CN110951843A

CN110951843A - 一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN110951843A
Application number: CN201911274235.9A
Authority: CN
Inventors: 张惠丹; 戴敬; 杨丽萍; 赵洪玉
Original assignee: Suzhou Huizhen Medical Testing Co ltd
Current assignee: Suzhou Huizhen Medical Testing Co ltd
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2020-04-03

Abstract

本发明涉及一种试剂盒及其应用，特别涉及一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒及方法，属于核酸检测技术领域。一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒，该试剂盒包含上述用于检测HER2基因拷贝数变异的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑6所示引物对及检测探针1和检测探针2、预混液和校准标准品（包含：阴性对照品及阳性对照品）。本发明针对循环肿瘤细胞进行检测，实现对肿瘤用药、用药监测、复发检测等的无创、高灵敏度、高准确性的实时监控。试剂盒对低投入量样本的绝对定量准确性、灵敏度、重复性良好；对低频突变的检出有良好的结果。

Description

一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种试剂盒及其应用，特别涉及一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒及方法，属于核酸检测技术领域。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指脱离了肿瘤原发部位和转移部位而进入血液循环中的各类肿瘤细胞。CTC在肿瘤早期发现、指导用药、预后复发检测、肿瘤转移提示等方面有明显的优势。一、恶性肿瘤早期诊断，研究表明在早期的无症状的恶性肿瘤患者外周血中也可检测到少量的CTCs；二，CTCs与原发病灶肿瘤细胞具有相似的基因遗传学特征，能够实现无创、可持续性监测肿瘤病程，并指导用药；三，持续监测预后复发状况。

HER2基因属于EGFR家族成员之一。阳性表达可见于各种癌症，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、涎腺肿瘤、肺癌、胆管癌、膀胱癌、前列腺癌、结直肠癌等。在肿瘤的诊断、用药中有以下几个重要作用，一、与肿瘤的发生、发展、转移相关，二、重要的临床治疗监测及预后指标，三、肿瘤靶向治疗药物选择的一个重要靶点。临床发现HER2与乳腺癌患者的肿瘤负荷、淋巴结状况有一定关联，转移风险高，预后较差，病情进展迅速，化疗缓解期短，内分泌治疗效果差，是环磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶和赫赛汀的主要参考指标。因此，检测HER2基因过表达情况有助于了解癌基因状况、预测癌症的发展及预后、帮助用药指导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测HER2基因拷贝数变异的引物对及检测探针，所述的引物对及检测探针在检测HER2基因拷贝数变异时灵敏度高，特异性强。

本发明还提供了一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人循环肿瘤细胞HER2基因拷贝状态。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于检测HER2基因拷贝数变异的引物对及检测探针1，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其检测探针1核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测探针1为FAM荧光基团标记。

一种用于检测HER2基因拷贝数变异的引物对及检测探针2，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其检测探针2核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述检测探针2为CY5荧光基团标记。

一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒，该试剂盒包含上述用于检测HER2基因拷贝数变异的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-6所示引物对及检测探针1和检测探针2、预混液和校准标准品(包含：阴性对照品及阳性对照品)。

作为优选，所述试剂盒的阴性对照样品是：K562细胞系提取DNA稀释至1ng/μl；阳性对照样品是：SW480细胞系提取DNA稀释至1ng/μl。

一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的非诊断方法，该方法具体是：

①提取待测样本的DNA作为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示引物作为扩增引物，并加入SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示检测探针、ddPCR预混液和ddH₂O，进行ddPCR扩增，

②对扩增产物进行拷贝数统计并将HER2基因的拷贝数简写为H、EFTUD2基因的拷贝数简写为E，计算H/E的比值，若H/E≥1.2，则判定HER2扩增阳性；若H/E＜1.2，则判定HER2扩增阴性。

本发明针对循环肿瘤细胞进行检测，实现对肿瘤用药、用药监测、复发检测等的无创、高灵敏度、高准确性的实时监控。

HER2基因在肿瘤中主要表现为过表达。目前对HER2基因表达量的检测一般采用经典的免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)及PCR定量，荧光原位杂交(FISH)技术被认为是目前检测HER-2基因是否存在扩增的“金标准”；PCR定量主要有两大类，实时荧光定量PCR和数字PCR。IHC及FISH检测针对合适的组织样本，且有一定的几率无法判断是否为HER2阳性，而分类为不确定样本；对无法得到合适组织样本的患者，无法进行检测。在两种PCR方法中，数字PCR较定量PCR精确度更高，灵敏度更高，特别是低检测量样本使用数字PCR可以实现。

