CN116479121A - 检测脑膜瘤和胶质瘤tert启动子突变的引物组、试剂盒、扩增方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因检测领域，尤其涉及检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的引物组、试剂盒、扩增方法和应用；所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的第一C228T突变基因探针、如SEQ ID NO.2所示第二突变型C228T突变基因探针、如SEQ ID NO.3所示第一C250T突变基因探针和如SEQ ID NO.4所示第二C250T突变基因探针；还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的第一GAPDH基因探针和如SEQ ID NO.6所示的第二GAPDH基因探针；设计C228T突变基因探针和C250T突变基因探针，引入GAPDH基因对样本质量的差异进行控制，能得到特异性表达的真正差异，实现一次性扩增就能检测出脑膜瘤和胶质瘤中的TERT启动子突变型。
Description
技术领域
本申请涉及基因检测领域，尤其涉及检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的引物组、试剂盒、扩增方法和应用。
背景技术
TERT(telomerase reverse transcriptase，端粒末端转移酶逆转录酶)突变与脑膜瘤的WHO分级级别、复发率、侵袭性等具有密切的关系，而且具有TERT启动子突变的脑膜瘤直接诊断为CNS WHO III级，是较为严重的脑膜瘤。目前TERT在绝大多数非肿瘤细胞中没有转录活性，但是约在73％的肿瘤中存在TERT突变，目前常见的TERT突变主要发生在TERT启动子的5号染色体的两个热点(1,295,228和1,295,250)，分别被命名为C228T突变和C250T突变。目前TERT启动子突变型脑膜瘤患者的中位无复发生存期为14个月，而TERT启动子野生型脑膜瘤患者的中位为101个月，因此与TERT启动子野生型脑膜瘤患者相比，有TERT启动子突变型脑膜瘤复发率增加了5.4倍、死亡率增加了3.6倍，在脑膜瘤患者中检测TERT启动子突变型显得十分必要。
同时TERT启动子突变中的C228T突变是更普遍的癌症相关TERT变体，其中又以少突胶质细胞瘤的突变比例最高，胶质瘤是中枢神经系统最常见、预后较差的恶性肿瘤，一般需要通过手术切除，但是切除之前需要先分析胶质瘤中的突变类型，方便对手术切除的部位和切除的方式进行确定，因此对TERT突变进行检测，是确定胶质瘤和脑膜瘤中的突变类型的重要方式之一。
目前针对基因突变的检测包括实时定量PCR、荧光原位杂交、流式细胞术、二代测序技术，它们都是通过患者血液、体液或组织细胞对DNA进行检测，但都因技术人员要求高、操作复杂、费用昂贵、报告周期长等缺点，导致其在实际的临床应用中十分受限，同时由于不同检测方法所用试剂的灵敏度不同，为了检测的准确，一般还需要多次取样，增加了检测步骤和费用，影响患者自身的情况。
为了解决灵敏度的问题，目前常规的技术手段是通过荧光定量PCR技术提高检测的灵敏程度，从而提高检测的准确性，但是目前针对脑膜瘤和胶质瘤的TERT启动子突变检测，由于探针引物的特异性要求不同，因此大多需要分开并采用不同的引物组进行检测，导致检测的时间过长，因此如何提供既能检测脑膜瘤又能检测胶质瘤中TERT启动子突变的探针引物组，是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的引物组、试剂盒、扩增方法和应用，以解决现有技术中引物组难以同时检测脑膜瘤和胶质瘤中TERT启动子突变的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的引物组，所述引物组包括第一C228T突变基因探针、第二突变型C228T突变基因探针和、第一C250T突变基因探针和第二C250T突变基因探针，所述第一C228T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述第二突变型C228T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第一C250T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二C250T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述引物组还包括第一GAPDH基因探针和第二GAPDH基因探针，所述第一GAPDH基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二GAPDH基因探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
