CN107904289A - 提高egfr基因19外显子缺失突变检测特异性的方法及应用 - Google Patents

提高egfr基因19外显子缺失突变检测特异性的方法及应用 Download PDF

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田振华
于源华
姜金兰
张晓�
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Abstract

一种提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法及应用，属于微生物检测技术领域，其方法是：特异性扩增EGFR基因19缺失突变位点区域的前引物和后引物，所述的前引物末端与野生型不匹配而与突变型匹配，本引物末端多出2个错配位点，并在第4位人为的再引入一个错配，有效的防止野生型对检测的影响。该特异性前引物和后引物一起扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50‑200bp;特异性针对扩增产物的taqman探针，其Tm高于引物9‑12℃，所述的探针携带能检测的荧光标记。有益效果是：通过采用改进型ARMS引物，建立了ARMS法和taqman探针法相结合的方法，大大增加了19外显子检测的特异性。具有灵敏度高特异性好的特点，适合高通量，微量样本的检测。

Description

提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法及应用
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，近50年来许多国家报道的肺癌的发病率和死亡率均明显增高趋势。由于肺癌的病因至今尚不完全明确以及前期诊断手段的缺失，大多数患者往往不能得益于临床治疗。比如，临床上最常用的化学治疗对非小细胞肺癌也仅有30％-40％的疾病缓解率，且一般不能治愈非小细胞肺癌，只能延长患者生存而且对患者的生活质量有很大影响。
大量研究表明，EGFR基因是肺癌的重要基因靶点，TK类药物吉非替尼和厄洛替尼等分子药物对肺癌有很好的疗效，而吉非替尼和厄洛替尼的疗效与EGFR基因突变状况密切相关。然而，临床上TK类药物并不是对所有的患者有效，因此在临床用药选择时，EGFR基因的诊断特别是占总突变比例较大的外显子19突变的检测就显得尤为重要。
现在，检测肺癌基因突变的方法最主要是DNA测序法，需要获取肿瘤组织、分离肿瘤细胞、提取核酸和进行测序，所需时间长，费用高，对取材和技术要求都比较严格，因此应用于临床仍受到一定程度的限制。另还有毛细管电泳法，聚合酶链式反应-单链构象多态性分析等方法，但它们不仅操作繁琐，而且需要专门的仪器。用于EGFR基因19外显子突变检测的样本主要包括肿瘤组织样本和血液样本，其中组织样本成份复杂，除了肿瘤组织DNA，也含有部分正常组织DNA，加上肿瘤本生的异质性，其待检测突变在样本中所占的比例往往低于20％(测序要求的最低浓度)。血液样本肿瘤组织DNA含量更少，检测困难。
发明内容
本发明的目的是：提供一种提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法及应用，通过采用改进型ARMS引物，建立了ARMS法和taqman探针法相结合的方法，大大增加了19外显子检测的特异性。
本发明的技术方案是：
本发明的检测特异性的方法是：特异性扩增EGFR基因19缺失突变位点区域的前引物和后引物，所述的前引物末端与野生型不匹配而与突变型匹配，特别的与常规的ARMS引物相比，本引物末端多出2个错配位点，并在第4位人为的再引入一个错配，大大提高了其特异性，有效的防止野生型对检测的影响。该特异性前引物和后引物一起扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50-200bp；特异性针对扩增产物的taqman探针，其Tm高于引物9-12℃，所述的探针携带能检测的荧光标记。
所述的前引物为ARMS引物，与突变基因存在一个碱基的不同其余完全互补，与野生型存在3-4个碱基不同(常规仅有1个不同)，其余完全互补，长度为17-25bp；较佳地为18-22bp。
经过优化得到的探针序列前引物及后引物序列如下：
探针：
FAM-CGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTG-BHQ1
后引物：
R1：5’-ATGAGAAAAGGTGGGCCTGA-3’
R2：:5’-CTGAGGTTCAGAGCCATG-3’
前引物：2237-2251DEL15 5’-GTCGCTATCAAGGCAGCTC-3’
本发明公开了一种检测人类EGFR基因突变的应用，包括以下步骤:
(1)提供上述引物和探针；
(2)待测样品的处理和模板的提取；
(3)配制荧光定量PCR反应体系；
(4)用步骤(1)的引物和探针扩增待测的突变基因靶序列；
(5)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过监测反应过程中的荧光强度变化来区分野生型和突变型。
所述的检测人类EGFR基因突变的方法，其中步骤(2)所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。
