CN116837098A - 一种用于检测egfr突变基因的引物和荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测EGFR突变基因的引物和荧光探针及其应用。所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括SEQ ID NO.5‑SEQ ID NO.12所示的序列。本发明创造性地设计了用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针，检测灵敏度高、检测周期短，可以准确检测出患者是否具有T790M和C797S突变及其频率，并且能判别两种突变位点的排列方式。

Description

一种用于检测EGFR突变基因的引物和荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测EGFR突变基因的引物和荧光探针及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜糖蛋白，构成酪氨酸激酶受体ErbB家族的四个成员之一。在非小细胞肺癌(NSCLC)的发生发展中起着重要的作用，与NSCLC转归密切相关。EGFR能够介导细胞的生长和凋亡，其主要机制是通过EGFR配体本身同源二聚化或异源二聚化启动信号通路，从而引起机体内部的级联反应。EGFR能够介导的信号转导通路有很多种，其中，Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路和PI3K/Akt/mTOR路在NSCLC的发生、发展中发挥重要的作用。

EGFR受体酪氨酸激酶区域的18到21外显子是基因突变的主要位置，能够影响NSCLC的发生、发展。在NSCLC机体发病过程中，19外显子氨基酸缺失约达到50％，21外显子L858R点突变约占40％左右，而20外显子突变仅占1％-10％。而这些缺失突变导致了EGFR的过度表达(上调或扩增)，从而导致细胞发生失去控制的分裂。

T790M突变是EGFR基因20外显子第790位点由一个庞大体积的蛋氨酸(M)替代苏氨酸(T)，出现了位阻效应，减弱了与EGFR的ATP口袋中药物的结合力。另外，T790M突变增加了EGFR-L858R突变体与ATP的亲和力，而产生对TKIs的获得性耐药。

C797S突变是EGFR基因第20号外显子编码的酪氨酸激酶结构域，是EGFR蛋白与ATP竞争性靶向抑制剂结合的关键位点。C797S突变体现为半胱氨酸残基错义突变成丝氨酸，这一突变破坏了EGFR蛋白与第三代靶向药物结合，从而无法阻止EGFR蛋白与ATP结合及下游信号通路的活化。

当T790M和C797S同时突变时，T790M和C797S位于相同等位基因上，这种构型称为顺式；T790M和C797S位于不同等位基因上，这种构型称为反式。

目前检测EGFR基因T790M和C797S顺反式突变的方法主要有：高通量测序法，载体构建的一代测序法，实时荧光PCR法。但是高通量测序法检测步骤繁杂、试剂费用昂贵、结果判读依赖于生物信学分析计算，检测周期长。载体构建的一代测序法：(载体选择→引物设计→PCR扩增→载体和目标片段的限制性酶切→连接转化→挑取克隆提质粒验证)流程繁琐，操作过程容易造成污染，对血液ctDNA检测敏感性较低，不易使用，目前很少用PCR直接测这两个位点。实时荧光PCR法可以检测EGFR基因T790M和C797S顺反式突变，但该方法灵敏度较低，DNA用量高，容易受到抑制剂的影响导致假阴性的结果，检测灵敏度不高。

综上所述，目前检测EGFR基因T790M和C797S顺反式突变的现有方法存在检测步骤繁杂、试剂费用昂贵、结果判读依赖于生物信学分析计算，检测周期长等问题。如何提供一种快速、简便、高灵敏度、高特异性、试剂费用低、结果易于判读的检测EGFR基因C797S和T790M顺反式突变的检测方法，已成为目前生物技术领域亟待解决的问题之一。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测EGFR突变基因的引物和荧光探针及其应用，检测方法步骤简单，针对一个基因突变位点设计一条突变和野生型探针即可检测靶点突变型，通过三种探针法数字PCR检测T790M和C797S突变频率及顺反式，即可区分EGFR-T790M和EGFR-C797S为顺式突变或反式突变，且能计算突变频率。不需通过二代测序的实验和数据分析的复杂性来确定EGFR-T790M和EGFR-C797S是顺式突变还是反式突变。检测周期短，仅需一天就可出结果，且数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的序列，所述荧光探针的核酸序列包括SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.12所示的序列。