可选的，所述引物组还包括第一GAPDH上游引物、第二GAPDH上游引物、第一GAPDH下游引物和第二GAPDH下游引物，所述第一GAPDH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述第二GAPDH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述第一GAPDH下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述第二GAPDH下游引物如SEQ ID NO.10所示。
可选的，所述第一C228T突变基因探针和第二C228T突变基因探针的5’端分别连接有第一报告基团，所述第一C228T突变基因探针和第二C228T突变基因探针的3’端分别连接有第一非荧光淬灭基团。
可选的，所述第一C250T突变基因探针和所述第二C250T突变基因探针的5’端分别连接有第二报告基团，所述第一C250T突变基因探针和所述第二C250T突变基因探针的3’端分别连接有第二非荧光淬灭基团。
可选的，所述第一报告基团和所述第二报告基团分别包括FAM或ROX。
可选的，所述第一非荧光淬灭基团和所述第二非荧光淬灭基团分别包括BHQ或MGB。
可选的，所述引物组还包括第一TERT上游引物、第二TERT上游引物、第一TERT下游引物和第二TERT下游引物，所述第一TERT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述第二TERT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述第一TERT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述第二TERT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
第二方面，本申请提供了一种检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物组。
第三方面，本申请提供了一种非诊断目的检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的扩增方法，所述扩增方法在第二方面所述的试剂盒中进行，所述扩增方法包括：
分别提取预设重量的离体肿瘤组织样品；
对所述肿瘤组织样品进行前处理，得到含目的基因的样品上清液；
向所述试剂盒中加入所述样品上清液和磁珠溶液，后进行PCR扩增反应，以得到纯化的扩增产物，其中，所述预设重量为2.5mg～5.0mg，所述肿瘤组织样品包括脑膜瘤组织样品和/或胶质瘤组织样品。
第四方面，本申请提供了一种检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的引物组的应用，将第一方面所述的引物组用于制备手术过程中快速检测脑膜瘤TERT启动子突变的检测试剂中。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一种检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的引物组的应用，通过设计的第一C228T突变基因探针、第二突变型C228T突变基因探针和、第一C250T突变基因探针和第二C250T突变基因探针，可以在同一次的检测过程中将脑膜瘤或者胶质瘤中的TERT启动子突变的C228T突变和C250T突变检测出，同时还引入了第一GAPDH基因探针和第二GAPDH基因探针作为内参基因，利用GAPDH基因对样本质量的差异进行控制，使得C228T突变和C250T突变分别通过设计的多组基因探针扩增后，能得到特异性表达的真正差异，方便脑膜瘤或者胶质瘤中的C228T突变和C250T突变分别和设计的多组基因探针进行特异性结合，进而在第一GAPDH基因探针和第二GAPDH基因探针的参与下，通过设计的第一C228T突变基因探针、第二突变型C228T突变基因探针和、第一C250T突变基因探针和第二C250T突变基因探针将脑膜瘤或者胶质瘤中的C228T突变和C250T突变准确的检测出，从而实现一次性扩增就能检测出脑膜瘤和胶质瘤中的TERT启动子突变型。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的方法的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的方法的详细流程示意图；
图3为本申请实施例提供的C228T突变阳性的PCR曲线示意图；
图4为本申请实施例提供的C250T突变阳性的PCR曲线示意图；
图5为本申请实施例提供的TRERT野生型的PCR曲线示意图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请的创造性思维为：
