CN107723213A - 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法 - Google Patents

一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107723213A
CN107723213A CN201711212624.XA CN201711212624A CN107723213A CN 107723213 A CN107723213 A CN 107723213A CN 201711212624 A CN201711212624 A CN 201711212624A CN 107723213 A CN107723213 A CN 107723213A
Authority
CN
China
Prior art keywords
droplet
detection
detection probe
growth factor
factor receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711212624.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN107723213B (zh
Inventor
龚建
冯晓燕
林挺
王文利
于祥春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Apexbio Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Apexbio Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Apexbio Technology Co Ltd filed Critical Beijing Apexbio Technology Co Ltd
Priority to CN201711212624.XA priority Critical patent/CN107723213B/zh
Publication of CN107723213A publication Critical patent/CN107723213A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107723213B publication Critical patent/CN107723213B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明基于三荧光通道的数字PCR方法精准检测人EGFR基因的突变位点。本方法利用特异的TAQMAN探针，针对EGFR基因L858R、L861Q、E19缺失和T790M四重突变区域，在单管反应液中同时检测涉及EGFR‑TKI药敏和耐药的共22个突变位点，并且可以根据突变DNA的拷贝数判定模板类型。针对人EGFR基因19号外显子缺失突变，本方法还设计了特殊的一种探针，使用了特异修饰的阻遏核苷酸与野生型DNA相结合的方法从而确保检测到的荧光微珠均为突变DNA的信号，之后再根据突变DNA的拷贝数判定模板的类型。本发明中涉及到的试剂盒及方法主要利用了人体血液进行液态活性检测，并通过检测人EGFR基因突变的情况，克服了以往EGFR基因突变检测中繁琐和灵敏度低等问题，大大提高了人EGFR基因突变检测的稳定性、特异性和灵敏度。

Description

一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒及方法
技术领域
本发明专利涉及一种EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒及方法，属于生物医学核酸检测技术领域。
背景技术
随着现代生活水平和质量的提高，现代疾病也呈现发展的态势，尤其是恶性肿瘤的发病率在我国已经呈现逐年迅速上升的状况。其中，基因产生的突变是癌症高发的重要因素，而分子靶向药物专门针对基因产生突变引发的癌症发挥功效。靶向药物(也称作靶向制剂)是指被赋予了靶向(Targeting)能力的药物或制剂。其目的是使药物或其载体能瞄准特定的病变部位，并在目标部位蓄积或释放有效成分。靶向制剂可以使药物在目标局部形成相对较高的浓度，从而在提高药效的同时抑制毒副作用，减少对正常组织或细胞的伤害，目前的靶向药以分子靶向药类居多。肺癌靶向药物的出现让非小细胞型肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)患者的生存时间和生活质量都有了显著的提升。对于肺癌患者，尤其是晚期患者，靶向治疗相较于化疗、放疗，可以很大程度地延长患者生命，并且给患者带来的治疗损伤较小。之前已经有许多研究表明EGFR基因产生的突变与酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI)的关系密切，其中外显子21上的替代突变(L858R)占EGFR基因总敏感突变的45％，外显子19缺失突变占EGFR基因总敏感突变的50％。EGFR敏感突变已成为癌症患者是否对TKI敏感的强预测因子，有研究表明，EGFR发生敏感突变的患者中，大约有75％对TKI治疗有反应。其中以吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)为代表的靶向药物取得了良好的疗效。目前，美国食品药品监督管理局(Food and DrugAdministration，FDA)以及美国国立综合癌症网络(National Comprehensive CancerNetwork，NCCN)指南已规定TKI药物的治疗必须要依据EGFR基因的检测结果来选择治疗对象，要筛选最合适的患者进行有针对性的靶向治疗以提高药物疗效。目前，我国已有的“EGFR突变NSCLC治疗之中国共识”、“中国NSCLC患者EGFR基因突变检测专家共识”以及CFDA也规定TKI药物的治疗必须先进行EGFR基因突变的伴随诊断，只有具有EGFR敏感突变的患者才能进行后续的EGFR-TKI治疗。因此，当前首先检测EGFR基因的突变状态是决定患者是否能够使用EGFR-TKI治疗的先决条件。但是，一代/二代EGFR-TKI靶向药物治疗平均8-14个月后，多数患者会陷入新的困境——继发性耐药，其中EGFR基因的T790M突变是耐药现象产生的主要原因，该突变发生概率在44～86％。研究还发现，T790M突变不仅存在于TKI治疗后的患者标本中，也存在于TKI治疗前的患者标本中。因此，对于TKI耐药的非小细胞型肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者，如何根据突变的类型和突变的丰度，在合适的时间进行合适的治疗是目前迫切需要解决的问题。如果通过基因检测，发现患者产生了T790M的耐药突变，则可以选择服用国内已经上市的靶向药物奥希替尼(AZD9291)来进行治疗。奥希替尼是阿斯利康的第三代靶向EGFR-TKI药物，针对T790M突变导致的耐药性有很好的疗效。因此，对EGFR基因的T790M耐药突变的动态监测，已成为目前及时发现耐药患者从而采取最佳治疗策略的关键所在。