数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，ddPCR的优势在于精确度高，可达到万分之一，灵敏度非常高，尤其适用于痕量、不易得到的待检样品。ddPCR可以检测低丰度突变组织、穿刺样本、低于10ml全血等突变含量在万分之一以内的困难样本，这对不适合手术的患者来说是急需的检测方法；ddPCR采用多通道荧光，可以在同一扩增体系内检测目标基因和参考基因的拷贝数。本发明采用ddPCR进行检测，有助于肿瘤病程的监测以及早发现、早处理。

目前PCR检测方法中采用的内参基因有：CEP17、EFTUD2、EIF2C1等三个。其中，CEP17容易与HER2一起发生共扩增，而EFTUD没有与ERBB2共扩增；同时，1号染色体不能排除17号染色体多倍体带来的影响，而17号染色体多倍体的病理表现与HER2扩增阴性表现相似。因此，本发明使用EFTUD2作为参考基因。

本检测试剂盒的阴性对照样品是：K562细胞系提取DNA稀释至1ng/μl，每批次检测添加阴性对照样品以校验检测批次的准确性；本检测试剂盒的阳性对照样品是：SW480细胞系提取DNA稀释至1ng/μl，每批次检测添加阳性对照样品以校验检测批次的准确性。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供了用于人CTCs HER2、EFTUD2基因拷贝数检测的引物和探针，该引物和探针灵敏度高、特异性强的优点。所设引物、探针能够特异性结合突变序列，且结合稳定，能够实现单拷贝模板条件下的有效扩增；

2、本发明提供了成本低、精度高、灵敏度高、准确度高、重复性好、样本投入低、绝对定量的检测人循环肿瘤细胞HER2基因拷贝数检测试剂盒。试剂盒对低投入量样本的绝对定量准确性、灵敏度、重复性良好；对低频突变的检出有良好的结果。

附图说明

图1是实施例2中阴性样本的检测结果图；

图2是实施例3中阴性样本的检测结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

仪器：外周血循环肿瘤细胞(CTCs)分析系统；型号：cellsearch；厂商：美国veridex；功能：系统是一个采用独创的免疫磁性技术进行微量细胞分析的先进诊断研究平台，它可以对血液里微量细胞进行精确的可复验分析，其中包括对上皮循环癌细胞和内皮循环细胞等多种细胞的分析。

本发明以CTCs为检测投入物，目前的富集方法主要有两种：基于免疫学和基于生物物理学的富集技术。本具体实施例中使用的是

系统。

实施例1：用于检测HER2基因拷贝数变异的特异PCR引物及检测探针序列

1、序列获得：本发明所涉及的HER2、EFTUD2基因检测位点见表1。

表1

基因	基因位点区域
		HER2	17q12
EFTUD2	17q21.31

2、设计方法：根据NCBI数据库公布的HER2、EFTUD2基因序列，设计特异的引物和检测探针(表2)。

表2、HER2、EFTUD2引物和检测探针序列表

引物名称	引物序列	荧光	序列名称
				HER2-F	CTAGCACC TTGCTAAGCA		SEQ ID NO：1
HER2-R	AGCACCATTCACAGAAA		SEQ ID NO：2
				HER2-P	CCAGGAGGCACCATTCACATTG	FAM	SEQ ID NO：3
EFTUD2-F	CTTCCTTCTTGCCTATTC		SEQ ID NO：4
				EFTUD2-R	CTGTCTAGTCTTAGTCTTATG		SEQ ID NO：5
EFTUD2-P	TGCCTCCTCTCCAGTGAC	CY5	SEQ ID NO：6

实施例2：应用一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒及方法检测阴性样本中的HER-2基因拷贝数的变异情况。

其中，阴性对照样品是：K562细胞系提取DNA稀释至1ng/μl；阳性对照样品是：SW480细胞系提取DNA稀释至1ng/μl。

一、CTCs分离

以HER2基因拷贝数变异阴性肿瘤患者循环肿瘤细胞为例。取肿瘤患者全血4-10ml，离心分离血浆。血浆用

系统各富集CTCs，要求不少于20个的CTCs，10μl的NFH₂O重悬细胞。

二、数字PCR反应液制备

1.4℃解冻5×引物混合物、2×定量预混液，使用前将这些试剂涡旋5-10秒，1000rpm离心10秒，收集试剂到管底。

5×引物混合物，为表1中SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6所示引物及探针按1：1：1：1：1：1比例混合；