由于TERT启动子突变中的C228T突变和C250T突变可导致ETS转录因子家族成员的产生新的结合位点，而ETS(E26 transformation specific)家族转录因子在发育、细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤发生中起着至关重要的作用。与ETS结合的增加会导致TERT基因表达上调，其编码的蛋白质，也就是端粒酶逆转录酶，主要通过连续维持增殖的癌细胞的端粒长度来促进癌细胞的永生。多项基础研究发现，TERT与β-catenin、NF-kB、Sp1等协同作用，促进其靶基因的转录，从而诱导肿瘤细胞的上皮细胞-间充质转化(EMT)、侵袭、干细胞表型、血管生成以及耐药的产生，因此通过对TERT启动子突变中的C228T突变和C250T突变的检测，可以有效的确定脑膜瘤细胞和胶质瘤细胞的类型。
目前针对脑膜瘤的手术方案主要是行次全切除、全切除、完全切除术，但是不同的手术方案针对的是不同的脑膜瘤细胞的类型，如果能通过确定TERT启动子突变的装填，就能对于TERT启动子突变型脑膜瘤扩大切除范围，将极大的降低患者的术后复发率。
胶质瘤是中枢神经系统最常见、预后较差的恶性肿瘤。而2021年WHO中枢神经系统肿瘤分类中将分子特征正式纳入胶质瘤分类依据，且当组织学和分子特征不一致时，分子特征往往成为分类的主要决定因素，为胶质瘤精准诊断和治疗方案的准确制订提供了依据，其中，对分子特征中的基因突变进行检测，可以为胶质瘤精准诊断和治疗方案提供有力的证据。
但是目前针对基因突变的检测包括实时定量PCR、荧光原位杂交、流式细胞术、二代测序技术，它们都是通过患者血液、体液或组织细胞对DNA进行检测，但都因技术人员要求高、操作复杂、费用昂贵、报告周期长等缺点，导致其在实际的临床应用中十分受限，同时由于不同检测方法所用试剂的灵敏度不同，为了检测的准确，一般还需要多次取样，增加了检测步骤和费用，影响患者自身的情况。
为了解决灵敏度的问题，目前常规的技术手段是通过荧光定量PCR技术提高检测的灵敏程度，从而提高检测的准确性，目前流行的荧光定量PCR技术包括第一代DNA测序技术和第二代基因测序技术，其中，由于第二代测序开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序，在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记(一般为荧光分子标记)来确定DNA的序列，虽然二代测序相比较sanger测序虽然大幅降低了检测成本并保持了较高的准确性，然而由于探针引物的特异性要求不同，针对脑膜瘤细胞和胶质瘤细胞的类型的检测过程需要分开并采用不同的引物组进行检测，使得上样过程时间过长，从而导致检测的时间过长，因此如何提供既能检测脑膜瘤又能检测胶质瘤中TERT启动子突变的探针引物组，是目前亟需解决的技术问题。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
在本申请的一个实施例中，提供一种检测TERT启动子突变的引物组，所述引物组包括第一C228T突变基因探针、第二突变型C228T突变基因探针和、第一C250T突变基因探针和第二C250T突变基因探针，所述第一C228T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二突变型C228T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第一C250T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二C250T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述引物组还包括第一GAPDH基因探针和第二GAPDH基因探针，所述第一GAPDH基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二GAPDH基因探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
在一些可选的实施方式中，所述引物组还包括第一GAPDH上游引物、第二GAPDH上游引物、第一GAPDH下游引物和第二GAPDH下游引物，所述第一GAPDH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述第二GAPDH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述第一GAPDH下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述第二GAPDH下游引物如SEQ IDNO.10所示。
