CN104762408A

CN104762408A - 检测egfr基因突变的试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN104762408A
Application number: CN201510213349.8A
Authority: CN
Inventors: 王弢; 李宗飞; 孙爱娟; 李�杰; 张丽
Original assignee: SUZHOU MICRO DIAG BIOMEDICINE CO Ltd
Current assignee: Jiangsu is the real biopharmaceutical technology Limited by Share Ltd
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2035-04-29
Also published as: CN104762408B

Abstract

本发明公开了检测EGFR基因突变的试剂盒及其检测方法，试剂盒含有针对EGFR基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针，该特异探针能够与野生型DNA结合，能检出含0.01％EGFR基因突变的DNA样本，本发明的检测方法对EGFR基因突变检测具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，特别适合从血浆，尿液，唾液等含有突变含量低的体液中检测基因突变，适合对肺癌进行早期筛查和诊断，为个体化用药提供指导。

Description

检测EGFR基因突变的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测EGFR基因突变的试剂盒，该涉及利用该试剂盒在非疾病诊断中检测EGFR基因突变的方法。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，定位于细胞膜上，一种跨膜受体酪氨酸激酶。EGFR主要通过两条途径将信号传递至细胞核，一条是Ras→Raf→MAPK途径；另一条是PI3K→PKC→IKK途径。当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化。EGFR信号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。

目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)临床治疗的重要手段。易瑞沙(Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康)和特罗凯(Tarceva/厄罗替尼/Erlotinib，罗氏制药)作为表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是，临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30％的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗疗效相关，多数携带EGFR基因突变的患者疗效显著。

临床研究证实，18-21外显子突变可作为TKI治疗的有效预测指标。各种来源的肺癌组织是检测突变的最佳样本，但部分中晚期患者难以得到较佳的病理组织，检测血液中来自肿瘤的DNA是否有突变是一种趋势。肿瘤患者的血液循环DNA，亦称非细胞游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)中包含肿瘤起源的DNA。肿瘤cfDNA包括来源于正常细胞的野生型DNA和肿瘤细胞DNA，多项研究表明肿瘤患者血液中可以检测到与自身肿瘤相一致的DNA突变。

因此，检测组织或血液EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药，具有重要的参考价值。

目前检测基因突变的方法主要有以下几种：

(1)直接测序法。直接测序法的原理是：首先针对突变位点设计引物(每个基因设计一对引物，引物所对应的产物尽可能的包含突变位点所在的位置)，然后通过简单PCR扩增获得目的基因产物，最后对PCR产物进行测序并且对测序结果进行初步分析。初步分析完成后，对一些可能的突变样品的PCR产物，需要对目的条带进行切胶回收；回收后的PCR产物连接克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。此过程比较繁琐、耗时长，而且由于测序方法本身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。

(2)变性高效液相色谱法(denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。由于杂合双链在突变位点处出现错配，更易于形成“Y”形结构，与固定相的结合能力降低，因此杂合DNA链要比纯合DNA链优先洗脱出来，通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确认。

(3)高分辨率溶解曲线(high resolution melting，HRM)。高分辨率溶解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。

(4)探针扩增阻滞突变法(amplification refractory mutation system，ARMS)。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物,该检测方法的灵敏度在1％左右。

(5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(competitive allele-specific TaqManpolymerase chain reaction，CAST-PCR)。CAST-PCR法采用优化TaqMan探针，通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优先扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在1-0.1％左右。

因此，急需一种提高检测EGFR基因的灵敏度的方法和相应的检测试剂盒，为肺癌个体化用药提供指导。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供检测EGFR基因突变的试剂盒，该试剂盒特异性强且灵敏度高；本发明的目的之二在于提供检测EGFR基因突变，该方法检测周期短。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、检测EGFR基因突变的试剂盒，所述试剂盒含有针对EGFR基因突变位点的LNA锁核酸修饰的Block序列。

优选的，所述LNA锁核酸修饰的Block序列如下：

G719X：CC+GGAG+C+CCAGCACTTTG-PO₄；

19-del：TA+TCAAGGAATTA+A+GA+GAAGCAACATCTC-PO₄；

20-Insertions：GGACAAC+CC+CCAC+G+TGTGC-PO₄；

T790M：AT+CA+C+G+C+AGCTCATGCC-PO₄；

S768I：GG+C+CA+GCG+TGGACAACCC-PO₄；

L858R：GG+GC+T+GG+CC+AAACTGCTG-PO₄；

L861Q：AC+T+G+CTG+GG+TGCGGAAGAGAAAG-PO₄；

其中“+”后的T，A，C或G表示锁核酸修饰碱基。

优选的，所述试剂盒中还包含检测EGFR基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列如所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.6与SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.8与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.10与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.12与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.14与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.16与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.17与SEQID NO.24、SEQ ID NO.18与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.20与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.22与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.26与SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.27与SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29与SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31与SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.33与SEQ ID NO.34所示。

更优选的，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。

更优选的，所述试剂盒中各组分的终浓度如下：1×PCR buffer、2.5mM MgCl₂、dNTP250μM、引物250nM、探针500nM、1×EVE GREEN、DNA聚合酶1U和DNA模板2-20ng。

2、所述检测EGFR基因突变的试剂盒在非疾病诊断中检测EGFR基因突变的方法，包括如下步骤：

a.设计检测EGFR基因突变的引物和针对EGFR基因突变位点的LNA锁核酸修饰的Block；

b.从待测样品中提取模板DNA，然后利用步骤a得到的引物和Block进行荧光定量PCR扩增反应；

c.根据溶解曲线判读Ct值，然后根据Ct值判断待测样品中EGFR基因突变情况，若溶解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct<45，表明扩增区段发生突变。

本发明的检测原理如图1所示。

优选的，所述荧光定量PCR扩增反应的条件如下：92～97℃预变性5～15分钟；92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，进行35～55个循环；然后92～97℃预变性0.2～5分钟，20～55℃退火0.2～5分钟，然后熔解，所述熔解条件为60～97℃、温度变化梯度为0.02-0.06℃/s下采集荧光，每秒采集荧光10～30次。

本发明的有益效果在于：(1)特异性强：加入能与野生型特异性结合的block；(2)灵敏度高，检测灵敏度达到0.01％；(3)检测过程为闭管反应，减少污染的可能性；(4)操作简单快速，整个PCR反应过程只有90分钟；而直接测序法则需要2天的时间，且为开管操作，大大增加污染的可能性；(5)结果判读明确客观，只需根据扩增数据和熔解曲线即可完成对样本基因类型的判读；(6)安全性好，整个体系不包含有毒有害物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1本发明的检测原理图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本项目由“江苏省科技成果转化专项资金资助”和“国家高技术研究发展计划(863计划)资助”，项目编号2014AA020803。

本发明中所使用的仪器如下：Lightcycler 480、nanodrop 1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。

本发明中所使用的试剂：DNA聚合酶(罗氏公司)、10×PCR Buffer(罗氏公司)、MgCl2(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。

本发明中所使用探针：所有探针纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。

实施例1

EGFR基因阴性质控品为EGFR基因未突变的人血清基因组DNA，然后稀释至10³拷贝数。EGFR基因阳性质控品由EGFR基因4个外显子EGFR18、EGFR19、EGFR20和EGFR21对应的29个突变位点的突变序列连接到pUC57-Amp载体，转化大肠杆菌后，经提取纯化，最后稀释成浓度为10³拷贝数/μl。其中突变位点信息来源于Cosmic数据库，分别为G719A、G719S、G719C、E746_A750del(1)、E746_A750del(2)、L747_P753>S、E746_T751>I、E746_T751del、E746_T751>A、E746_S752>A、E746_S752>V、E746_S752>D、L747_A750>P、L747_T751>Q、L747_E749del、L747_T751del、L747_S752del、L747_A750>P、L747_P753>Q、L747_T751>S、L747_T751del、L747_T751>P、T790M、S768I、H773_V774insH、D770_N771insG、V769_D770insASV、L858R、L861Q，其中EGFR19上的缺失突变位点命名为19-del；EGFR20上的插入突变位点命名为20-Insertions，突变位点的序列由苏州金唯智生物技术公司合成，具体序列如表1所示：

表1、EGFR基因突变位点序列

根据含突变位点的序列设计检测EGFR基因29个突变位点的引物，具体引物如表2所示：

表2、检测EGFR基因突变的引物

Block是指一种寡核苷酸，其3’端做过以下修饰：磷酸化或者间臂：Spacer 3、Spacer 6和Spacer 18处理中的一种或多种处理，在PCR反应过程中，没有探针延伸扩增的功能。Block以锁核酸(LNA)修饰以硫化修饰后的野生型DNA为模板，进行设计序列和合成。Block和模板的特异结合的部位覆盖了探针的结合部位，当非突变DNA存在时，Block与之结合，提高了探针和突变DNA结合的特异性。设计的Block序列如表3所示：

表3、Block序列

位点	Block序列
		G719X	CC+GGAG+C+CCAGCACTTTG-PO₄
19-del	TA+TCAAGGAATTA+A+GA+GAAGCAACATCTC-PO₄
		20-Insertions	GGACAAC+CC+CCAC+G+TGTGC-PO₄
T790M	AT+CA+C+G+C+AGCTCATGCC-PO₄
		S768I	GG+C+CA+GCG+TGGACAACCC-PO₄
L858R	GG+GC+T+GG+CC+AAACTGCTG-PO₄
		L861Q	AC+T+G+CTG+GG+TGCGGAAGAGAAAG-PO₄

根据设计的引物和Block序列，对各组分在如下条件下进行优化：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1μM EGFR正向探针、0.1～1μM EGFR基因反向探针、0.1～2μM block、0.05～2ng/μl模版DNA、Eva Green染料0.5～2μl、1～5mM二氯化镁，反应程序为95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，50个循环；95℃变性1min，40℃退火1min，65-95℃解链，最后40℃保存。考虑到实验过程中可能存在加样或人为因素导致的差异，故选择重复测定3次，并设置浓度梯度的样本和空白对照。

不同突变位点的Tm范围如表4所示。

表4、不同位点突变的Tm值范围

突变名称	突变的Tm值范围
		19-Del	80≤Tm≤85
L858R	84≤Tm≤87
		T790M	84.5≤Tm≤88
20-Insertions	89≤Tm≤93
		G719X	85≤Tm≤88
S768I	89≤Tm≤93
		L861Q	85≤Tm≤88

荧光定量结束后根据CT值和熔解曲线进行结果判定，具体方法如下：

1.运行Abs Quant/2nd Derivative Max程序来判断扩增曲线有无，如有扩增曲线，计算Cp值(Ct值)。

2.运行Tm Calling程序来查看熔解曲线并计算Tm值，如果熔解曲线有2个或者2个以上的峰，以最高峰对应的Tm为准。

3.运行阳性质控品(STD)，阳性质控有扩增曲线且Ct值<40，每个位点熔解曲线峰的Tm值有一个参考范围，如19-Del的Tm值范围为81≤Tm≤84，L858R的Tm范围为85≤Tm≤86.5，T790M的Tm范围为85.5≤Tm≤87.5，20-Insertions的Tm值范围为90≤Tm≤92，G719X的Tm值范围85.5≤Tm≤87，S768I的Tm值范围为90≤Tm≤92，L861Q的Tm值范围为86≤Tm≤87.5，Control的Tm值范围为81≤Tm值≤84。

4.运行Control，如果有扩增曲线，组织样本Ct值<32或血浆样本Ct值<39，且熔解峰型(Tm值)与STD的Control熔解峰型(Tm值)符合(Tm值差值绝对值小于或等于0.85，则样品合格，可以继续分析。如果：无扩增曲线，或组织样本Ct值大≥32或血浆样本Ct值≥39，或熔解峰型(Tm值)与STD的Control熔解峰型(Tm值)不符合(Tm值差值绝对值大于0.85)说明样品DNA降解严重，不适合试验需要。

5.运行无模板对照(NTC)，应无扩增曲线；或有扩增曲线，但是Ct≥45；或是每个位点熔解峰型(Tm值)与STD该位点熔解峰型(Tm值)不符合(Tm值差值绝对值大于0.85)。

6.符合上述条件，运行待检样本，首先判读扩增曲线有无，如无扩增曲线，可直接判读为阴性。如有扩增曲线，但是每个位点的Ct值大于或等于临界值(表5)，判断为阴性。如果某位点有扩增曲线且Ct值小于临界值，且该位点熔解峰型(Tm值)与STD该位点熔解峰型(Tm值)符合(Tm值差值绝对值小于或等于0.85)，判断为该位点突变；如果该位熔解峰型(Tm值)与STD该位点熔解峰型(Tm值)不符合(Tm值差值绝对值大于0.85)，判断为阴性。

表5、不同位点突变Ct临界值

突变位点	组织样本	血浆样本
			G719X	43	44.5
19-Del	45	45
			20-Insertions	43	44.5
T790M	43	44.5
			S768I	38.5	44
L858R	45	45

L861Q

38

43

不符合上述第4项要求，建议重提DNA，重复检测。不符合上述3项、5项要求，建议重复实验。

对反应体系的优化结果显示，如表6所示的反应体系效果最佳。

表6、最优反应体系

原材料	体系(反应最终体系浓度)
		10×PCR buffer	1×
MgCl₂	2.5mM
		dNTP	250μM
引物(上下游)	250nM
		Block	500nM
EVE-GREEN	1×
		DNA聚合酶	1U
DNA模板	2-20ng
		总体系	20μL

利用优化的检测体系和反应程序分析EGFR基因29个位点的最低检测限度，分别以阳性对照品DNA浓度为0ng/μl、0.1ng/μl、1ng/μl和5ng/μl的EGFR基因阳性质控品，并且在最低限检测过程中设置空白样本，以空白样本没有发生扩增确定为实验可信。本实验检测样本时，最低检测限度必须是每个位点都必须达到，所以在选择设置最低检测限度时应该以29个位点中全部适用的结果，结果如表7所示。

表7、最低检测限度结果

由表7可知，EGFR基因29个位点的最低DNA背景浓度为0.1ng/μl。

实施例2

对29个突变阳性质控品以及Control质控品进行准确稀释，统一稀释到10³拷贝数，稀释液为10ng/μl的野生型DNA，然后将阳性质控品与Control质控品按照阳性质控品与Control质控品的比例分别为0:100、0.01:99.99、0.5:99.5、5:95配制敏度参考品。考虑到实验过程中可能存在加样或个人因素导致的差异，故选择重复测定3次，每次将混合样本与0％的进行对比分析，检测其灵敏度，根据结果中的平局值分析对应的灵敏度区间。根据最低检测限度实验结果，所有位点空白样本都没有发生扩增，实验可信。本实验检测样本时，需要的最低检测限度必须是每个位点都必须达到，所以在选择设置最低检测限度应该以29个位点中全部适用的结果，其检测结果见表8所示。

表8、突变率最低检测限度结果

由表8可知，突变率最低检测限度为0.01％。

本发明的试剂盒批内、批间重复性/精密度指示标准为变异系数CV，通过计算CV值来评估试剂盒批内和批间的试剂性能差异，判断试剂盒是否具有良好的重复性。此指标指示本试剂盒重复性时需要同时评估29个位点的变异系数CV值。对3批3次重复实验的统计结果为：三批试剂盒检测得出各批试剂盒内CV值均小于5％，具有极高的重复性；并且三批试剂盒检测得出批间CV值均小于5％，同样表明具有极高的重复性。

实施例3

采集100份肺癌患者组织样本及所配对的术前的的血浆样本，样本均采集自浙江大学医学院附属第一医院。样本采集后，立即放入-80度冰箱中保存。组织样本中的DNA与血浆中游离的DNA(cf-DNA)，均采用Qiagen试剂盒进行抽提，并进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测定。

然后使用实施例1的方法分别检测15例肺癌病人的组织样本和血浆样本中的突变位点，并且同时对组织样本进行测序，根据测序结果来确定突变的类型，结果图表9所示。

表9、采用本发明的方法检测肺癌患者结果

结果显示，使用本发明的方法检测血浆样本与测序方法检测配对的组织样本的突变符合率在93.3％。用本发明的方法检测血浆样本和配对的组织样本的符合率在86.7％，说明本方法可以用于组织，血浆中EGFR突变的检测。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有针对EGFR基因突变位点的LNA锁核酸修饰的Block序列。

2.根据权利要求1所述检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述LNA锁核酸修饰的Block序列如下：

G719X：CC+GGAG+C+CCAGCACTTTG-PO₄；

19-del：TA+TCAAGGAATTA+A+GA+GAAGCAACATCTC-PO₄；

20-Insertions：GGACAAC+CC+CCAC+G+TGTGC-PO₄；

T790M：AT+CA+C+G+C+AGCTCATGCC-PO₄；

S768I：GG+C+CA+GCG+TGGACAACCC-PO₄；

L858R：GG+GC+T+GG+CC+AAACTGCTG-PO₄；

L861Q：AC+T+G+CTG+GG+TGCGGAAGAGAAAG-PO_4；

其中“+”后的T，A，C或G表示锁核酸修饰碱基。

3.根据权利要求1所述检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含检测EGFR基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2、SEQID NO.1与SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.8与SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.10与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.12与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.24、SEQID NO.14与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.16与SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.18与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.20与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.24、SEQID NO.22与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25与SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.26与SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.27与SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29与SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31与SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.33与SEQ ID NO.34所示。

4.根据权利要求1所述检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。

5.根据权利要求4所述检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各组分的终浓度如下：1×PCR buffer、2.5mM MgCl₂、dNTP 250μM、引物250nM、探针500nM、1×EVEGREEN、DNA聚合酶1U和DNA模板2-20ng。

6.权利要求1-5任一项所述检测EGFR基因突变的试剂盒在非疾病诊断中检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

c.根据溶解曲线判读CP值，然后根据Ct值判断待测样品中EGFR基因突变情况，若溶解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct<45，表明扩增区段发生突变。

7.根据权利要求6所述检测EGFR基因突变的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR扩增反应的条件如下：92～97℃预变性5～15分钟；92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，进行35～55个循环；然后92～97℃预变性0.2～5分钟，20～55℃退火0.2～5分钟，然后熔解，所述熔解条件为60～97℃、温度变化梯度为0.02-0.06℃/s下采集荧光，每秒采集荧光10～30次。