CN109790580A - 用于检测Htert基因的启动子中的突变的方法，序列，组合物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测Htert基因启动子中c.‑124C>T和c.‑146C>T突变的方法。所述方法使用了反应组合物，其包含扩增引物和用于基因分型的探针。本发明的另一方面涉及引物和探针，其用于以表示为SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.6的序列进行前述方法，其表现出对于这些突变的高特异性，以及包含这些引物和探针的组合物。本发明进一步涉及包含上述组合物的试剂盒，其用于通过进行本发明的方法来检测Htert基因启动子中的c.‑124C>T突变和c.‑146C>T突变。本发明的方法、基因序列、组合物和试剂盒可以有利地用于检测生物样品中的痕量的c.‑124C>T突变和c.‑146C>T突变，这是由于其对于这样的突变的高灵敏性和特异性。本发明因此可以用于与这类突变有关的疾病的早期检测、鉴别、复发检测或者预测和监测，例如膀胱癌、甲状腺癌、鳞状上皮细胞癌、基细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤和肝细胞癌等，并且最终提供用于限定适当的治疗的基础。因此，本发明涉及医学、药学、分子生物学、生物化学和人类遗传学的技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种超灵敏检测Htert基因启动子中的c.-124C>T和c.-146C>T突变的方法，包含用于扩增的引物和用于基因分型的探针的反应组合物，被称作SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的序列(其被设计来显示对于这些突变的高特异性)，以及包含用于进行所述方法的这类组合物的试剂盒。
本发明可以有利地用于检测生物样品和体外存在的痕量的这类c.-124C>T和c.-146C>T突变，这归因于所述方法的高灵敏性和所产生的基因序列的特异性，并且由此允许与那些突变相关的疾病的早期检测，复发鉴别或者预测和监测，例如膀胱癌、甲状腺癌、鳞状上皮细胞癌、基细胞癌、皮肤癌、中枢神经系统癌和肝细胞癌等，并且最后提供适当的治疗设置的基础。
因此，本发明落入医学，药学，分子生物学，生物化学和人类相关遗传学的技术领域。
背景技术
在DNA复制(其先于有丝分裂)过程中发生的体细胞突变是某些人类疾病的源头，特别是某些类型的癌症的源头。在高百分比(大约75-80％)的肿瘤细胞系中观察到存在着酶端粒末端转移酶。最近，本申请人已经鉴别了编码这种酶的端粒末端转移酶基因——TERT基因——的启动子中的突变，特别是在位置c.-124C>T和c.-146C>T(从初始ATG起算)处的突变。这些突变与几个恶性肿瘤有关，例如中枢神经系统癌(43-51％)，膀胱癌(59-66％)，肝细胞癌(59％)，甲状腺癌(10％)，皮肤癌(黑素瘤29％-73％，73％基细胞癌(BCC)和鳞状上皮细胞癌(SCC)45％)和胃肠道间质肿瘤(GISTs)(4％)[1-7]。
端粒末端转移酶启动子突变以相对较高的频率存在于某些癌症中的事实使得它们是用于早期检测，诊断，预后，复发检测或者预测/监测肿瘤的治疗响应的潜在生物标记物，例如中枢神经系统肿瘤，膀胱癌，肝细胞癌，甲状腺癌和皮肤癌等。例如在膀胱癌中，在端粒末端转移酶基因的位置c.-124C>T和c.-146C>T(从ATG起算)处的体细胞突变是普遍的，其达到了85％，并且与在成纤维细胞生长受体3(FGFR3)基因中的突变R248C和S249C[9]一起为用于膀胱癌的最可靠的生物标记物。
但是，对于体外使用的生物样品液体(例如尿，血浆，脑脊液，抽吸细胞学(aspiration cytology)等)，在端粒末端转移酶基因的位置c.-124C>T和c.-146C>T(从ATG起算)的突变检测方法必须具有高的分析灵敏性，来检测痕量的突变等位基因，甚至当它们在样品中被更丰富的“野生型”等位基因“稀释”时更是如此。
文献WO2015153808公开了可用于检测一些疾病的方法和组合物，特别是癌，更具体是甲状腺癌，其涉及在TERT基因的位置c.-124C>T和c.-146C>T处的突变。但是，该文献公开的核苷酸序列是通过直接扩增的方法用于检测这样的突变，其是依赖于序列的，并且当所存在的正常序列相对高于突变体序列时其具有有限的灵敏性。另一方面，它们易于发生非特异性扩增，这样它们就不会表现出对于这类突变的高特异性，这导致它的一般方法不够灵敏和特异。
文献WO2014160834公开了可用于检测和治疗不同类型的甲状腺癌的方法和组合物，其与TERT基因在位置c.-124C>T和c.-146C>T的突变有关。但是，在这个文献中，所公开的核苷酸序列未表现出高的灵敏性，这是因为与突变体序列相比，存在着非常丰富的正常序列，并且所提出的方法是基于使用“BigDye terminator v3.1”测序备用试剂盒并在Applied Biosystems ABI PRISM装置3730中进行的DNA测序，其对于反应中的稀少的等位基因具有有限的灵敏性。此外，突变的存在必须通过在两个方向(正义和反义)上测序来确认，其使得所述方法是不切实际和费力的，并且仅仅适用于甲状腺癌。
因此，必需开发一种具有足够的灵敏性和特异性的方法，其允许检测生物样品中这样的突变，甚至在其中突变的等位基因是以非常低的量存在的条件中也是如此。
本发明提出一种超灵敏方法，其允许通过设计引物和探针(其序列对于这个目的来说是特异性的)，来检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T。