本申请实施例中，在引物组汇总引入第一GAPDH上游引物、第二GAPDH上游引物、第一GAPDH下游引物和第二GAPDH下游引物，利用多组GAPDH上游引物和GAPDH下游引物作为对照，在扩增阶段可以对多组C228T突变基因探针和多组C250T突变基因探针的扩增产物进行比对，一方面可以剔除反应阶段的误差，从而降低差异化扩增的产物的数量，另一方面可以避免差异化扩增产物对正确扩增产物的屏蔽，不仅方便低含量的C228T突变和C250T突变分别和设计的基因探针进行特异性结合，得到纯正的扩增产物，还可以使得后续检测阶段被检测出，从而提高了引物组的检测准确性，进而实现引物组对脑膜瘤和胶质瘤中的TERT启动子突变的准确检测，进而在第一GAPDH基因探针和第二GAPDH基因探针的参与下，既能检测出脑膜瘤的TERT启动子突变型又能检测出胶质瘤中的TERT启动子突变型。
在一些可选的实施方式中，所述第一C228T突变基因探针和第二C228T突变基因探针的5’端分别连接有第一报告基团，所述第一C228T突变基因探针和第二C228T突变基因探针的3’端分别连接有第一非荧光淬灭基团。
本申请实施例中，在第一C250T突变基因探针和第二C228T突变基因探针的5’端分别设计第二报告基团，而在其3’端分别设计第二非荧光淬灭基团，利用非荧光淬灭基团不发光的特性，能够大大降低本底信号的强度，使得带有荧光基团的基因探针和待测样本的模板结合后能有较亮的荧光信号，进而在第一GAPDH基因探针和第二GAPDH基因探针的参与下，既能检测出脑膜瘤的TERT启动子突变型又能检测出胶质瘤中的TERT启动子突变型。
在一些可选的实施方式中，所述第一C250T突变基因探针和所述第二C250T突变基因探针的5’端分别连接有第二报告基团，所述第一C250T突变基因探针和所述第二C250T突变基因探针的3’端分别连接有第二非荧光淬灭基团。
本申请实施例中，在第一C250T突变基因探针和第二C250T突变基因探针的5’端分别设计第二报告基团，而在其3’端设计第二非荧光淬灭基团，利用非荧光淬灭基团不发光的特性，能够大大降低本底信号的强度，使得带有荧光基团的基因探针和待测样本的模板结合后能有较亮的荧光信号，方便识别和筛选出TERT启动子的C250T突变，进而在第一GAPDH基因探针和第二GAPDH基因探针的参与下，既能检测出脑膜瘤的TERT启动子突变型又能检测出胶质瘤中的TERT启动子突变型。
在一些可选的实施方式中，所述第一报告基团和所述第二报告基团分别包括FAM或ROX。
本申请实施例中，控制第一报告基团、第二报告基团的种类，使得扩增出的产物能够带上较为亮的荧光，能够提高引物组被仪器识别到最小检测限，方便后续的检测和识别，进而提高检测的灵敏度。
在一些可选的实施方式中，所述第一非荧光淬灭基团和所述第二非荧光淬灭基团分别包括BHQ或MGB。
本申请实施例中，控制非荧光淬灭基团的种类，从而能进一步的通过控制报告基团和非荧光淬灭基团的种类，促使非荧光淬灭基团淬灭扩增不到位的基因片段，同时由于非荧光淬灭基团不带荧光，因此能凸显报告基团的荧光，即使在低含量的样本容量的条件下，也能将其检测出，从而够提高引物组的准确性。
在一些可选的实施方式中，所述引物组还包括第一TERT上游引物、第二TERT上游引物、第一TERT下游引物和第二TERT下游引物，所述第一TERT上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.11所示，所述第二TERT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述第一TERT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述第二TERT下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.14所示。
本申请实施例中，控制引物组中还设置第一TERT上游引物、第二TERT上游引物、第一TERT下游引物和第二TERT下游引物，利用多组TERT上游引物和下游引物对TERT基因进行扩增，从而能得到充足的检测样本。
接下来，描述本申请实施例提供的一种检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组。
由于本申请实施例所介绍的试剂盒，其包括的引物组为本申请实施例前述提供的引物组，故而在此不再赘述引物组中引物组的组成和各自的核苷酸序列。凡是包括本申请实施例的引物组的试剂盒都属于本申请所欲保护的范围。
接下来，如图1所示，描述本申请实施例提供的一种非诊断目的的检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的扩增方法，所述扩增方法在所述试剂盒中进行，所述扩增方法包括：
S1.提取预设重量的离体肿瘤组织样品；
S2.对所述肿瘤组织样品进行前处理，得到含目的基因的样品上清液；
S3.向所述试剂盒中加入所述样品上清液和磁珠溶液，后进行PCR扩增反应，以得到纯化的扩增产物；
