KR20160056841A

KR20160056841A - Ｆｌｔ３ 유전자 변이 정량분석방법 및 분석 키트

Info

Publication number: KR20160056841A
Application number: KR1020150158956A
Authority: KR
Inventors: 김명신; 김용구; 이건동
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-11-12
Filing date: 2015-11-12
Publication date: 2016-05-20
Also published as: KR102041001B1

Abstract

본 발명은 FLT3 유전자 변이 정량분석방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 절편분석을 이용한 FLT3-ITD 정량분석법은 실시간 정량 PCR법에 비하여 비용이 저렴하고, FLT3-ITD와 같이 다양한 양상을 보이는 변이를 비교적 손쉽게 효과적으로 정량값을 측정할 수 있는 효과가 있다. 또한 기존의 PCR결과에 비해 민감도, 특이도가 우수하고 더 예민한 방법으로 판단되어 급성골수성백혈병 환자의 FLT3-ITD의 정량값을 분석하는데 유용하게 활용할 수 있고, 예후와의 연관성도 높아 임상적인 유용성도 높을 것으로 기대된다.

Description

ＦＬＴ３ 유전자 변이 정량분석방법 및 분석 키트{Method for quantitative analysis of FLT3 gene mutation and kit}

본 발명은 FLT3 유전자 변이 정량분석방법 및 분석 키트에 관한 것이다.

혈액 악성 종양에서는, FLT3가 높은 수준으로 발현되거나 FLT3 돌연변이들이 FLT3 수용체 및 하류 분자 경로의 제어되지 않은 유도를 야기한다. FLT3의 돌연변이는 약 30%의 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia) 환자 및 적은 수의 급성 림프성 백혈병(acute lymphomatic leukemia) 또는 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes)에서 발견되고 있다.

FLT3(fms-related tyrosine kinase 3) 유전자는 13번 염색체의 장완(13q12)에 위치하면서 조혈모세포의 분화와 증식을 조절하는 티로신키나아제 단백질을 만들어 낸다. FLT3의 돌연변이를 가지고 있는 환자는 완화 기간 및 질병 완치 생존율이 저하되는 나쁜 예후를 보이는 경향이 있다. FLT3의 활성화된 돌연변이는 크게 ITD(internal tandem duplication)와 TKD(tyrosine kinase domain) 변이로 나뉘는데, FLT3 변이의 3/4는 ITD 변이이며, 나머지 1/4는 TKD 변이이다. FLT3-ITD 변이는 수용체의 막근접(juxtamembrane) 영역에서 4-40 아미노산의 중복이고(환자의 25-30%), FLT3-TKD 변이는 키나제 도메인의 점 돌연변이(point mutation)이다(환자의 5-7%). 이들 돌연변이는 수용체의 막근접(juxtamembrane) 도메인 내의 아미노산의 작은 탠덤 중복(small tandem duplications)과 종종 관련되고, 타이로신 키나제의 활성을 초래한다.

한편, 급성골수성백혈병(acute myeloide leukemia, AML)에서 유전자변이를 검사하는 것은 진단뿐만 아니라 잔류 병소의 검출, 재발 유무, 생존율과 같은 예후를 예측하는 지표로 사용되고 있다. 이 중 FLT3 (fims-like tyrosine kinase) 유전자 변이는 AML에서 가장 흔히 나타나는 변이로 진단 시에 FLT3 내부 직렬 중복(FLT3 internal tandem duplication, FLT3-ITD)이 존재하면 예후가 불량하며 재발율과 생존율에 영향을 미치는 것으로 보고되어 왔다. 특히 최근에는 FLT3-ITD 유무보다 변이의 정량(quantification)적 차이가 환자의 치료성적 및 예후와 더욱 밀접한 관련성이 있는 것으로 보고되고 있다. 그러나 FLT3-ITD의 정량 분석은 유전자 변이의 위치와 크기가 다양하기 때문에 실시간 정량 PCR (real-time quantitative PCR)로 시행되기 어려운 점이 있다.