发明内容
本发明涉及一种引物组和探针序列(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6)，用于生物样品的DNA扩增和杂交，其设计来在根据权利要求1的Htert基因启动子中突变c.-124C>T和c.-146C>T的检测中具有高的特异性。
这些引物和DNA探针，因为它们在这样的突变的检测中具有高的特异性，因此允许将其用于这些突变的高灵敏性检测方法中。
本发明还涉及用于DNA扩增和杂交的组合物，其使用了PCR(聚合酶链式反应)技术，包含根据权利要求2所述的引物和DNA探针的序列。
这些组合物可用于检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T，其可以预先制备或者可以在进行本发明检测方法时制备。
本发明另一方面涉及一种根据权利要求7的用于检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T的组合物，其包含PCR的组合物加上来自于生物样品的用于就这种突变进行测试的人类DNA。
在这些组合物中，已知设计用于该目的本发明引物和探针的高特异性，DNA在测试样品中的量可以是相当低的。
本发明另一方面涉及一种试剂盒，其包含引物组合物和特异性基因探针，来检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T，其是根据权利要求9预先制备的。
这种试剂盒具有以下优点：通过将样品人类DNA加入到用于检测所述突变的测试中，从而开发了以快速和可靠的方式体外检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T的超灵敏方法。
本发明另一方面涉及根据权利要求11的使用包含用于扩增的引物和用于基因分型的探针的反应组合物(其序列是特异性针对这些突变)，来体外检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T的方法。
这种方法可以有利地用于检测生物样品存在的痕量的这类突变c.-124C>T和c.-146C>T，这归因于其通过设计用于这个目的基因序列所赋予的高灵敏性以及其对于这样的突变具有高特异性。
因此，本发明可以应用于早期检测，鉴别，复发检测或者预测检测和监测与这样的突变相关的疾病，例如膀胱癌，甲状腺癌，皮肤癌，中枢神经系统癌和肝细胞癌等，并且最后提供用于适当的治疗设置的基础。
因此，本发明的另一方面涉及根据权利要求15的治疗方法，其中将适量的Htert基因启动子抑制剂用于这样的个体，其在本发明的Htert基因启动子中的c.-124C>T或者c.-146C>T的突变检测测试中测试呈阳性。
发明说明
本发明涉及一种体外检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T的方法。所述反应方法使用了包含用于扩增的引物和用于基因分型的探针的组合物，其序列(SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.6)是特异性针对这些突变的。
因此，制备产生了用于扩增的引物序列和用于基因分型的探针，来构建用于所述的扩增反应的基础，例如实时PCR测定(RT-PCR)或者数字时间PCR。如序列表所示，设计了6个序列用于引物和探针。这包括用于下面目的序列：
a.位于hTERT基因的ATG上游的第-124位碱基处的突变的检测
·SEQ ID NO.1：起始子F
·SEQ ID NO.2：起始子R
·SEQ ID NO.3：探针-124C
·SEQ ID NO.4：探针-124T
b.位于hTERT基因的ATG上游的第-146位碱基处的突变的检测
·SEQ ID NO.1：起始子F
·SEQ ID NO.2：起始子R
·SEQ ID NO.3：探针-146C
·SEQ ID NO.4：探针-146T
上面的序列可以通过固相核苷酸合成方法，使用亚磷酰胺核苷来制备，如公开文献：Beaucage，SL；Iyer，RP(1992).“Advances in the Synthesis of Oligonucleotidesby the Phosphoramidite Approach”.Tetrahedron 48(12)：2223中所述。所述合成可以在具有固体载体的柱上进行(可控孔径玻璃或者聚苯乙烯)，其是用每个寡核苷酸的3'端的第一个碱基官能化的。每个寡核苷酸的制备是按照数个合成循环进行，每个合成循环是由下面的化学反应组成，典型的四个化学反应：i)释放(desbloqueio)(脱三苯甲基化)，ii)偶联，iii)保护，和iv)氧化。在每个循环中，将对应于所需序列的核苷酸残基添加到生长链(cadeia em crescimento)的5'端。
它们可以进一步通过以下方式来修饰：在探针的5'和3'序列添加本领域技术人员已知的相应的荧光团例如FAM，Yakima Yellow，猝灭剂(TAMRA)等，目的是用于多重PCR中的扩增和杂交反应。因此，本发明中合适的荧光团例如是已知的化合物Alexa Fluor FAM，TET，JOE，VIC，HEX，Cy3，ATTO550，TAMRA，ROX，Cy5，Cy5.5。
核苷酸指的是天然或者合成来源的核苷酸，具有通过碱基配对来与互补的核苷酸杂交的能力，并且可以包括但不限于DNA，RNA和核苷酸类似物(例如具有封闭构象的核酸，称作“锁核酸”-LNA)核苷酸或者没有核苷酸磷酸二酯间类型连接(例如肽核酸-PNA)和具有硫代二酯键的核酸等，用于相同目的。