其中，所述预设重量为2.5mg～5.0mg；所述肿瘤组织样品包括脑膜瘤组织样品和/或胶质瘤组织样品。
本申请实施例中，控制预设重量为2.5mg～5.0mg的积极效果是在该重量范围内，能保证TERT启动子突变的脑膜瘤或胶质瘤样本足够，同时能保证试剂盒中引物组对样本的扩增产物足够，使得检测结果的准确；当预设重量的取值大于该范围，说明TERT启动子突变的脑膜瘤或者胶质瘤的样本过量，会导致原料浪费，当预设重量的取值小于该范围，说明TERT启动子突变的脑膜瘤或者胶质瘤的样本量不足，引物组无法扩增出充足的样本量，影响最终检测的准确性。
在一些可选的实施方式中，如图2所示，所述对所述肿瘤组织样品进行前处理，得到含目的基因的样品上清液，具体包括：
S21.向动物样本前处理试剂盒中加入所述肿瘤组织样品，后在小于或等于基准温度的低温条件下进行离心，得到含目的基因的样品上清液；
其中，所述基准温度为8℃，所述离心的转速≥6000rpm，所述离心的时间为2min～4min。
本申请实施例中，控制基准温度为8℃，使得样本保持在较低温度的状态，维持肿瘤细胞的活性。
控制离心的转速在6000rpm，不仅可以使肿瘤细胞组织的破碎完全，得到肿瘤细胞，还能使得肿瘤细胞在动物样本前处理试剂盒中被充分的破碎，释放出目的基因。
控制离心的时间为2min～4min的积极效果是在该时间范围内，使得肿瘤细胞组织的破碎完全，得到肿瘤细胞，同时还能进一步对肿瘤细胞进行破碎，释放出目的基因。
接下来，描述本申请实施例提供的一种检测TERT启动子突变的引物组的应用，将所述引物组用于制备快速检测TERT启动子突变的检测试剂中。
由于本申请实施例所介绍的应用，其包括的引物组为本申请实施例前述提供的引物组，故而在此不再赘述引物组中引物组的组成和各自的核苷酸序列。凡是包括本申请实施例的引物组的应用都属于本申请所欲保护的范围。
实施例1
一种检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的引物组，引物组包括第一C228T突变基因探针、第二突变型C228T突变基因探针和、第一C250T突变基因探针和第二C250T突变基因探针，第一C228T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二突变型C228T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第一C250T突变基因探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，第二C250T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
引物组还包括第一GAPDH基因探针和第二GAPDH基因探针，第一GAPDH基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，第二GAPDH基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
引物组还包括第一GAPDH上游引物、第二GAPDH上游引物、第一GAPDH下游引物和第二GAPDH下游引物，第一GAPDH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，第二GAPDH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，第一GAPDH下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，第二GAPDH下游引物如SEQ ID NO.10所示。
引物组还包括第一TERT上游引物、第二TERT上游引物、第一TERT下游引物和第二TERT下游引物，第一TERT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，第二TERT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，第一TERT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，第二TERT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
引物组的具体核苷酸序列如表1所示。
表1引物组核苷酸序列情况表
| 引物组名称 | 序列号 | 序列 |
| 第一C228T突变基因探针 | SEQ ID NO.1 | 5’-CCCAGCCCCTTCC-3’ |
| 第二C228T突变基因探针 | SEQ ID NO.2 | 5’-CGGAAGGGGCTGG-3’ |
| 第一C250T突变基因探针 | SEQ ID NO.3 | 5’-CCCGACCCCTTCC-3’ |
