CN113088573A - 一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测EGFR基因L858R和Del E746‑A750突变的试剂及其应用，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.3所示的第一引物对及序列如SEQ IDNo.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对。通过本发明方案的制备的试剂对L858R和DelE746‑A750基因突变进行检测，特异性高，灵敏度高，同时减少了野生型背景对检测结果的干扰，时间短，成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂及其应用。
背景技术
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因位于人类7号染色体短臂上，有28个外显子。EGFR编码蛋白是一种跨膜糖蛋白，该蛋白是由1186个氨基酸组成，具有络氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)活性，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞和角细胞等细胞表面。正常情况下，作为细胞表面蛋白可与配体如表皮生长因子EGF(epidermal growth factor)结合，EGFR可被激活，由单体转化为二聚体以及发生自体络氨酸磷酸化，激活后的EGFR可以再磷酸化下游蛋白，对细胞的生长、增殖和分化等生理生化过程起着重要的调控作用。然而，当EGFR基因发生突变，EGFR基因就会过量表达EGFR蛋白并组装到细胞膜表面，导致表皮生长因子受体过多，EGF与EGFR的过多结合，导致细胞发生异常生长和分裂，最终发生癌变。
EGFR基因突变主要发生在TK区域的前四个外显子上面，一般突变有三种类型，分别是缺失突变、替代突变、复制或插入突变。其中，缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是del E746-A750，替代突变主要发生在外显子21上的L858R，这两种突变约占突变的90％，所以对于EGFR基因的突变研究，这两者突变的检测至关重要。对于肿瘤患者的肿瘤基因获取一般来源于组织样本，但是晚期的肺癌患者组织样本不易获取。相关研究发现，在肺癌患者晚期的外周血中发现有来自于肿瘤组织的游离DNA，所以，可以通过对外周血进行EGFR基因的突变检测。EGFR的突变检测目的主要是为了根据患者的自身情况进行个性化治疗，达到最大的治疗效果。
目前对EGFR突变检测手段主要包括测序法与ARMS方法。相关文献报道比较了两种方法的优缺点，测序法的灵敏度低，大约为25％，同时该方法的检测流程复杂、速度慢，同时对分析要求高，仪器成本高，检测试剂成本相对来说低；ARMS方法的灵敏度较高为1％，其检测流程简单，速度快，数据分析要求低，仪器成本低，但是ARMS检测的费用成本高，是由于该方法检测使用的探针需要进行荧光修饰，修饰的费用平均为300元人民币/条，平均一个位点单次反应检测成本需要20元人民币。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂，能够准确、快速、低成本的检测表皮生长因子受体基因的突变率。
本发明还提出上述试剂的应用。
本发明还提出一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂盒。
本发明还提出上述试剂盒的应用。
本发明还提出一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的方法。
根据本发明的一个方面，提出了一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.3所示的第一引物对及序列如SEQ IDNo.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对。
在本发明的一些实施方式中，所述所述试剂还包括序列如SEQ ID No.6所示的第一荧光探针和SEQ ID No.7所示的第一猝灭探针和序列如SEQ ID No.8所示的第二荧光探针和SEQ ID No.9所示的第二猝灭探针。
在本发明的一些实施方式中，所述第一荧光探针、第二荧光探针均独立地于5’端结合荧光基团；所述第一猝灭探针、第二猝灭探针均独立的于3’端结合淬灭基团。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE或HEX。
在本发明的一些实施方式中，所述淬灭基团包括NFQ、TAMRA、BHQ或IABkFQ。
在本发明的一些实施方式中，所述淬灭基团为BHQ。
在本发明的一些实施方式中，所述第一引物对和所述第一荧光探针和所述第一猝灭探针用于检测EGFR基因19号外显子的del E746-A750突变；所述第二引物对和所述第二荧光探针和所述第二猝灭探针用于检测EGFR基因21号外显子的L858R突变。
根据本发明第二方面实施方式的上述试剂的应用，所述试剂在检测EGFR基因的突变中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂在检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变中的应用。
根据本发明第三方面的一种检测L858R和Del E746-A750突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括KPbuffer。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒在检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒在制备肺癌检测试剂中的应用。
