CN109082468A - 检测egfr基因19外显子突变的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测EGFR基因19外显子突变的试剂盒及方法,具体地,本发明提供了检测NSCLC患者血液游离核酸EGFR基因19外显子突变的方法、引物、探针及其试剂盒,具有过程简单、可检突变类型多、绝对定量、灵敏度高、样本易获取等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和肿瘤诊断领域,具体地说,本发明涉及检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的试剂盒及方法。
背景技术
肺癌的发病率和死亡率均居世界首位,其中,非小细胞肺癌(NSCLC)占85%以上,而大部分患者在确诊时已处于癌症晚期,其死亡率高达80%-90%。因此,晚期NSCLC的治疗越来越受到人们重视。含铂双药联合化疗仍是晚期NSCLC治疗的主要手段,但治疗效果并不十分理想。随着肿瘤分子生物学技术的发展,药物靶向治疗效果较为显著,相对传统细胞毒性药物,靶向治疗可以更加精准地作用于肿瘤部位,能明显减少对周围正常组织的损伤,在降低患者不良反应发生率的同时,提高作用于肿瘤的准确性。
表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜蛋白,广泛分布于细胞膜上,为受体酪氨酸激酶家族成员之一。EGFR与表皮生长因子(EGF)的结合可启动细胞核内相关基因,从而促进细胞分裂增殖。EGFR存在于大多数细胞中,对肿瘤细胞的生长、繁殖、转移、新血管生成、浸润等起到重要作用,在非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中均有表达。
近年来,以EGFR为靶点的分子靶向治疗对晚期NSCLC患者的效果较好。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是EGFR突变型晚期NSCLC的重要治疗手段之一,在客观缓解率和无进展生存期方面均显著优于传统含铂双药联合方案,但大部分患者在治疗6-12个月后即出现EGFR-TKIs耐药,其耐药机制主要包括原发性耐药和获得性耐药。在NSCLC患者中,EGFR突变通常发生在18-21号外显子,其中第19外显子19del位点缺失以及第21外显子L858R位点突变是最常见的EGFR敏感突变,约占总突变的90%,又叫经典突变或热点突变。
目前,组织活检是肿瘤检测的金标准,但由于组织样本的获取存在有创性和局限性,大多数晚期NSCLC患者或复诊患者很难利用重复组织活检来监测机体耐药情况及实时病情,这就使得液体活检技术应运而生。液体活检主要以血液游离核酸(cfDNA)为检测对象,具有更全面地反映肿瘤特性、克服肿瘤异质性难题及非侵入性可多次取样等优点。大量研究表明,cfDNA可作为组织不可取时的首选替代标本,用于评估EGFR基因突变状态,选择是否采用EGFR-TKI治疗方法。cfDNA检测仅需少量外周血样本,操作简单、无创、具有可重复性,适合用于对NSCLC患者病情进展连续监测,肿瘤预后评估,残余病灶检测等。由于cfDNA在晚期肺癌患者血液中的浓度极低,因此,其对检测灵敏度要求较高,常用的基因突变检测方法如:Sanger测序法、高分辨熔点曲线分析法、实时荧光定量PCR法、变性高效液相色谱技术等均难以满足其检测要求。
因此,本领域迫切需要开发能够有效检测肺癌患者血液中cfDNA的技术以满足临床需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测非小细胞肺癌EGFR基因19外显子突变的试剂盒及方法。
在本发明的第一方面,提供了一种用于数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的检测引物对,所述检测引物对包括检测上游引物和检测下游引物;其中,所述检测上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示,所述检测下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
本发明的第二方面,提供了一种用于数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的探针,所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
在另一优选例中,所述探针的5’端包含有荧光报告基团FAM;和/或,所述探针的3’端包含有荧光淬灭基团MGB。
本发明的第三方面,提供了一种用于数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的试剂盒,所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括PCR扩增阻断剂,所述PCR扩增阻断剂与EGFR基因19外显子19del位点的野生型序列结合,特异性阻断所述检测引物对对目的片段的扩增;优选地,所述PCR扩增阻断剂的3’端标记有ZIP;更优选地,所述PCR扩增阻断剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括内控上游引物和内控下游引物,其中,所述内控上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示,所述内控下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.:6所示。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括内控探针,所述内控探针的核苷酸序列如SEQID NO.:7所示;优选地,所述内控探针的5’端标记有VIC荧光报告基团,和/或,所述内控探针的3’端标记有MGB荧光淬灭基团。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括阳性对照,和/或阴性对照。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括数字PCR反应酶;和/或数字PCR用缓冲液。
在另一优选例中,所述检测上游引物和所述检测下游引物在反应体系中的最终浓度为0.1~10μmol/L;更优选为0.5~5μmol/L。
在另一优选例中,所述内控上游引物和所述内控下游引物在反应体系中的最终浓度为0.1~10μmol/L;更优选为0.5~5μmol/L。