经过优化得到的最佳的反应体系为：
其中所用的酶为TAKALA的rTaq酶，总体系为25ul，在保证各组分浓度不变的情况下，也可调整为20ul，也能取得良好的结果。
经过优化得到的反应程序:
94℃ 3min
94℃ 30s
60℃ 10s
40个循环并且在第三步60℃ 10s结束时收集检测FAM荧光。
本发明的有益效果是：通过采用改进型ARMS引物，建立了ARMS法和taqman探针法相结合的方法，大大增加了19外显子检测的特异性。具有灵敏度高特异性好的特点，适合高通量，微量样本的检测。
附图说明
图1是本发明实时荧光定量扩增曲线；
图2是本发明测序结果；
图3是本发明引物A/A1/A2/A3特异性强弱对比(A)；
A1出现S型曲线，且其CT值为24，在阳性结果判读之内。该引物不能区分突变型和野生型。
图4是本发明引物A/A1/A2/A3特异性强弱对比(B)；
A2出现S型曲线，其CT值为28左右，比A1特异性好，结合内参基因可区分出野生型和突变型。但是其特异性仍不理想。
图5是本发明引物A/A1/A2/A3特异性强弱对比(C)；
A3出现S型曲线，其CT值为29.5左右，比A2特异性好，结合内参基因可区分出野生型。
图6是本发明引物A/A1/A2/A3特异性强弱对比(D)；
A完全没有特异性曲线，本身就可以区分出野生型和突变型，不需要内参即可区分阳性和阴性。
经对比可知道本发明设计的新型ARMS引物的特异性较常规的ARMS引物具有很大的优势，很好的解决了常规方法特异性不好的缺点。
图7是本发明检测分辨率及灵敏度(A)；
图8是本发明检测分辨率及灵敏度(B)；
图9是本发明阳性样本扩增曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步描述：
实施例1
新型ARMS引物的特异性实验
经过优化的检测反应体系为：
经优化的反应程序为：
94℃ 3min
94℃ 30s
60℃ 10s
40个循环，60℃ 10s后收集荧光。
用优化出来的引物探针按照上述体系及PCR程序用eppendorf realplex实时荧光定量PCR仪进行反应，结果为:用于检测EGFR基因突变的引物ARMS引物仅能特异性扩增含EGFR基因突变的阳性样本，而对于含有其他类型基因突变的阳性样本无扩增曲线。且经测序验证阳性样本确实为外显子19确实突变(如图2所述)。其实时荧光定量扩增曲线图如图1所示。结果表明本发明筛选得到的引物是经过严格的设计和验证的，具有高度的特异性。
新型引物与常规引物特异性对比实验
为验证该引物的特异性，并说明该方法的优越性，特与常规的引物进行比较。因野生型和突变型大部分序列都相同，常规引物因其特异性较差，会与野生型发生假性的结合，从而出现假阳性，新型引物特异性较强，大大避免了此情况的发生。
新型ARMS前引物A＝5’-G TCGCTATCAA GGCA GCTC-3’
AATT
常规引物A1＝5’-TCCCGTCGCTATCA AGGC-3’
TCCT
A2＝5’-TCCCGTCGCTATCA TGGC-3’
TCCT
A3＝5’-TCCCGTCGCTATCA CGGC-3’
TCCT
根据引物错配规则，强错配有A/G C/T弱错配有A/C G/T中度错配有A/A C/C G/GT/T。
其中引物A1仅有末端一个C/C错配，引物A2人为的在第三位引入一个错配T/T，进一步提高其特异性，引物A3人为引入的是强错配C/T而本发明设计的新型ARMS引物A通过将引物向3’端位移2个碱基，使其末端错配碱基达到3个，并且人为的在第三位引入一个强错配，进一步增加其特异性。采用上述体系和PCR程序，除了引物不同其他条件均相同，上机检测阴性质粒，即正常未突变的序列。
A1出现S型曲线，且其CT值为24，在阳性结果判读之内。该引物不能区分突变型和野生型。
检测灵敏度及分辨率试验
将构建的外显子19质粒标准品按照100/101/102/103/104依次进行梯度稀释，进行灵敏度验证试验。每个梯度设3个重复孔。
结果如图7所示，到10copies依然有扩增曲线，可知其最低检测限为10copies/uL。
分别将依次稀释的外显子19突变型质粒加入到的野生型质粒中，制成依次为10％、1％、0.5％、0.1％、0％突变率的样本，验证可检测的最低突变率。
结果如图8所示，到0.1％依然有扩增曲线，可知其可检测的最低突变率为0.1％。
临床样本检测步骤
临床样本DNA的提取
本实施例是从非小细胞肺癌患者肺部石蜡包埋组织切片中提取DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用天根生物公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒，具体详述如下。
样本的处理
取石蜡切片5-8张，小心将切片上样本刮入1.5ml无菌离心管中。
加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10sec。
12000rpm室温离心2min，弃上清。
室温放置5-10min，充分挥发乙醇。
加入200ul缓冲液GA和20ul蛋白酶K，充分混匀，56℃孵育1h直至样本完全裂解。90℃孵育1h。
在上管中加入220ul缓冲液GB涡旋混匀，再加入250ul无水乙醇，涡旋震荡混匀，短暂离心
将上步得到的混合液加入一个吸附柱CR2中8000RPM室温离心2min，弃废液。