但是由于患者的肿瘤组织样本获取难度较高，难以满足实时动态监测的需要，因此，基于血液样本的液态活检技术已成为肿瘤组织检测的重要补充。血液检测除了可用于筛选EGFR-TKIs的适治患者，还可以动态监测靶向治疗过程中肿瘤标志物的变化，特别是可用于发现新出现的耐药相关基因如T790M突变的变异。与检测肿瘤组织的基因突变相比，虽然进行血液检测的EGFR基因突变具有高度的特异性(IPASS、IFUM和IGNITE研究中特异性分别是100％、99.8％和97.2％)，但是目前都普遍存在敏感性较低(IPASS、IFUM和IGNITE研究中敏感性分别是43.1％、65.7％和49.6％)的情况。产生这种情况的主要原因是因为基因突变检测方法存在很明显的缺陷。目前基因突变常用检测方法有一代测序法和基于实时定量PCR的扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)。一代测序又被称为Sanger测序，其检测周期长(需要1-2天)，且灵敏度低，仅能检测到10％以上的突变；ARMS法虽然已成为基因突变检测最常用的方法，但是其灵敏度仅为1％。因此，利用血液进行液态活检，选择和使用在具有高度检测特异性的同时，又可以提高检测灵敏度的技术对于EGFR基因突变的检测是尤为重要的。
数字PCR技术为有效提高基因突变检测灵敏度以及精准度提供了可能。数字PCR被称为第三代PCR，该技术是将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元里。根据每个反应单元中扩增后的荧光信号相对比例和反应单元的体积，通过泊松分布计算出核酸靶分子的浓度。由于通过分液过程降低了每个反应单元中的背景，数字PCR技术极大地提高了检测灵敏度和检出率。目前市场上已有利用数字PCR技术检测EGFR基因突变的研究与方法，但是由于通量与荧光检测通道的限制，还无法准确进行EGFR基因多位点的同时检测。虽然也有专利描述可以在双检测通道的基础上利用探针的浓度差异进行多位点检测，但是探针浓度的差异势必会影响背景信号强度的差异，从影响检测阈值的判定，导致检测结果重复性差以及数据的不稳定。因此，为了有效提高EGFR基因突变检测的灵敏度、稳定性与检测通量，非常有必要提供一种基于液态活检的EGFR基因突变高灵敏多位点检测方法，以满足越来越细化的临床精准医疗的迫切需求。
本发明专利首创采用三通道对四个基因的22个变异位点进行检测分析，利用单色光在保证检测灵敏度的基础上实现了双靶标的检测，使用蓝色荧光检测EGFR基因18号外显子上的两个敏感突变(L858R、L861Q)，使用绿色荧光检测19号外显子上19种敏感缺失(19del)，而使用红色荧光检测20号外显子上的1个耐药突变(T790M)。三个检测通道保证了EGFR基因多突变位点检测的准确性与可靠性。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种适用于临床需求的快速、简便、灵敏、准确、稳定的人EGFR基因多位点突变的检测方法。
本发明目的之二在于提供一种高灵敏EGFR基因多突变检测方法的试剂盒，针对肿瘤组织产生的游离DNA，包括血浆游离DNA、血清游离DNA、尿液游离DNA、汗液DNA、唾液DNA以及FFPE切片提取所得的极微量DNA来进行EGFR基因多突变检测，从而为患者EGFR-TKI用药、耐药研究以及肿瘤的全程医疗管理方案提供强有力的工具。
附图说明
图1是实施例1中空白对照L861Q野生型位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图2是实施例1中EGFR特异性多重基因标准品L861Q野生型位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图3是实施例1中EGFR特异性多重基因标准品L858R突变位点(FAM)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图4是实施例1中EGFR特异性多重基因标准品L858R野生型位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图5是实施例1中EGFR特异性多重基因标准品T790M突变位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图6是实施例1中EGFR特异性多重基因标准品T790M野生型位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图7是实施例1中EGFR特异性多重基因标准品E19缺失位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图8是实施例1中EGFR特异性多重基因标准品E19野生型位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图9是实施例2中EGFR特异性多重基因标准品L861Q和L858R突变型位点(FAM)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图10实施例2中EGFR特异性多重基因标准品E19缺失位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图11是实施例2中EGFR特异性多重基因标准品T790M突变型位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图12是实施例3中含12.5％L858R突变标准品的L858R突变型位点(FAM)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图13实施例3中含12.5％L858R突变标准品的L858R野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图14是实施例3中含12.5％L858R突变标准品的L858R突变型位点(FAM)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是L858R突变型位点(FAM)的荧光信号值，Y轴是L858R野生型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区。
图15是实施例3中含1％L858R突变标准品的L858R突变型位点(FAM)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图16实施例3中含1％L858R突变标准品的L858R野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图17是实施例3中含1％L858R突变标准品的L858R突变型位点(FAM)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是L858R突变型位点(FAM)的荧光信号值，Y轴是L858R野生型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区。