用于扩增和DNA杂交的组合物(PCR组合物)是通过将反应物溶液加入PCR来制备的，其是市售的，具有不同浓度的不同核苷酸序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6，以及双蒸馏水和双去离子水。
用于PCR的反应溶液是随着所需扩增反应的类型而不同的。用于本发明实施方案的PCR的合适反应物溶液的实例如是Thermofischer Scientific company的溶液“Universal PCR Master Mix”或者用于DNA扩增和杂交目的的类似溶液。
探针的浓度指的是溶液的摩尔浓度，其对应于每个探针的摩尔数/溶液体积，其中纳摩尔(nM)对应于1x10-9mol/L。
制备了用于PCR的组合物，其包含不同浓度的探针与序列SEQ ID NO.3至SEQ IDNO.6的不同组合。如前所述，设计探针(它的序列是通过SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4定义的)来用于Htert基因启动子中的c.-124C>T突变的特异性检测，而设计探针SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6来用于Htert基因启动子中的c.-146C>T突变的特异性检测。
因此，本发明的用于PCR的组合物可以包含仅仅一组或者两组上述探针，即，本发明的用于PCR的组合物可以仅仅包含具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的探针(c.-124组)，具有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的探针(c.-146组)，或者具有SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6的全部探针(c.-124+c.-146完全组)。
在本发明的组合物包含仅仅一个探针组(组c.-124或者c.-146)的情况下，则它们仅仅特异性用于检测各自的突变c.-124C>T或者C.-146C>T。在两组探针均存在于用于PCR的组合物的的情况下，则这些组合物特异性用于检测c.-124C>T和c.-146C>T突变二者。
调节PCR溶液中本发明的核苷探针的浓度，以促进本发明方法检测这样的突变的灵敏性。优选地，每个探针的最终浓度值调整到400-1600nM，更优选地，最终浓度值是800-1600nM，并且在本发明另一优选的实施方案中，每个探针的最终浓度值是大约1600nM。
因此，可以获得用于PCR的组合物，其包含通过SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6所限定的每个探针的最终浓度值的不同组合。
因此，在一种优选的形式中，所述用于PCR的组合物包含以下浓度具有SEQ IDNO.3至SEQ ID NO.6的探针：
i.250nM-500nM的SEQ ID NO.3，400nm-1600nM的SEQ ID NO.4，250nM-500nM的SEQID NO.5和400nm-1600nM的SEQ ID NO.6，或者
ii.250nM-500nM的SEQ ID NO.3，800nm-1600nM的SEQ ID NO.4，250nM-500nM的SEQ ID NO.5和800nm-1600nM的SEQ ID NO.6。
该用于检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T的反应混合物的组合物是通过将来自于待测试的生物样品的DNA加入上述用于PCR的组合物来制备的。
待测试DNA可以使用本领域已知的标准方法(例如由Qiagen公司市售的或者类似方法)从组织，尿，循环肿瘤DNA，生殖组织(germinativo)或者其他生物来源获得。待测试的DNA的量可以在用于检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T的组合物中以低于500ng，小于100ng，50ng和大于1ng的浓度存在。
所用探针的浓度的调节目的是提高本发明方法的分析灵敏性，其是通过与“野生型”等位基因(WT DNA)的数目相比所检测的突变等位基因(DNA MUT)的最小数目来证明。假定了分析灵敏性的增加是由于通过与有利于突变等位基因的扩增而增加了反应中所使用的探针浓度。
同时，它降低了“野生型”等位基因的杂交和扩增效率，来尽可能多的保持有利于突变等位基因的扩增的反应平衡。
因此，可以开发一种方法，其中所使用的不同浓度探针的不同组合产生了这样的条件，即其增强了分析灵敏性并且可以检测非常低水平的突变等位基因。
在某种程度上来说，增加突变探针的浓度不会导致“野生型”等位基因的非特异性检测，这可通过当仅仅使用WT DNA作为样品时不存在探针-124T和-146T的信号(图5-图C和D)来证明。因此，基于对所用探针浓度的操控，可以校正所述分析方法的灵敏性，同时保持它的特异性。
突变等位基因-124T和-146T的检测中这种效率增加的反映出可以明显增加了所述方法的分析灵敏性，对于-124T等位基因达到最小检测值1.56％和对于-146T等位基因是0.78％(分别是图6A和B)。