미국등록특허 제7,858,333호

이에, 본 발명자들은 절편분석(fragment analysis) 방법을 이용한 FLT3-ITD 정량분석법을 새로이 개발하였고, 이를 다양한 방법으로 검증 및 평가하여 FLT3-ITD를 효과적으로 분석할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 FLT3 유전자 변이 정량분석방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 FLT3 유전자 변이 정량분석방법을 위한 FLT3 유전자 변이 검출용 키트를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 급성골수성백혈병의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분석하고자 하는 DNA 시료를 FLT3 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; 상기 PCR 증폭산물을 전기영동하는 단계; 및 정량분석하는 단계;를 포함하는 FLT3 유전자 변이 정량분석방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표기되는 염기서열을 갖는 프라이머 세트일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 프라이머는 5'에 형광물질을 표지한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 PCR 증폭은, 95℃에서 5분간 반응시키는 단계; 95℃에서 30초, 56℃에서 1분 및 72℃에서 2분을 30 ~ 40회 반복하여 반응시키는 단계: 및 60℃에서 30분간 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 정량분석은 GeneMapper 소프트웨어를 이용하여 수행하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 정량분석은 하기의 수학식1에 의해 계산하는 것일 수 있다.

[수학식 1]

{변이형 피크 높이 또는 면적/ (야생형 피크 높이 또는 면적 + 변이형 피크 높이 또는 면적) x 100}

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 정량분석 최소 검출 DNA 복제수는 10인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 정량분석으로 검출 가능한 농도는 3 ~ 100%인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 DNA 시료는 골수로부터 분리된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 버퍼 용액; DNA 중합효소; DNTPs; 및 서열번호 1 및 서열번호 2로 표기되는 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 FLT3 유전자 변이 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은, 분석하고자 하는 DNA 시료를 FLT3 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; 상기 PCR 증폭산물을 모세관 전기영동하는 단계; 및 FLT3 유전자 변이를 정량분석하는 단계를 포함하는, 급성골수성백혈병의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표기되는 염기서열을 갖는 프라이머 세트일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 정량분석 결과, 분석하고자 하는 DNA 시료에 함유된 FLT3 유전자 변이 정량값이 50% 이상 또는 돌연변이 길이가 70bp 이상인 경우에는 위험군으로 급성골수성백혈병의 재발 가능성이 높다고 판단하고, FLT3 유전자 변이 정량값이 50% 미만 및 돌연변이 길이가 70bp 미만인 경우에는 비위험군으로 재발 가능성이 낮다고 판단할 수 있다.