在另一优选例中,所述突变探针在反应体系中的终浓度为0.1~5μmol/L;优选为0.1~1μmol/L。
在另一优选例中,所述内控探针在反应体系中的终浓度为0.1~5μmol/L;优选为0.1~1μmol/L。
本发明的第四方面,提供了一种数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的方法,所述方法包括步骤:
(1)提供待检测对象的DNA样本;
(2)制备数字PCR反应体系并进行数字PCR检测:
其中,所述数字PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述DNA样本、本发明第一方面所述的检测引物对、和本发明第二方面所述的探针。
在另一优选例中,所述DNA样本来自血液游离核酸。
在另一优选例中,所述方法为非诊断目的的检测方法。
在另一优选例中,所述数字PCR反应体系还包括PCR扩增阻断剂,所述PCR扩增阻断剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中,所述数字PCR反应体系还包括内控上游引物和内控下游引物,其中,所述内控上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示,所述内控下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
在另一优选例中,所述数字PCR反应体系还包括内控探针,所述内控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示。
在另一优选例中,所述数字PCR反应体系还包括数字PCR反应酶;和/或数字PCR用缓冲液。
在另一优选例中,所述检测上游引物和所述检测下游引物在反应体系中的最终浓度为0.1~10μmol/L;更优选为0.5~5μmol/L。
在另一优选例中,所述内控上游引物和所述内控下游引物在反应体系中的最终浓度为0.1~10μmol/L;更优选为0.5~5μmol/L。
在另一优选例中,所述突变探针在反应体系中的终浓度和所述内控探针在反应体系中的终浓度比为2:1。
在另一优选例中,所述突变探针在反应体系中的终浓度为0.1~5μmol/L;优选为0.1~1μmol/L。
在另一优选例中,所述内控探针在反应体系中的终浓度为0.05~2μmol/L;优选为0.1~0.5μmol/L。
本发明的第五方面,提供了本发明第一方面所述的检测引物对、和/或本发明第二方面所述的探针的用途,用于制备数字PCR检测试剂盒,所述数字PCR检测试剂盒用于检测EGFR基因19外显子突变。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1:本发明检测19del突变位点阴性对照的dPCR结果示意图;
图2:本发明检测19del突变位点gDNA对照的dPCR结果示意图;
图3:本发明检测19del突变位点阳性对照的dPCR结果示意图;
图4:本发明检测19del突变位点样本DNA模板的dPCR结果示意图;
图5:使用对照引物对1的检测结果;
图6:使用对照引物对2的检测结果;
图7:使用对照探针1的检测结果;
图8:使用对照探针2的检测结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,获得一种检测非小细胞肺癌EGFR基因19外显子突变的试剂盒及方法,实验结果表明,本发明的方法和试剂盒能够对EGFR基因的19del突变位点的18种突变类型进行检测,基于数字PCR平台能检出0.1%的突变率,具有检测过程简单、可检突变类型多、绝对定量、灵敏度高、样本易获取等优点。
具体地,本发明提供了一种检测非小细胞肺癌患者血液游离核酸EGFR基因突变的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。本申请以非小细胞肺癌患者血液游离核酸为模板,在测得EGFR基因突变的同时还可直接获取突变比例。本发明涉及非小细胞肺癌检测技术领域,具体来说是一种基于数字PCR平台,检测非小细胞肺癌患者EGFR基因突变的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒,检测样本为非小细胞肺癌患者的血液游离核酸。
在描述本发明之前,应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的,本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料,本文在此处例举优选的方法和材料。
数字PCR
数字PCR(dPCR)能实现核酸分子的绝对定量,在检测cfDNA的EGFR基因突变时具有较高的灵敏度和特异性。其通过物理或化学分割的方式,将一个PCR反应体系分配到上万个微小的反应器中,在每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子,进行“单分子模板PCR扩增”。扩增结束后,通过阳性反应单元的数目和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。因此,dPCR无需建立标准曲线,可直接确定低至单拷贝待检靶分子的绝对数目。但是,数字PCR对引物和探针的要求都很高,引物和探针序列的些许改变就会影响检测的特异性和灵敏度。
大量研究表明,EGFR基因突变与TKI疗效密切相关。因此,随着EGFR-TKIs耐药的出现,检测血液游离核酸中EGFR基因19del位点缺失突变可为肺癌患者靶向治疗的筛选提供参考,并可实时监测患者用药期间的耐药突变。
EGFR基因19外显子野生型序列和19del缺失的18种突变类型如下:
EGFR基因19外显子野生型序
列:TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTC(SEQ ID NO.:8)
Del1(E746-A750del(1))突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTC(SEQ ID NO.:9)
Del2(E746-A750del(2))突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTC(SEQ ID NO.:10)
Del3(E746-T751del)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGTCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG(SEQ ID NO.:11)