因此，本发明的方法包含以下步骤：i)制备用于检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和/或c.-146C>T的组合物，如上所述，ii)促进从待测试所述突变的生物样品中提取的DNA与用于PCR扩增和杂交的组合物的接触，也如上所述，iii)扩增和杂交该样品组合物DNA，用于通过PCR反应，实时PCR，RT-PCR或者数字PCR或者甚至多重PCR反应来检测Htert基因启动子中的突变c.-124C>T和/或c.-146C>T，和iv)分析因此获得的扩增曲线。
通过荧光信号指数增长的存在(其对应于存在着至少一种所述的突变)来验证所分析的测试样品中Htert基因启动子中突变c.-124C>T和/或c.-146C>T的存在。
本发明的方法可用于检测几种生物液体中痕量的c.-124C>T和c.-146C>T突变，例如尿，血浆，脑脊液，抽吸细胞学等，其具有从这些不同来源获得的作为输入的DNA。在这些实例中，优点是能够基于较少创伤的样品种类作出决定，而无需依赖于活检或者外科手术。
它可用于通过尿样品的基于DNA的分析结果来监测膀胱癌患者。这种应用是基于这样的事实，即，膀胱癌中突变c.-124C>T和c.-146C>T是非常频繁的，并且可以在来源于尿的DNA中检测到(图7)。对于处于临床监测的患者，因为他们具有50-70％的复发率，因此用于尿测试来检测复发的可能性优于基于膀胱镜检查的常规方法之处在于完全无创的和对于患者来说更方便。
本发明的方法还可以用于检测其中存在着Htert基因突变的其他类型的癌，以及用于其他临床目的。一个实例是通过甲状腺结节的细针吸入物的分析来提供可用于确定是否需要烧蚀治疗或者淋巴结清扫扩充的预测信息。
应用本发明的另一实例涉及早期检测，诊断，预后，复发检测或者预测/监测肿瘤的治疗响应，例如中枢神经系统癌，膀胱癌，肝细胞癌，甲状腺癌，皮肤癌等。
本发明还可以可用于分析肿瘤组织或者在“液体活检”情况中的循环DNA，来用于可能的选择和治疗候选患者，预测对治疗的反应以及监测例如用Htert基因启动子的端粒末端转移酶抑制剂进行的治疗。
附图说明
图1：证实了检测Htert基因启动子(TERTp)c.-124C>T突变的测定能力。
在这个图中，可以看出所述测定是特异性用于检测位置-124处的等位基因。该测定的性能是通过在异源DNA样品(DNA HET124)中和“野生型”情况(WT DNA)中实施检测c.-124C>T突变的测定以检测c.-124C>T突变来证实的。结果证实了特异性针对突变等位基因的探针(探针-124T)在HET-124DNA样品中产生了信号但在WT DNA样品中没有信号，并且用于“野生型”等位基因的探针(探针-124C)在两种样品中都产生了扩增信号。
1-扩增曲线，用探针-124C(“野生型”等位基因)在WT DNA 中获得。
2-扩增曲线，用探针-124C(“野生型”等位基因)在HET-124DNA中获得。
3-扩增曲线，用探针-124T(突变等位基因)在HET-124DNA中获得。
4-扩增曲线，用探针-124T(突变等位基因)在WT DNA中获得。
X轴-扩增循环
Y轴-荧光变化
图2：证实了检测TERTp c.-146C>T突变的测定能力。
在这个图中，可以看出所述测定是特异性用于检测位置-146处的等位基因性的。该测定检测突变c.-146C>T的性能是通过分析异源DNA样品(DNA HET146)的c.-146突变和野生型情况(WT DNA)来证实的。结果显示了特异性针对突变等位基因的探针(探针-146T)在HET-146DNA样品中产生了信号但在WT DNA样品中没有信号，并且用于“野生型”等位基因的探针(探针-146C)在两种样品中都产生了扩增信号。
1-扩增曲线，用探针-146C(“野生型”等位基因)在WT DNA中获得。
2-扩增曲线，用探针-146T(突变等位基因)在HET-146DNA中获得。
3-扩增曲线，用探针-146C(“野生型”等位基因)在HET-146DNA中获得。
4-扩增曲线，用探针-146T(突变等位基因)在WT DNA中获得。
X轴-扩增循环
Y轴-荧光变化
图3：评估所述测定的分析特异性：
(A)突变TERTp c.-124C>T的特异性检测
(B)突变TERTp c.-146C>T的特异性检测
在这个图中，可以看出所述测定在所测试的突变之间不具有交叉反应。
图3-A：用于突变TERTp-146C>T的异源DNA样品没有通过探针-124T扩增，并且发射荧光的单个探针实际上是探针-124C(对应于在位置-124处的“野生型”等位基因)。
图3-B：另一方面，用于突变TERTp-124C>T的异源DNA样品没有通过探针-146T扩增，并且发射荧光的单个探针实际上是探针-146C(对应于在位置-146处的“野生型”等位基因)。
1-扩增曲线，用探针-124C(“野生型”等位基因)在HET-146DNA中获得。
2-扩增曲线，用探针-124T(突变等位基因)在HET-146DNA中获得。
3-扩增曲线，用探针-146C(“野生型”等位基因)在HET-124DNA中获得。
4-扩增曲线，用探针-146T(突变等位基因)在HET-124DNA中获得。
X轴-扩增循环
Y轴-荧光变化
图4：评估在来源于生物液体的模拟DNA样品的条件下，用于检测等位基因-124T(A)和-146T(B)的分析灵敏性，其中在整体环境中存在着少量突变等位基因，其中主要的等位基因是“野生型”的。使用具有c.-124C>T突变的DNA样品或者使用具有在“野生型”DNA样品中连续稀释的c.-146C>T突变的样品。
这个图报告了所述测定在检测突变等位基因-124T和-146T中的效率和灵敏性。
1-扩增曲线，用探针-124T在50％DNA MUT124/DNA WT获得。
2-扩增曲线，用探针-124T在25％DNA MUT124/DNA WT获得。
3-扩增曲线，用探针-124T在12.5％DNA MUT124/DNA WT获得。