本发明创造性地设计了用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针，检测方法步骤简单，针对一个基因突变位点设计一条突变和野生型探针即可检测靶点突变型，通过三种探针法数字PCR检测T790M和C797S突变频率及顺反式，即可区分EGFR-T790M和EGFR-C797S为顺式突变或反式突变，且能计算突变频率。不需通过二代测序的实验和数据分析的复杂性来确定EGFR-T790M和EGFR-C797S是顺式突变还是反式突变。检测周期短，仅需一天就可出结果，且数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

SEQ ID NO.1：CACACTGACGTGCCTCTCC。

SEQ ID NO.2：TTTGCGATCTGCACACACCA。

SEQ ID NO.3：AGCGTGGACAACCCCCA。

SEQ ID NO.4：TGCGATCTGCACACACCAG。

SEQ ID NO.5：AGCTCATCACGCAGCTCA。

SEQ ID NO.6：AGCTCATCATGCAGCTCATG。

SEQ ID NO.7：CCTTCGGCTGCCTCCT。

SEQ ID NO.8：CCTTCGGCAGCCTCCT。

SEQ ID NO.9：TCGGCTCCCTCCTGGA。

SEQ ID NO.10：ACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGC。

SEQ ID NO.11：ATGCAGCTCATGCCCTTCGGCAGC。

SEQ ID NO.12：ATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTCC。

优选地，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。

优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、CY5或ROX中任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或MGB中任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针在制备用于检测EGFR突变基因的产品中的应用。

第三方面，本发明提供了一种检测EGFR突变基因的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针。

第四方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针在检测EGFR突变基因中的应用。

第五方面，本发明提供了一种检测EGFR突变基因的方法，所述方法包括：

从待测样本中提取ctDNA作为模板，利用第一方面所述的用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针进行多重微滴式数字PCR扩增，根据荧光PCR扩增结果进行判断。

优选地，所述判断的标准为：阴阳性质控在控的前提下：(1)存在连续阳性微滴(单荧光值)≥3，判定为阳性；(2)若阳性微滴≤2，需要增加投入量提高检出后判读；(3)阳性微滴数＝0，判定为阴性。

优选地，所述多重微滴式数字PCR扩增的方法包括：

(1)反应体系配置、分装至8联排中；

(2)模板投入；

(3)震荡混匀、上机检测；

(4)设置检测程序；

优选地，步骤(1)中所述反应体系包括PCR缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶。

优选地，步骤(1)中所述反应体系包括PCR反应Mix，所述PCR反应Mix包括DNA反应Mix，所述Mix的浓度为3×-5×。

优选地，所述PCR缓冲液为3×-5×PCR缓冲液，所述dNTP的浓度为50nM-200nM，所述Taq DNA聚合酶的浓度为0.1U-5U。

优选地，所述EGFR突变的位点包括T790M和/或C797S。

可以理解，本发明在基于现有的检测理论与结果基础上，通过设计针对不同突变位点检测的特异性引物及带有不同荧光修饰针对不同突变位点的探针，在同一个反应体系中，可以同步并行检测多个突变位点，通过一步多重PCR即可完成两个以上具有突变位点的目标序列的特异性扩增，借助带有不同荧光修饰的针对不同突变位点的探针即可同时检测多个基因位点突变。

可以理解，本发明并不局限于检测单位点突变，通过对现有探针设计方法的改进，在同一个反应体系还适用于单碱基缺失、短片段插入或缺失等其他突变类型的检测。

优选地，所述待测样本包括：血液、石蜡包埋组织、新鲜肿瘤组织、术后冰冻组织。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明检测方法步骤简单，针对一个基因突变位点设计一条突变和野生型探针即可检测靶点突变型，通过三种探针法数字PCR检测T790M和C797S突变频率及顺反式，即可区分EGFR-T790M和EGFR-C797S为顺式突变或反式突变，且能计算突变频率，不需通过二代测序的实验和数据分析的复杂性来确定EGFR-T790M和EGFR-C797S是顺式突变还是反式突变。检测周期短，仅需一天就可出结果，且数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，特别适合在复杂背景中检测稀有突变；

(2)本发明可以直接计算目标序列的拷贝数，无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量，结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于ct值的鉴定，高于QPCR灵敏度，检测限可达1％；

(3)本发明的反应体系引物探针特异性良好、灵敏度高、适用样本范围广。

附图说明

图1为实施例1中检测样本1EGFR T790M突变(c.2369C>T)的绝对定量图；

图2为实施例1中检测样本3/5EGFR C797S突变(c.2389T>A或c.2390G>C)的绝对定量图；

图3为实施例1中检测样本7/9EGFRT790M/C797S顺反式突变(c.2369C>T；c.2389T>A或c.2369C>T；c.2390G>C)的绝对定量图；