| 第二C250T突变基因探针 | SEQ ID NO.4 | 5’-CGGAAGGGGTCGG-3’ |
| 第一GAPDH上游引物 | SEQ ID NO.5 | 5’-CCAATAGAATTCAACTGCGAGC-3’ |
| 第二GAPDH上游引物 | SEQ ID NO.6 | 5′-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3′ |
| 第一GAPDH下游引物 | SEQ ID NO.7 | 5’-GGTTAATGAGGCTATCTCCACA-3’ |
| 第二GAPDH下游引物 | SEQ ID NO.8 | 5′-GAGCGGCTGTCTCCCACAAGT-3′ |
| 第一GAPDH基因探针 | SEQ ID NO.9 | 5′-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGC-3′ |
| 第二GAPDH基因探针 | SEQ ID NO.10 | 5’-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3’ |
| 第一TERT上游引物 | SEQ ID NO.11 | 5’-AAGGAAGGGGAGGGGCTG-3’ |
| 第二TERT 上游引物 | SEQ ID NO.12 | 5’-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3’ |
| 第一TERT下游引物 | SEQ ID NO.13 | 5′-GGCTCCCAGTGGATTCG-3′ |
| 第二TERT下游引物 | SEQ ID NO.14 | 5’-GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’ |
其中，第一C228T突变基因探针和第二C228T突变基因探针的5’端分别连接有第一报告基团FAM，第一C228T突变基因探针和第二C228T突变基因探针的3’端分别连接有第一非荧光淬灭基团MGB；
第一C250T突变基因探针和第二C250T突变基因探针的5’端分别连接有第二报告基团ROX，第一C250T突变基因探针和第二C250T突变基因探针的3’端分别连接有第二非荧光淬灭基团MGB。
实施例2
将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：
还提供一种检测TERT启动子突变的试剂盒，包括引物组。
其中，试剂盒采用GBS核酸检测试剂盒，具体成分如表2所示。
表2 GBS核酸检测试剂盒的成分表
实施例3
将实施例3和实施例2进行对比，实施例3和实施例2的区别在于：
还提供一种非诊断目的的检测脑膜瘤TERT启动子突变的扩增方法，扩增方法在含有引物组的GBS核酸检测试剂盒中进行，包括：
S1.提取预设重量的离体脑膜瘤组织样品；
S21.向GeneReady动物样本前处理试剂盒(KT01-200/KT01-400)中加入脑膜瘤组织样品，后在小于或等于基准温度的低温条件下以生物样品低温快速离心系统(BSH-CL2)进行离心匀浆处理，得到含目的基因的样品上清液；
其中，基准温度为8℃，震荡时间为45s/cycles，循环数为1cycles，离心的转速为6000rpm，离心的时间为3min；
S3.向试剂盒中加入200μL样品上清液和10μL磁珠溶液，移液枪吹匀后盖紧试剂检测卡盒，后进行PCR扩增反应，以得到纯化的扩增产物；其中，PCR扩增反应的程序如表3所示。
表3 PCR反应程序情况表
S4.对纯化的扩增产物上荧光定量PCR仪Life Ready K1000进行检测，利用仪器自带的全自动核酸检测分析系统对样本进行处理，得到检测数据。
其中，AIGS仪器的荧光通道设计如表4所示。
表4 AIGS仪器的荧光通道情况表
| Detector | Target |
| FAM | TERT(C228T)突变基因 |
| ROX | TERT(C250T)突变基因 |
| CY5 | 内标基因 |
实施例4
将实施例4和实施例3进行对比，实施例4和实施例3的区别在于：
为了保证取样量的合适，选取两组脑膜瘤样本，其中A组为TERT C250T突变型，B组为TERT C228T突变型，C组为TERT野生型，进行两轮实验，其中，第一轮实验将每组样本分为2.5mg、5mg、7.5mg和10mg，再提取脑膜瘤的含目的基因的样品上清液后，各取200μL上清液上机检测；第二轮实验将每组样本分为四等份的5mg重量的样本，但在上机检测的上清液体积进行梯度递减(200μL、100μL、50μL和25μL)，得到如表5的数据。
表5
表5中分析得出，在仪器默认的40个固定循环内，既要保证结果的准确性，又要避免浪费样本，因此最佳的取样量为2.5mg～5mg，此时的循环阈值(CT)在22～25之间。
实施例5
将实施例5和实施例4进行对比，实施例5和实施例4的区别在于：