4-扩增曲线，用探针-124T在6.25％DNA MUT124/DNA WT获得。
5-扩增曲线，用探针-124T在3.125％DNA MUT124/DNA WT获得。
6-扩增曲线，用探针-146T在50％DNA MUT146/DNA WT获得。
7-扩增曲线，用探针-146T在25％DNA MUT146/DNA WT获得。
8-扩增曲线，用探针-146T在12.5％DNA MUT146/DNA WT获得。
9-扩增曲线，用探针-146T在6.25％DNA MUT146/DNA WT获得。
X轴-扩增循环
Y轴-荧光变化
图5：在检测等位基因-124T(A)和-146T(B)中分析灵敏性的增强。
使用具有c.-124C>T突变的DNA样品或者使用具有在“野生型”DNA样品中以25％MUT DNA/DNA-WT比例连续稀释的c.-146C>T突变的样品。
可以观察到在用于“野生型”等位基因的低浓度探针条件(例如250nM)下，使用用于突变等位基因-124T和-146T的高浓度探针(400-800-1600nM)导致了突变等位基因的检测信号显著增加(图5中分别的图A和B)。
在这个图的图C和D中，可以看到高达某些水平时，突变探针的浓度增加不会导致“野生型”等位基因的非特异性检测，证据是当仅仅使用DNA-WT作为样品时，不存在来自于探针-124T和-146T的信号。
1-扩增曲线-124T探针(突变体)，浓度400nm。
2-扩增曲线-124C探针(野生型)，浓度250nM。
3-扩增曲线-124T探针(突变体)，浓度800nm。
4-扩增曲线-124C探针(野生型)，浓度250nM。
5-扩增曲线-124T探针(突变体)，浓度1600nM。
6-扩增曲线-124C探针(野生型)，浓度250nM。
7-扩增曲线-146T探针(突变体)，浓度400nm。
8-扩增曲线-146C探针(野生型)，浓度250nM。
9-扩增曲线-146T探针(突变体)，浓度800nm。
10-扩增曲线-146C探针(野生型)，浓度250nM。
11-扩增曲线-146T探针(突变体)，浓度1600nM。
12-扩增曲线-146C探针(“野生型”)，浓度250nM。
13-扩增曲线-124T探针(突变体)，浓度1600nM。
14-扩增曲线-124C探针(“野生型”)，浓度250nM。
15-扩增曲线-1246T探针(突变体)，浓度400nm。
16-扩增曲线-146C探针(“野生型”)，浓度250nM。
X轴-扩增循环
Y轴-荧光变化
图6：评估当增加用于突变等位基因的探针浓度和降低用于“野生型”等位基因的探针浓度时，检测等位基因-124T(A)和-146T(B)的分析灵敏性。探针的相关组合物中的这种变化导致分析灵敏性增加。
这个图显示了在检测突变等位基因-124T和-146T中效率和灵敏性增加：对于等位基因-124T，最小检测值为1.56％和对于等位基因-146T是0.78％。
1-扩增曲线，用探针-124T在25％DNA MUT124/DNA WT中获得。
2-扩增曲线，用探针-124T在12.5％DNA MUT124/DNA WT中获得。
3-扩增曲线，用探针-124T在6.25％DNA MUT124/DNA WT获得。
4-扩增曲线，用探针-124T在3.125％DNA MUT124/DNA WT获得。
5-扩增曲线，用探针-124T在1.56％DNA MUT124/DNA WT获得。
6-扩增曲线，用探针-146T在50％DNA MUT146/DNA WT获得。
7-扩增曲线，用探针-146T在25％DNA MUT146/DNA WT获得。
8-扩增曲线，用探针-146T在12.5％DNA MUT146/DNA WT获得。
9-扩增曲线，用探针-146T在6.25％DNA MUT146/DNA WT获得。
10-扩增曲线，用探针-146T在3.125％DNA MUT146/DNA WT获得。
11-扩增曲线，用探针-146T在1.56％DNA MUT124/DNA WT获得。
12-扩增曲线，用探针-146T在0.78％DNA MUT146/DNA WT获得。
X轴-扩增循环
Y轴-荧光变化
图7：证实了在膀胱癌患者的尿样品中检测TERTp突变c.-124C>T和c.-146C>T的测定能力。在这个图中，可以看到检测尿样品中的c.-124C>T突变或者c.-146C>T突变。结果表明在获自膀胱癌患者的这类样品中，检测了突变等位基因中突变-124(A)或者-146突变(B)以及相应的“野生型”等位基因的信号。
1-扩增曲线，用探针-124C(“野生型”等位基因)在获自膀胱癌患者的尿样品的DNA中获得。
2-扩增曲线，用探针-124T(突变等位基因)在获自膀胱癌患者的尿样品的DNA中获得。
3-扩增曲线，用探针-146C(“野生型”等位基因)在获自膀胱癌患者的尿样品的DNA中获得。
4-扩增曲线，用探针-146T(突变等位基因)在获自膀胱癌患者的尿样品的DNA中获得。
X轴-扩增循环
Y轴-荧光变化
实施例
实施例1-制备引物和探针序列
如下所述制备了两种引物序列：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，和4个另外的探针序列：SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6：
上述序列是通过固相核苷酸合成方法，使用亚磷酰胺核苷来制备。该合成是在装填有固体载体的柱上进行的，所述固体载体是用每个寡核苷酸的3'端的第一个碱基官能化的。每个寡核苷酸的制备是按照数个合成循环进行，每个合成循环是由四个化学反应组成：