본 발명에 따르면 절편분석을 이용한 FLT3-ITD 정량분석법은 실시간 정량 PCR법에 비하여 비용이 저렴하고, FLT3-ITD와 같이 다양한 양상을 보이는 변이를 비교적 손쉽게 효과적으로 정량값을 측정할 수 있는 효과가 있다. 또한 기존의 PCR결과에 비해 민감도, 특이도가 우수하고 더 예민한 방법으로 판단되어 급성골수성백혈병 환자의 FLT3-ITD의 정량값을 분석하는데 유용하게 활용할 수 있고, 예후와의 연관성도 높아 임상적인 유용성도 높을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일실시에에 따른 FLT3 야생형과 변이형 혼합시료에 대한 직선성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시에에 따른 정량백분율 계산 시 피크의 높이값과 피크의 면적값의 상관성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시에에 따른 AML 초기 진단 시 FLT3-ITD 검사 의뢰된 환자의 FLT3-ITD 변이 비율을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시에에 따른 FLT3-ITD 정량이 장기생존율(overall survival), 무병생존율(disease free survival)에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시에에 따른 FLT3-ITD 정량이 조혈모세포이식 후 생존율에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시에에 따른 FLT3-ITD 정량 및 돌연변이 길이가 장기생존율(overall survival) 및 무합병증 생존율(event free survival)에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시에에 따른 정상 염색체를 보이는 급성골수병백혈병 환자들에서 FLT3-ITD 정량 및 돌연변이 길이가 장기생존율(overall survival) 및 무합병증 생존율(event free survival)에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시에에 따른 공고요법 처리 대상군에서 FLT3-ITD 정량 및 돌연변이 길이가 장기생존율(overall survival) 및 무합병증 생존율(event free survival)에 미치는 영향을 분석한 결과이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 FLT3 유전자 변이 정량분석방법 및 이를 위한 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 절편분석(fragment analysis) 방법을 이용한 FLT3-ITD 정량분석방법 및 FLT3 유전자 변이 정량분석방법을 위한 FLT3 유전자 변이 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명은 급성골수성백혈병(acute myeloide leukemia, AML)에서 FLT3-ITD 유전자 변이의 정량검사법을 개발한 것으로, (1) FLT3 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, (2) ABI 3130 Genetic Analyzer를 이용하여 모세관 전기영동을 수행하고, (3) 절편 분석(fragment analysis)을 수행한 후, (4) GeneMapper v4.1소프트웨어를 이용하여 정량분석하는 것을 통해, AML의 예후, 생존율, 재발율 등을 보다 정확하게 진단할 수 있음을 규명하였다.

본 발명에서 "FLT3(fms-related tyrosine kinase 3)"는 FMS-유사 수용체 티로신 키나아제를 지칭한다. FLT3의 여러 돌연변이가 확인되었고 수용체의 구조적 활성화를 야기하는 것으로 나타났다. 급성 골수성 백혈병에서, 이러한 돌연변이가 질환과 관련된 가장 흔한 유전적 변형이며, AML를 가지는 환자의 대략 25%를 차지한다. FLT3는 STAT5를 인산화하고 활성을 조절하는 것으로 나타났다.

바람직하게 본 발명에서 분석하고자 하는 상기 FLT3 유전자는 진뱅크번호 NG_007066.1 의 유전자로서 상기 유전자는 FLT3에 존재하는 다양한 변이를 포함하고 있다.

또한, 본 발명에서 상기 "FLT3-ITD"는 FLT3 내부 직렬 중복(internal tandem duplication)을 지칭하는 것으로 FLT3-ITD는 FLT3 유전자의 중복의 위치, 길이 및 개수에 변화가 있는 급성 골수성 백혈병의 체세포 돌연변이이며 FLT3-ITD는 진뱅크번호 NG_007066.1 의 유전자에 이의 돌연변이가 존재할 수 있다.

따라서, 본 발명은 FLT3 유전자 변이 정량분석방법을 제공하며, FLT3 유전자 변이 정량분석방법은 (a) 분석하고자 하는 DNA 시료를 FLT3 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; (b) 상기 PCR 증폭산물을 전기영동하는 단계; 및 (c) 정량분석하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 FLT3 유전자 변이를 정량적으로 분석하기 위해, 먼저 분석하고자 하는 DNA 시료를 FLT3 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시킨다.

본 발명에서 상기 DNA 시료는 생물학적 시료로부터 분리될 수 있다. 상기 생물학적 시료로는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 샘플, 생검 표본, 모근, 조직 배양과 같은 고형 조직 샘플 또는 이로부터 유래된 세포 및 그 자손이 포함된다. 또한, 상기 샘플들은 시약처리, 가용화된 샘플 또는 배양세포, 세포 상등액 및 세포 용해물도 포함한다. 바람직하게는, 상기 DNA 시료는 골수로부터 분리된 것일 수 있다. 상술한 생물학적 시료로부터 DNA의 분리는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서 PCR 증폭을 위해 사용한 FLT3 프라이머는 하기의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표기되는 염기서열을 갖는 프라이머 세트일 수 있다.