图18是实施例3中含0.1％L858R突变标准品的L858R突变型位点(FAM)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图19实施例3中含0.1％L858R突变标准品的L858R野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图20是实施例3中含0.1％L858R突变标准品的L858R突变型位点(FAM)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是L858R突变型位点(FAM)的荧光信号值，Y轴是L858R野生型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区。
图21是实施例3中含0.05％L858R突变标准品的L858R突变型位点(FAM)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图22实施例3中含0.05％L858R突变标准品的L858R野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图23是实施例3中含0.05％L858R突变标准品的L858R突变型位点(FAM)和野生位点(VIC)检测二维图。X轴是L858R突变型位点(FAM)的荧光信号值，Y轴是L858R野生型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区。
图24是实施例3中含12.5％L861Q突变标准品的L861Q突变型位点(FAM)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图25实施例3中含12.5％L861Q突变标准品的L861Q野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图26是实施例3中含12.5％L861Q突变标准品的L861Q突变型位点(FAM)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是L861Q突变型位点(FAM)的荧光信号值，Y轴是L861Q野生型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区。
图27是实施例3中含1％L861Q突变标准品的L861Q突变型位点(FAM)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图28是实施例3中含1％L861Q突变标准品的L861QR野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图29是实施例3中含1％L861Q突变标准品的L861Q突变型位点(FAM)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是L861Q突变型位点(FAM)的荧光信号值，Y轴是L861Q野生型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区；
图30是实施例3中含0.1％L861Q突变标准品的L861Q突变型位点(FAM)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图31是实施例3中含0.1％L861Q突变标准品的L861Q野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图32是实施例3中含0.1％L861Q突变标准品的L861Q突变型位点(FAM)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是L861Q突变型位点(FAM)的荧光信号值，Y轴是L861Q野生型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区。
图33是实施例3中含0.05％L861Q突变标准品的L861Q突变型位点(FAM)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图34是实施例3中含0.05％L861Q突变标准品的L861Q野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图35是实施例3中含0.05％L861Q突变标准品的L861Q突变型位点(FAM)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是L861Q突变型位点(FAM)的荧光信号值，Y轴是L861Q野生型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区。
图36是实施例3中含12.5％T790M突变标准品的T790M突变型位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图37实施例3中含12.5％T790M突变标准品的T790M野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图38是实施例3中含12.5％T790M突变标准品的T790M突变型位点(CY5)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是T790M野生型位点(CY5)的荧光信号值，Y轴是T790M突变型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区。
图39是实施例3中含1％T790M突变标准品的T790M突变型位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图40实施例3中含1％T790M突变标准品的T790M野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图41是实施例3中含1％T790M突变标准品的T790M突变型位点(CY5)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是T790M野生型位点(CY5)的荧光信号值，Y轴是T790M突变型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区。
图42是实施例3中含0.1％T790M突变标准品的T790M突变型位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图43实施例3中含0.1％T790M突变标准品的T790M野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图44是实施例3中含0.1％T790M突变标准品的T790M突变型位点(CY5)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是T790M野生型位点(CY5)的荧光信号值，Y轴是T790M突变型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区。