Del4(E746-T751>A)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGCATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGA(SEQ ID NO.:12)
Del5(E746-S752>A)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG(SEQ ID NO.:13)
Del6(E746-S752>D)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGATCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG(SEQ ID NO.:14)
Del7(L747-E749del)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG(SEQ ID NO.:15)
Del8(L747-T751del)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGT(SEQ ID NO.:16)
Del9(L747-S752del)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAACCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG(SEQ ID NO.:17)
Del10(L747-T751>S)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATCATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGAT(SEQ ID NO.:18)
Del11(L747-T751del)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGT(SEQ ID NO.:19)
Del12(L747-P753>S)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG(SEQ ID NO.:20)
Del13(E746-T751>1)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAATATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTG(SEQ ID NO.:21)
Del14(E746-S752>V)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGTACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGAT(SEQ ID NO.:22)
Del15(L747-A750>P)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAGCCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG(SEQ ID NO.:23)
Del16(L747-T751>Q)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAGCAATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG(SEQ ID NO.:24)
Del17(L747-A750>P)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAACCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG(SEQ ID NO.:25)
Del18(L747-T751>P)突变型序列:
TCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAACCATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG(SEQ ID NO.:26)
本发明提供了一种检测NSCLC患者血液游离核酸EGFR基因突变的方法、引物、探针及其试剂盒,具有优化过程简单、可检突变类型多、绝对定量、灵敏度高、样本易获取等优点。
本发明的技术方案如下:
一种检测NSCLC患者血液游离核酸EGFR基因突变的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。提供了用于检测19外显子19del缺失位点所需的特异性引物及探针。本申请以NSCLC患者血液游离核酸为模板,在测得EGFR基因突变的同时还可直接获取突变比例。本试剂盒对EGFR基因19外显子19del缺失突变的18种类型进行检测,基于dPCR平台能检出0.1%的突变率,具有可检突变类型多、优化过程简单、绝对定量、灵敏度高、样本易获取等优点。
在本发明的一个优选地实施方式中,本发明公开了一种检测NSCLC患者血液游离核酸EGFR基因突变的引物、探针:
所述探针包括检测19del位点的突变探针和内控探针;所述突变探针的5’端标记有FAM荧光报告基团,所述内控探针的5’端标记有VIC荧光报告基团,所述突变探针、内控探针的3’端标记有MGB荧光淬灭基团;
所述检测19外显子19del位点突变的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,PCR扩增阻断剂的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,突变探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;所述用于检测19del的引物和探针中还添加有作为内控的引物和探针,作为内控的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,内控的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,内控的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示;所述SEQ ID NO:3核苷酸序列的3’端标记有ZIP,所述SEQ ID NO:4核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有MGB,所述SEQ ID NO:7核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有MGB;