图4为实施例1中检测样本2/4/6/8/10EGFRT790M、C797S、顺反式野生型(c.2369C>T；c.2389T>A或c.2390G>C；c.2369C>T/c.2389T>A或c.2369C>T/c.2390G>C)的绝对定量图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

样本设计。

分别考察EGFR基因两个突变位点的三种突变类型，EGFR基因T790M位点、C797S位点及T790M/C797S顺反式构型三种突变类型检测情况如表1所示。

表1

根据表1设计T790M，C797S，T790M/C797S顺反式突变和野生型共计10种样本类型，如表2所示，分别为T790M、C797S、790M/C797S顺反式构型各位点的野生型、突变型样本，均为二代测序检出的已知野生型、突变型核酸样本(广州华银医学检验中心已确认)。

表2

实施例2

探针及引物的设计与合成。

探针设计要求：Taqman探针需包含多态性位点碱基，探针G/C含量在20～80％之间，长度在20～35bp之间，Tm值在50～65℃之间，5’端第一、第二个碱基避免为G。探针5’端进行荧光基团修饰(荧光选择：FAM、HEX、VIC)，3’端进行淬灭基团修饰(MGB或BHQ1、BHQ2)，且探针合成后需进行HPLC纯化。

上下游引物序列设计要求：引物PCR扩增产物需包含突变位点碱基，引物特异性高，避免二聚体和发卡结构的形成，避免重复核苷酸序列，尤其不能有4个连续的G，G/C含量在30～80％，引物长度在18～35bp之间，上下游引物间互补配对数不高于6bp，扩增产物长度在100～250bp范围内。

NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对上下游引物在基因组的特异性。

探针及引物皆在擎科生物公司进行合成，探针进行HPLC纯化，引物进行PAGE纯化。

本发明所设计引物探针如表3所示，在EGFR基因待测靶位点rs121434569、rs1057519861及rs2128958701的两侧设计引物，同时在待检测位点处设计探针，探针5’端进行荧光基团修饰，3’端带有淬灭基团修饰。rs121434569位点针对野生型和突变型设计探针，rs1057519861位点针对野生型和突变型设计探针，rs2128958701位点针对野生型和突变型设计探针，T790M/C797S顺反式构型针对野生型和突变型设计探针。

表3

反应体系扩增与验证：

如表4配置EGFR T790M检测体系，进行数字PCR扩增，使用微滴式数字PCR用反应预混液，货号：S0200020101，加入表2对应的DNA样本。进行数字PCR扩增→MicroDrop-100B型生物芯片分析仪中进行微滴检测→导出数据，进行定量分析，扩增程序如表7所示。

表4

如表5、表6配置C797S、T790M/C797S顺反式构型检测体系，使用微滴式数字PCR用反应预混液，货号：S0200020101，加入表2对应的DNA样本。进行数字PCR扩增→MicroDrop-100B型生物芯片分析仪中进行微滴检测→导出数据，进行定量分析，扩增程序如表7所示。

表5

表6

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表7

位点验证：

(1)分别根据EGFR基因的T790M、C797S、T790M/C797S顺反式构型通过二代测序检出结果为野生型、突变型核酸样本(广州华银医学检验中心已确认)，

微滴式数字PCR检测结果需满足阴阳性质控在控的前提下，进行结果判定。

阴阳性判读标准为：

①存在连续阳性微滴数(单荧光值)≥3，判定为阳性；

②若阳性微滴数≤2，需要增加投入量提高检出后判读；

③阳性微滴数＝0，判定为阴性。

(2)通过表3的引物和探针设定，EGFR基因的T790M、C797S、T790M/C797S顺反式构型位点突变的结果判定方式一致：首先根据第1和第2象限的单阳和双阳最下面的阳性微滴来划分阈值线，然后结合目标基因(FAM通道，即第1象限微滴)和参考基因(HEX通道，即第4象限微滴)的阳性微滴数比率来判定检测位点是否存在突变。检测结果如表8所示，绝对定量图如图1-图3所示。