一种应用上述引物组合物或上述试剂或上述试剂盒检测EGFR基因L858R和DelE746-A750突变率的方法，包括以下步骤：将从全血样本中提取的DNA样本与上述引物组合物或上述试剂进行QPCR反应，对从全血样本中提取的EGFR基因进行PCR扩增根据CT值和熔点曲线来检测是否有突变发生，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
在本发明的一些实施方式中，所述特异性荧光探针5’端标有荧光发光基团，3’端有荧光淬灭基团BHQ1，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与突变后的模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5′-3′外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做突变样本具体含量的定量检测。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂，通过本发明方案的引物设计，极大程度提高引物对突变型模板的特异性，且本发明方案不引入野生型的引物设计，降低了试剂成本，同时减少野生型背景对检测结果的干扰。通过荧光定量PCR技术即可检测表皮生长因子受体基因L858R和Del E746-A750突变频率，检测灵敏度高，检测时间短，操作过程简单，成本低，并且从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率。一次可检测多个样本，结果判读准确直观，且整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的EGFR基因Del E746-A750突变位点引物扩增结果图；
图2为本发明实施例1中的荧光探针引物设计原理图；
图3为本发明实施例2中的DNA含量及反应体系体积对EGFR基因Del E746-A750突变位点的检测的影响结果图；
图4实施例2中的EGFR基因Del E746-A750突变位点检测野生型背景耐受量结果图；
图5为本发明实施例2中的EGFR基因L858R突变位点检测野生型背景耐受量结果图；
图6为本发明实施例3中的EGFR基因E746-A750del突变基因型检测结果图；
图7为本发明实施例3中的EGFR基因L858R突变型基因的检测结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂
一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂，其制备方法如下：
1、引物设计与合成
(1)EGFR基因Del E746-A750突变位点引物设计及优化
EGFR基因Del E746-A750突变是19号外显子的15个碱基缺失造成的，在突变位点设计上游引物时，del E746-A750的上游引物由两部分组成，第一部分是与荧光标记引一致的序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，第二部分为与突变型模板互补的序列。通过分别设计距离突变位点的位置为4个碱基引物F1，7个碱基引物F2。下游引物del E746-A750-R设计为与模板的匹配度达到100％，距离突变位点的位置为55个碱基，引物序列如表1所示。
对引物F1、F2分别进行测试，在5％突变频率，DNA投入量10ng，经过QPCR扩增后，其扩增效率的结果如图1所示。从图中可以看出，F1的扩增效率优于F2，因此选择F1作为delE746-A750的上游扩增引物。
(2)EGFR基因Del E746-A750突变位点引物设计
EGFR基因L858R突变是21号外显子的碱基T突变为碱基G。同样地，在引物设计时，上游引物由两部分组成，第一部分是与荧光标记一致的序列5’-GCGACCTAGACTGGACTCCAT-3’，第二部分为与突变型模板互补的序列。对第二部分的设计，不仅针对该突变位点将引物的3’端位置设计在突变碱基处，由于野生型与突变型只有一个碱基的差别，当野生型模板含量高时，可能会发生无效的引物结合，对突变型的检测造成干扰，所以在引物的3’端距离突变位点的位置为1个碱基处人为的引入一个错配碱基，可大大提高引物对突变型模板的特异性。下游引物设计为与模板的匹配度达到100％，距离突变位点的位置为76个碱基，引物序列如表1所示。
表1EGFR突变位点引物序列
2、荧光探针的引物设计
本发明方案所使用的荧光探针和猝灭探针为通用荧光探针与猝灭探针。其原理如图2所示，从图中可以看出，经过第一轮PCR反应，延伸后的模板被加上了检测引物的序列；经过第二轮PCR反应，特异性扩增的末端序列互补链被扩增出来，此时通用的荧光探针与猝灭探针仍然结合，整个体系没有荧光信号产生。再经过PCR反应，荧光探针引物的扩增随着反应的进行呈现指数型增加，此时的荧光探针引物与猝灭探针引物分开，体系产生荧光，荧光探针引物核苷酸序列如表2所示。
表2荧光探针与猝灭探针序列
| CP1-1 | FAM/5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3(SEQ ID No.6) |
| CRP1-1 | 5’-CATGAACTTGGTCACCTTC-3’/BHQ2(SEQ ID No.7) |
| DP2-1 | ROX/5’-GCGACCTAGACTGGACTCCAT-3’(SEQ ID No.8) |
| DRP2-1 | 5’-AGTCCAGTCTAGGTCGC-3’/BHQ2(SEQ ID No.9) |
实施例2检测方法的优化
(1)DNA含量及反应体系体积对EGFR基因Del E746-A750突变位点的检测的影响