在确定了最佳取样量后，对10例脑膜瘤患者的肿瘤样本进行检测，并以二代测序技术(NGS)作为检测金标准，检测结果如四格表的表6所示。
表6
由表6可知，在10例实际脑膜瘤患者样本的检测中，检测的总体准确率达到了100％，同检测过程中，TERT突变型中的C228T突变和C250T突变以及TERT野生型的CT值和荧光浓度的关系如图3至图5所示，其中，CT阈值的确定是根据扩增反应过程中荧光采集的情况给出一条扩增曲线(荧光曲线)，同时设置一条水平线(阈值线)，将阈值线拉至荧光曲线拐点处，两线交叉处的循化数即为CT值。
并且数据读取需满足：
如果FAM及Cy5曲线呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，则样品判为存在C228T突变。
如果ROX及Cy5曲线呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，则样品判为存在C250T突变。
如果仅有内部质控Cy5曲线呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，则样品判为未检测到目的基因，考虑TERT启动子突变阴性。
若FAM、ROX、Cy5均呈现阴性时，则表明卡盒试剂失效或故障，样本需要重新取样后检测。
数据读取需满足的情况如表7所示。
表7实时荧光PCR曲线图的结果判定情况表
由表5和表6，结合图3、图4和图5可知，本申请的试剂盒对脑膜瘤的准确性为100％，检测灵敏度为100％，特异度为100％，阳性预测值为100％，总符合率达到100％，由且由于采用了一体化的GBS试剂盒装置和AIGS实时荧光PCR仪器，使得整体检测结果的耗时在55min内，结果由设定程序自动生成，图像判读简便。
实施例6
将实施例6和实施例2进行对比，实施例6和实施例2的区别在于：
还提供一种非诊断目的的检测胶质瘤TERT启动子突变的扩增方法，扩增方法在含有引物组的GBS核酸检测试剂盒中进行，包括：
S1.提取预设重量的离体胶质瘤组织样品；
S21.向GeneReady动物样本前处理试剂盒(KT01-200/KT01-400)中加入胶质瘤组织样品，后在小于或等于基准温度的低温条件下以生物样品低温快速离心系统(BSH-CL2)进行离心匀浆处理，得到含目的基因的样品上清液；
其中，基准温度为4℃，震荡时间为45s/cycles，循环数为1cycles，离心的转速为6000rpm，离心的时间为3min；
S3.向试剂盒中加入200μL样品上清液和10μL磁珠溶液，盖紧试剂检测卡盒，后进行PCR扩增反应，以得到纯化的扩增产物；其中，PCR扩增反应的程序如表3所示。
S4.对纯化的扩增产物上AIGS仪器检测，利用AIGS仪器自带的系统对样本进行处理，实施例7
将实施例7和实施例6进行对比，实施例7和实施例6的区别在于：
为了保证取样量的合适，选取两组胶质瘤样本，其中A组为TERT C250T突变型，B组为TERT C228T突变型，C组为TERT野生型，进行两轮实验，其中，第一轮实验将每组样本分为2.5mg、5mg、7.5mg和10mg，再提取胶质瘤的含目的基因的样品上清液后，各取200μL上清液上机检测；第二轮实验将每组样本分为四等份的5mg重量的样本，但在上机检测的上清液体积进行梯度递减(200μL、100μL、50μL和25μL)，得到如表9的数据。
表9
表3中分析得出，在仪器默认的40个固定循环内，既要保证结果的准确性，又要避免浪费样本，因此最佳的取样量为2.5mg～5mg，此时的循环阈值(CT)在22～25之间。
实施例8
将实施例8和实施例7进行对比，实施例8和实施例7的区别在于：
在确定了最佳取样量后，对30例胶质瘤患者的肿瘤样本进行检测，并以二代测序技术(NGS)作为检测金标准，检测结果如表10所示。
表10
由表10可知，在30例实际胶质瘤患者样本的检测中，检测的总体准确率达到了100％，同检测过程中，TERT突变型中的C228T突变和C250T突变以及TERT野生型的CT值和荧光浓度的关系如图3至图5所示，其中，CT阈值的确定是根据扩增反应过程中荧光采集的情况给出一条扩增曲线(荧光曲线)，同时设置一条水平线(阈值线)，将阈值线拉至荧光曲线拐点处，两线交叉处的循化数即为CT值。
由上述实施例的数据可知，采用本申请的引物组，其对脑膜瘤和胶质瘤的TERT启动子突变型检测具有准确度高、灵敏度高以及特异性强的特点，因此采用本申请的引物组、试剂盒和扩增方法，能作为可靠的床旁手术中辅助诊断工具，不仅能够对术中快速组织病理诊断结果起到补充作用，也能为将来术中治疗方式的改进、术中靶向分子治疗、肿瘤分子全切等提供重要的分子依据。