FLT3 정방향 프라이머 : 5 6-FAM-TTTAGGTATGAAAGCCAGCTACA 3(서열번호 1)

FLT3 역방향 프라이머 : 5 AGCATTTTGACGGCAACCT 3(서열번호 2)

또한, 유전자 증폭산물을 확인하기 위한 형광물질로서 실시간 유전자 검출방법에 사용되는 DNA-결합 형광물질(DNA-binding fluorophore)을 사용하며 그 종류에 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 FLT3 정방향 프라이머 5'에 형광물질을 표지하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 PCR 증폭은 90~100℃에서 3~5분 동안 1회 반응시키는 단계; 90~100℃에서 20~40초, 55~65℃에서 30초~1분 및 70~75℃에서 1~3분을 30~40회 반복하여 반응시키는 단계: 및 60℃에서 30분간 반응시키는 단계를 포함할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 95℃에서 5분간 반응시키는 단계; 95℃에서 30초, 56℃에서 1분 및 72℃에서 2분을 30 ~ 40회 반복하여 반응시키는 단계: 및 60℃에서 30분간 반응시키는 단계로 수행하였다.

다음으로, 상기 PCR 증폭산물을 전기영동한다. 바람직하게는 모세관 전기영동을 수행할 수 있다.

전기영동을 진행한 후에는 정량분석을 수행할 수 있으며, 정량분석 이전에는 절편분석(fragment analysis)을 추가로 진행할 수 있다. 이때 절편분석은 당업계에 공지된 PCR 산물을 절편분석할 수 있는 방법이라면 모두 사용할 수 있으며 본 발명의 일실시예에서는 GeneMapper Software v4.1을 이용하여 분석하였다.

또한, 상기 정량분석도 GeneMapper 소프트웨어를 이용하여 수행할 수 있는데 본 발명의 정량분석은 하기의 수학식1에 의해 계산할 수 있다.

[수학식 1]

본 발명에 따른 FLT3 유전자 변이 정량분석방법은 최소 검출 DNA 복제수는 10이고, 검출 가능한 농도는 3 ~ 100%인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 FLT3 유전자 변이 정량분석방법을 이용하는 경우, 종래에 사용하던 실시간 정량 PCR법에 비하여 비용이 저렴하고, FLT3-ITD와 같이 다양한 양상을 보이는 변이를 비교적 손쉽게 효과적으로 정량값을 측정할 수 있다. 또한 기존의 PCR결과에 비해 민감도, 특이도가 우수하고 더 예민한 방법으로 판단되어 급성골수성백혈병 환자의 FLT3-ITD의 정량값을 분석하는데 유용하게 활용할 수 있고, 예후와의 연관성도 높아 임상적인 유용성도 높을 것으로 기대된다.

한편, 본 발명은 FLT3 유전자 변이 정량분석방법을 위한 FLT3 유전자 변이 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 키트는 FLT3 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함한다. 본 발명에 따른 키트에 포함되는 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열 또는 이들 염기 서열에 각각 상보적인 염기서열로 구성되는 군에서 적어도 하나 이상 선택되는 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.

본 발명의 FLT3 유전자 변이 검출용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 FLT3 유전자 변이 검출용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, FLT3 유전자 변이 검출용 키트는 버퍼 용액; DNA 중합효소; dNTPs; 및 서열번호 1 및 서열번호 2로 표기되는 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 포함한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표기되는 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 FLT3 유전자 변이 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 프라이머는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

나아가 본 발명은 급성골수성백혈병의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있는데, 즉, 분석하고자 하는 DNA 시료를 FLT3 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; 상기 PCR 증폭산물을 모세관 전기영동하는 단계; 및 절편분석(fragment analysis)하여 FLT3 유전자 변이를 정량분석하는 단계를 포함하는, 급성골수성백혈병의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 정보제공 방법은, 본 발명에 따른 FLT3 유전자 변이 정량분석 결과, 분석하고자 하는 DNA 시료에 함유된 FLT3 유전자 변이 정량값이 50% 이상 또는 돌연변이 길이가 70bp 이상인 경우에는 위험군으로 급성골수성백혈병의 재발 가능성이 높다고 판단할 수 있으며, 반면 FLT3 유전자 변이 정량값이 50% 미만 및 돌연변이 길이가 70bp 미만인 경우에는 비위험군으로 재발 가능성이 낮다고 판단할 수 있다.