释放(脱三苯甲基化)；偶联；保护和氧化。在每个循环中，对应于所需序列的核苷酸残基是在生长链的5'端逐步添加的。
通过在双蒸馏水和双去离子水中稀释冻干制品，来将探针浓度调节到400-1600nM的值。
实施例2-制备PCR反应组合物
制备了几个PCR反应组合物，其包含不同浓度的根据SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的核苷酸混合物(例如400nm，800nm，1600nM)，如下所述。出于对比的目的，还制备了具有用于“野生型”等位基因的备选探针浓度的溶液(例如250nM，500nM)。
I-用于检测位于hTERT基因的ATG起始密码子上游的第-124位碱基处的突变的组合物
本发明的组合物Ia：
·实时PCR试剂溶液“Universal PCR Master Mix”，浓度1X；
·寡核苷酸，具有序列：SEQ ID NO.1，浓度900nM；
·寡核苷酸，具有序列：SEQ ID NO.2，浓度900nM；
·寡核苷酸探针，具有序列：SEQ ID NO.3，浓度250nM，其包含修饰，例如在5'和3'端分别引入称作YAKIMA和四甲基若丹明(TAMRA)的化合物；
·寡核苷酸探针，具有序列：SEQ ID NO.4，浓度1600nM，其包含修饰，例如在5'和3'端分别引入称作6-羰基-荧光素(6-FAM)和四甲基若丹明(TAMRA)的化合物；
·双蒸馏和双去离子水。
本发明组合物Ib：
这种组合物是以与组合物Ia类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针替换为SEQID NO.4，浓度800nm。
本发明的组合物Ic：
这种组合物是以与组合物Ia类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针替换为SEQID NO.4，浓度400nm。
对比组合物Id：
这种组合物是以与组合物Ia类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针具有序列SEQ ID NO.3，浓度500nM。
II-用于检测位于hTERT基因的ATG起始密码子上游的第-146位碱基处的突变的组合物
本发明组合物IIa：
·实时PCR实际溶液“Universal PCR Master Mix”，浓度1X；
·寡核苷酸，具有序列：SEQ ID NO.1，浓度900nM；
·寡核苷酸，具有序列：SEQ ID NO.2，浓度900nM；
·寡核苷酸探针，具有序列：SEQ ID NO.5，浓度250nM，包含分别在5'和3'端的修饰；
·寡核苷酸探针，具有序列：SEQ ID NO.6，浓度1600nM，包含分别在5'和3'端的修饰；
·双蒸馏和双去离子水。
所述在探针序列的5'和3'端的修饰是对应于加入本领域技术人员已知的荧光团(FAM，Yakima Yellow)和猝灭剂(TAMRA)等的修饰。
本发明组合物IIb：
这种组合物是以与组合物IIa类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针具有序列SEQ ID NO.6，其是以浓度800nM存在的。
本发明组合物IIc：
这种组合物是以与组合物IIa类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针具有序列SEQ ID NO.6，其是以浓度400nM存在的。
对比组合物IId：
这种组合物是以与组合物Ia类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针具有序列SEQ ID NO.5，其是以浓度500nM存在的。
III用于同时检测位于hTERT基因的ATG起始密码子上游的第-124位和第-146位碱基处的突变的组合物：
本发明组合物IIIa：
·实时PCR试剂溶液“Universal PCR Master Mix”，浓度1X；
·寡核苷酸，具有序列：SEQ ID NO.1，最终浓度900nM；
·寡核苷酸，具有序列：SEQ ID NO.2，最终浓度900nM；
·寡核苷酸，具有序列：SEQ ID NO.3，最终浓度900nM；
·寡核苷酸探针，具有序列：SEQ ID NO.4，浓度1600nM，包含分别在5'和3'端的修饰；
·寡核苷酸探针，具有序列SEQ ID NO.5，浓度250nM，包含分别在5'和3'端的修饰；
·寡核苷酸探针，具有序列SEQ ID NO.6，浓度1600nM，包含分别在5'和3'端的修饰；
·双蒸馏和双去离子水。
本发明组合物IIIb：
这种组合物是以与组合物IIIa类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针具有序列SEQ ID NO.4，其是以浓度800nM存在的。
本发明组合物IIIc：
这种组合物是以与组合物IIIa类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针具有序列：SEQ ID NO.4，其是以浓度400nM存在的。
本发明组合物IIId：
这种组合物是以与组合物IIIa类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针具有序列：SEQ ID NO.6，其是以浓度800nM存在的。
本发明组合物IIIe：
这种组合物是以与组合物IIIa类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针具有序列：SEQ ID NO.6，其是以浓度800nM存在的。