同时本申请采用的引物，可以通过第一C228T突变基因探针和第二C228T突变基因探针为一个通道、第一C250T突变基因探针和第二C250T突变基因探针为一个通道，第一GAPDH上游引物、第二GAPDH上游引物、第一GAPDH下游引物、第二GAPDH下游引物、第一GAPDH基因探针和第二GAPDH基因探针为一个通道，组成三色三通道核酸扩增反应液，不仅能加快反应的进行，节约反应的时间，另外搭配GBS试剂盒，能缩短反应时间至1h内，还能通过实时的荧光检测，反映出低含量的样本容量如何被检测出的。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括第一C228T突变基因探针、第二突变型C228T突变基因探针和、第一C250T突变基因探针和第二C250T突变基因探针，所述第一C228T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二突变型C228T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第一C250T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二C250T突变基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述引物组还包括第一GAPDH基因探针和第二GAPDH基因探针，所述第一GAPDH基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二GAPDH基因探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括第一GAPDH上游引物、第二GAPDH上游引物、第一GAPDH下游引物和第二GAPDH下游引物，所述第一GAPDH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述第二GAPDH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述第一GAPDH下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述第二GAPDH下游引物如SEQ ID NO.10所示。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一C228T突变基因探针和第二C228T突变基因探针的5’端分别连接有第一报告基团，所述第一C228T突变基因探针和第二C228T突变基因探针的3’端分别连接有第一非荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述第一C250T突变基因探针和所述第二C250T突变基因探针的5’端分别连接有第二报告基团，所述第一C250T突变基因探针和所述第二C250T突变基因探针的3’端分别连接有第二非荧光淬灭基团。
5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述第一报告基团和所述第二报告基团分别包括FAM或ROX。
6.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述第一非荧光淬灭基团和所述第二非荧光淬灭基团分别包括BHQ或MGB。
7.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括第一TERT上游引物、第二TERT上游引物、第一TERT下游引物和第二TERT下游引物，所述第一TERT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述第二TERT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述第一TERT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述第二TERT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
8.一种检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-7任一项所述的引物组。
9.一种非诊断目的的检测脑膜瘤和胶质瘤TERT启动子突变的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法在权利要求8所述的试剂盒中进行，所述扩增方法包括：
提取预设重量的离体肿瘤组织样品；
对所述肿瘤组织样品进行前处理，得到含目的基因的样品上清液；
向所述试剂盒中加入所述样品上清液和磁珠溶液，后进行PCR扩增反应，以得到纯化的扩增产物，其中，所述预设重量为2.5mg～5.0mg，所述肿瘤组织样品包括脑膜瘤组织样品和/或胶质瘤组织样品。
10.一种检测脑膜瘤TERT启动子突变的引物组的应用，其特征在于，将如权利要求1-7任一项所述的引物组用于制备手术过程中快速检测脑膜瘤TERT启动子突变的检测试剂中。
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