이러한 정보제공 방법은 환자들의 생존율과 재발율 예측에도 유용하게 사용될 수 있으며, 조혈모세포 이식후 생존율을 예측하고 예후를 예측하기 위한 용도로도 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 일 실시예를 제공한다. 다만, 하기의 실시예들은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 아래의 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

대상 및 방법

<1-1> 시험대상

2009년 4월부터 2014년 3월까지 가톨릭대학교 서울성모병원 진단검사의학과에 FLT3 유전자변이 검사가 의뢰된 4235건 중 PCR 검사로 FLT3-ITD 양성이 나온 182개의 검체를 대상으로 하였다.

<1-2> DNA 추출

진단 당시의 골수검체는 원심분리를 통하여 백혈구 층을 분리한 후 QIAamp DNA 혈액 키트(QIAGEN, Germany)를 사용하여 시약의 지침서에 따라 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 1ul 당 50~100ng이 되도록 1X TBE buffer로 희석하였다. FLT3- ITD 정량을 위한 프라이머는 5에 형광색소를 부착하였고 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

<1-3> PCR 혼합물 제조

PCR 증폭을 위한 반응물 준비는 MgCl₂가 포함된 10×반응완충용액 2.5ul, 200umol dNTPs 0.5ul, 5U Hotstar Taq polymerase(QIAGEN) 0.25ul, 10pmol F 프라이머 1.5ul, 10pmol R 프라이머 1.5ul, 및 DW 13.75ul를 혼합하였다. 혼합물을 각 PCR 튜브에 20ul씩 넣고 희석된 DNA를 5ul 첨가하여 최종 반응액이 25ul가 되도록 준비하였다.

<1-4> PCR 반응

PCR 기기는 C-1000 thermal cycler(Bio-Rad, USA)를 이용하였다.

95℃에서 5분간 1회 실시하고, 95℃에서 30초, 56℃에서 1분, 72℃에서 2분간 35회 실시한 다음, 60℃에서 30분 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 후 2% 아가로즈 겔을 사용하여 PCR 산물을 전기영동하여 증폭 여부를 확인하고, PCR 산물을 증류수로 10배 희석하였다. 희석된 PCR 산물 1ul를 HiDi formamide 10ul와 size standard 0.2ul가 혼합된 반응물에 넣고, PCR 기기에서 95℃로 2분 동안 반응시켰다. 반응액은 3130xl sequencer(ABI, USA)를 이용하여 전기영동하고 GeneMapper Software v4.1를 이용하여 분석하였다.

<실시예 2>

FLT3-ITD 정량 분석

FLT3-ITD의 정량 분석은 FLT3-ITD 변이형(mutant)을 전체 FLT3 (야생형(wild type)과 변이형(mutant)의 합)로 나눈 백분율로 계산하였다.{mutant peak 높이 또는 면적/ (wild type peak 높이 또는 면적 + mutant peak 높이 또는 면적) x 100}

FLT3-ITD 정량검사법으로 정상 검체를 분석한 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 50 검체 모두에서 음성결과를 보여 본 발명의 검사법이 변이(mutant)만을 특이적으로 증폭할 수 있음을 확인하였고, 기존 PCR 결과에서 양성이었던 182건 모두 FLT3-ITD 정량검사법으로도 변이(중앙값 32.3%, 2.8-94.7%)가 검출되었다.

그리고 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 야생형(wild type)과 변이형(mutant type) 각각의 최소 검출 DNA 복제수(copy number)는 10으로 나타났다.