对比组合物IIIf：
这种组合物是以与组合物Ia类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针具有序列SEQ ID NO.3，其是以浓度500nM存在的。
对比组合物IIIg：
这种组合物是以与组合物Ia类似的方式来制备的，但是寡核苷酸探针具有序列SEQ ID NO.5，其是以浓度500nM存在的。
实施例3-制备用于检测突变的组合物
用于检测基因hTERT启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T的反应混合物的组合物是通过将来自于生物测试样品的DNA(大约100ng的DNA,它可以1ng-500ng的较少量使用)加入上述PCR组合物来制备，并且将具有序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6的探针浓度调节到400-1600nM的值，如前面的实施例所述。该用于检测的组合物因此是用含有c.124C>T突变的DNA样品或者用含有在“野生型”DNA样品中“系列稀释”的c.146C>T突变的样品来制备的。
同样，通过将来自于生物测试样品的DNA加入前述实施例的对比溶液中，而制备了用于对比目的检测组合物。
实施例4-检测位于hTERT基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T的方法。
为了进行本发明的方法，如前面的实施例所述制备了不同的检测突变的组合物。
在这个实施例中，使用了来自于细胞系的DNA或者来自于DNA肿瘤组织的DNA，其是新鲜的或者福尔马林固定并且石蜡包埋的。
将来自于前面实施例的检测组合物在实时PCR和数字PCR中进行扩增和杂交方法的处理。还使用同时用于所分析的两种突变的相同反应探针，对该组合物进行同时(多重)测定，所述探针是用不同的荧光团标记的探针。其中最常用的荧光团是已知的化合物：Alexa Fluor FAM，TET，JOE，VIC，HEX，Cy3，ATTO550，TAMRA，ROX，Cy5，Cy5.5。
为了在实时PCR中进行所述方法，使用了Scientific ThermoFischer销售的ABI7500 Fast机器。
扩增和杂交条件：
第1阶段：在95℃下进行10分钟的1个循环
第2阶段：45个循环，包含在92℃下进行30秒，在60℃下进行1分钟，并且从第25个循环开始每个循环降温0.2℃
第3阶段：在57℃下进行1分钟的1个循环，并且采集信号。
实施例5-用于检测位于尿样品的hTERT基因启动子中的突变c.-124C>T和c.-146C>T的方法
患者尿样品获自临床膀胱癌患者或者获自处于肿瘤复发预防的监测程序(膀胱镜检)中的膀胱癌患者。将尿在超过重力1000倍的力(1000G)下离心分离超过5分钟的时间，来沉淀尿中存在的来自于膀胱的上皮细胞。DNA是使用本领域已知的常规方法(例如Qiagen公司市售的或者类似方法)来从所获得的沉淀细胞中提取的。将1-500ng的所获得的DNA加入如实施例1，2和3所述制备的用于检测突变的扩增组合物。
对来自于实施例3的检测组合物在实时PCR和数字PCR中进行了扩增和杂交方法的处理。还使用同时用于所分析的两种突变的相同反应探针，对该组合物进行同时(多重)测定，所述探针是用不同的荧光团标记的探针。其中最常用的荧光团是已知的化合物：AlexaFluor FAM，TET，JOE，VIC，HEX，Cy3，ATTO550，TAMRA，ROX，Cy5，Cy5.5。
为了在实时PCR中进行所述方法，使用了Scientific ThermoFischer销售的ABI7500 Fast机器。
扩增和杂交条件：
第1阶段：在95℃进行10分钟的1个循环
第2阶段：45个循环，包含在92℃下进行30秒，在60℃下进行1分钟，并且从第25个循环开始每个循环降温0.2℃
第3阶段：在57℃下进行1分钟的1个循环，并且采集信号。
使用这种方法，在低等级和高等级膀胱癌患者中，以及在复发膀胱癌患者中检测到了hTERT基因启动子中的c.-124C>T和c.-146C>T突变(图7)。
结论：
验证了所述探针的特异性，即评估了是否用于c.-124C>T突变的探针(具有SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4的探针)没有在用于突变c.-146C>T的异源DNA样品(DNA MUT146)中产生扩增和反之亦然(使用具有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的探针)(图3A和3B)。然后验证了在所述探针和各个突变之间不存在交叉检测或者错误检测的现象。
在来源于生物液体的DNA样品中，其中在“野生型”等位基因占主导的环境中存在少量突变的等位基因，在其对各个突变的检测能力下，在最终浓度400nm时，探针-124T和-146T的分析灵敏性保持在最高达3.125％(在探针-124T的情况)和6.25％(在探针-146T的情况)(分别是图4a和b)，其明确显示了探针检测在高“野生型”等位基因稀释条件下的各个突变的高效率和因此本发明方法的超灵敏性。
在使用25％DNA MUT/DNA WT的条件下，可以观察到在用于“野生型”等位基因的低探针浓度(例如250nM)下，使用用于突变等位基因-124T和-146T的较高探针浓度(400-800-1600nM)导致突变等位基因的检测信号的显著增加(图5的图A和B)，其清楚地表明通过管控探针浓度，可以调节本发明方法用于检测所研究的突变的灵敏性。