所述PCR扩增阻断剂与EGFR基因19外显子19del位点的野生型序列结合,特异性阻断上下游引物对目的片段的扩增,突变探针不释放荧光信号;当19del位点突变,突变探针与上下游引物所扩增的目的片段结合,释放FAM荧光信号;所述内控引物与内控探针是根据人EGFR基因保守片段设计并合成的,用于检测EGFR基因19外显子c.2235~2257发生的全部突变。
优选地,所述检测上游引物在反应体系中的终浓度为1.0μmol/L,所述检测下游引物在反应体系中的终浓度为1.0μmol/L,所述突变探针在反应体系中的终浓度为0.25μmol/L,所述内控探针在反应体系中的终浓度为0.125μmol/L。
所述各突变位点的引物探针序列如下表,检测19外显子19del缺失位点的引物探针核苷酸序列信息:
上述PCR引物和标有不同类型荧光的探针可用于对野生型和突变型DNA模板进行检测,根据结果呈现的不同荧光,判断样本DNA模板类型;上述引物和探针根据人EGFR基因第19外显子突变位点的基因序列设计并合成,可以检测EGFR基因19外显子突变位点18种突变类型;即,EGFR基因第19外显子19del突变发生在核苷酸序列c.2235~2257之间的任一缺失突变类型。
所述特异性引物和探针,能够准确检测以血液游离核酸为模板的EGFR基因突变类型,在检测突变的同时,可以直接得出基因位点的突变频率。采用突变探针与内控探针检测19外显子基因缺失位点,通过拷贝数判定,检测不同荧光信号及其拷贝数的比例来确定19外显子是否发生基因突变及发生基因突变的比例。本发明结合dPCR系统可检出0.1%的突变比例。
上述特异性引物和探针所制备的试剂盒,基于dPCR平台可检测EGFR基因19外显子基因缺失位点18种突变类型,为患者是否需要进行靶向治疗提供参考,也可用于NSCLC患者的高灵敏度早期检测,以及用药期间耐药性突变的实时监测。
在本发明的另一个优选地实施方式中,本发明公开了一种检测NSCLC患者血液游离核酸EGFR基因突变的试剂盒,包括用于配制dPCR反应液的引物探针混合液、Mastermix、Solution、对照样本、无菌水和密封液,其中,引物探针混合液包括如下成分,如表1,
表1 引物探针混合液
其中,所述用于检测19del突变位点的引物与探针分别如下,
探针包括检测19del位点的突变探针和内控探针;所述突变探针的5’端标记有FAM荧光报告基团,所述内控探针的5’端标记有VIC荧光报告基团,所述突变探针、内控探针的3’端标记有MGB荧光淬灭基团;
检测19外显子19del位点突变的引物探针,包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物核苷酸序列,由SEQ ID NO:2所示的下游引物核苷酸序列,由SEQ ID NO:3所示的PCR扩增阻断剂核苷酸序列,由SEQ ID NO:4所示的突变探针核苷酸序列;检测19del的引物和探针中还添加有作为内控的引物和探针,包括由SEQ ID NO:5所示作为内控的上游引物核苷酸序列,由SEQ ID NO:6所示作为内控的下游引物核苷酸序列,由SEQ ID NO:7所示作为内控探针的核苷酸序列;所述SEQ ID NO:3核苷酸序列的3’端标记有ZIP,所述SEQ ID NO:4核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有MGB,所述SEQ ID NO:7核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有MGB;
所述PCR扩增阻断剂与EGFR基因19外显子19del位点的野生型序列结合,特异性阻断上下游引物对目的片段的扩增,突变探针不释放荧光信号;当19del位点突变,所述PCR扩增阻断剂无法与EGFR基因19外显子19del位点的突变型序列结合,检测引物对对突变的目的片段进行扩增,突变探针与扩增的目的片段结合,释放FAM荧光信号;所述内控引物与探针是根据人EGFR基因保守片段设计并合成的,用于检测含有19外显子的全部EGFR基因。
优选地,所述上游引物在反应体系中的终浓度为1.0μmol/L,所述下游引物在反应体系中的终浓度为1.0μmol/L,所述突变探针在反应体系中的终浓度为0.25μmol/L,所述内控探针在反应体系中的终浓度为0.125μmol/L;
所述dPCR反应液的Mastermix包括如下成分,如表2,
表2 Mastermix
所述对照品包括如下成分,如表3,
表3 对照样本
优选地,所述gDNA对照的细胞株DNA混合液中含有Caco2细胞株核酸;
所述阳性对照的细胞株DNA混合液中含有:EGFR基因19外显子19del缺失的H1650细胞株DNA。
本发明所述试剂盒适用样本为血液游离核酸。
本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为:每次检测均设置阴性对照组、gDNA对照组和阳性对照组,当检测结果的阳性对照组为阳性,且阴性对照组和gDNA对照组均为阴性时,表明实验结果有效。本发明所述试剂盒的检测灵敏度可达到0.1%。
在本发明的另一个优选地实施方式中,本发明还公开了一种检测NSCLC患者血液游离核酸EGFR基因突变的方法,具体步骤包括:
(1)处理待测样本并提取样本DNA模板;优选地,待测样本为血液游离核酸;
(2)配制dPCR反应体系,将待测样本DNA模板、特异性引物探针混合液、Mastermix、Solution及无菌水混合,制备得到dPCR反应液;dPCR反应液构成如表4,
表4 dPCR反应液
特异性引物和探针 | 1μL |
DNA模板 | 5μL |
Mastermix | 7.5μL |
Solution | 0.75μL |
无菌水 | 补足至16μL |
优选地,所述特异性引物和探针混合液为上述用于检测19del缺失位点序列SEQID NO:1~SEQ ID NO:7的引物与探针;
更优选地,上游引物在反应体系中的终浓度为1.0μmol/L,下游引物在反应体系中的终浓度为1.0μmol/L,所述突变探针在反应体系中的终浓度为0.25μmol/L,所述内控探针在反应体系中的终浓度为0.125μmol/L;