< 실시예 3>

FLT3-ITD 정량 분석 방법의 검증

본 발명의 FLT3-ITD 정량 분석 방법의 특이도를 알아보기 위해 정상 골수 공여자 50 검체를 분석하였고, 검출 민감도 및 재현성, 직선성을 보기 위하여, TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, USA)로 FLT3 유전자를 클로닝하여 야생형과 변이형의 플라스미드 DNA를 각각 추출하였다. 추출한 DNA를 이용하여 FLT3 변이 대립유전자(allele)의 함유량을 100%에서 0%까지 되도록 혼합 희석한 시료를 제작하여 비교 분석하였다. 2009년 4월부터 2014년 3월까지 가톨릭대학교 서울성모병원 진단검사의학과에 FLT3 유전자변이 검사가 의뢰된 4235건 중 PCR 검사로 FLT3-ITD 양성이 나온 182개의 검체를 대상으로 본 발명에 따른 새로운 FLT3-ITD 정량검사법의 임상적 의미를 평가하였다.

<3-1> 검출 민감도 및 재현성 검증 결과

야생형과 변이형 혼합 희석 실험을 통해 측정한 검출 최저농도는, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 기존 PCR 방법에서 10%의 민감도를 나타낸 반면, 본 발명의 FLT3-ITD 정량분석법에서는 3%의 민감도로서 종래 PCR 방법에 비해 높은 민감도를 보이는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에서 제안하는 방법은 보다 정확하고 높은 민감도로 FLT3-ITD을 정량분석할 수 있음을 알 수 있었다.

<3-2> 직선성 검증 결과

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 직선성 평가에서는 r값이 0.991로 나타났고, 정량 백분율 계산 시 피크의 높이를 사용한 값과 피크의 면적을 사용한 값을 비교한 결과 y=1.0297x (y:높이,x:면적)로 높은 상관성을 보이는 것으로 나타났다.

또한, AML 초기 진단 시 FLT3-ITD 검사가 의뢰된 환자 75명(남자41, 여자34, 연령분포 18-79세, 연령중앙값 49세)을 조사한 결과 변이 비율은 중앙값 35.2% (9.3-69.2%)로 나타났고(도 3 참조), AML의 진단기준에 따른 아형별 변이 비율은 하기 표 5와 같이 나타났다.

<3-3> 치료성적과의 연관성 분석 결과

나아가 본 발명자들은 본 발명의 방법이 실제적으로 환자에게 적용하였을 경우, 치료성적과의 연관성이 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였는데, 장기생존율은 병이 재발되었거나 또는 부분적으로만 치료되었다고 하더라도 진단 시점부터 환자가 생존한 기간을 말하며 FLT3-ITD 양성 함량이 50% 이상인 군과 50% 미만인 군 간의 생존율을 Kaplan-Meier 생존분석법으로 비교하였다. 무병생존율은 병이 골수 형태학적 그리고 분자유전학적으로 재발하지 않고 생존한 기간을 말하며 FLT3-ITD 양성 함량이 50% 이상인 군과 50% 미만인 군 간의 생존율을 Kaplan-Meier 생존분석법으로 비교하였다.

분석 결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, FLT3-ITD의 정량분석 결과는 장기생존율(overall survival), 무병생존율(disease free survival), 조혈모세포이식 후 생존율에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 즉, FLT3-ITD의 정량 분석에 따라 환자군을 FLT3-ITD의 함량이 50% 이상과 50% 미만으로 구분하여 분석한 결과, 50% 이상인 군에서 말초혈액 내 백혈병세포 (blast) 비율이 높은 것으로 나타났다(평균 63% vs. 50% 이상인 군은 81%로 나타남).