为了增加检测突变等位基因-124T和-146T的效率，本发明方法的分析灵敏性的显著增加对应于在-124T等位基因的情况中达到1.56％的最小检测值和在-146T等位基因的情况中达到0.78％的最小检测值(分别是图6A和B)，其清楚地表明通过操控探针的浓度，可以增强本发明方法用于检测所研究的突变的分析灵敏性，同时保持它的特异性。
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Claims (15)
1.一组核苷酸序列，用于检测基因hTERT的启动子中的突变c.-124 C>T和/或c.-146 C>T，其特征在于其包含SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2和至少SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6。
2.一种用于PCR扩增和杂交的组合物，其用于检测基因hTERT的启动子中突变C.-124 C>T和/或c.-146 C>T，其特征在于除了用于PCR的试剂溶液之外，还包括权利要求1所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2和至少SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.4和/或SEQ IDNO.5至SEQ ID NO.6。
3.根据前述权利要求的组合物，其特征在于SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6中的至少一种以400nm-1600nM的最终浓度存在于这种组合物中。
4.根据前述权利要求的组合物，其特征在于SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6核苷酸序列中的至少一种以800nm-1600nM的最终浓度存在于这种组合物中。
5.根据前述权利要求的组合物，其特征在于SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5核苷酸序列以250nm-500nM最终浓度存在于这种组合物中，并且其特征在于SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6核苷酸序列以800nm-1600nM的最终浓度存在于这种组合物中。
6.根据前述权利要求的组合物，其特征在于其包含以下浓度的SEQ ID NO.3至SEQ IDNO.6：
i)250nM-500nM的SEQ ID NO.3，400nm-1600nM的SEQ ID NO.4，250nM-500nM的SEQ IDNO.5和400nm-1600nM的SEQ ID NO.6，或者
ii)250nM-500nM的SEQ ID NO.3，800nm-1600nM的SEQ ID NO.4，250nM-500nM的SEQ IDNO.5和800nm-1600nM的SEQ ID NO.6。
7.一种用于检测基因hTERT的启动子中的突变c.-124 C>T和c.-146 C>T的组合物，其特征在于其除了获自体外生物样品的人类DNA之外，还包括至少一种如权利要求2-6中任一项所述的用于PCR扩增和杂交的组合物。
8.根据前述权利要求的组合物，其特征在于在所述组合物中，所包含的测试样品的DNA的量的最终浓度小于500ng、小于100ng、小于50ng和大于1ng。
9.一种试剂盒，其用于检测基因hTERT的启动子中的突变c.-124 C>T和/或C.-146 C>T，其包含至少一种权利要求7-8中任一项所述的用于检测突变的组合物。
10.根据前述权利要求的试剂盒，其特征在于其还包含至少一种DNA样品，其含有基因hTERT的启动子中的突变c.-124 C>T和/或c.-146 C>T。
11.一种用于检测基因hTERT的启动子中的突变c.-124 C>T和/或C.-146 C>T的体外方法，其特征在于包含以下步骤：
a)通过以下方式制备权利要求7-8中所述的用于检测的组合物：促使从生物样品提取的用于测试所述突变的DNA，与权利要求2-6中所述的用于PCR扩增和杂交的组合物进行接触，
b)通过PCR反应来扩增和杂交检测组合物的DNA样品，
c)分析(b)中获得的扩增曲线，和验证荧光信号的指数扩增的存在，其对应于所分析的样品中的基因hTERT启动子的启动子中c.-124 C>T突变和/或c.-146 C>T突变的存在呈阳性。
12.根据前述权利要求的方法，其中(a)的生物样品来源于人的尿、血浆、脑脊液、抽吸细胞学。
13.根据前述权利要求的方法，其中所述生物样品组合物(a)中DNA的量是以小于500ng，小于100ng，小于50ng和大于1ng的最终浓度变化。
14.根据权利要求11-13的方法，其中所述扩增条件如下：
·第1阶段：在95℃下10分钟的1个循环
·第2阶段：45个循环，包含在92℃下30秒，在60℃下1分钟，并且从第25个循环开始每个循环温度降低0.2℃
·第3阶段：在57℃下1分钟的1个循环，并且采集信号。
15.一种治疗与基因hTERT的启动子中的突变c.124 C>T和/或c.-146 C>T相关的人类疾病的方法，其特征在于包含将适量的基因hTERT启动子的抑制剂给予这样的个体，其生物样品在基因hTERT启动子的突变c.-124 C>T和/或c.-146 C>T的检测测试中呈阳性，其包含权利要求11-14中任一项所述的方法步骤。
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