2×定量预混液中含有：氯化钾(100mmol/L),氯化镁(1.5mmol/L)，三羟甲基氨基甲烷(pH值为7.4，10mmol/L),乙二胺四乙酸(0.1mmol/L)，二硫苏糖醇(1mol/L),吐温20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯,0.5％),乙基苯基聚乙二醇(0.5％)，甘油(50％)；dATPs(4mol/L),dTTPs(4mol/L)，dCTPs(4mol/L),dGTPs(4mol/L),PCR酶(300000units/L)。

2.为补偿在转管过程中的损失，在配置扩增混合物时，曾加0.1-2个反应。

3.扩增混合物组成：

4.标记PCR反应管，分装扩增混合物到每个标记后的PCR反应管底部。

5.将分离所得CTC收集液样本至标记样本的PCR反应管底部。

6.分别添加阴性对照样品(1ng/μl)、阳性对照样品(1ng/μl)及NFH₂O各5μl，添加至标记阴性对照样品、阳性对照样品及空白对照的PCR反应管底部。

三、PCR反应微滴制备

1.打开微滴制备仪。

2.将配好的25μl体系混匀，依次转移到微滴发生卡。

3.在油孔中加入微滴生成油。

4.选择设置好的微滴制备程序，编辑样本。

5.制备完成后，移出制备好的样本，进行下一步PCR反应。

PCR扩增

PCR仪(Bio-RAD C1000 96孔梯度扩增仪(1851197)

扩增条件

将完成PCR反应体系添加的PCR管转移至PCR仪上，反应条件如下：

若出现扩增困难样本，可适当增加扩增循环数，但不可高于55个循环。扩增完全后，产物立即进行分析。

扩增产物分析

将扩增后样品转移至信号采集仪。选择相应的程序对实验结果进行分析计算。

数据分析后输出检测结果图像如图1所示。阴性样本中FAM/CY5液滴数小于1.2。

实施例3：应用一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒及方法检测阳样本中的HER-2基因拷贝数的变异情况。

CTCs分离

数字PCR反应液制备

3.扩增混合物组成：

5.将分离所得CTC收集液样本至标记样本的PCR反应管底部。

6.分别添加阴性对照样品(1ng/μl)、阳性对照样品(1ng/μl)及NFH2O各5μl，添加至标记阴性对照样品、阳性对照样品及空白对照的PCR反应管底部。

PCR反应微滴制备

1.打开微滴制备仪。

2.将配好的25μl体系混匀，依次转移到微滴发生卡。

3.在油孔中加入微滴生成油。

4.选择设置好的微滴制备程序，编辑样本。

5.制备完成后，移出制备好的样本，进行下一步PCR反应。

PCR扩增

PCR仪(Bio-RAD C1000 96孔梯度扩增仪(1851197)

扩增条件

扩增产物分析

数据分析后输出检测结果图像如图2所示。阳样本中FAM/CY5液滴数大于1.2。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110> 苏州绘真医学检验有限公司

<120> 一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒及方法

<130> W-HLY19-107

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(HER2-F)

<400> 1

ctagcacctt gctaagca 18

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(HER2-R)

<400> 2

agcaccattc acagaaa 17

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(HER2-P)

<400> 3

ccaggaggca ccattcacat tg 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(EFTUD2-F)

<400> 4

cttccttctt gcctattc 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(EFTUD2-R)

<400> 5

ctgtctagtc ttagtcttat g 21

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(EFTUD2-R)

<400> 6

tgcctcctct ccagtgac 18

Claims

1.一种用于检测HER2基因拷贝数变异的引物对及检测探针1，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其检测探针1核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测探针1为FAM荧光基团标记。

2.一种用于检测HER2基因拷贝数变异的引物对及检测探针2，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其检测探针2核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述检测探针2为CY5荧光基团标记。

3.一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1和权利要求2所述的引物对及检测探针、预混液和校准标准品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的阴性对照样品是：K562细胞系提取DNA稀释至1 ng/µl；阳性对照样品是：SW480细胞系提取DNA稀释至1 ng/µl。

5.一种基于ddPCR检测CTCs的HER2拷贝数变异的非诊断方法，其特征在于该方法具体是：

①提取待测样本的DNA作为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所示引物作为扩增引物，并加入SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示检测探针、ddPCR预混液和ddH₂O，进行ddPCR扩增，