또한, 항암 화학요법을 2 사이클 처리한 후 완전관해(백혈병 세포를 거의 관찰할 수 없는 상태)에 도달하는 비율은 FLT3-ITD가 50% 이상인 군에서 더 낮은 것으로 나타났다(50% 이상인 군은 54.5% vs. 50% 미만인 군은 71.2%로 나타남). 완전관해 이후 재발율도 FLT3-ITD의 정량분석 값이 50% 이상인 군은 50.0%로 나타났고 50% 미만인 군은 27.0%로 나타남에 따라 본 발명의 방법이 치료 후 재발 정도를 예측하기 위한 수단으로도 활용할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 전체적인 생존률과 무병생존율도 FLT3-ITD가 50% 이상인 군이 미만인 군에 비해 짧은 것으로 조사되었고, 특히 조혈모세포 이식을 한 환자들을 대상으로 본 발명의 방법으로 생존률과 재발율을 예측할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 4 및 도 5 참조).

<실시예 4>

추가 임상실험 대상 및 방법

가톨릭대학교 서울성모병원에서 급성골수성백혈병으로 진단받은 363명의 환자의 검체를 대상으로 진단검사의학과에서 FLT3 유전자변이 검사를 진행한 결과, 73명(20.1%)의 환자에서 FLT3-ITD 돌연변이가 검출되었다. 상기 실험에서 PCR 검사는 실시예 1의 방법과 동일한 방법을 사용하였다.

<실시예 5>

FLT3-ITD 정량 분석과 급성 골수성 백혈병 치료 성적과의 연관성 분석

본 발명자들은 본 발명의 방법이 실제적으로 환자에게 적용하였을 때, 치료성적과 연관성이 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였는데, 장기생존율은 병이 재발되었거나 또는 부분적으로만 치료되었다고 하더라도 진단 시점부터 환자가 생존한 기간을 말하며 FLT3-ITD 양성 함량이 50% 이상인 군과 50% 미만인 군의 생존율 그리고 돌연변이 길이가 70bp 이상인 군과 70bp 미만인 군의 생존율을 Kaplan-Meier 생존분석법으로 비교하였다.

무합병증 생존율은 치료 후 현재 급성 골수성 백혈병 증상의 재발, 새로운 골수 관련 질병이 발병하지 않고 생존한 기간을 말하며 FLT3-ITD 양성 함량이 50% 이상인 군과 50% 미만인 군의 생존율 그리고 돌연변이 길이가 70bp 이상인 군과 70bp 미만인 군의 생존율을 Kaplan-Meier 생존분석법으로 비교하였다.

분석 결과, 도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, FLT3-ITD의 정량분석 결과는 장기생존율(overall survival), 무병생존율(disease free survival), 조혈모세포이식 후 생존율에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 즉, FLT3-ITD의 정량분석에 따라 환자군을 FLT3-ITD의 함량이 50% 이상 또는 돌연변이 길이가 70bp 이상, FLT3-ITD의 함량이 50% 미만 및 돌연변이 길이가 70bp 미만으로 구분하여 분석한 결과, FLT3-ITD의 함량이 50% 이상 및 돌연변이 길이가 70bp 이상인 군에서는 말초혈액 내 백혈병세포(blast) 비율이 높은 것으로 나타났다.

또한, 정상 염색체를 보이는 급성골수성백혈병 환자들에서는 돌연변이 정량이 50% 이내 또는 돌연변이 길이가 70bp 이하인 경우 조혈모세포 이식에 의해 예후가 개선되었다. 그러나, 돌연변이 정량이 50% 이상 또는 돌연변이 길이가 70bp 이상인 경우는 조혈모세포 이식으로도 치료 성적이 좋아지지 않으므로 새로운 치료법 예를들면, FLT3 억제제 등의 적용이 필요할 것으로 예상된다.