图45是实施例3中含0.05％T790M突变标准品的T790M突变型位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图46实施例3中含0.05％T790M突变标准品的T790M野生位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图47是实施例3中含0.05％T790M突变标准品的T790M突变型位点(CY5)和野生位点(VIC)检测二维图。图例说明：X轴是T790M野生型位点(CY5)的荧光信号值，Y轴是T790M突变型位点(VIC)的荧光信号值，右下是突变型位点阳性微滴区，左上是野生型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区；
图48是实施例3中含12.5％E19缺失标准品的E19缺失位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图49是实施例3中含12.5％E19缺失标准品的E19野生型位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图50是实施例3中含12.5％E19缺失标准品的E19缺失位点(VIC)和野生位点(CY5)检测二维图。图例说明：X轴是E19野生型位点(CY5)的荧光信号值，Y轴是E19缺失型位点(VIC)的荧光信号值，右下是野生型位点阳性微滴区，左上是缺失型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区；
图51是实施例3中含1％E19缺失标准品的E19缺失位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图52是实施例3中含1％E19缺失标准品的E19野生型位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图53是实施例3中含1％E19缺失标准品的E19缺失位点(VIC)和野生位点(CY5)检测二维图。图例说明：X轴是E19野生型位点(CY5)的荧光信号值，Y轴是E19缺失型位点(VIC)的荧光信号值，右下是野生型位点阳性微滴区，左上是缺失型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生型位点共有微滴区；
图54是实施例3中含0.1％E19缺失标准品的E19缺失位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图55是实施例3中含0.1％E19缺失标准品的E19野生型位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图56是实施例3中含0.1％E19缺失标准品的E19缺失位点(VIC)和野生位点(CY5)检测二维图。图例说明：X轴是E19野生型位点(CY5)的荧光信号值，Y轴是E19缺失型位点(VIC)的荧光信号值，右下是野生型位点阳性微滴区，左上是缺失型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生位点共有微滴区。
图57是实施例3中含0.05％E19缺失标准品的E19缺失位点(VIC)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图58实施例3中含0.05％E19缺失标准品的E19野生型位点(CY5)检测一维图。图例说明：X轴是crystal digital PCR检测体系中生成的微滴数(单位：个)，Y轴是荧光信号，阈值线以上为阳性微滴，阈值线以下为阴性微滴。
图59是实施例3中含0.05％E19缺失标准品的E19缺失位点(VIC)和野生位点(CY5)检测二维图。图例说明：X轴是E19野生型位点(CY5)的荧光信号值，Y轴是E19缺失型位点(VIC)的荧光信号值，右下是野生型位点阳性微滴区，左上是缺失型位点阳性微滴区，右上是突变型位点和野生位点共有微滴区。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均属于本发明的保护范围内。
具体实施方式
1、实验材料：
1.1本发明专利中所涉及到的EGFR基因突变的检测位点见表1
表1、EGFR基因突变的检测位点
1.2根据Cosmics数据库公布的人类EGFR基因19外显子E19、20外显子T790M、21外显子L861Q、21外显子L858R为野生型基因序列，针对人类EGFR基因19外显子E19、20外显子T790M、21外显子L861Q、21外显子L858R突变位点为基础，设计特异性引物和新型探针(见表2)，本发明专利中使用到的引物及探针是在美国赛默飞世尔科技公司(上海)合成。
表2、引物及探针序列
2、实验试剂：
PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix：美国Quanta BiosciencesTM公司
荧光素钠盐(Fluorescein sodium salt)：美国Amresco公司
EGFR特异性多重基因标准品(EGFR Gene-Specific Multiplex ReferenceStandard)：美国Horizon Discovery公司
3、主要实验仪器：
小型台式高速离心机：美国Sigma公司
Naica Crystal DigitalTM PCR：法国STILLA Technologies公司
实施例1引物及探针单通道验证
实验分别用含12.5％上述各基因突变比例的EGFR特异性多重基因标准品为模板，数字PCR检测包括以下步骤：
1、从Horizon Discovery购买的EGFR特异性多重基因标准品浓度为50ng/μL，用Tris-HCl(10mmol/L，pH8.0)溶液调整DNA浓度到5ng/μL作为PCR模板，取2μL进行PCR反应扩增，反应体系见表3。
表3、引物、探针扩增反应体系
2、微滴生成和PCR扩增
2.1打开气压泵电源开关，确认气压泵输出压力和微滴生成扩增系统输入压力稳定在1150+/-50mbar。打开微滴生成扩增系统Naica Geode电源开关。
2.2将配置好的25μLPCR反应液加入到STILLA公司生产的微滴生成和反应器Sapphire chip的反应井中，盖上白色tall cap，并将Sapphire chip转移至微滴生成扩增系统Naica Geode中，并根据表4设置微滴生成和PCR扩增反应程序。
表4扩增反应程序
3、微滴荧光信号读取
3.1打开微滴阅读分析系统Naica Prism3电源和开关键，点击crystal reader软件图标，将Sapphire chip置于微滴阅读分析系统Naica Prism3中。点击“Newexperiment”，对检测基因和品进行命名并设置扫描参数。然后点击“scan”进行数据采集。
3.2扫描完成后，点击质控标识，查看检测图片，从微滴总数、图片清晰度和是否存在过度曝光
三个角度对本次检测进行QC质控。可以通道调节曝光时间和清洁芯片底部后重新读取微滴荧光信号。
4、PCR结果判定与分析
4.1打开Crystal Miner软件，导入样本检测数据。
4.2确认所有检测样本的微滴数要在20000以上。在“ANALYZE DATA”界面，点击“1Ddot plot”，选择所有样本文件，以空白对照对照组划定突变型探针和野生型探针的阈值，在阈值线上点击右键可以手动调节每个通道的阈值线，然后点击“Apply”进行确认。
