞和阴性细胞HeLa(二氢 叶酸还原酶融合基因阴性)(来源于ATCC细胞库)的RNA，将融合基因阳 性细胞的RNA从1μg开始用阴性细胞HeLa细胞的RNA进行10倍梯度稀释， 最低稀释至10-6。逆转录后进行双重荧光定量PCR扩增，实验步骤同实施例3，3次重复，每次实验均包括一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对 照。实验结果显示二氢叶酸还原酶融合基因的检测灵敏度为10-3，即103个 细胞中存在1个带有DHFR-Chr7阳性的细胞就能通过本发明的引物、试剂盒 以及方法检测到其融合基因。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的 描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术 人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些 修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.引物对和探针组合，其特征在于，包括两组引物对和两条探针；
所述两组引物对包括第一引物对和第二引物对；
所述两条探针包括第一探针和第二探针，所述第一探针与第一引物对相对应，所述第二探针与第二引物对相对应；
所述第一引物对包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述第一探针包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
所述第二引物对包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，所述第二探针包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物对和探针组合在筛选治疗白血病的药物中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对和探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光定量PCR扩增试剂；
任选的，所述荧光定量PCR扩增试剂包括来自Roche公司的货号为#6402682001的FastStart Essential Probes Master试剂盒中的试剂FastStart Essential ProbesMaster Mix(2×)。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括总RNA提取试剂；
任选的，所述总RNA提取试剂包括红细胞裂解液、TRIZOL、氯仿、异丙醇和乙醇中的至少一种；
任选的，还包括逆转录试剂；
任选的，所述逆转录试剂包括来自北京全式金生物技术有限公司的货号为AU311-03的TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit中所包含的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照、阴性对照和空白对照；
任选的，所述阳性对照为含有二氢叶酸还原酶融合基因和GAPDH内参基因的溶液；所述阴性对照为不含二氢叶酸还原酶融合基因但含有GAPDH内参基因的溶液；所述空白对照为生理盐水或去离子水。
7.权利要求3至6中任一项所述的试剂盒在筛选治疗白血病的药物中的应用。
8.一种筛选治疗白血病的药物的方法，其特征在于，包括：
提取从白血病患者分离出的生物样品中的核酸样本；
采用权利要求1所述的引物对和探针组合对所述核酸样本进行荧光定量PCR反应；
以及基于荧光定量PCR反应的结果，判断所述白血病患者对应的药物治疗是否适用；
任选的，所述提取所述生物样品中的核酸样本是从生物样品中提取RNA样本，然后对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本；
任选的，判断所述白血病患者对应的药物治疗是否适用的标准为：
当荧光定量PCR反应的结果显示二氢叶酸还原酶融合基因呈阳性时，则表示不适用甲氨蝶呤的药物治疗；当荧光定量PCR反应的结果显示二氢叶酸还原酶融合基因呈阴性时，则表示适用甲氨蝶呤的药物治疗。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述荧光定量PCR反应的反应体系如下：
所述FastStart Essential Probes Master Mix(2×)为Roche公司的货号为#6402682001的FastStart Essential Probes Master试剂盒中的试剂；
任选的，所述荧光定量PCR反应的程序如下：95℃10min，1个循环；95℃10s，60℃30s(收集荧光)，45个循环；40℃10s，1个循环。
10.一种筛选治疗白血病的药物的系统，其特征在于，包括：
核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取从白血病患者分离出生物样品中的核酸样本；
荧光定量PCR装置，所述荧光定量PCR装置与所述核酸提取装置相连，适用于采用权利要求1所述的引物对和探针组合对所述核酸样本进行荧光定量PCR反应；以及
判断装置，所述判断装置与所述荧光定量PCR装置相连，以便基于荧光定量PCR反应的结果，判断所述白血病患者对应的药物治疗是否适用。
任选的，所述核酸提取装置进一步包括：
RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从生物样品中提取RNA样本；
以及逆转录单元，所述逆转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
任选的，判断所述白血病患者对应的药物治疗是否适用的标准为：
当荧光定量PCR反应的结果显示二氢叶酸还原酶融合基因呈阳性时，则表示不适用甲氨蝶呤的药物治疗；当荧光定量PCR反应的结果显示二氢叶酸还原酶融合基因呈阴性时，则表示适用甲氨蝶呤的药物治疗。
任选的，所述荧光定量PCR反应的反应体系如下：
所述FastStart Essential Probes Master Mix(2×)为Roche公司的货号为#6402682001的FastStart Essential Probes Master试剂盒中的试剂。
任选的，所述荧光定量PCR反应的程序如下：95℃10min，1个循环；95℃10s，60℃30s(收集荧光)，45个循环；40℃10s，1个循环。
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