(3)取15μL配制的dPCR反应液,借助ClarityTM自动加样仪将其自动、均匀地细分成10 000个纳升级的反应单元;采用ClarityTM密封仪加入密封液对反应单元进行密封。
(4)在专用PCR仪中进行PCR扩增,所述PCR的扩增条件为:第一阶段,95℃预变性10分钟;第二阶段,94℃变性30秒,56℃延伸30秒,40个循环;第三阶段,98℃稳定微反应10分钟;最终4℃终止反应;
(5)用ClarityTM系统软件对检测结果进行分析,并基于泊松分布统计原理计算出各样本中靶标分子的拷贝数;
(6)根据各荧光信号的强度和比例,判定待测样本是否存在突变,并得到突
变比例。
本申请采用的dPCR检测原理如下:dPCR技术是把单个PCR管中的反应试剂划分成约上万个微反应,每个微反应中或不含待检核酸靶标分子,或含有1个至数个待检核酸靶分子,且每个微反应都作为一个独立的PCR反应单元。PCR过程结束后,对微反应逐个进行荧光检测,识别出阴/阳性反应。含有不同DNA模板的微反应释放出不同荧光信号,没有模板的微反应则不产生荧光信号。最后,根据泊松分布统计原理及阳性微反应的比例计算出待检靶标分子拷贝数。由于dPCR结果的判读仅判断有无扩增,不依赖Ct值,对PCR反应抑制剂的耐受能力大大提高,不需要参考品和标准曲线就可以精确定量,为本申请提供了一种全新的技术思路与手段。
本发明提供了一种检测非小细胞肺癌患者EGFR基因突变的方法、引物、探针及试剂盒,该试剂盒基于dPCR平台,可检出突变基因0.1%的突变率。具体实施步骤如下,
步骤一、待测样本DNA模板提取
抽取NSCLC患者静脉血2~10mL置于无创采血管中,做好标记确保标签信息无误后,常温保存,12小时内分离出血浆,优选地立即分离血浆,用于样本DNA的提取。使用中山大学达安基因股份有限公司的血液游离核酸提取试剂盒,试剂盒货号为cat.#DA0670或cat.#DA0680,按照试剂盒说明书进行游离核酸的提取;使用Qubit 2.0荧光定量仪测定所提核酸的纯度及浓度,模板DNA可直接用于后续实验,或置于-20℃冰箱冻存备用;
步骤二、dPCR体系的制备
dPCR体系配制前准备:取出试剂盒中的特异性引物和探针、Mastermix、Solution、无菌水等,室温融化,涡旋震荡混匀后离心10秒,配制dPCR体系;dPCR体系构成如表5:
表5 dPCR体系
特异性引物和探针 | 1μL |
Mastermix | 7.5μL |
Solution | 0.75μL |
无菌水 | 补足至11μL |
所述引物探针的核苷酸序列信息分别如上所述;
步骤三、加样
取步骤一所制备的样本DNA模板5μL及试剂盒中的各对照样本5μL,加样至步骤二配制的dPCR反应体系的八连管中,使每管dPCR反应液的总体积为16μL;盖紧八连管管盖,充分混匀,高速离心10秒,用于制备微反应;所述试剂盒的对照样本如表6:
表6试剂盒的对照样本
编号 | 组分 | 组分中的主要成分 |
1 | 阴性对照 | 无菌纯化水 |
2 | gDNA对照 | Caco2细胞株DNA |
3 | 阳性对照 | 细胞株DNA混合液 |
所述gDNA对照样本为含有EGFR基因的19del野生型核酸样本,来源于Caco2细胞株DNA;阳性对照是将野生型Caco2细胞株DNA与含有突变型模板DNA分别按一定比例混合;其中,含有EGFR基因19del突变位点阳性的DNA模板来源于H1650细胞株;阴性对照样本为无菌纯化水;
步骤四、制备微反应
取15μL配制的dPCR反应液,借助ClarityTM自动加样仪将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元;采用ClarityTM密封仪加入密封液对反应单元进行密封;
步骤五、PCR扩增
将封膜后的96孔板放入PCR仪,进行扩增,PCR扩增的反应条件:第一阶段,95℃预变性10分钟;第二阶段,94℃变性30秒,56℃延伸30秒,40个循环;第三阶段,98℃稳定微反应10分钟;最终4℃终止反应;
步骤六、结果读取及分析
将PCR产物放入ClarityTM阅读仪中,打开软件,完成检测样本基本信息的设置;检测完成后,查看FAM通道和VIC通道荧光信号的值;通过阴性对照样本、阳性对照样本及无模板对照样本的参照及荧光信号的分布,可调节微反应信号阈值。
本发明的主要优点在于:
(1)本发明提供的用于扩增检测EGFR基因19del突变位点部位目的核酸片段的引物对,灵敏度极高,可以对血浆游离核酸进行有效扩增,完全可以满足数字PCR的需要;
(2)本发明优化了特异性引物、和探针,针对EGFR基因19del突变位点18种突变类型仅需一对引物与一套荧光标记的探针即可进行检测,因而显著地降低了检测成本;
(3)使用本发明提供的特异性引物与探针,可计算EGFR基因突变率,能检测出0.1%的突变比例,灵敏度高;
(4)本发明的方法可检突变类型多、过程简单、所需样本少、性能稳定高效、准确性高,能分辨出单个拷贝的差异,实现真正意义上的绝对定量,数据分析可自动化,结果可实时观察。
(5)本发明的方法无需样本转移步骤,减少人工操作时间。采用封闭式系统,降低污染机会,减少样本损失。
本发明适用于对非小细胞肺癌患者EGFR-TKI耐药机制及靶向用药的评估,实现治疗效果的动态追踪及对病人预后的实时监测,是探索非小细胞肺癌早期诊断与高效治疗的一条可行途径,值得推广应用。另外,本发明的方法同样适用于非诊断的目的,例如,在新药研发过程中,使用本发明的检测方法获得用作中间结果的基因突变信息,这些基因突变信息可以作为公众健康管理之需,也可以用于EGFR-TKI耐药机制的研究及靶向新药研发。
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
本实施例提供了一种检测非小细胞肺癌患者EGFR基因突变的试剂盒的组成成分、包装及数量(48反应/盒),如表7,
表7试剂盒的组成成分、包装及数量
实施例2:灵敏度检测及突变检出率实验
gDNA对照样本为含有EGFR基因19del野生型的核酸,来源于Caco2细胞株DNA;灵敏度参考品由野生型Caco2细胞株DNA与突变型模板DNA分别按一定比例混合,混合液的突变率分别为10%、5%、1%、0.1%;其中,含有EGFR基因19del突变位点的DNA来源于H1650细胞株;阴性对照为无菌水;
取阴性对照、gDNA对照、灵敏度参考品各5μL,加样至步骤二配制的dPCR反应体系的八连管中,使每管dPCR反应液总体积为16μL;盖紧八连管管盖,充分混匀,高速离心10秒,用于微反应制备;