向吸附柱中加入500ul缓冲液GD，8000rpm室温离心60sec，弃废液。
向吸附柱中加入600ul漂洗液PW，8000rpm室温离心60sec，弃废液。
重复上步
12000rpm空离2min，开盖放置2-5min，以彻底晾干残余的漂洗液。
将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中加入65℃预热的洗脱液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，得到DNA。
预混液配制
按如下比例配制反应液
涡旋混匀，取出69ul，加入前引物1.5ul,后引物0.75ul，探针0.9ul.充分混匀，以每孔25ul，加入8连管中，每样3个重复，
上机，按优化后的反应程序
94℃ 3min
94℃ 30s
60℃ 10s
40个循环并且在第三步60℃ 10s结束时收集检测FAM荧光。
结果分析，如出现扩增曲线，且其CT值小于35可判定为阳性，如未出现扩增曲线，或CT值大于35，可判定为阴性。如图9所示。
〈110〉长春理工大学
〈120〉提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法及应用
〈160〉4
〈210〉1
〈211〉99
〈212〉DNA
〈213〉智人（Homo sapiens）
〈220〉
〈221〉gene
〈222〉（1）…（99）
〈223〉该DNA序列共有99bp，是位于智人种第7号染色体上EGFR基因中的19号外显子,该外显子易出现缺失突变，99bp的基因为野生未突变型。
〈400〉1
gga ctc tgg atc cca gaa ggt gag aaa gtt aaa att ccc gtc gct 45
Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala
1 5 10 15
atc aag gaa tta aga gaa gca aca tct ccg aaa gcc aac aag gaa 90
Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu
20 25 30
atc ctc gat 99
Ile Leu Asp
〈210〉2
〈211〉84
〈212〉DNA
〈213〉智人（Homo sapiens）
〈220〉
〈221〉gene
〈222〉（1）...（84）
〈223〉该DNA序列共有84bp，是位于智人种第7号染色体上EGFR基因中的19号外显子,该外显子易出现缺失突变，84bp的基因为突变型。其为51-65位15碱基缺失，缺失碱基为ggaattaagagaagc
〈400〉2
Gga ctc tgg atc cca gaa ggt gag aaa gtt aaa att ccc gtc gct 45
Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala
1 5 10 15
atc aaa aca tct ccg aaa gcc aac aag gaa atc ctc gat 84
Ile Lys Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp
20 25
〈210〉3
〈211〉84
〈212〉DNA
〈213〉智人（Homo sapiens）
〈220〉
〈221〉gene
〈222〉（1）...（84）
〈223〉该DNA序列共有84bp，是位于智人种第7号染色体上EGFR基因中的19号外显子,该外显子易出现缺失突变，84bp的基因为突变型。其为52-66位15碱基缺失，缺失碱基为gaattaagagaagca
〈400〉3
Gga ctc tgg atc cca gaa ggt gag aaa gtt aaa att ccc gtc gct 45
Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala
1 5 10 15
Atc aag aca tct ccg aaa gcc aac aag gaa atc ctc gat 84
Ile Lys Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp
20 25
〈210〉4
〈211〉84
〈212〉DNA
〈213〉智人（Homo sapiens）
〈220〉
〈221〉gene
〈222〉（1）...（84）
〈223〉该DNA序列共有84bp，是位于智人种第7号染色体上EGFR基因中的19号外显子,该外显子易出现缺失突变，84bp的基因为突变型。其为53-67位15碱基缺失，缺失碱基为aattaagagaagcaa
〈400〉4
Gga ctc tgg atc cca gaa ggt gag aaa gtt aaa att ccc gtc gct 45
Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala
1 5 10 15
atc aag gca tct ccg aaa gcc aac aag gaa atc ctc gat 84
Ile Lys Ala Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp
20 25