나아가, 항암 화학요법을 2 사이클 처리한 후 완전관해(백혈병 세포를 거의 관찰할 수 없는 상태)에 도달하는 비율은 FLT3-ITD의 함량이 50% 이상 또는 돌연변이 길이가 70bp 이상인 군에서 더 낮은 것으로 나타났다. 완전관해 이후 재발율도 FLT3-ITD 정량분석 값이 50% 이상 또는 돌연변이 길이가 70bp 이상인 군은 6.6%로 나타났고, FLT3-ITD 정량분석 값이 50% 미만 및 돌연변이 길이가 70bp 미만인 군은 13.5%로 나타남에 따라 본 발명의 방법이 치료 후 재발 정도를 예측하기 위한 수단으로 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 전체적인 생존률과 무병생존율도 FLT3-ITD의 함량이 50% 이상 또는 돌연변이 길이가 70bp 이상인 군이 FLT3-ITD 정량분석 값이 50% 미만 및 돌연변이 길이가 70bp 미만인 군에 비해 짧은 것으로 조사되었고, 특히 조혈모세포 이식을 한 환자들을 대상으로 본 발명의 방법으로 생존률과 재발율을 예측할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 6 내지 8 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

분석하고자 하는 DNA 시료를 FLT3 유전자에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계;
상기 PCR 증폭산물을 모세관 전기영동하는 단계; 및
정량분석하는 단계를 포함하는,
FLT3 유전자 변이(FLT3-ITD)의 정량분석방법.
제1항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표기되는 염기서열을 갖는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 FLT3 유전자 변이 정량분석방법.
제1항에 있어서,
상기 프라이머는 5'에 형광물질을 표지한 것을 특징으로 하는 FLT3 유전자 변이 정량분석방법.
제1항에 있어서,
상기 PCR 증폭은,
90~100℃에서 3~5분 동안 1회 반응시키는 단계;
90~100℃에서 20~40초, 55~65℃에서 30초~1분 및 70~75℃에서 1~3분을 30~40회 반복하여 반응시키는 단계: 및
60℃에서 30분간 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 FLT3 유전자 변이 정량분석방법.
제1항에 있어서,
상기 분석 시료는 혈액, 세포, 조직 및 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 FLT3 유전자 변이 정량분석방법.
제1항에 있어서,
상기 정량분석은 GeneMapper 소프트웨어를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 FLT3 유전자 변이 정량분석방법.
제1항에 있어서,
상기 정량분석은 하기의 수학식 1에 의해 계산하는 것을 특징으로 하는 FLT3 유전자 변이 정량분석방법;
[수학식 1]
{변이형 피크 높이 또는 면적/ (야생형 피크 높이 또는 면적 + 변이형 피크 높이 또는 면적) x 100}.
제1항에 있어서,
정량분석의 최소 검출 DNA 카피수는 10 카피수인 것을 특징으로 하는 FLT3 유전자 변이 정량분석방법.
PCR 버퍼 용액;
DNA 중합효소;
dNTPs; 및
서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, FLT3 유전자 변이 검출용 키트.
분석하고자 하는 DNA 시료를 FLT3 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계;
상기 PCR 증폭산물을 모세관 전기영동하는 단계; 및
FLT3 유전자 변이를 정량분석하는 단계를 포함하는,
급성골수성백혈병의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
제10항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표기되는 염기서열을 갖는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 급성골수성백혈병의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
제10항에 있어서,
상기 정량분석은 하기의 수학식 1에 의해 계산하는 것을 특징으로 하는 급성골수성백혈병의 예후 예측을 위한 정보제공방법;
[수학식 1]
{변이형 피크 높이 또는 면적/ (야생형 피크 높이 또는 면적 + 변이형 피크 높이 또는 면적) x 100}.
제10항에 있어서,
정량분석 결과, 분석하고자 하는 DNA 시료에 함유된 FLT3 유전자 변이 정량값이 50% 이상 또는 돌연변이 길이가 70bp 이상인 경우에는 위험군으로 급성골수성백혈병의 재발 가능성이 높다고 판단하고, FLT3 유전자 변이 정량값이 50% 미만 및 돌연변이 길이가 70bp 미만인 경우에는 비위험군으로 재발 가능성이 낮다고 판단하는 것을 특징으로 하는 급성골수성백혈병의 예후 예측을 위한 정보제공방법.