4.3含有荧光信号的微滴标记为1，不含荧光信号标记为0。Crystal Miner软件会根据泊松分布公式计算每个样本25μL反应体系中所含模板拷贝数浓度。泊松分布计算公式如下：N：总微滴数量；p：阳性微滴数量；v：每个微滴的体积(单位为μL)；d：稀释因子。基因突变率计算公式如下：突变拷贝数/(突变拷贝数+野生拷贝数)，计算各基因突变率。利用公式：突变拷贝数/(突变拷贝数+野生拷贝数)，计算各基因突变率(表5)。
实施例1的检测数据显示，本试剂盒所涉及的引物和探针分别能够与L858R、L861Q、E19-Dels及T790M的突变型位点和野生型位点特异性结合，并且各位点突变频率与EGFR特异性多重基因标准品(Horizon Discovery)的突变频率基本一致。说明本发明试剂盒对L858R、L861Q、E19-Dels及T790M检测具有高特异性(100％)。
表5各基因突变率计算
实施例2 19外显子E19、20外显子T790M、21外显子L861Q、21外显子L858R突变位点同时检测
本实施例分别以19外显子E19、20外显子T790M、21外显子L861Q、21外显子L858R突变为例来阐述本发明的crystal digital PCR检测上述EGFR基因突变。实验分别用含12.5％上述各基因突变比例的EGFR特异性多重基因标准品为模板，检测方法如下：
1、从Horizon Discovery购买的EGFR特异性多重基因标准品浓度为50ng/μL，用Tris-HCl(10mmol/L，pH8.0)溶液调整DNA浓度到5ng/μL作为PCR模板，取2μL进行PCR反应扩增。反应体系见表6。
表6引物、探针扩增反应体系
2、微滴生成和PCR扩增
2.1打开气压泵电源开关，确认气压泵输出压力和微滴生成扩增系统输入压力稳定在1150+/-50mbar。打开微滴生成扩增系统Naica Geode电源开关。
2.2将配置好的25μL PCR反应液加入到STILLA公司生产的微滴生成和反应器Sapphire chip的反应井中，盖上白色tall cap，并将Sapphire chip转移至微滴生成扩增系统Naica Geode中，并根据表7设置微滴生成和PCR扩增反应程序。
表7扩增反应程序
3、微滴荧光信号读取
3.1打开微滴阅读分析系统Naica Prism3电源和开关键，点击crystal reader软件图标，将Sapphire chip置于微滴阅读分析系统Naica Prism3中。点击“Newexperiment”，对检测基因和品进行命名、并设置扫描参数。然后点击“scan”进行数据采集。
3.2扫描完成后，点击质控标识，查看检测图片，从微滴总数、图片清晰度和是否存在过度曝光三个角度对本次检测进行QC质控。可以通道调节曝光时间和清洁芯片底部后重新读取微滴荧光信号。
4、PCR结果判定与分析
4.1打开Crystal Miner软件，导入样本检测数据。
4.2确认所有检测样本的微滴数要在20000以上。在“ANALYZE DATA”界面，点击“1Ddot plot”，选择所有样本文件，以空白对照对照组划定突变型探针和野生型探针的阈值，在阈值线上点击右键可以手动调节每个通道的阈值线，然后点击“Apply”进行确认。
4.3含有荧光信号的微滴标记为1，不含荧光信号标记为0。Crystal Miner软件会根据泊松分布公式计算每个样本25μl反应体系中所含模板拷贝数浓度。泊松分布计算公式如下：N：总微滴数量；p：阳性微滴数量；v：每个微滴的体积(单位为μL)；d：稀释因子。
19外显子E19、20外显子T790M、21外显子L861Q、21外显子L858R突变位点拷贝数浓度检测结果，利用公式：突变拷贝数/(突变拷贝数+野生拷贝数)，计算各基因突变率(表8)。
经实施例2的检测数据显示，本试剂盒所涉及的引物和探针在crystal digitalPCR仪上能够同时检测L858R、L861Q、E19-Dels及T790M的突变型位点。
表8各基因突变率计算
实施例3数字PCR的检测灵敏度的测定
本实施例分别以不同百分比的19外显子E19、20外显子T790M、21外显子L861Q、21外显子L858R突变为例来阐述数字PCR对上述EGFR基因突变的检测灵敏度。
1、实验分别用含12.5％上述各基因突变比例的EGFR特异性多重基因标准品和野生型细胞A549基因组为模板，按照表9配制成突变等位基因和野生等位基因的比例分别为12.5％、1％、0.1％、0.05％溶液作为反应模板，反应体系见表10。
表9不同突变百分比配制表
MU(copies) WT(copies) A549(copies)
12.5％ 250 1780 0
1％ 25 178 2497.97
0.10％ 25 178 24979.7
0.05％ 25 178 49959.4
表10引物、探针扩增反应体系
2、微滴生成和PCR扩增
2.1打开气压泵电源开关，确认气压泵输出压力和微滴生成扩增系统输入压力稳定在1150+/-50mbar。打开微滴生成扩增系统Naica Geode电源开关。
2.2将配置好的25μL PCR反应液加入到STILLA公司生产的微滴生成和反应器Sapphire chip的反应井中，盖上白色tall cap，并将Sapphire chip转移至微滴生成扩增系统Naica Geode中，并根据表11，设置微滴生成和PCR扩增反应程序。
表11扩增反应程序
3、微滴荧光信号读取
3.1打开微滴阅读分析系统Naica Prism3电源和开关键，点击crystal reader软件图标，将Sapphirechip置于微滴阅读分析系统Naica Prism3中。点击“New experiment”，对检测基因和品进行命名、并设置扫描参数。然后点击“scan”进行数据采集。
3.2扫描完成后，点击质控标识，查看检测图片，从微滴总数、图片清晰度和是否存在过度曝光三个方面对本次检测进行QC质控。可以通道调节曝光时间和清洁芯片底部后重新读取微滴荧光信号。
4、PCR结果判定与分析
4.1打开Crystal Miner软件，导入样本检测数据。
4.2确认所有检测样本的微滴数要在20000以上。在“ANALYZE DATA”界面，点击“1Ddot plot”，选择所有样本文件，以空白对照对照组划定突变型探针和野生型探针的阈值，在阈值线上点击右键可以手动调节每个通道的阈值线，然后点击“Apply”进行确认。
4.3含有荧光信号的微滴标记为1，不含荧光信号标记为0。Crystal Miner软件会根据泊松分布公式计算每个样本25μL反应体系中所含模板拷贝数浓度。
泊松分布计算公式如下：N：总微滴数量；p：阳性微滴数量；v：每个微滴的体积(单位为μL)；d：稀释因子。
基因突变率计算公式如下：突变拷贝数/(突变拷贝数+野生拷贝数)，计算各基因突变率。
以不同比例EGFR基因突变型和野生型的模板为检测样本，采用本实施例的EGFR基因突变检测试剂盒进行检测，根据实验结果得出该反应体系检测的灵敏度分别见表12，表13，表14，表15。
经实施例3检测数据显示，检测结果与理论总拷贝数结果基本一致，crystaldigital PCR数字PCR仪对本发明试剂盒中检测L858R、L861Q、E19-Dels及T790M检测的灵敏度可达0.05％。
表12 L858R位点灵敏度检测结果
表13 L861Q位点灵敏度检测结果
表14 T790M位点灵敏度检测结果
表15 19外显子的E19-dels位点灵敏度检测结果
序列表
<110> 北京爱普拜生物技术有限公司