在样本溶液的突变频率为1％的情况下，分别测试了10μl、25μl条件下加入DNA含量分别为1ng、5ng、10ng和15ng的突变频率检测结果。突变频率检测结果图3所示，从图中可以看出，不同DNA投入量的情况下，25μl的体系对于del E746-A750突变情况的检测扩增效率更高，所以优选地25μl体系条件下进行del E746-A750突变检测。
在25μl的体系条件下，加入野生型DNA含量分别为10ng、20ng、40ng和60ng时，对Del E746-A750突变位点进行检测，测试结果如图4所示。由图可以看出，野生型DNA加入量为60ng时，无非特异性扩增，说明野生型基因干扰小相对容易检出突变丰度较低的变异体。
(2)EGFR基因L858R突变位点检测野生型背景耐受量
在25μl的体系条件下，加入野生型DNA含量分别为10ng、20ng、40ng和60ng，对于L858R突变基因型进行检测，测试结果如图5所示，从图中可以看出该突变型对野生型背景的耐受量为20ng，随着野生型背景的增加，会出现非特异性扩增，而使最终结果受到影响。
实施例3利用本方法检测E746_A750del和L858R突变
本发明的表皮生长因子受体基因L858R和Del E746-A750突变的检测方法通过荧光定量PCR进行检测，具体过程为：
1、样本制备：采用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA。具体提取步骤如下：
(1)血液样本置于室温解冻，混匀，取100μl白细胞至1.5ml离心管，加100μl PBS，混匀；
(2)加入10μl RnaseA，20μl蛋白酶K，混匀，涡旋离心，放置1min，加入200μlBufferAL，混匀离心；
(3)56℃水浴，10min；
(4)取下，降至室温后，加入200μl无水乙醇，混匀，快速离心；
(5)将步骤(4)所得的混合物转移至离心柱上，室温放置5min，10000g，1min，弃滤液；
(6)加入500μl Buffer AW1，10000g，1min，弃滤液；
(7)加入500μl Buffer AW2，20000g，3min，弃滤液；20000g，空转1min；
(8)柱子转移至新的离心管，开盖室温放置5min，加入100μl Buffer AE，放置5min；10000g，1min；再加100μl Buffer AE，放置1min；10000g，1min。
2、基因组纯化
基因组DNA纯化试剂盒购自ZYMO RESEEARCH，具体的纯化流程如下：
(1)在上述提取的200μl DNA中加400μl(2倍体积的)DNABinding Buffer，混匀，瞬离；
(2)转移至柱子中，13000g，30s，弃滤液；
(3)加入200μl Washing Buffer，13000g，30s，弃滤液；
(4)重复步骤(3)一次；
(5)柱子转移至新的离心管中，加入40μl Buffer AE，放置1min，10000g，30s；
(6)再加入40μl Buffer AE，放置1min；10000g，30s；
(7)Qubit浓度测定。
3、超声打断纯化后的基因组DNA，步骤如下：
(1)准备好超声打断仪器(购自Covaris，型号为M220)和50μl专用超声打断管子(购自Covaris)，取50μl上述纯化好的DNA，转移至专用管中；
(2)设置程序为150bp，运行60s；
(3)超声结束后，用2倍体积的AMPure XP Beads纯化，35μl ddH2O洗脱；
(4)再将洗脱获得的片段化DNA用0.8倍体积AMPure XP Beads纯化，35μl ddH2O洗脱；
(5)Qubit荧光定量仪对步骤(4)获得的DNA片段浓度进行测定。
4、不同突变频率的样本溶液配置
将购买的具有5％突变频率的EGFR肿瘤标准品(Multiplex cfDNA ReferenceStandard，horizondiscovery)稀释至浓度为5ng/μl，同时将打断的150bp大小的白细胞DNA稀释至同样浓度5ng/μl，不同突变频率的样本溶液配置结果如表3所示。
表3
| 样本类型 | 样本组成 |
| 5％突变频率样本 | 5％突变的肿瘤标准品 |
| 1％突变频率样本 | 10μl5％突变的肿瘤标准品+40μl150 bp的白细胞DNA |
| 0.5％突变频率样本 | 10μl1％突变的肿瘤标准品+90μl150 bp的白细胞DNA |
| 0.4％突变频率样本 | 40μl0.5％突变的肿瘤标准品+10μl150 bp的白细胞DNA |
| 0.2％突变频率样本 | 25μl0.4％突变的肿瘤标准品+25μl150 bp的白细胞DNA |
| 0.1％突变频率样本 | 25μl0.2％突变的肿瘤标准品+25μl150 bp的白细胞DNA |
| 0.05％突变频率样本 | 25μl0.1％突变的肿瘤标准品+25μl150 bp的白细胞DNA |
5、QPCR检测
对配置好的突变频率样本进行Q-PCR测试，其反应体系如下表所示，按表4配制反应液，对配置好的反应液进行上机测试，QPCR的反应程序如表5所示。
表4 Q-PCR反应各组分试剂配置
| 名称 | 浓度 | 体积(μl) |
| DNA | 5 ng/μl | 2 |
| 2×KPbuffer | 12.5 | |
| 引物F | 10μM | 0.25 |
| 引物R | 10μM | 0.25 |
| 探针mix | 10μM | 0.625 |
| ddH<sub>2</sub>O | 9.375 | |
| 总体积 | 25 |
表5 Q-PCR反应程序