取15μL配制的dPCR反应液,借助ClarityTM自动加样仪将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元;采用ClarityTM密封仪加入密封液对反应单元进行密封,用于PCR扩增;
PCR扩增的反应条件:第一阶段,95℃预变性10分钟;第二阶段,94℃变性30秒,56℃延伸30秒,40个循环;第三阶段,98℃稳定微反应10分钟;最终4℃终止反应;
将PCR扩增产物放入ClarityTM阅读仪中,打开软件,完成检测样本基本信息的设置;检测完成后,查看FAM通道和VIC通道荧光信号的值,通过阴性对照样本、阳性对照样本及无模板对照样本的参照及荧光信号的分布,可调节微反应信号阈值;
用dPCR系统对本发明的灵敏度和突变检出率进行检测,当上述阳性对照样本混合液理论突变率的值分别为10%、1%、0.1%时,实际测得的突变率如表8所示,
表8灵敏度检测结果
试剂盒的灵敏度检测结果与理论值相符,表明引物与探针具有较好的特异性,灵敏度检测良好;当突变型与野生型核酸混合的阳性对照样本突变率为0.1%时,dPCR系统可稳定检测出相应型别为突变阳性,实际检测突变率分别平均为0.12%,因此,本发明的可检出突变率为0.1%。
图1为本发明检测19del突变位点阴性对照的dPCR结果示意图。
图2为本发明检测19del突变位点gDNA对照的dPCR结果示意图。
图3为本发明检测19del突变位点阳性对照(1%)的dPCR结果示意图。
实施例3:本申请试剂盒的准确性检测
根据所测得对照样本的拷贝数,制备准确性参考品
将gDNA对照样本Caco2细胞株DNA与阳性样本H1650细胞株DNA按一定比例分别混合,突变比例为5%,阳性样本浓度约为2000copies/μL;具体的,
(1)制备EGFR基因19del位点准确性参考品:取gDNA对照样本Caco2细胞株的基因组DNA与含有19del突变位点的H1650细胞株基因组DNA,按照一定比例混合,制得19del突变型核酸总突变比例5%的混合液;
每种准确性参考品做2个重复实验,共8管;取EGFR基因19del位点准确性参考品4μL,加样至步骤二所配制的dPCR反应体系的八连管中,使得dPCR反应液的总体积为22μL;盖紧八连管管盖,充分混匀,高速离心10秒,用于微反应制备;
取15μL配制的dPCR反应液,借助ClarityTM自动加样仪将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元;采用ClarityTM密封仪加入密封液对反应单元进行密封,用于PCR扩增;
PCR反应条件为:第一阶段,95℃预变性10分钟;第二阶段,94℃变性30秒,56℃延伸30秒,40个循环;第三阶段,98℃稳定微反应10分钟;最终4℃终止反应;
将PCR扩增产物放入ClarityTM阅读仪中,打开软件,完成检测样本基本信息的设置;检测完成后,查看FAM通道和VIC通道的荧光信号值,通过gDNA对照样本、阳性对照样本、阴性对照样本的参照及荧光信号的分布,课调节微反应信号阈值;
用dPCR系统对本发明试剂盒的准确性进行检测,得到结果如表9,
表9
根据上表所述结果,各质控品准确性的检测结果阳性率为100%,符合理论定性标准,表明本发明试剂盒的准确性检测符合要求。
实施例4:临床应用实验
抽取30例NSCLC患者的静脉血2~10mL置于无创采血管中,提供血样的30名患者已进行组织标本检测,并且明确为携带EGFR基因19del突变位点;做好样本标记并确保标签信息无误,常温保存,12小时内分离出血浆,用于提取游离核酸样本或-80℃保存备用;使用中山大学达安基因股份有限公司货号为cat.#DA0670或cat.#DA0680的血液游离核酸提取试剂盒对样本进行提取,按照试剂盒说明书操作;用Qubit 2.0荧光定量仪测定所提核酸的纯度及浓度,放置于-20℃冰箱保存;
取每个样本的DNA模板5μL及试剂盒中对照样本各5μL,加样至步骤二配制的dPCR反应体系的八连管中,使每管dPCR反应液的总体积为16μL;盖紧八连管管盖,充分混匀,高速离心10秒,用于微反应制备;
取15μL配制的dPCR反应液,借助ClarityTM自动加样仪将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元;采用ClarityTM密封仪加入密封液对反应单元进行密封,用于PCR扩增;
PCR扩增的反应条件:第一阶段,95℃预变性10分钟;第二阶段,94℃变性30秒,56℃延伸30秒,40个循环;第三阶段,98℃稳定微反应10分钟;最终4℃终止反应;
将PCR扩增产物放入ClarityTM阅读仪中,打开软件,完成检测样本基本信息的设置;检测完成后,查看FAM通道和VIC通道的荧光信号值,通过阴性对照样本、阳性对照样本、无模板对照样本的参照及荧光信号的分布,可调节微反应信号阈值;
检测结果为:30例样本中,6例样本呈19del阳性,所检结果与组织活检的结果一致性为100%。
图4为本发明检测19del突变位点代表性阳性样本DNA模板的dPCR结果示意图。
对比例1
本发明人在研究过程中,筛选了数十对数字PCR用引物,其中绝大部分无法满足数字PCR的需求。典型的普通引物序列和检测效果数据如下:
对照引物对1:
上游引物:5’-CCAGCCATAAGTCCTCGACGT-3’(SEQ ID NO.:27);
下游引物:5’-AGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGC-3’(SEQ ID NO.:28)
对照引物对2:
上游引物:5’-TCAGTAGTCACTAACGTTCGC-3’(SEQ ID NO.:29);
下游引物:5’-GTGGCTTTAGGTCAGCCAGCA-3’(SEQ ID NO.:30)
具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例,使用对照引物对1的检测结果如图5所示,检测结果表明对照引物对1的特异性极差无法有效区分阳性和阴性的样本。使用对照引物对2的检测结果如图6所示,检测结果表明对照引物对2的特异性较差无法有效区分阳性和阴性的样本,同时检测灵敏度也无法满足临床要求。
对比例2
本发明人在研究过程中,对数字PCR用探针序列同样进行了反复优化,研究中发现有些探针虽然仅差一个核苷酸即可显著影响检测特异性,其中绝大部分无法满足数字PCR的需求。典型的普通探针序列和检测效果数据如下:
对照探针1:
突变探针:5’-FAM-CAGATTTTGGGCG-MGB-3’(SEQ ID NO.:31);
对照探针2:
突变探针:5’-FAM-TTGGGCGGGCCA-MGB-3’(SEQ ID NO.:32);