<120> 一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒及方法
<130> 1
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 1
cgcagcatgt caagatca 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 2
ccttctgcat ggtattcttt ctc 23
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 3
tggcccgccc a 11
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 4
ccagctgttt g 11
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 5
gcctgctggg catct 15
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 6
ttgtgttccc ggacata 17
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 7
tgagctgcat gatga 15
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 8
agttaaaatt cccgtcgc 18
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 9
acccccacac agcaaag 17
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 10
atcgaggatt tccttg 16
<210> 11
<211> 12
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 11
attaagagaa gc 12

Claims (8)

1.一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒及方法。
2.按照权利要求1所述的一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒及方法，其特征在于，适用于检测肿瘤组织产生的游离DNA，包括人体组织、血浆游离DNA、血清游离DNA、尿液游离DNA、汗液DNA、唾液DNA以及FFPE切片提取所得的微量DNA。
3.按照权利要求1所述的一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒及方法，其特征在于，适用于人EGFR基因L858R、L861Q、T790M、E19-Dels四个变异区域的共22个突变位点的检测。
4.按照权利要求3所述的一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒及方法，其特征在于，在单个PCR管中完成人EGFR基因的L858R、L861Q、T790M、E19-Dels共22个突变位点的检测。
5.按照权利要求1所述的一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒，其特征在于：包括引物探针混合液、数字PCR反应液的预混液、数字PCR芯片、数字PCR校准文件；
所述引物探针混合液中包括用于检测21外显子L858R位点突变的正向引物1、反向引物1、检测探针1，用于检测21外显子L861Q位点突变的正向引物1、反向引物1、检测探针2，用于检测20外显子T790M位点突变的正向引物2、反向引物2、检测探针3，以及用于检测19外显子E19-Dels位点的正向引物3、反向引物3、检测探针4、Block探针；
所述上述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述检测探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述上述检测探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述上述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述反向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述检测探针3的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述上述正向引物3的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述反向引物3的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述检测探针4的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述Block探针的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述Block探针的核苷酸序列使用了特异修饰的阻遏核苷酸；
所述检测探针1和检测探针2的5’端设计带有一种荧光报告基团，所述检测探针3的5’端设计带有另一种荧光报告基团，所述检测探针4的5’端设计带有第三种荧光报告基团，所述的Block探针的5’端和3’端不带有荧光报告基团，所述检测探针1、检测探针2、检测探针3、检测探针4的3’端设计带有淬灭荧光基团；
所述上述各正向引物和反向引物在反应体系中的终浓度为0.5μΜ；
所述上述检测探针1、检测探针2、检测探针3、检测探针4和Block探针在反应体系中的终浓度为0.2μΜ；
6.按照权利要求5所述的一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒，其特征在于：所述检测探针1和检测探针2的5’端的荧光报告基团是FAM，所述检测探针3的5’端的荧光报告基团是Cy5，所述检测探针4的5’端的荧光报告基团是VIC，所述检测探针1和检测探针2的3’端的淬灭荧光基团是BHQ1或MGB，所述检测探针3的3’端的淬灭荧光基团是BHQ3或MGB，所述检测探针4的3’端的淬灭荧光基团是BHQ1或BHQ2或MGB。
7.按照权利要求5所述的一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR反应液的预混液中包括DNA聚合酶、dNTP混合液、灭菌超纯水和PCR反应缓冲液。
8.按照权利要求5所述的一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒，其特征在于：反应时，反应体系中包括数字PCR反应预混液5μL，引物探针混合液2μL，模板1μL，灭菌超纯水定容至25μL总体积，所述模板的使用浓度为0.01ng/μL～0.4ng/μL。