Claims (6)

1.一种提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法，其方法是：特异性扩增EGFR基因19缺失突变位点区域的前引物和后引物，所述的前引物末端与野生型不匹配而与突变型匹配，特别的与常规的ARMS引物相比，本引物末端多出2个错配位点，并在第4位人为的再引入一个错配，大大提高了其特异性，有效的防止野生型对检测的影响。该特异性前引物和后引物一起扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50-200bp；特异性针对扩增产物的taqman探针，其Tm高于引物9-12℃，所述的探针携带能检测的荧光标记。
2.如权利要求1所述的一种提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法，其方法是：所述的前引物为ARMS引物，与突变基因存在一个碱基的不同其余完全互补，长度为17-25bp。
3.如权利要求1、2所述的一种提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法，其方法是：所述的前引物为ARMS引物，与突变基因存在一个碱基的不同其余完全互补，长度较佳地为18-22bp。
4.如权利要求1所述的一种提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法，其方法是：探针序列前引物及后引物序列如下：
探针
FAM-CGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTG-BHQ1
后引物
R1：5’-ATGAGAAAAGGTGGGCCTGA-3’
R2：:5’-CTGAGGTTCAGAGCCATG-3’
前引物
2237-2251DEL15 5’-GTCGCTATCAAGGCAGCTC-3’。
5.一种提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法的应用，其应用是：
(1)提供上述引物和探针；
(2)待测样品的处理和模板的提取；
(3)配制荧光定量PCR反应体系；
(4)用步骤(1)的引物和探针扩增待测的突变基因靶序列；
(5)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过监测反应过程中的荧光强度变化来区分野生型和突变型。
6.如权利要求5所述的一种提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法的应用，其应用是：
经过优化得到的最佳的反应体系为：
其中所用的酶为TAKALA的rTaq酶，总体系为25ul，在保证各组分浓度不变的情况下，也可调整为20ul，也能取得良好的结果；
经过优化得到的反应程序
94℃ 3min
94℃ 30s
60℃ 10s
40个循环并且在第三步60℃10s结束时收集检测FAM荧光。
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