具体检测步骤、检测条件、引物序列同以上实施例,使用对照探针1的检测结果如图7所示,检测结果表明对照探针1的特异性极差,难以满足临床应用的要求。使用对照探针2的检测结果如图8所示,检测结果表明对照探针2的特异性同样较差,难以满足临床应用的要求。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学达安基因股份有限公司
<120> 检测EGFR基因19外显子突变的试剂盒及方法
<130> 000005
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
gtggcaccat ctcacaat 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
actagagcta gaaagggaaa g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
tcgctatcaa aacatctccg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
gtgagtttct gctttgctgt 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
cactgacgtt tatccctgac c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
ataggcaaat ggtgcaaagc 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
atgatgtgct gccatactc 19
<210> 8
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
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aaggaattaa gagaagcaac atctccgaaa gccaacaagg aaatcctc 108
<210> 9
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
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aaaacatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctc 93
<210> 10
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc 60
aagacatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctc 93
<210> 11
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
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<210> 12
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
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aaggcatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga 100
<210> 13
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
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aaggctccga aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgag 98
<210> 14
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
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<210> 15
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
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<210> 16
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 16
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<210> 17
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 17
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<210> 18
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 18
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<210> 19
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 19
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<210> 20
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 20
tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc 60
aaggaatcga aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgag 98
<210> 21
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 21
tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc 60
aaaatatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtg 99
<210> 22
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 22
tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc 60
aaggtacatc tccgaaagcc aacaaggaaa tcctcgat 98
<210> 23
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 23
tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc 60
aaggagccaa catctccgaa agccaacaag gaaatcctcg atgtgag 107
<210> 24
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 24
tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc 60
aaggagcaat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg tgag 104
<210> 25
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 25
tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc 60
aaggaaccaa catctccgaa agccaacaag gaaatcctcg atgtgag 107
<210> 26
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 26
tctctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc 60
aaggaaccat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg tgag 104
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 27
ccagccataa gtcctcgacg t 21
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 28
aggtggcttt aggtcagcca gc 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 29
tcagtagtca ctaacgttcg c 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 30
gtggctttag gtcagccagc a 21
<210> 31
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 31
cagattttgg gcg 13
<210> 32
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 32
ttgggcgggc ca 12
Claims (10)
1.一种用于数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的检测引物对,其特征在于,所述检测引物对包括检测上游引物和检测下游引物;其中,所述检测上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.:1所示,所述检测下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
2.一种用于数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的探针,其特征在于,所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
3.如权利要求2所述的探针,其特征在于,所述探针的5’端包含有荧光报告基团FAM;和/或,所述探针的3’端包含有荧光淬灭基团MGB。
4.一种用于数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括权利要求2所述的探针。
6.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR扩增阻断剂,所述PCR扩增阻断剂与EGFR基因19外显子19del位点的野生型序列结合,特异性阻断所述检测引物对对目的片段的扩增;优选地,所述PCR扩增阻断剂的3’端标记有ZIP;更优选地,所述PCR扩增阻断剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
7.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括内控上游引物和内控下游引物,其中,所述内控上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示,所述内控下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示;和/或
所述试剂盒还包括内控探针,所述内控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示;优选地,所述内控探针的5’端标记有VIC荧光报告基团,和/或,所述内控探针的3’端标记有MGB荧光淬灭基团。
8.一种数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(1)提供待检测对象的DNA样本;
(2)制备数字PCR反应体系并进行数字PCR检测:
其中,所述数字PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述DNA样本、权利要求1所述的检测引物对、和权利要求2所述的探针。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述DNA样本来自血液游离核酸。
10.本发明第一方面所述的检测引物对、和/或本发明第二方面所述的探针的用途,用于制备数字PCR检测试剂盒,所述数字PCR检测试剂盒用于检测EGFR基因19外显子突变。
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