表8

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表8中的EGFR T790M突变型(c.2369C>T)样本的结果图可参照图1，其突变频率为10.66％；EGFR C797S突变型(c.2389T>A或c.2390G>C)样本的结果图可参照图2，其突变频率分别为4.83％和8.85％；EGFR T790M/C797S顺反式突变型(c.2369C>T；c.2389T>A或者c.2369C>T；c.2390G>C)样本的结果图可参照图3，其突变频率为6.75％；EGFR T790M、C797S、T790M/C797S顺反式野生型样本的结果图可参照图4，其突变频率为0％。

实施例2

灵敏度测试。

根据表1所设定的EGFR T790M、C797S、T790M/C797S顺反式构型位点，将各位点已检测为突变型的1例样本(二代测序已确认)用野生型样本稀释其突变型样本的突变频率为0.1％，进行最低检出限确定，使用相同程序对其进行检测，重复5次。统计实验数据，拟定最低检出限为0.1％。根据野生背景下，突变频率为0.1％的临床样本重复5次均能有效检出，检测性能合格。

实施例3

准确性测试。

T790M位点、C797S位点突变及T790M/C797S顺反式构型不同检测方法的准确性比对收集各突变位点5份血浆通过二代测序检测确认为已知阳性结果的核酸样本，与本发明方法进行结果比对，以检测本方法的准确性。按照上述方法进行EGFR基因T790M、C797S及T790M/C797S顺反式构型突变位点数字PCR检测。

结果表明：数字PCR结果与二代测序结果一致，说明本发明可准确的检测血浆和组织样品样本中的T790M位点、C797S位点突变、T790M/C797S顺式构型。

实施例4

特异性测试。

选取5例突变型临床样本和5例野生型临床样本(二代测序已确认)，分别设定为下列实验组：1.不含干扰物的临床样本；2.含有109g/L血红蛋白干扰物的临床样本；3.含有450μmol/L胆红素干扰物的临床样本；4.含有6.70mmol/L甘油三酯干扰物的临床样本。经各实验组数据统计，加入干扰物质的临床样本与未加干扰物质的临床样本实验结果的符合率等于100％，检测性能合格。

综上所述，本发明检测方法步骤简单，针对一个基因突变位点设计一条突变和野生型探针即可检测靶点突变型，通过三种探针法数字PCR检测T790M和C797S突变频率及顺反式，即可区分EGFR-T790M和EGFR-C797S为顺式突变或反式突变，且能计算突变频率，不需通过二代测序的实验和数据分析的复杂性来确定EGFR-T790M和EGFR-C797S是顺式突变还是反式突变。检测周期短，仅需一天就可出结果，且数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针，其特征在于，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.12所示的序列。

2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团；

优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC或ROX中任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或MGB中任意一种或至少两种的组合。

3.权利要求1或2所述的用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针在制备用于检测EGFR突变基因的产品中的应用。

4.一种检测EGFR突变基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针。

5.权利要求1或2所述的用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针在检测EGFR突变基因中的应用。

6.一种检测EGFR突变基因的方法，其特征在于，所述方法包括：

从待测样本中提取ctDNA作为模板，利用权利要求1或2所述的用于检测EGFR突变基因的引物及荧光探针进行多重微滴式数字PCR扩增，根据荧光PCR扩增结果进行判断。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述判断的标准为：

阴阳性质控在控的前提下：(1)在连续阳性微滴(单荧光值)≥3，判定为阳性；(2)若阳性微滴≤2，需要增加投入量提高检出后判读；(3)阳性微滴数＝0，判定为阴性。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述多重微滴式数字PCR扩增的方法包括：

(1)反应体系配置、分装至8联排中；

(2)模板投入；

(3)震荡混匀、上机检测；

(4)设置检测程序；

优选地，步骤(1)中所述反应体系包括PCR缓冲液、dNTP和TaqDNA聚合酶；

优选地，步骤(1)中所述反应体系包括PCR反应Mix，所述PCR反应Mix包括DNA反应Mix，所述Mix的浓度为3×-5×；

优选地，所述PCR缓冲液为3×-5×PCR缓冲液，所述dNTP的浓度为50nM-200nM，所述TaqDNA聚合酶的浓度为0.1U-5U。

9.根据权利要求6-8所述的方法，其特征在于，所述EGFR突变的位点包括T790M和/或C797S。

10.根据权利要求6-9所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括：血液、石蜡包埋组织、新鲜肿瘤组织或术后冰冻组织中的任意一种或至少两种的组合。