CN201711212624.XA 2017-11-28 2017-11-28 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法 Active CN107723213B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711212624.XA CN107723213B (zh) 2017-11-28 2017-11-28 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711212624.XA CN107723213B (zh) 2017-11-28 2017-11-28 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107723213A true CN107723213A (zh) 2018-02-23
CN107723213B CN107723213B (zh) 2018-07-13

Family

ID=61219770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711212624.XA Active CN107723213B (zh) 2017-11-28 2017-11-28 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107723213B (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108504725A (zh) * 2018-06-12 2018-09-07 上海浦美生物医药科技有限公司 一种用于检测egfr tki敏感突变的引物和探针
CN109234390A (zh) * 2018-09-03 2019-01-18 刘红彦 野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途
CN110904234A (zh) * 2019-12-19 2020-03-24 苏州绘真医学检验有限公司 基于ddPCR及EGFR热点突变检测人循环肿瘤细胞的引物组、探针组、试剂盒及用途
CN111440852A (zh) * 2019-11-20 2020-07-24 北京爱普拜生物技术有限公司 一种多探针检测mgmt基因启动子dmr2区域甲基化位点的试剂盒及方法
CN113322352A (zh) * 2021-06-08 2021-08-31 浙江省检验检疫科学技术研究院 三重数字微滴pcr检测猪圆环病毒的方法、引物、探针和试剂盒
CN113373205A (zh) * 2021-08-03 2021-09-10 远辰生物科技(苏州)有限公司 一种利用数字PCR定量检测EGFR基因19del和L858R位点突变的方法
CN113373206A (zh) * 2021-08-03 2021-09-10 远辰生物科技(苏州)有限公司 一种egfr基因突变检测体系及其试剂盒
CN113584132A (zh) * 2019-10-15 2021-11-02 新羿制造科技（北京）有限公司 一种用于检测人egfr基因突变的数字pcr试剂盒
CN115820862A (zh) * 2022-12-05 2023-03-21 四川大学华西医院 一种检测人egfr基因多突变位点的数字pcr试剂盒
CN116751867A (zh) * 2023-08-10 2023-09-15 思纳福(苏州)生命科技有限公司 一种用于检测egfr突变基因的引物及荧光探针及其应用
CN116773291A (zh) * 2023-03-31 2023-09-19 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 一种石蜡切片dna预处理试剂及方法
CN117987558A (zh) * 2024-04-07 2024-05-07 北京求臻医疗器械有限公司 人met基因14号外显子跳跃突变核酸标准物质及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101092644A (zh) * 2006-06-21 2007-12-26 上海基康生物技术有限公司 非小细胞肺癌疗效相关的egfr基因突变的快速检测
CN103184274A (zh) * 2011-12-27 2013-07-03 上海复星医学科技发展有限公司 一种ldr技术的egfr突变检测试剂盒
CN104762408A (zh) * 2015-04-29 2015-07-08 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 检测egfr基因突变的试剂盒及其检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101092644A (zh) * 2006-06-21 2007-12-26 上海基康生物技术有限公司 非小细胞肺癌疗效相关的egfr基因突变的快速检测
CN103184274A (zh) * 2011-12-27 2013-07-03 上海复星医学科技发展有限公司 一种ldr技术的egfr突变检测试剂盒
CN104762408A (zh) * 2015-04-29 2015-07-08 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 检测egfr基因突变的试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BORSU ET AL: "Clinical Application of Picodroplet Digital PCR Technology for Rapid Detection of EGFR T790M in Next-Generation Sequencing Libraries and DNA from Limited Tumor Samples", 《THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 *
ISHII ET AL: "Digital PCR analysis of plasma cell-free DNA for non-invasive detection of drug resistance mechanisms in EGFR mutant NSCLC: Correlation with paired tumor samples", 《ONCOTARGET》 *
IWAMA ET AL: "Highly sensitive and quantitative evaluation of the EGFR T790M mutation by nanofluidic digital PCR", 《ONCOTARGET》 *
ZHU ET AL: "Highly sensitive Droplet digital PCR method for detection of EGFR-Activating mutations in plasma cell-free DNA from patients with advanced Non-small cell lung cancer", 《THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 *