实验结果如图6和图7所示，图6为EGFR基因E746-A750del突变基因型检测结果图，从图中可以看出，通过QPCR对E746-A750del缺失突变进行检测，在投入的DNA量为10ng的背景下，该突变型基因可被检测的肿瘤标准品突变频率低至0.05％。图7为EGFR基因L858R突变型基因的检测结果图，从图中可以看出，通过QPCR对L858R突变型基因的检测，在投入DNA含量为10ng的条件下，本发明的方法可检测突变含量为0.2％的肿瘤标准品，检测灵敏度高，特异性好。通过对肿瘤标准品的检测，可以看出本发明建立的基于KASP技术原理对EGFR中常见的两个突变类型检测的方法，可以高效应用于肿瘤低频突变的检测。
基于测序法与ARMS方法的比较，本发明方案是构建一种基于KASP技术的分析方法，检测低频突变的肿瘤相关基因EGFR，以期对该基因的实时突变进行检测，对肿瘤患者进行个体化用药指导。KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)技术主要应用于基因分析，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。KASP的技术原理如图1所示，只要合成两个通用荧光探针，两个通用淬灭探针，再加合成多个针对具体位点的SNP PCR引物，就可以测许多位点。该方法的优点在于灵敏度较高，其检测流程简单，速度快，数据分析要求低，检测成本低。对于检测试剂成本来说，荧光探针与猝灭探针价格相对来说比较昂贵，相比于ARMS检测方法，KASP的试剂使用的是通用型荧光探针和淬灭探针，成本相对较低，平均一个位点单次反应检测成本仅需1元人民币，是ARMS的1/20，大幅降低检测成本。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
序列表
<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司
<120> 一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tattcccgtc gctatcaaaa ca 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tcccgtcgct atcaaaacat ct 42
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacagcaaag cagaaactca cat 23
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgacctaga ctggactcca ttcaagatca cagattttgg ggg 43
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgacctaa agccacctcc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catgaacttg gtcaccttc 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcgacctaga ctggactcca t 21
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtccagtct aggtcgc 17
Claims (10)
1.一种检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变的试剂，其特征在于，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.3所示的第一引物对及序列如SEQ ID No.4及SEQ IDNo.5所示的第二引物对。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括序列如SEQ ID No.6所示的第一荧光探针和SEQ ID No.7所示的第一猝灭探针和序列如SEQ ID No.8所示的第二荧光探针和SEQ ID No.9所示的第二猝灭探针。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述第一引物对、第一荧光探针和第一猝灭探针用于检测EGFR基因19号外显子的del E746-A750突变；所述第二引物对、第二荧光探针和第二猝灭探针用于检测EGFR基因21号外显子的L858R突变。
4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，第一引物对和所述第二引物对的荧光标记序列不同。
5.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，第一荧光探针、第二荧光探针均独立地于5’端结合荧光基团；第一猝灭探针、第二猝灭探针均独立于3’端结合淬灭基团。
6.根据权利要求1所述的试剂在制备EGFR基因的突变检测试剂中的应用。
7.根据权利要求1所述的试剂在制备EGFR基因L858R和Del E746-A750突变检测试剂中的应用。
8.一种用于检测表皮生长因子受体基因L858R和Del E746-A750突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5任一所述的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒在制备肺癌检测试剂中的应用。
10.一种应用权利要求1-5任一所述试剂检测EGFR基因L858R和Del E746-A750突变率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤，将从全血样本中提取的DNA样本与上述引物组合物或上述试剂进行QPCR反应，对从全血样本中提取的EGFR基因进行PCR扩增根据CT值和熔点曲线来检测是否有突变发生，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210709 |