邱斐: "微滴数字PCR技术动态监测非小细胞癌患者血浆游离DNA EGFR基因突变", 《中国博士学位论文全文数据库-医药卫生科技辑》 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108504725A (zh) * 2018-06-12 2018-09-07 上海浦美生物医药科技有限公司 一种用于检测egfr tki敏感突变的引物和探针
CN109234390A (zh) * 2018-09-03 2019-01-18 刘红彦 野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途
CN113584132A (zh) * 2019-10-15 2021-11-02 新羿制造科技（北京）有限公司 一种用于检测人egfr基因突变的数字pcr试剂盒
CN113584132B (zh) * 2019-10-15 2024-04-12 新羿制造科技（北京）有限公司 一种用于检测人egfr基因突变的数字pcr试剂盒
CN111440852A (zh) * 2019-11-20 2020-07-24 北京爱普拜生物技术有限公司 一种多探针检测mgmt基因启动子dmr2区域甲基化位点的试剂盒及方法
CN110904234A (zh) * 2019-12-19 2020-03-24 苏州绘真医学检验有限公司 基于ddPCR及EGFR热点突变检测人循环肿瘤细胞的引物组、探针组、试剂盒及用途
CN113322352A (zh) * 2021-06-08 2021-08-31 浙江省检验检疫科学技术研究院 三重数字微滴pcr检测猪圆环病毒的方法、引物、探针和试剂盒
CN113373206A (zh) * 2021-08-03 2021-09-10 远辰生物科技(苏州)有限公司 一种egfr基因突变检测体系及其试剂盒
CN113373205A (zh) * 2021-08-03 2021-09-10 远辰生物科技(苏州)有限公司 一种利用数字PCR定量检测EGFR基因19del和L858R位点突变的方法
CN115820862A (zh) * 2022-12-05 2023-03-21 四川大学华西医院 一种检测人egfr基因多突变位点的数字pcr试剂盒
CN116773291A (zh) * 2023-03-31 2023-09-19 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 一种石蜡切片dna预处理试剂及方法
CN116773291B (zh) * 2023-03-31 2024-04-19 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 一种石蜡切片dna预处理试剂及方法
CN116751867A (zh) * 2023-08-10 2023-09-15 思纳福(苏州)生命科技有限公司 一种用于检测egfr突变基因的引物及荧光探针及其应用
CN117987558A (zh) * 2024-04-07 2024-05-07 北京求臻医疗器械有限公司 人met基因14号外显子跳跃突变核酸标准物质及应用
CN117987558B (zh) * 2024-04-07 2024-07-05 北京求臻医疗器械有限公司 人met基因14号外显子跳跃突变核酸标准物质及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107723213B (zh) 2018-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107723213B (zh) 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒及方法
CN106520931B (zh) Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN106591438B (zh) 一种用于检测Her2基因的核酸组合、试剂盒及应用
CN105624309A (zh) 检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒
CN104762408B (zh) 检测egfr基因突变的试剂盒及其检测方法
CN109504776A (zh) 用于肿瘤基因变异检测的试剂盒、引物、探针和检测剂
CN104263820B (zh) 一种cyp2d6基因多位点突变检测方法
CN108949990A (zh) 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法
CN107988369B (zh) 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒
CN108841953A (zh) 利用数字pcr技术检测egfr基因22种突变的试剂盒
CN106801091A (zh) 检测人类egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系
CN111363810B (zh) 检测egfr基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒
CN106755297A (zh) 一组基于arms荧光定量pcr检测egfr基因t790m突变的引物组及其制备方法
CN107447013A (zh) 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒
CN110863051B (zh) 一种met基因扩增检测的引物、体系及试剂盒
CN112048560A (zh) 一种多内参结合序贯概率比检验分析her2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法
CN109762878A (zh) 一种肺癌EGFR L858R位点的ddPCR检测方法及应用
CN104774963A (zh) 检测pik3ca基因突变的试剂盒及其检测方法
Liu et al. EGFR mutation types and abundance were associated with the overall survival of advanced lung adenocarcinoma patients receiving first-line tyrosine kinase inhibitors
US20180112271A1 (en) Kit For Detecting PIK3CA Gene Mutation
CN107151707B (zh) 一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用
CN108130362A (zh) 用于egfr基因突变检测的试剂盒及应用
CN108728538B (zh) Alk基因融合检测引物、方法及试剂盒
CN110438206A (zh) 一组检测egfr基因19外显子缺失突变的引物、探针和试剂盒
CN110004217A (zh) 外周血浆中egfr基因t790m位点突变的检测方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant